TCNICAS DE ANLISIS MASIVO DE LA EXPRESIN DE GENES

Los conocimientos sobre el genoma humano hacen posible la utilizacin de tecnologas en

Genmica y Protemica, capaces de analizar la diversidad y complejidad de cada tipo de
cncer, enfocadas hacia el diagnstico molecular de tumores, adecuando la terapia a cada
paciente y contribuyendo a la identificacin de genes relevantes en cncer espordico y
familiar.
De inters particular es la aplicacin de los sistemas de anlisis molecular masivo a la
prediccin de respuesta a tratamientos individuales.
Numerosos estudios han demostrado la capacidad de generar estos modelos predictivos
aplicados a supervivencia, metstasis, respuesta a tratamientos concretos. Todos ellos, en
mayor o menor grado, adolecen del mismo defecto, la insuficiente reproducibilidad de los
resultados generados, cuando son aplicados en un contexto distinto; es decir, en otros
centros, por otros especialistas, o usando una tecnologa diferente.
SISTEMAS DE ANLISIS MOLECULAR MASIVO
Matrices tisulares (tissue arrays)
Permiten utilizar en bloques parafinados sistemas de anlisis masivo. Para ello crean
un nuevo bloque de parafina en el que se insertan en posiciones predefinidas hasta
800 cilindros de 600 a 1000, procedentes de biopsias de aguja efectuadas sobre
bloques de parafina preexistentes.
Es un sistema adaptado para investigar un marcador o un panel de marcadores
relacionados en una serie amplia de muestras, til en IHQ, FISH, HIS, complementario
a microarrays de cDNA. Indicaciones tpicas de esta tcnica son control de calidad,
anlisis de nuevos anticuerpos, estudio molecular de cnceres de pequeo tamao,
establecimiento de modelos predictivos basados en expresin de protenas.
La posibilidad de digitalizar el resultado de las inmunotinciones, as como de cuantificar
la expresin de un marcador preciso, abre el camino de un uso ms ambicioso de las
matrices tisulares (MTA).
SNPs
Variaciones naturales de la secuencia entre dos copias del genoma debidas a
sustituciones de una base. Hay actualmente descritos por encima de tres millones en
todo el genoma -SNP Consortium (TSC) & Human Genome Project (HGP)-, con una
densidad mnima de 1 SNP/1.9 kb. De ellos, hay 60.000 SNPs en exones, lo que refleja
una mayor densidad de los mismos en regiones exnicas, ms investigadas, hasta una
densidad de 1 SNIP/1.08 kb. El nmero de polimorfismos existente est en el rango de
10 a 15 millones por individuo.
El anlisis de SNPs permite realizar estudios de gentica de poblaciones, estudio de
genes candidatos para asociacin con enfermedades precisas, anlisis de resistencia a
frmacos, sensibilidad/toxicidad a drogas, as como informar de la predisposicin
individual a contraer enfermedades complejas, multignicas. As, la mejora en las
posibilidades de deteccin masiva de polimorfismos abre el camino a estudios que
relacinen variabilidad gentica con riesgo a formas precisas de cncer y sensibilidad
individual a drogas.

CGH-Arrays
Hay diferentes opciones para arrays de CGH, esencialmente BACs u oligonucletidos.
BACs son cromosomas artificiales humanos conteniendo secuencias de DNA de
longitud variable entre 100 a 200 kb.
Su uso permite el diagnstico preciso de deleciones, duplicaciones, inserciones y
reordenamientos. La disponibilidad de miles de BACs ha permitido el desarrollo de
chips de BACs (CGH-arrays), que permiten detectar duplicaciones y deleciones con
una sensibilidad de 100 Kb. Para ello se realiza hibridacin comparativa entre DNA de
un paciente/DNA sujeto sano, o DNA tumoral/DNA constitucional. Un ejemplo de ello es
la reciente publicacin de un array de BACs especfico para la LLC-B, desarrollado por
Peter Lichter.
Matrices de cDNA (Oncochip) u oligonucletidos
Es un sistema miniaturizado en el que fragmentos de DNA se inmovilizan en soportes
slidos. Desde un punto de vista de longitud de la sonda usada, hay 2 tipos de
microarrays de DNA:

Microarrays de cDNA que presenta sondas de cientos de bases

Arrays de oligonucletidos con sondas de 20-25 bases o 50-80.

Estos chip o microarrays consisten en un soporte slido, por ejemplo un portaobjetos,

sobre el que un robot ha impreso de manera ordenada miles de cDNAs especficos (u
oligonucletidos) representantes de otros tantos genes.
Por analoga con el trmino chip micro-electrnico (dispositivo con una alta densidad de
circuitos electrnicos), en biologa molecular tambin se ha utilizado el trmino de
biochip de expresin para denominar a los arrays de DNA, ya que son dispositivos de
pequeo tamao (chip) en los que se alcanza una gran densidad de material biolgico
(bio) inmovilizado sobre una superficie slida. Un chip puede ser hibridado
simultneamente con dos sondas de cDNA marcadas diferencialmente (por ejemplo
con los fluorocromos Cy3 y Cy5) generadas a partir del RNA mensajero de las
muestras a comparar (por ejemplo, tejido normal versus tejido tumoral), o bien ser
marcado con un nico fluorocromo.
Despus de la hibridacin, y utilizando un scanner, puede medirse para cada spot de
cDNA la intensidad de cada uno de los fluorforos, siendo el nivel de seal detectado
proporcional al nmero de copias de mRNA en la muestra; de modo que el cociente de
la intensidad de fluorescencia (Cy3/Cy5) constituye una medida de la expresin gnica
diferencial relativa al cDNA representado en el chip ("ratios" de expresin).
El alto grado de integracin del array permite, en un solo ensayo, obtener multitud de
valores de expresin gnica relativa para distintas condiciones biolgicas, lo que
convierte a esta tcnica en una herramienta de alto rendimiento para trabajos en el
rea de la genmica funcional. El gran volumen de datos generados debe ser tratado
con herramientas y mtodos bioinformticos.

ANLISIS DE RESULTADOS DE MICROARRAYS

Los datos generados en estos experimentos precisan de anlisis bioinformtico, que
esencialmente pretenden:
Agrupar muestras o genes expresados de forma sincronizada.
Identificar genes cuya expresin se asocia a eventos especficos.
Asignar funcin biolgica a los genes resultado del experimento.
Identificar cambios tiempo-dependientes, ordenados a lo largo del tiempo.
Simplificar series de genes al mnimo nmero de datos posible.
Asignar riesgos especficos derivados de la expresin de genes concretos.
DETECCIN DE PROTENAS COMO MARCADORES SRICOS
Mltiples grupos de investigacin coinciden en el objetivo de identificar marcadores sricos
informativos de riesgo de contraer enfermedades especficas, o adecuados para el
seguimiento de enfermedad residual mnima. La idea no necesita apenas justificacin, el
anlisis de suero es una tcnica mnimamente invasiva, que permite monitorizar con
frecuencia cambios previos al diagnstico clnico o a lo largo de la enfermedad. Resultados
iniciales obtenidos en cncer de ovario, pncreas o prstata alentaron esta lnea de trabajo,
usando SELDI-TOF-MS.
Sin embargo, estos estudios han demostrado una baja reproducibilidad y una elevada tasa de
falsos positivos, lo que prejuzga su uso como tcnica de anlisis rutinario en anlisis de
poblaciones a riesgo de contraer enfermedades especficas.
APLICACIONES EN FARMACOGENMICA
Las matrices de cDNA permiten tambin establecer el llamado perfil genmico de un frmaco,
o firma molecular del mismo, adems de establecer firmas moleculares predictivas de
sensibilidad/resistencia. Aunque desde un punto de vista clnico tiene mayor inters identificar
marcadores iniciales, al diagnstico, de sensibilidad a drogas precisas, alcanzar este objetivo
tropieza con los mecanismos de accin mltiples de la mayora de las drogas en uso, as
como con la existencia de mltiples sistemas redundantes de promocin de la supervivencia
de las clulas neoplsicas. En la prctica, se ha demostrado que los cambios inducidos por
drogas son ms informativos que alteraciones moleculares al diagnstico. Estos cambios
pueden ser analizados in vitro -clulas tumorales expuestas a la accin de drogas precisas- o
in vivo - cambios en el tiempo en clulas leucmicas tras tratamiento-.
De hecho, el tratamiento con un frmaco concreto de una lnea celular especfica permite
identificar el conjunto de genes inducidos en respuesta a ese frmaco. Estos genes muestran
variabilidad en funcin de la droga, estirpe celular, alteraciones gnicas precisas e intervalo de
tiempo transcurrido hasta el anlisis. Su conocimiento permite proponer mecanismos de
accin de una droga precisa.
Uno de los objetivos en anlisis farmacogenmico es la identificacin de pacientes sensibles o
resistentes a drogas concretas. La resistencia a una droga depende de mltiples factores,
incluyendo sobreexpresin de genes de resistenciaa drogas, incremento en la reparacin de
DNA, o alteraciones en la sensibilidad celular a quimioterapia, afectando a mltiples rutas.

Marcadores de resistncia o sensibilidad identificados en modelos experimentales en el

laboratorio o en pacientes aislados pueden perder inters cuando se estudian sobre series
largas de pacientes. Consecuentemente, es preciso analizar la relevancia clnica de los genes
as identificados en series de pacientes tratados de forma randomizada.
Una aplicacin extremadamente relevante de estos estudios es la identificacin de dianas
teraputicas y el anlisis de rutas. Esencialmente, la informacin derivada de estos estudios
brinda la oportunidad de proponer nuevas dianas que, despus de validacin experimental,
permitan el desarrollo de drogas racionalmente dirigidas.
FUTURO EN LA APLICACIN DE TCNICAS DE GENMICA Y PROTEMICA
El alto potencial aplicado a investigacin y diagnstico de estas tcnicas an precisa de
numerosos estudios adicionales, previamente a su aplicacin clnica masiva. Este carcter
novedoso y el alto nivel de complejidad de estos experimentos queda subrayado por el hecho
de que an se publican muchas ms revisiones o comentarios editoriales sobre tcnicas de
genmica y protemica que resultados originales. No obstante, cabe esperar que la aplicacin
clnica de estas tcnicas siga en incremento, cubriendo primero una etapa de identificacin de
marcadores diagnsticos y, posteriormente, propuesta y validacin de dianas teraputicas. El
desarrollo de estas tcnicas de anlisis molecular masivo, al mismo tiempo, est ofreciendo
un reto para el desarrollo de sistemas de anlisis estadstico de mltiples variables y
validacin de datos.