CURSUL I

Istoric

Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia este o tehnică histologică de identificare a

constituenţilor celulari sau tisulari prin folosirea interacţiunii antigen-anticorp. Unii autori folosesc
termenul de imunohistochimie când utilizează aceste tehnici în studiul histologic al ţesuturilor şi de
imunocitochimie când utilizează tehnicile pentru preparatele citologice (pentru studiul frotiurilor sau
amprentelor). Cei mai multi autori folosesc termenul de imunohistochimie pentru ambele tipuri de
studii.

Dezvoltată în ultimii 60 de ani, imunohistochimia a devenit o metodă calitativă foarte

valoaroasă pentru studii de citologie, embriologie, histologie, medicină legală şi mai ales pentru
anatomie patologică. Imunohistochimia este la ora actuală o metodă de diagnostic foarte valoroasă
pentru majoritatea laboratorelor de cercetare şi de diagnostic, fiind deseori preferată microscopieie
electronice, datorită eficacităţii, rapidităţii, preciziei şi costurilor nu prea ridicate.
Tehnicile actuale de IHC au apărut datorită efortului susţinut a mai multor cercetători şi
laboratoare care au dorit să aprofundeze studiile de microscopie, biologie celulară şi moleculară.
Pentru a putea vizualiza o anumită structură (un antigen) într-un ţesut sau într-o celulă este necesar să
se utilizeze “anticorpi marcaţi”, adică anticorpi care să poată fi vizualizaţi la microscop.

Primele tehnici de imunohistochimie au utilizat anticorpi marcaţi cu fluorocromi

(izotiocianatul de fluoresceină şi rodamina). Cel mai mare dezavantaj al acestei tehnici a fost
necesitatea folosirii unui microscop cu fluorescenţă, aparat greu de procurat şi utilizat. În plus, tehnica
de imunofluorescenţă nu permitea evidenţierea unor detalii morfologice ale celulelor marcate.
Aceste inconveniente au fost eliminate prin marcarea enzimatică a anticorpilor (ex. marcarea
enzimatică a anticorpilor cu peroxidază din hrean) ataşată de un amestec cromogen adecvat cum ar fi
diaminobenzidina (DAB)- metodă propusă de Nakane & Pierce în 1966. Această metodă a permis
atât vizualizarea morfologiei celulelor cât şi demonstrarea antigenului prin cuplarea acestuia cu
anticorpul specific marcat cu peroxidază şi cromogen.
Din 1966 au fost imaginate mai multe tehnici enzimatice. În 1970 Sternberger a descris tehnica
cu peroxidază-antiperoxidază (PAP). Engvall şi Perlman în 1971 au folosit marcarea cu fosfatază
alcalină, iar Geggeness şi Ash (1977) au propus folosirea pentru imunofluorescenţă a complexului
avidină-biotină. Cordell şi colab. (1984) a descris sistemul fosfatază alcalină - anti-fosfatază
alcalină (APAAP) folosind un produs de reacţie roşu. Această metodă a câştigat teren acolo unde
blocarea endogenă a peroxidazei sau prezenţa pigmentului maro au făcut dificilă interpretarea.

Prezenta unor antigene în cantitate foarte mică, chiar şi prin folosirea unei tehnici optimizate,
face imposibilă demonstrarea existenţei acestora. De aceea au fost imaginate diverse tehnici de
amplificare a reacţiei de demascare a antigenelor. Adăugarea imidazolului (Straus 1982) sau a
metalelor grele (Hsu & Soban 1982) la substrat a adus în multe cazuri beneficii. Totuşi Borow (1989)
a raportat o creştere a sensibilităţii prin adăugarea tiraminei (amină rezultată din decarboxilarea
tirozinei) cu peroxidază din hrean. Reacţia se bazează pe depunerea tiraminei biotinate (reacţie
catalizată de peroxidază) pe situsurile de imunoreactivitate. Aceasta permite legarea biotinei în
cantitate mai mare de situsurile complexelor antigen-anticorp şi automat mai multă avidin-peroxidază
poate fi ataşată la locurile de desfăşurare a reacţiilor imunologice. Când substratul cu soluţie DAB este
aplicat, este atinsă o sensibilitate mai mare. Totuşi, toate metodele ce folosesc sistemul avidină-biotină
au dezavantajul existenţei biotinei endogene, în special în ţesutul hepatic şi cel renal.

1
 O altă metodă de amplificare, descoperită de Mangham & Isaacson (1999), consta in folosirea
anticorpilor complementari imagine in oglindă (MICA). Aceasta este de fapt o metodă in cinci timpi
care conferă o sensibilitate asemănătoare aceleia oferite de tiramină, dar evită dezavantajul falsei
marcări datorate biotinei endogene.
Sistemele de marcare s-au dezvoltat în paralel cu producerea de anticorpi. În 1975 Kohler &
Milstein au descris o metodă revoluţionară pentru producerea anticorpilor monoclonali. Tehnicile
moleculare moderne au permis sintetizarea unor peptide împotriva cărora se pot produce atât anticorpi
monoclonali cât şi policlonali (Lagunowich 1990).

Cu toate progresele făcute în domeniul sistemelor de marcare şi al anticorpilor, folosirea acestora

în cadrul histopatologiei a fost limitată de tehnicile de fixare în formol şi includere la parafină. La
începuturile imunocitochimiei s-a crezut ca aceste tehnici de procesare distrug anumiţi epitopi.
Huang în 1976 a descris folosirea tripsinei asupra secţiunilor la parafină ca un mijloc de
evidenţiere a unor antigene care erau mascate de fixarea în formol şi includerea la parafină.

Totuşi, cel mai mare progres în acest sens s-a făcut în 1991 când Shi a descris tratamentul
anterior cu căldură. Acesta implica la început folosirea microundelor pentru încălzirea secţiunilor
incluse la parafină într-o soluţie de metal greu ca un mijloc de recuperare (demascare) a antigenelor
din ţesuturile procesate prin fixare în formol. Cattoretti în 1993 a propus soluţii alternative care
compensau problemele de securitate asociate folosirii metalelor grele. Tamponarea cu citrat soluţie la
pH 6 (0,01M) a devenit alegerea de bază pentru ca este ieftină, foarte eficientă şi uşor de preparat. În
continuare, Norton (1994) a constatat că oala de gătit sub presiune confecţionată din inox a fost mai
eficientă decât cuptorul cu microunde pentru recuperarea unor antigene, fapt confirmat şi de Miller în
1995. De asemenea, în 1994, Bankfalvi a descris o metodă de recuperare a antigenelor folosind
autoclavul. Au fost propuse şi multe alte metode pentru pre-tratarea cu caldura cum ar fi încălzirea
peste noapte la temperaturi între 70°C şi 80°C în citrat (Man & Tavossoli 1996), sau în Tris-EDTA
sau acid boric la 60°C (Bidolph & Jones 1998).

Alte noi metode au fost de asemenea propuse. Folosirea ultrasunetelor ca o metodă de demascare
înaintea includerii a fost descrisă de Gimeno (1998), iar folosirea aburilor din vegetale de Taylor
(1996).
Totuşi, folosirea crescută a recuperării antigenelor pentru imunocitochimie a condus la
numeroase modificări aduse metodei, în special la nivelul soluţiilor de recuperare şi al aparaturii de
încălzire. Toate aceste studii au concluzionat ca există numeroşi factori care influenţează calitatea
recuperării, cum ar fi pH-ul, volumul de lichid, timpul şi temperatura de încălzire.

Anumiţi epitopi, de exemplu antigenul de proliferare, Ki67 şi antigenele celulelor T- CD5 şi

CD8- pot fi evidenţiate numai prin fixare în formol, includere la parafină şi pre-tratare cu căldură, şi
apoi numai cu anumiţi anticorpi monoclonali. Anticorpii, cum ar fi aceia direcţionaţi împotriva
antigenului comun leucocitar (clonele PD7/2B11) şi antigenului CD20 (clona L26) produc o colorare
puternică după tamponare cu citrat, încălzire şi, surprinzător, pre-tratarea cu căldură permite
creşterea considerabilă a factorilor de diluţie. Demonstrarea antigenelor cum ar fi ciclina D1 (clona
DCS-6) se realizează preferenţial în soluţii cu pH mai înalt (Tris-EDTA, pH =10) (fig. 20.2)
Diferitele metode de recuperare pot genera confuzii, în special datorită faptului că nu există
standardizare.

2
 Definiţii
Imunohistochimia (IHC) sau imunocitochimia este o tehnică histologică de identificare a
constituenţilor celulari sau tisulari prin folosirea interacţiunii antigen-anticorp.

Antigenul
Este substanţă (moleculă) străină care, pătrunsă în organism, determină apariţia anticorpilor;
(gr. anti = împotriva, gennan = a naşte). Antigenele cele mai cunoscute sunt proteinele cu masă
moleculară relativ mare (peste 10 000 daltoni) dar pot funcţiona ca antigene şi molecule polipeptidice
de mici dimensiuni cu g.m. mai mică de 1000 daltoni, moleculele polizaharidice, lipidice,
lipoproteice, acizii nucleici, proteine nucleare, etc. Pentru a avea proprietăţi antigenice molecula
respectivă trebuie să aibă o anumită mărime, o anumită structură care să-i permită menţinerea unei
configuraţii spaţiale tridimesionale necesară pentru recunoaşterea antigenică. În plus, antigenele
trebuie să aibă capacitate imunogenă (capacitatea de a induce formarea de anticorpi) şi de
recativitate specifică (capacitatea de a forma complexe imune cu anticorpul a cărei formare a indus-
o). Pentru a obţine anticorpi cu o specificitate cât mai bună, trebuie ca antigenul obţinut sa fie cât mai
pur. Obţinerea unor antigene de bună calitate este o muncă extrem de laborioasă, care encesită
multiple tehnici biologice şi biochimice de extracţie şi purificare.

Trebuie notat că nu toată molecula antigenică se leagă de anticorpul specific ci numai anumite
regiuni topografice formate dintr-un număr mai mare sau mai mic de aminoacizi sau unităţi
monozaharidice, regiuni cunoscute sub numele de epitropi sau determinanţi antigenici.
Există două categorii de epitropi proteici:
- secvenţiali;
- conformaţionali.
Epitropii secvenţiali sunt formaţi dintr-o secvenţă de aminoacizi prezenţi pe un lanţ
polipeptidic; epitropii conformaţionali sunt formaţi din secvenţe de aminoacizi (de mărimi varibile)
situate la distanţă unele de altele pe acelaşi lanţ polipeptidic sau pe lanţuri diferite, dar care, datorită
structurii secundare şi terţiare a proteinelor (pliate contorsionate), sunt aduse unele lângă altele.
Nu toţi epitropii determină un răspuns imun de aceeaşi intensitate. În structura unui antigen pot
să existe epitropi imunodominanţi care determină răspunsuri imune mai puternice şi epitropi care
determină răspunsuri imune slabe.

Anticorpii
Sunt glicoproteine plasmatice aparţinând imunoglobulinelor, capabile să recunoască specific
un anumit antigen. Ei sunt sintetizaţi în sistemul imunitar de către plasmocite, celulele finale ale
transformării limfocitului B după recunoaşterea unui antigen, dar în cantităţi mici şi de limfocitele B.
Există cinci tipuri de anticorpi (imunoglobuline) în sânge: IgA, IgD, IgE, IgG şi IGM.
Producerea de anticorpi. La un prim contact cu un antigen, limfocitul B se transformă în
imunoblast sau limfocit activat. Această transformare constă în creşterea volumului celular, diametrul
celulei depăşind 10 µm, sporirea citoplasmei prin creşterea cantităţii de hialoplasmă şi de organite,
accentuarea bazofiliei prin creşterea cantităţii de ribozomi şi reticul endoplasmic rugos, creşterea
nucleului şi a cantităţii de eucromatină şi apariţia a 2-4 nucleoli. Aceste limfocite activate se divid de
mai multe ori prin mitoze, dând naştere la clone celulare, din care unele celule se vor diferenţia în
plasmocite (celule secretoare de imunoglobuline), iar altele vor forma limfocitele cu memorie (celule
capabile la un nou contact cu acelaşi antigen să-l recunoască mai uşor şi să declanşeze un răspun imun
secundar mult mai rapid).
Plasmocitele sintetizează anticorpii sau imunoglobulinele specifice care vor fi exocitate în
mediul intern, realizând forma de imunitate umorală sau imediată.

3
 - IgG formează circa 75% din totalul imunoglobulinelor serice. Molecula de IgG este formată
din două lan’uri similare de aminoaciyi, unite printr-o legătură bisulfidică. Fiecare subunitate conţine
două lanţuri polipeptidice: unul lung, lanţul greu (H) şi unul scurt, lanţul uşor (L). Lanţul H se uneşte
de lanţul L printr-o legătură bisulfidică. În ansamblu, molecula de IgG prezintă două zone funcţionale
notate Fc, zona care se leagă cu un receptor specific prezent pe suprafaţa unor celule (limfocite,
macrofage, mastocite) şi respectiv, Fab care se leagă de antigen. Moleculele de IgG au greutate
moleculară de circa 150.000 daltoni.

- IgM reprezintă aproximativ 10% din imunoglobulinele serice. Sunt imunoglobulinele

dominante în răspunsul imun primar. Ele apar sub forma unui pentamer (cu greutatea moleculară de
900 000 daltoni). Sunt prezente în cantitate mare pe suprafaţa limfocitului B.
- IgA se găsesc în cantitate mică în plasma sanguină, dar se găsesc în cantitate mare în secreţia
lacrimală, colostru, salivă, secreţia nazală, bronşică, intestinală, uterină sau prostatică sub formă de
IgA secretorie (la monomerul IgA produs de limfocite şi plasmocite se adaugă un lanţ polipeptidic
denumit proteina J sintetizat de celulele mucoaselor, care-i sporeşte acţiunea şi îi facilitează
transportul prin epiteliile de acoperire).

- IgE se prezintă sub forma unui monomer cu greutatea moleculară de 180 000 daltoni. În
sânge se găsesc în cantitate foarte mică, de 3-5 µg/100ml. Aceste imunoglobuline au o afinitate
crescută pentru receptorii membranari ai mastocitelor şi polimorfonucleare bazofile.
- IgD sunt mai puţin cunoscute din punct de vedere al efectelor biologice. Se prezintă sub
forma unui monomer cu greutatea moleculară de 180 000 daltoni. Ca şi IgE se găsesc în cantitate
foarte mică în sânge (0,2% din totalul imunoglobulinelor). În cantităţi mai mari se găsesc pe suprafaţa
limfocitelor B.

IgG sunt cel mai frecvent folosite în imunohistochimie. Specificitatea pentru antigene a IgG
se află în partea distală (variabilă) a lanţurilor H şi L, formând cele două braţe ale Y-ului. Fiecare braţ
este capabil de combinare cu un determinant antigenic şi de aceea se numeşte un fragment de anticorp
sau Fab. Stemul Y-ului format din părţi ale ambelor lanţuri H se numeşte fragmentul constant sau Fc.
Regiunile terminale ale fiecărui braţ prezintă variaţii ale secvenţelor de amino-acizi şi sunt cunoscute
sub numele de domenii variabile. Variabilitatea amino-acizilor produce o specificitate pentru un
anumit epitop şi permite legarea specifică a anticorpului de antigenul împotriva căruia a fost produs.

Din punct de vedere imunohistochimic, molecula de IgG are 3 trăsături importante:

- capetele fragmentelor Fab sunt capabile să se lege de cîte un determinant antigenic (au doua
locusuri de legare);
- fragmentul Fc, comun tuturor anticorpilor speciei de animal nu este implicată în combinarea
cu antigenele;
- imunoglobulinele sunt ele însele macromolecule şi se pot comporta ca antigene când sunt
injectate la specii diferite de animale. Ca şi antigen, molecula de IgG poate să aibă câteva
locuri antigenice şi poate să lege mai multe molecule de anticorpi. Această proprietate este
folosită în tehnicile de amplificare a recaţiei imunohistochimice.

Surse de anticorpi
Anticorpii sunt produşi prin imunizarea unui animal de experienţă cu un antigen. Injectarea
antigenului se face de mai multe ori. Animalul va dezvolta răspuns umoral şi anticorpii astfel produşi
pot fi extraşi din sângele animalului. Este puţin probabil ca animalul să producă numeroase clone de

4
plasmocite (celule care sintetizează anicorpii specifici) ca reacţie imună la injectarea antigenului.
Fiecare clonă de plasmocite va produce un anticorp cu o specificitate uşor diferită faţă de epotipii
prezenţi pe imunogen. În plus, animalul poate avea în mod natural mulţi alţi anticorpi şi proteine
prezente în ser, care pot genera probleme de reactivitate încrucişată sau colorare nespecifică.

Serul imun conţine aproximativ 10 mg/ml imunoglobiuline, din care numai 0,1-1 mg
reprezintă anticorpul de interes. O parte din aceşti anticorpi vor reacţiona încrucişat cu alte molecule
şi, de aici, necesitatea de a fi îndepărtaţi din ser prin diverse metode biologice şi biochimice. Cel mai
adesea se utilizeată reacţia de precipitatre a imunoglobulinelor cu sulfat de aminoiu, urmată de
cromatografie sau alte tehnici de purificare. Dacă anticorpul de interes este prezent în concentraţii
mari, multe dintre reacţiile nedorite pot fi eliminate prin diluarea anticorpului obţinut.
Cu toate acestea nu se poate obţine doar un singur tip de anticorp pentru antigenul injectat
anumalului, şi din acest motiv, acestia se numesc anticporpi policlonali. Anticorpii policlonali pot da
reacţii încrucişate cu alte molecule (antigene) din celule sau ţesuturi. De aceea se consideră că un ser
policlonal, oricât de purificat ar fi, nu poate fi lipsit de reacţii încrucisate nedorite.

Pentru a creşte acurateţea examenului imunohistochimic, s-a reuşit obţinerea unor anticorpi
monoclonali în culturi de celule, prin tehnica hibridomului, prin combinarea unor limfocite B cu
celule de mielom. S-a izolat astfel o singură clonă imună de limfocite B sau plasmocite care produc un
singur anticorp, specific pentru un antigen. Aceşti anticorpi se numesc anticorpi monoclonali.
Reacţiile încrucişate nu sunt în totalitate eliminate nici prin utilizarea anticorpuilor
monoclonali deoarece aceşti anticorpi pot recunoaste si alţi epitropi prezenţi în alte celule sau ţesuturi,
normale sau patologice. Totuşi este o proprietate a tuturor anticorpilor de a forma complexe numai cu
antigenele care le stimulează producţia. În plus, un antigen mare, format din mai multe
macromolecule diferite, va avea mulţi determinanţi antigenici (mai mulţi epitropi) şi va determina
sinteza mai multor specii diferite de anticorpi, toate capabile să se combine cu acelaşi antigen.

Deşi fiecare moleculă de antigen se leagă numai de epitopul său specific, două proteine
aproape similare pot interacţiona cu un anticorp determinat numai de una din ele. Asemenea
reactivitate încrucişată apare când locul determinantului antigenic este o secvenţă scurtă de
aminoacizi, comuni ambelor antigene. Această reactivitatea încrucişată este uneori o sursă de
confuzie în interpretarea preparatelor colorate imunohistochimic.
La ora actuală există mii de substanţe antigenice şi antiserice sunt disponibile în laboratoarele
de diagnostic şi cercetare din întreaga lume, producerea anticorpilor în laborator fiind azi o activitate
de cercetare dar şi comercială.

Complexul antigen-anticorp
Punerea în contact a unui antigen cu anticorpul specific determină formarea unui complex
antigen-anticorp, între cele două molecule exitând o analogie structurală la nivelul detrminanţilor
antigenici de tip “lacăt-cheie”. Acest complex este menţinut prin formarea unor punţi de hidrogen,
prin apariţia unor forţe electrostatice şi pri legături Van der Waals. Combinarea unui anticorp cu
antigenul său este o recţie imună prin care se urmăreşte neutralizarea toxicităţii sau patogenităţii
antigenului.
Complexele antigen-anticorp pot fi vizualizate numai prin marcarea anticorpului specific cu
fluorocromi sau cu enzime.

5
 Marcarea fluorescentă
Cei mai frecvenţi reactivi utilizaţi pentru marcajul anticorpilor sunt izotiocianatul fluoresceina
(FITC) şi izotiocianatul tetrametilrodamina (TRITC). Aceste substanţe, în soluţie alcalină (pH 9-
10) se combină covalent cu proteinele, reacţionând în principal cu grupul amino al lizinei.
Fluorocromul se va conjuga cu toate tipurile de proteine prezente în ser, nu numai cu anticorpul
sau anticorpii interesaţi. Materialul fluorescent nelegat va fi de asemenea prezent din cauza unor
hidrolize ale agenţilor de marcaj care survin în mediu alcalin necesar dezvoltării reacţiei cu aminele.

Materialul fluorescent neconjugat trebuie să fie eliminat din cauză că ar colora nespecific
ţesuturile. Serul marcat este dializat pentru a îndepărta moleculele mici (gm < 5000 daltoni) şi pentru
a înlocui solventul alcalin cu o soluţie salină cu un pH fiziologic. Apoi serul imun este trecut printr-o
coloană filtru de gel, care reţine moleculele mici sau poate fi tratat cu cărbune activat. Rezultatul final
duce la obţinerea unui ser ce conţine în cea mai mare parte anticorpul specific marcat cu un
fluorocrom.
Acest ser este pus în contact cu ţesutul care conţine antigenul într-o atmosferă umedă timp de
aproximativ o oră. Apoi se înlătură excesul cu o soluţie salină şi se montează între lamă şi lamelă
utilizând un amestec de glicerol şi tampon alcalin. Secţiunile colorate şi montate sunt examinate la
microscopul cu fluorescenţă, cu excitaţie şi filtrare adecvate pentru marcaj.
Aceste tenhici prezintă mai multe dezavantaje:
- prezenţa unui microscop cu lampă de ultraviolete, filtre speciale şi obiective microscopice
speciale;
- preparatul histologic trebuie examinat şi fotografiat cât mai repede deoarece emisia de
lumină se reduce progresiv cu trecerea timpului;
- montare nu se poate face în balsam de Canada şi de aici imposibilitatea de a fi păstrat mult
timp.

Marcarea enzimatică
Enzimele sunt cei mai folosiţi marcări în imunocitochimie. Incubaţia complexului antigen-
anticorp-enzimă cu un cromogen folosind o metodă histochimică standard generează un produs final
de reacţie colorat, stabil, uşor de examinat la microscopul optic obişnuit. În plus, varietatea enzimelor
şi cromogenilor disponibili, permit utilizatorului alegerea culorii produsului final de reacţie.
Peroxidaza din hrean este cea mai folosită enzimă, şi în combinaţie cu un cromogen favorabil
(DAB), conduce la un produs de reacţie maro închis stabil, insolubil şi permanent (Graham şi
Karnowsky 1966). Cu toate că DAB a fost considerat potenţial carcinogen, actual riscul demonstrat a
fi mic (Weisburger 1978).