TINCIN DIFERENCIAL DE

GRAM

La tincin propuesta por el mdico

dans Christian Gram en 1884, es una
de las tinciones diferenciales ms
utilizadas en bacteriologa, clasifica
los cultivos bacterianos de menos de
24 horas en gram positivas y gram
negativas.

Christian Gram

La reaccin de la tincin de gram se

basa en la cantidad de peptidoglucano
que se encuentra en las paredes
celulares de las bacterias.

Las bacterias gram positivas tienen muchas capas de

peptidoglucano, las cuales sostienen molculas de
cido teicoico, este reacciona con el cristal violeta y el
yodo utilizado en este proceso de tincin. Un
complejo de las molculas cristal violeta-yodo-cido
teicoico es muy difcil de remover. Como la pared
celular de las clulas gram positivas retiene estos
compuestos, es ms difcil decolorar una clula gram
positiva que una gram negativa. Una mezcla de
alcohol remueve el cristal violeta de la clula gram
negativa, pero no de la gram positiva.

Una mezcla de alcohol remueve el cristal violeta de la

clula gram negativa, pero no de la gram positiva.
Esta mezcla de alcohol tambin disuelve mucho de la
capa exterior de lipopolosacrido de la pared celular
de la pared gram negativa, lo cual acelera la remocin
del colorante primario cristal violeta de estas clulas.

Cuando otro colorante, usualmente safranina, se

aade, las clulas Gram positivas siguen de color
azul-violeta mientras que las Gram negativas
absorben el color rojizo de la safranina. Al final del
procedimiento de tincin, las clulas Gram positivas
sern del color del cristal violeta, o colorante
primario, y las clulas Gram negativas sern del color
de la safranina que es el colorante de contraste.

Bacteriologa:
Estudio
de
las
enfermedades que stas provocan.

bacterias

Las bacterias: son seres microscpicos estudiadas

mediante microscopios pticos en preparaciones
teidas o sin teir (en fresco) para estudiar su
estructura o morfologa, pero para estudiar su
estructura interna se necesita un microscopio
electrnico.

ESTRUCTURA DE SUPERFICIE Y DE CUBIERTA

Cpsula: Es una capa gelatinomucosa de tamao y
composicin variables que juega un papel importante
en las bacterias patgenas.
Cilios, o flagelos: Filamentosos y de longitud
variable, constituyen rganos de locomocin.

Pared celular: Poseen la mayora de las bacterias

explica la constancia de su forma. En efecto, es rgida,
dctil y elstica. Su originalidad reside en la
naturaleza qumica del compuesto macromolecular
que le confiere su rigidez. Este compuesto, un
mucopptido, est formado por cadenas de
acetilglucosamina y de cido murmico sobre las que
se fijan tetrapptidos de composicin variable. Las
cadenas estn unidas por puentes peptdicos.
Adems, existen constituyentes propios de las
diferentes especies de la superficie.

La diferencia de composicin bioqumica de las

paredes de dos grupos de bacterias es la que
distinguen a las bacterias en gram positivas y gram
negativas.
Se conocen actualmente los mecanismos de la sntesis
de la pared. Ciertos antibiticos pueden bloquearla.
La destruccin de la pared provoca una fragilidad en
la bacteria que toma una forma esfrica (protoplasto)
y estalla en medio hipertnico (solucin salina con
una concentracin de 7 g. de NaCI por litro).

Membrana citoplasmtica: Situada debajo de la

pared, tiene permeabilidad selectiva frente a las
sustancias que entran y salen de la bacteria. Es
soporte de numerosas enzimas, en particular las
respiratorias. Por ltimo, tiene un papel fundamental
en la divisin del ncleo bacteriano. Los mesosomas,
repliegues de la membrana, tienen una gran
importancia en esta etapa de la vida bacteriana.

ESTRUCTURAS INTERNAS.
El ncleo: Lleva el material gentico de la
bacteria; est formado por un nico filamento de
cido desoxirribonucleico (ADN) apelotonado y
que mide cerca de 1 mm de longitud (1000 veces
el tamao de la bacteria).

Ribosomas: Son elementos granulosos que se

hallan contenidos en el citoplasma bacteriano;
esencialmente compuestos por cido ribonucleico,
desempean un papel principal en la sntesis
proteica.
Citoplasma: Contiene inclusiones de reserva

FUNDAMENTO
Se basan en las diferencias entre las paredes celulares
de las bacterias Gram positivas y Gram negativas.
La pared celular de las bacterias Gram positivas
posee una gruesa capa de peptidoglucano, adems de
dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms
en la superficie, el cido teicoico que est anclado
solamente en el peptidoglucano (murena).

FUNDAMENTO
La capa de peptidoglucano de las Gram negativas es
delgada, y se encuentra unida a una segunda
membrana plasmtica exterior (de composicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a
una membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido
y lipopolisacrido.

FUNDAMENTO
Ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente
debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
La clave es el peptidoglicano, ya que es el material
que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y
las Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas.

FUNDAMENTO
La diferencia que se observa en la resistencia a la
decoloracin, se debe a que la membrana externa de
las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La
capa de peptidoglucano que posee es demasiado
delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por
lo tanto este complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea.

FUNDAMENTO
Por el contrario, las Gram positivas, al poseer una
pared celular ms resistente y con mayor proporcin
de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin
del solvente orgnico, sino que este acta
deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide
que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo,
y manteniendo la coloracin azul-violcea.

Bacterias resistentes a la tincin Gram

La siguientes bacterias de naturaleza grampositiva,
tien como gramnegativas:

Mycobacterias (estn encapsuladas).

Mycoplasmas (no tienen pared).
Formas L (prdida ocasional de la pared).
Protoplastos y esferoplastos (eliminacin total y
parcial de la pared, respectivamente).

Utilidades
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un
estudio fundamental por cumplir varias funciones:

Identificacin preliminar de la bacteria causal de la

infeccin.
Utilidad como control calidad del aislamiento
bacteriano.

Cocos Gram-positivos:
Racimos: forma tpica de Staphylococcus sp, como S.
aureus.

Cocos Gram-positivos:
Cadenas: forma tpica de Streptococcus sp, como S.
pneumoniae, Streptococcus grupo B

Cocos Gram-positivos:
Ttradas: forma tpica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-positivos:
Gruesos: forma tpica de Clostridium sp, como C.
perfringens, C. septicum.

Bacilos Gram-positivos:
Finos: forma tpica de Listeria sp.

Bacilos Gram-positivos:
Ramificados: forma tpica de Actinomycetes y Nocardia,
como A. israelii

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocos Gram-negativos:
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N.
meningitidis. Tambin Moraxella sp y Acinetobacter
sp. Acinetobacter puede ser pleomrfico, y a veces
aparece como coco Gram-positivo.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que
puede ser Gram-positivo o Gram-negativo, y, a
menudo, Gram-variable.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Bacilos Gram-negativos
Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae,
como E. Coli

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Cocobacilos: forma usual de Haemophilus sp, como
H. influenzae.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V.
cholerae, y Campylobacter sp, como C. jejuni.

Tincin GRAM: Bacterias Gram-Negativas

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium
sp

Causas que alteran la tincin de Gram

Edad de la bacteria.
Errores del operador.
Uso de antibiticos

Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa
bacteriolgica y esperar que enfre un poco.

Tomar el asa y con sta tomar un poco de muestra.

Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina

portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la
muestra en el portaobjetos mediante movimientos
giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de
tal forma que al terminar la extensin, tengamos
como producto una espiral en la parte media de la
lmina.

Esperar que seque. Tambin se puede fijar la muestra

con alcohol metlico.

Tincin:
Cubrir con violeta cristal. Se deja actuar al colorante
por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para
trabajar a una temperatura ambiente de 25 C.

Enjuague:
Al transcurrir el minuto, enjuagar la lmina
conteniendo la muestra con agua corriente. La
solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1%.

Mordiente:
Una vez enjuagado, aplicar como mordiente yodo o
lugol durante 1 minuto ms. El mordiente es
cualquier sustancia que forme compuestos insolubles
con colorantes y determine su fijacin a las bacterias.

Decoloracin:
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el
frotis se decolora con alcohol-acetona, hasta que ya no
escurra ms lquido azul.

Lavado y secado:
Lavar con agua para quitar los residuos de
decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre
o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma
anteriormente descrita.

Tincin de contraste:
Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir
nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un
colorante de contraste como por ejemplo la safranina,
dejar actuar durante 1 minuto.

Nuevo enjuague:
Pasado el minuto correspondiente, se
procede a enjuagar la lmina con agua,
se escurre el agua sobrante y se seca en
la forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el
frotis para su respectiva observacin
microscpica.

Observar al microscopio:
Con aceite de inmersin a 100 X.