Nama

: Ni Made Niagita Wiratni

NIM

: P07134014019

Pemeriksaan Treponema pallidum Hemaglutination Assay

(TPHA)
Tanggal praktikum
Tempat

: 14 September 2016
:Laboratorium

Imunoserologi
I. TUJUAN :
Untuk mengetahui adanya antibody spesifik terhadap Treponema pallidum dalam
serum/plasma secara kualitatif dan semikuantitatif berdasarkan reaksi aglutinasi
II. PRINSIP :
Berdasarkan reaksi aglutinasi anatara sel darah merah (eritrosit) burung angsa yang
dilekati dengan komponen Treponema pallidum sebagai antigen dengan serum atau
plasma pasien sebagai antibody.
III. METODE :
Hemaglutinasi langsung
IV. DASAR TEORI :
Sifilis adalah penyakit menular seksual yang ditularkan melalui kontak langsung
dari hubungan seksual atau dari seorang ibu hamil yang kemudian dapat menginfeksi
janinnya. Penyakit ini disebabkan oleh Treponema pallidum, yaitu bakteri yang
diklasifikasikan dalam filum Spirochaets, ordo Spirochaetales, dan famili
Spirochaetaceae. Klasifikasi treponema patogen didasarkan pada manifestasi klinis
yang ditimbulkan dari penyakit masing-masing. Treponema pallidum subsp pallidum

menyebabkan sifilis kelamin, T pallidum subsp pertenue menyebabkan frambusia, T

pallidum subspesies endemicum menyebabkan sifilis endemik dan T caratium
menyebabkan pinta.
Pada pasien sifilis stadium primer akan terdapat lesi pada kelamin saluran
kencing, kemudian lesi tersebut akan semakin meluas dan melebar, hal ini sudah
sudah memasuki tahap sekunder, apabila tidak diobati maka akan mengakibatkan
masalah pada jantung dan neurologis yang disebut dengan tahap tersier. Pada infeksi
selama kehamilan (sifilis kongenital) dapat mengakibatkan kematian pada janin atau
cacat lahir.
Pemeriksaan serologi merupakan parameter pengujian laboratorium yang sangat
diandalkan dalam mendignosis sifilis. Prinsip penting dari serologi sifilis adalah
mendeteksi antibodi treponema dengan tes skrining, kemudian dilanjutkan dengan tes
konfirmasi. Tes konfirmasi idealnya harus memiliki kepekaan setara dan spesifisitas
lebih besar dari tes skrining, sehingga dapat mengurangi kemungkinan reaksi positif
palsu (Manju Bala,dkk.2012).
Tes TPHA adalah uji treponemal untuk konfirmasi serologis sifilis, yang
mendeteksi secara spesifik adanya antibody terhadap Treponema pallidum dalam
sampel serum atau plasma. Namun pemeriksaan ini belum dapat dapat dilakukan di
semua laboratorium. Pasien yang positif pada pemeriksaan nontreponemal akan
segera diberikan antibiotik tertentu, sesuai dengan pedoman nasional untuk
menghindari bahaya lebih lanjut dari penyakit tersebut (Islay Rodrguez,dkk.2015).
V.

ALAT DAN BAHAN

a. alat
1. Mikropipet
2. Yellow tip
3. Mikroplate
b.
1.
2.
3.
4.

bahan :
Sampel : serum
Reagen diluent
Reagen test cell
Reagen control cell

5. Control positif
6. Control negatif
VI. CARA KERJA
A. Uji Kualitatif
Pengenceran diluent
1. Semua alat dan bahan pemeriksaan disiapkan dan dikondisikan pada
suhu ruang
2. Mikroplate diletakkan pada meja yang datar dan kering
3. Reagen diluent dimasukkan sebanyak 190L dengan mikropipet ke
dalam sumur 1 mikroplate
4. Sampel serum/plasma ditambahkan sebanyak 10L dengan mikropipet
ke dalam sumur tersebut
5. Campuran dihomogenkan
6. Dibuat control positif dan negative
Test
1. Pada sumur 1 dipipet sebanyak 25L dan tambahkan pada sumur 2
dan 3
2. Pada sumur 4 dan 5 ditambahkan dengan control positif dan negative
masing-masing 25L.
3. Pada sumur 2 ditambahkan dengan control cell sebanyak 75L
kemudian dihomogenkan.
4. Pada sumur 3,4 dan 5 ditambahkan dengan test cell sebanyak 75 L
kemudian dihomogenkan.
5. Sumur diinkubasi pada suhu ruang selama 45-60 menit.
6. Amati adanya hemaglutinasi yang terjadi.
Interpretasi hasil
Positif (+)

: adanya hemaglutinasi sel

Negatif (-)

: adanya pengendapan sel pada dasar sumur berupa titik merah.

B. Uji Kualitatif
Pengenceran diluent

1.

Semua alat dan bahan pemeriksaan disiapkan dan dikondisikan

2.
3.

pada suhu ruang

Mikroplate diletakkan pada meja yang datar dan kering
Reagen diluent dimasukkan sebanyak 190L dengan mikropipet ke

dalam sumur
Mikroplate
4. Sampel serum/plasma ditambahkan sebanyak 10L dengan mikropipet
ke dalam sumur tersebut
5. Campuran dihomogenkan
Test
1. Disiapkan 8 sumur dan beri label
2. Pada sumur 1 dikosongkan dan pada sumur 2-8 ditambahkan dengan
diluent 25L
3. Ditambahkan campuran specimen sebanyak 25L pada sumur 1 dan 2
4. Dihomogenkan campuran tersebut kemudian pada sumur 2 dipipet 25
L dan pindahkan pada sumur 3, kemudian dari sumur 3 dipipet 25 L
dan dipindahkan ke sumur 4, dan seterusnya hingga sumur 8 kemudian
dibuang 25 L.
5. Test cell ditambahkan pada semua sumur sebanyak 75L dan
dihomogenkan.
6. Sumur diinkubasi pada suhu ruang selama 45-60 menit
7. Amati hemaglutinasi yang terjadi dan tentukan titernya.
Interpretasi hasil
Positif (+) : adanya hemaglutinasi sel
Negatif (-)

: adanya pengendapan sel pada dasar sumur berupa titik

merah.
Sumur

Titer antibody

1
2
3
4
5
6
7
8
VII.

1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
1/2560
1/5120
1/10240

HASIL PENGAMATAN
Pada praktikum pemeriksaan TPHA yang telah dilakukan dengan
metode hemaglutinasi pada sampel serum dengan kode 090 diperoleh hasil
sebagai berikut :
A. Uji Kualitatif
Negative (-)
Hasil pemeriksaan

pada

uji

kualitatif

adalah

tidak

adanya

hemaglutinasi sel terbentuk pada dasar sumur

B. Uji Semi kuantitatif
Negative (-)
Hasil pemeriksaan pada uji kualitatif adalah

tidak

adanya

hemaglutinasi sel terbentuk pada dasar sumur

Gambar Pemeriksaan
Gambar

Keterangan

Sampel

serum

yang

diperiksa

Mikroplate yang digunakan

untuk pemeriksaan

Reagen-reagen
digunakan

yaitu

yang
control

cell, dilution, test cell,

control positif dan control
negative.

Hasil yang diperoleh pada

sumur

menunjukkan

adanya endapan pada dasar

sumur seperti titik.

VIII. PEMBAHASAN
Pemeriksaan Treponema pallidum Hemaglutination Assay (TPHA) adalah
pemeriksaan yang dilakukan untuk mengetahui adanya antibody spesifik terhadap
Treponema pallidum dalam serum/plasma dalam diagnosis penyakit sifilis. Sifilis
merupakan penyakit yang ditularkan melalui kontak langsung dari hubungan seksual
atau dari seorang ibu hamil yang kemudian dapat menginfeksi janinnya. Penyakit ini
disebabkan oleh bakteri Treponema pallidum. Antigen yang digunakan dalam tes ini
adalah sel darah merah (eritrosit) dari burung angsa. Tes ini juga diklasifikasikan
sebagai pemeriksaan spesifik atau treponemal.
Pemeriksaan serologis Treponema palidum dibagi menjadi 2, yaitu pemeriksaan
non treponema

dan pemeriksaan. Pemeriksaan non treponema yaitu uji yang

dilakukan dengan menggunakan suspensi dari jaringan yang telah terinfeksi oleh
Bakteri Treponema palidum sebelumnya. Sementara untuk uji Treponama yaitu uji
yang menggunakan suspense langsung bakteri Treponema plidum. Pada praktikum
kali ini dilakukan pemeriksaan treponemal test yaitu Treponema pallidum
Hemaglutination Assay (TPHA).
Prinsip dari pemeriksaan ini adalah Berdasarkan reaksi aglutinasi anatara sel
darah merah (eritrosit) burung angsa yang dilekati dengan komponen Treponema
pallidum sebagai antigen dengan serum atau plasma pasien sebagai antibody. Metode
pemeriksaan yang dilakukan adalah hemaglutinasi langsung.
Pada proses pemeriksaan, hal yang petama dilakukan adalah preparasi sampel.
Sampel yang dapat digunakan adalah serum atau plasma. Pada praktikum kali ini

sampel yang diperiksa adalah sampel serum darah probandus dengan kode 090.
Serum adalah cairan bening yang memisah setelah darah membeku. Pada serum tidak
terdapat faktor pembentukan fibrinogen, sedangkan pada plasma terdapat factor
fibrinogen, namun hal ini tidak mempengaruhi pemeriksaan. Jika darah tetap
dibiarkan selama 15 menit pada suhu kamar dalam suatu tabung tanpa antikoagulan
maka serum dan komponen darah lainnya akan memisah (Salih Hosoglu, 2013).
Namun pada saat praktikum untuk memdapatkan serum yang terpisah sempurna
dengan komponen lainnya, dilakukan sentrifuge setelah sampel darah yang telah
diambil dengan tabung berwarna merah (tanpa antikoagulan) didiamkan pada suhu
ruang hingga serum dan komponen darah lainnya terpisah. Sentrifuge dilakukan pada
kecepatan 1500 rpm selama 15 menit. Setelah dilakukan sentrifuge, serum
dipindahkan ke tabung effendorf dan disimpan pada suhu 2-80 C.
Setelah dilakukan preparasi sampel, selanjutnya dilakukan pemeriksaan pada
sampel serum tersebut dengan menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan serta
menggunakan alat pelindung diri (APD) lengkap untuk menghindari terjadinya
kecelakaan/bahaya saat melakukan pemeriksaan. Dalam melakukan pemeriksaan
TPHA ini terdapat uji kualitatif dan uji semi kuantitatif. Sebelum itu, harus dibuat
terlebih dahulu pengenceran dilution dengan cara memipet dilution sebanyak 190L
ke dalam satu sumur kemudian ditambahkan dengan sampel serum sebanyak 10L
dan dihomogenkan, selain itu perlu dibuat control positif dan negative. Kegunaan dari
adanya control positif dan negative adalah untuk memastikan kualitas dari reagen
yang digunakan sehingga pemeriksaan yang dilakukan dapat dipertanggung jawabkan
hasilnya.
Kemudian dilanjutkan dengan tahap test pada uji kualitatif yaitu dengan cara
memipet campuran diluent dengan sampel tersebut sebanyak 25 L dan dimasukkan
pada sumur 2 dan 3, kemudian pada sumur 2 ditambahkan dengan test cell sebanyak
75 L sedangkan pada sumur 3 ditambahkan dengan control cell sebanyak 75 L
kemudian dihomogenkan. Untuk control positif dan negative ditambahkan dengan
test cell sebanyak 75 L. kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 45-60 menit,

dan amati hemaglutinasi sel yang terjadi. Apabila hasil positif akan menunjukkan
adanya hemaglutinasi sel yang menyebar secara merata pada sumur, sedangkan
apabila hasil negative maka akan menujukkan adanya endapan pada dasar sumur
seperti titik.
Hasil yang diperoleh pada uji kualitatif adalah negative (-), hal ini ditandai
dengan adanya endapan pada dasar tabung seperti titik. Sedangkan hasil pada control
sudah menunjukkan hasil yang sesuai. Maka hasil tersebut dapat dipastikan
kebenarannya. Apabila diperoleh hasil negative maka pemeriksaan tidak dilanjutkan
pada uji semi kuantitatif, namun karena kami dalam proses praktikum maka tetap
dilanjutkan pada uji semi kuantitatif.
Pada uji semi kuantitatif, disiapkan 8 sumur dan beri label pada sumur tersebut.
Kemudian pada sumur 1 dikosongkan dan pada sumur 2-8 ditambahkan dengan
diluent 25L, pada sumur 1 dan 2 ditambahkan dengan campuran specimen sebanyak
25L kemudian dihomogenkan campuran tersebut dan pada sumur 2 dipipet 25 L
dan pindahkan pada sumur 3, kemudian dari sumur 3 dipipet 25 L dan dipindahkan
ke sumur 4, dan seterusnya hingga sumur 8 kemudian dibuang 25 L. pada semua
sumur ditambahkan test cell sebanyak 75L dan dihomogenkan. Sumur diinkubasi
pada suhu ruang selama 45-60 menit dan amati hemaglutinasi yang terjadi dan
tentukan titernya.
Untuk menentukan titer antibody pada uji semi kuantitatif adalah dengan cara
mengamati pada seluruh sumur yang terdapat hemaglutinasi sel, apabila
hemaglutinasi terhenti pada sumur 1 maka titer antibody terhadap Treponema
pallidum ialah 1/80, dan apabila terhenti pada sumur 2 maka titer antibodinya ialah
1/160, dan seterusnya. Apabila pada orang yang sehat, hasilnya akan negatif. Ini
berarti bahwa tidak ada antibodi terhadap organisme yang disebabkan oleh
Treponema pallidum. Sebagai antigen yang digunakan dalam tes nontreponemal
adalah komponen eritrosit dari unggas atau burung angsa (

IX. SIMPULAN
1. Pemeriksaan Treponema pallidum Hemaglutination Assay (TPHA) adalah
pemeriksaan yang dilakukan untuk mengetahui adanya antibody spesifik
terhadap Treponema pallidum dalam serum/plasma dalam diagnosis penyakit
sifilis
2. Pada hasil praktikum pemeriksaan TPHA pada sampel serum dengan kode
090 diperoleh hasil negative ( - )

DAFTAR PUSTAKA
Anurag Adhikari,2015.Evaluation of sensitivity and specificity of ELISA against
Widal test for typhoid diagnosis in endemic population of Kathmandu.
(online)tersedia:.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4647669/?report=classic. .
[diakses 20 maret 2016 15:12 wita]
Benedikt Ley. 2010. Evaluation of the Widal tube agglutination test for the diagnosis
of typhoid fever among children admitted to a rural hdospital in Tanzania
and

comparison

with

previous

studies.

(online)tersedia:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2898821/?report=classic.
[diakses 21 maret 2016 17:14 wita]
Gizachew Andualem .2014. A comparative study of Widal test with blood culture in
the diagnosis of typhoid fever in febrile patients. (online)tersedia:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4177418/?report=classic. .
[diakses 20 maret 2016 15:12 wita]
L. Olopoenia. 2000. Widal agglutination test 100 years later: still plagued by
controversy.
(online)tersedia:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1741491/?
report=classic. . [diakses 20 maret 2016 20:12 wita]
Ralte Lalremruata. 2014. Retrospective Audit of the Widal Test for Diagnosis of
Typhoid

Fever

in

Pediatric

Patients

in

an

Endemic

Region.

(online)tersedia:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4079999/?
report=classic. . [diakses 21 maret 2016 17:19 wita]
Wafaa MK Bakr, dkk. 2011.The dilemma of widal test - which brand to use? a study
of four different widal brands: a cross sectional comparative study.
(online)tersedia:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3050682/?
report=classic. [diakses 20 maret 2016 17:12 wita]

(Manju Bala,dkk.2012. Evaluation of the usefulness of Treponema pallidum

hemagglutination test in the diagnosis of syphilis in weak reactive Venereal Disease
Research

Laboratory

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505284/

sera(online).tersedia:

(Islay Rodrguez,dkk.2015. Considerations on the use and interpretation of

Treponema

pallidum

hemagglutination

test

for

diagnosis

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4660574/)

of

syphilis.