INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

LABORATORIO MTODOS DE ANLISIS
SEPARACIN E IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS DE JUGOS
DE FRUTOS POR CROMATOGRAFIA BIDIMENSIONAL EN CAPA
FINA

PROFESOR: FERNANDO HERNANDEZ DERRAMADERO

ALUMNA: OSORIO QUIROZ NOEMI KARINA
GRUPO: 4IM1

SECCIN 1

FECHA DE ENTREGA: 02/03/2016

FUNDAMENTO:
La cromatografa en capa fina es un caso de cromatografa de reparto en la que
los componentes de una mezcla se separan por diferencia de solubilidad entre dos
sistemas disolventes. Los elementos del sistema cromatogrfico son: soporte, fase
estacionaria (disolvente A), y fase mvil o eluyente (disolvente B). Es una tcnica
simple en cuanto al equipamiento necesario (placa y tanque cromatogrfico) y de
fcil desarrollo. El parmetro experimental asociado a la tcnica es el Rf
(coeficiente de reparto), relacionado con la solubilidad relativa de un compuesto
entre la fase estacionaria y fase mvil, y que depende de su estructura qumica y
su hidrosolubilidad/liposolubilidad. 1
La CCF presenta una serie de ventajas respecto a cromatografas alternativas.
Como es la de pael, tales como las siguientes:
a) Una mayor resolucin, obtenindose por lo general manchas ms
pequeas.
b) Una mayor velocidad de separacin.
c) Pueden utilizarse un gran nmero de materiales como soportes y
disolventes.
d) Los compuestos pueden ser detectados con facilidad y su recuperacin es
muy simple.
La cromatografa unidimensional consiste en colocar en tiras de papel como
soporte de una fase estacionaria acuosa mientras una fase mvil orgnica
desplaza en la tira, gotas de la sustancia a separar se agregan cerca del punto
donde partir el desplazamiento de la fase orgnica.
Por otra parte, la cromatografa bidimensional es una variante de considerable
poder de separacin, ya que se emplean dos diferentes solventes aplicados
secuencialmente para desplazar a un solo compuesto. La gota del compuesto
(generalmente un cido o un pptido) se revela con una mancha en papel, el
material usado como revelador es usualmente la ninhidrina.

OBJETIVOS:

Separar los aminocidos presentes en jugo de frutos por cromatografa

bidimensional en capa fina.
Identificar los aminocidos separados por comparacin de sus valores de
Rf con los de soluciones tipo de aminocidos.
Comparar el grado de resolucin de la cromatografa bidimensional, con el
de la unidimensional.

RESULTADOS:
1. Clculo de los valores de Rf
Rf =

Frente o distanciadel soluto

Frente o distanciadel disolvente

Ejemplo para el clculo de Rf para la primera fase mvil mancha 1

Rf= 3.9/7.9= 0.1159

a) Determinar los valores de Rf de cada aminocido en los cromatogramas

unidimensionales y enlistarlos en orden creciente de Rf en la primera fase
mvil, como se indica en la tabla 1.
Tabla1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases mviles
Aminocid
o
Lys
Glu
Gly
Pro
Arg
Thr
His
Tir
Phe
Met

1 fase mvil
Frente del
soluto
1.3
2.65
2.85
3.15
3.9
3.9
3.8
4.3
5.15
5.1

Frente del
disolvente
7.6
7.7
7.6
7.7
7.9
7.9
7.6
7.65
7.8
7.6

2 fase mvil
Rf
0.1711
0.3442
0.3750
0.4091
0.4937
0.4937
0.500
0.5621
0.6603
0.6711

Frente del
soluto
0.7
2.8
2.3
2.25
1
2.9
0.8
4.8
5.2
4.3

Frente del
disolvente
8.10
8.20
8.25
8.10
8.10
8.20
8.20
8.10
8.25
8.20

Rf
0.0864
0.3414
0.2787
0.2777
0.1234
0.3536
0.0975
0.5925
0.6303
0.5243

b) Determinar los valores de Rf de cada mancha del cromatograma

bidimensional tipo y enlistarlos en orden creciente de Rf en la primera fase
mvil, como se indican en la tabla 2, e identificar, por comparacin con los
valores de Rf de los cromatogramas unidimensionales, a que aminocido
corresponde cada mancha.
Tabla2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollados en las 2 fases mviles
No de
mancha

1
2
3
4
5
6
7

1 fase mvil
Frente
del
soluto
1.3
1.5
2.25
2.7
2.9
3.4
3.6

2 fase mvil

Aminocido
correspondient
e

Frente del
disolvente

Rf

Frente
del soluto

Frente del
disolvente

Rf

8.0
8.0
8.0
8.0
8.05
8.0
8.0

0.1625
0.1875
0.2813
0.3375
0.36025
0.4256
0.45

1.2
0.95
2.3
2.65
2.85
3.4
3.6

7.95
7.9
8
8
8.05
8
8

0.1203
0.1509
0.2875
0.3313
0.354
0.425
0.45

Lys
Arg
Pro
Glu
Gly
Thr
His

8
9
10

4.6
4.7
5.25

8.0
8.0
8.05

0.575
0.5875
0.6522

3.95
4.6
5

7.95
7.95
8

0.4969
0.5786
0.625

Tir
Phe
Met

c) Determinar los Rf de las manchas del cormatograma bidimensional problema,

acomodar en orden creciente de Rf en la primera fase mvil como se indica
en la tabla 3, comparar con los Rf del cromatograma bidimensional tipo e
identificar los aminocidos que contiene la muestra problema.
Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases mviles.
No de
mancha
1
2
3
4
5
6
7
8
9

1 fase mvil
Frente del
soluto
0.85
1.95
2.1
2.4
3.2
3.65
3.75
4.6
4.9

2 fase mvil
Frente del
disolvente
8.05
8.05
8.1
8.1
8.1
8.1
8.1
8.15
8.15

Rf
0.1056
0.2422
0.2593
0.2963
0.3951
0.4506
0.4630
0.5644
0.6012

Frente del
soluto
1.1
1.9
2.5
2.7
2.05
2.1
2.9
4.4
5.4

Frente del
disolvente
8.1
7.9
7.9
7.9
7.9
7.9
7.9
8.05
8.05

Rf
0.1358
0.2405
0.3164
0.3417
0.2594
0.2658
0.3670
0.5465
0.6708

d) Comparar los resultados de la tabla 3. Con los de la tabla 2para construir la

tabla 4. Numerando las manchas en orden creciente de Rf en la primera fase
mvil. Indique cul fue su muestra y qu aminocidos contiene.
Tabla 4. Cromatograma bidimensional de jugo de sanda desarrollado en las 2 fases mviles.
No. De mancha

Rf creciente en la 1a
fase mvil

Rf en la 2a fase
mvil

Aminocido
correspondiente
1
0.1056
0.13580
Lys
2
Arg
0.2422
0.24051
3
0.2593
0.31646
Pro
4
0.2963
0.34177
Glu
5
0.3951
0.25949
Thr
6
0.4506
0.26582
His
7
Tir
0.4630
0.36709
8
Phe
0.5644
0.54658
9
Met
0.6012
0.67081
En esta tabla mediante la relacin de Rf del cormatograma III en las dos fases mviles pudimos
establecer una serie de los posibles aminocidos presentes en el jugo de sanda.

Preguntas Extra:
1. Investigar en la literatura los aminocidos que contienen el jugo empleado
como problema: Jugo de sanda
A continuacin, se muestran la cantidad de aminocidos de la sanda, uno de
los alimentos pertenecientes a la categora de las frutas frescas:
Nutriente

Cantidad

cido asprtico

39 mg.

cido glutmico
Alanina
Arginina
Cistina

Nutriente
Leucina

18 mg.

63 mg.

Lisina

62 mg.

17 mg.

Metionina

59 mg.

Prolina

24 mg.

2 mg.

Serina

16 mg.

Tirosina

12 mg.

Treonina

27 mg.

Fenilalanina

15 mg.

Glicina

10 mg.

Hidroxiprolina

0 mg.

Triptofano

Histidina

6 mg.

Valina

Isoleucina

Cantidad

6 mg.

7 mg.
16 mg.

19 mg.

Imagen tomada de referencia 2.

Haciendo comparaciones de la tabla consultado en la literatura y la de nuestros

resultados se puede observar que la sanda contiene ms de los 10 aminocidos
que se utilizaron en la realizacin de la prctica as que puede haber manchas que
pertenezcan a otro aminocido ya que la sanda contiene 18 aminocidos de los
20 aminocidos primarios.
2. Escriba la reaccin completa y con nombres, de la ninhidrina con un
aminocido

3. Es posible cambiar el orden de las fases mviles? Explique sus respuesta

Si, puesto que dos de los cuatro cromatogramas son unidimensionales son
unidimensionales, los otros dos restantes, son bidireccionales en los cuales
corren horizontalmente con una fase mvil y despus verticalmente con otra
fase; es decir, no importara por cual fase se comenzara debido a que se
obtendra el mismo resultado.
4. Indique las posibles fuentes de error de esta tcnica 3
Incorrecta eleccin de fases mviles.
No usar guantes.
Que los aminocidos tipo estn degradados o contaminados.
Incorrectas proporciones de fases mviles, ya que esto puede
modificar su polaridad.
No neutralizar de manera correcta, puesto que la migracin que
necesitamos es la de su polaridad no la de su carga.
Contaminacin entre cromatoplacas.
DISCUSIN:
Por medio de cromatografa en capa fina se puede llevar a cabo la separacin de
una mezcla o solutos, en este caso de los aminocidos en jugo de sanda, es
importante destacar que el jugo de sanda contiene 18 de los 20 aminocidos
esenciales, por lo tanto la cromatografa unidimensional en capa fina no sera de
gran utilidad ya que no separara todos los aminocidos que contiene ese jugo, es
decir, en una mancha existira ms de un aminocido, y una buena tcnica para
obtener una mejor separacin es cromatografa bidimensional.

En la imagen se puede
observar algunos valores
estndar de Rf de los
aminocidos en varios
disolventes

Imagen 1. Tabla de valores de Rf de los aminocidos en varios disolventes 5

En base a nuestros resultados obtenidos, se deduce que la cromatografa

bidimensional en capa fina es una mejor tcnica de separacin ya que en esta se
utilizan dos fases mviles las cuales son distintas, en este caso el cloroformometanol-amoniaco es una fase mvil alcalina mientras que el butanol-cido
actico-amonaco es cida. Esto debido a que influyen muchos factores para que
se lleve a cabo una buena separacin como la afinidad, el peso molecular o
tamao o el grupo R. Los aminocidos se clasifican segn la naturaleza del
grupo R esta clasificacin es:
o
o
o
o

No polar, hidrofbico
Polar sin carga (pH 7)
Cargado negativamente (pH 7)
Cargado positivamente (pH 7.0)

Esto significa que los aminocidos con grandes cadenas laterales no polares (Leu,
Ile, Fenala, Trp, Val, Met, Tir) migran ms que aquellos con cadenas laterales ms
cortas no polares (Pro, Ala, Gli) o con cadenas laterales polares (Thr, Glu, Ser,
Arg, Asp, His, Lis, Cis). Esto refleja la mayor solubilidad relativa de las molculas
polares en la fase estacionaria hidroflica, y de las molculas no polares en
solventes orgnicos.
Por otra parte se llev a cabo el revelado con ninhidrina ya que esta reacciona con
cualquier aminocido libre y que adems es un reactivo de color morado que
permite una mejor visualizacin de las manchas. Todo eso permiti observar
buenos resultados en nuestros cromatogramas unidimensionales (I y II) ya que
las manchas de los aminocidos se vean bien definidas y separadas, cada
aminocido tipo corri en el carril que le corresponda y lo mismo sucedi con el

cromatograma III, se separaron perfectamente porque se obtuvieron 10 manchas

el mismo nmero de aminocidos tipo, aunque en el cromatograma IV en donde
se encontraba nuestro jugo de sanda se obtuvieron 9 manchas de las cuales
algunas eran de mayor concentracin, esto debido a que no hubo una separacin
de todos los aminocidos, como ya se haba mencionado anteriormente el jugo de
sanda contena ms de 10 aminocidos y algunos aminocidos pudieron haber
corrido la misma distancia y es por eso que no se observaron ms manchas y no
hubo una perfecta separacin, aunque se tuvo una relacin de los aminocidos
que contena el jugo respecto a los aminocidos problema.

CONCLUSIN
Finalmente se alcanzan todos los objetivos ya que se pudo separar e identificar la
mayor parte aminocidos de nuestro jugo de sanda por cromatografa
bidimensional en capa fina y a los valores R f con las soluciones tipo de
aminocidos, se corrobora que esta tcnica tiene un mayor grado de resolucin a
comparacin con la tcnica de cromatografa unidimensional.

REFERENCIAS:
1. http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/11%20CROMATOGRAF%C3%8DA
%20DE%20CAPA%20FINA%20DE%20AAs.pdf
2. http://alimentos.org.es/aminoacidos-sandia
3. Anlisis qumico cuantitativo, Harris Daniel C., 3 edicin, editorial Revert. Pag 302
4. http://acemucsc.galeon.com/articulos/Bioquimica/aminoacidos.htm
5. https://books.google.com.mx/books?
id=htRP2dHJkXgC&pg=PA344&lpg=PA344&dq=tabla+de+rf+de+aminoacidos&source=bl&
ots=zoOn-851vU&sig=TXpFstspkkQV8sWgXkytlcfSg98&hl=es419&sa=X&ved=0ahUKEwiY1MCTpZ7LAhXktYMKHUAZBRwQ6AEIMzAG#v=onepage&q=
tabla%20de%20rf%20de%20aminoacidos&f=false