J.pascapanen.2005!2!1 Libre
J.pascapanen.2005!2!1 Libre
Stabilitas
Panas 2Enzim
PDC: 1-7
dari Bakteri Termofil Penghasil Etanol
J.Pascapanen
(2) 2005
Penggunaan bakteri termofil telah menarik banyak pihak, terutama dalam sistem produksi bahan bakar alternatif seperti
bioetanol. Keuntungan pemakaian bioetanol adalah dapat menurunkan tingkat polusi dan pemanasan global karena hasil
pembakaran etanol tidak memberikan tambahan netto CO2 pada lingkungan. Satu isolat bakteri termofilik unggul telah
diisolasi dari sampel kompos yang menunjukkan kemampuan untuk memproduksi etanol. Hasil identifikasi dengan sekuensing
16S rRNA menunjukkan isolat ini diklasifikasikan sebagai Geobacillus thermoleovorans, bakteri gram positif berbentuk
batang yang mampu tumbuh pada kisaran substrat yang luas, dengan suhu optimum pertumbuhan 60oC dan bersifat fakultatif
anaerob. Isolat tersebut juga menunjukkan aktivitas enzim Pyruvate decarboxylase (PDC), enzim kunci dalam produksi
etanol. Hasil pengukuran aktivitas pada suhu 25, 40 dan 60oC yang menunjukkan stabilitas yang tinggi terhadap pemanasan
dengan meningkatnya aktivitasnya setelah dilakukan pemanasan pada suhu 60 oC dibandingkan dengan PDC dari Zymomonas
mobilis yang kehilangan aktivitasnya secara total. Komponen lain dalam asay enzim sensitif terhadap panas sehingga
pengukuran aktivitas hanya bisa dilakukan pada suhu 25oC
Kata kunci : bakteri termofil, etanol, Geobacillus thermoleovorans, PDC.
ABSTRACT. Pujoyuwono Martosuyono and P.L. Rogers. 2005. Thermal stability of PDC enzyme from
thermophilic bacteria producing ethanol. There has been considerable interest in the use of thermophiles for the
production of fuel and bulk chemicals such as alcohol and acids. The advantage of ethanol utilization as a fuel is the
capability to reduce the pollution level and global warming since it recycles atmospheric carbon from renewable biomass
such as cellulose, hemicelluose and starch, thus closing the carbon balance. One isolat of thermophilic bacteria with the
capability to produce ethanol had been isolated from compost sample. Identification by 16S rRNA sequencing has revealed
that the isolat is classified as Geobacillus thermoleovorans, a gram positive bacteria, rod shape, grow on wide variety of
substrates with optimum growing temperature of 60 oC, and facultative anaerobe. The cell extract from isolate D-2124
shows the presence of Pyruvate decarboxylase; the key enzyme in ethanol production system. Activity measurement of
PDC at 25, 40 and 60oC demonstrate the thermostable character of the enzyme. Total activity of pre-incubated cell extract
at 60oC was higher than other temperature while the activity of the counterpart enzyme of Zymomonas mobilis was totally
lost at that temperature. The other components of enzyme assay were thermal sensitive, consequently the activity
measurement was carried out at 25oC.
Keywords : thermophilic bacteria, ethanol, Geobacillus thermoleovorans, PDC.
PENDAHULUAN
Kebutuhan pemakaian minyak bumi yang terus meningkat
dan diiringi dengan penyusutan suplai menyebabkan
harga bahan bakar terus melambung mencapai tingkat
harga yang mengganggu keseimbangan perekonomian
dunia. Bertolak dari kondisi tersebut, terdapat pemikiran
untuk mencari sumber bahan bakar alternatif yang dapat
mensubstitusi minyak bumi dalam pemakaian sehari-hari,
terutama untuk penggunaan sebagai bahan bakar
kendaraan bermotor dan industri. Salah satu alternatif
yang potensial untuk dikembangkan adalah penggunaan
bio-etanol yaitu etanol yang dihasilkan dari proses
fermentasi bahan berpati oleh mikroorganisme (Aristidou
dan Penttila, 2000).
Banyak sekali keuntungan penggunaan bio-etanol
sebagai bahan bakar alternatif pengganti minyak bumi.
Faktor utama yang menjadi pertimbangan adalah pati
Martosuyono1 et al.,
Pyruvate decarboxylase,
TPP, Mg2+
Piruvat
CO2
alcohol dehydrogenase
Asetaldehid
Etanol
NADH + H+
NAD
Gambar 1. Reaksi pembentukan etanol dari piruvat dengan kerja enzim Pyruvate decarboxylase (PDC) dan
Alcohol dehydrogenase (ADH)
Figure 1. Conversion of pyruvate to ethanol by means of PDC and ADH action
Metode.
Isolasi dan seleksi bakteri penghasil etanol
Isolasi bakteri dilakukan dari sampel kompos dalam fase
termogenik (suhu 60-80 oC) berusia 2-6 bulan yang
diperoleh dari lokasi pengomposan di Lucas Heights
Landfill di Sydney, NSW, Australia. Teknik yang digunakan
meliputi cara sebar langsung (direct plating) dan
menggunakan media diperkaya (enrichment media)
dengan xylosa sebagai satu-satunya sumber karbon dan
penambahan 4% etanol sebagai medium seleksi. Isolasi
dan seleksi koloni dilakukan dalam medium padat dengan
komposisi sama. Koloni yang tumbuh dimurnikan dengan
cara mengambil tiap koloni tunggal untuk diseleksi lebih
lanjut.
Kemampuan tiap isolat untuk memproduksi etanol
dilakukan dengan cara menumbuhkan tiap isolat dalam
erlenmeyer berisi medium cair dengan menggunakan
xylosa sebagai sumber karbon tunggal pada suhu 60oC.
Sampel diambil pada jam ke-0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24,
30, 36, 42, dan 48. Tiap sampel diukur jumlah biomassa
dan supernatannya digunakan untuk pengukuran jumlah
etanol menggunakan kromatografi gas dengan kolom
Porapak Q (ukuran fase diam 100-200 mm), gas pembawa
nitrogen, suhu oven 160oC (isotermal), suhu injektor dan
detektor 200 oC dan menggunakan detektor Flame
Ionization Detector (FID).
Suhu optimum pertumbuhan dan produksi etanol
Isolat yang menunjukkan kemampuan menghasilkan
etanol digunakan untuk karakterisasi lebih lanjut. Suhu
optimum pertumbuhan dan produksi etanol diukur pada
suhu 50, 60 dan 70 oC dalam medium Thermophilic
Minimum Media (TMM) dengan menggunakan xylose
sebagai sumber karbon dan medium TMM tanpa xylose.
Karakterisasi sifat fisiologis dan biokimia isolat
terpilih
Penetapan karakter sifat fisiologi dan biokimia isolat
terpilih dilakukan dengan cara melakukan uji penggunaan
substrat, uji Voges-Proskauer, dan motilitas bakteri. Uji
penggunaan substrat dilakukan dengan cara memasukkan
glukosa, sukrosa, laktosa, maltosa, mannitol, xilosa,
arabinosa, salicin, sorbitol, urea dan sitrat kedalam medium
sebagai satu-satunya sumber karbon. Pertumbuhan isolat
dalam medium diamati dan diberikan kode positif (+) jika
menunjukkan ada pertumbuhan dan negatif (-) jika tidak.
Uji motilitas dilakukan dengan menanamkan satu ose
biakan bakteri kedalam agar dan dilihat pergerakannya
menembus medium agar.
Tabel 1.
Table 1.
Pereaksi (ml)
Reagents (ml)
0,2 M buffer sitrat
2,9
2,8
2,7
0,1
0,1
0,1
0,05
0,05
0,05
0,05
Ekstrak sel
0,1
1,0 M Na-pyruvate
(substrat)
6,4 mM -NADH
Keterangan/Remark :
- = tidak digunakan/not available
Martosuyono1 et al.,
0,35
0,3
0,3
Tabel 2.
Table 2.
Substrat
Substrates
Glukosa fosfat
Pertumbuhan
Growth*
+
Produksi asam
Acid production**
N/A
Produksi gas
Gases production**
-
Glucose PW
++
Sukrosa PW
Lactosa
Maltosa
Mannitol
Xylosa
Arabinosa
Salicin
Sorbitol
Agar urea
N/A
N/A
Agar sitrate
Uji
Test
Motility test#
VP- test
Methyl red test
Hasil
Result
+
+
-
Keterangan / Remark :
* + = tumbuh / growth ; - = tidak tumbuh /no growth
** + = membentuk gas dan atau asam/form gas and or acid
= tidak membentuk gas dan atau asam /
not form gas and or acid
# + = motil / die ; N/A = tidak dilakukan /not available
0,25
0,2
0,15
0,08
0,16
0,1
0,07
0,05
0,05
0,05
0
50
60
o
70
o
0,6
25C
40C
60C
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
C2112
D2124
F2121
Z.mobilis
Ekstrak sel dari isolat
Cell extract of Isolates
E.coli
Gambar 3. Pengukuran aktivitas PDC pada suhu 25, 40 dan 60oC dari isolat terpilih dan kontrol.
Figure 3. Determination of PDC activity at 25, 40 and 60 oC of selected isolates and control isolates
0,6
25C
40C
60C
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
C-2112
D-2124
F-2121
Z. mobilis
E. coli
Martosuyono1 et al.,
0,25
25C
40C
60C
0,2
0,15
0,1
0,05
0
C-2112
D-2124
F-2121
Z. mobilis
E . coli
Gambar 5. Pengaruh pemanasan ekstrak sel terhadap aktivitas spesifik enzim PDC dari isolat terpilih dan kontrol
Figure 5. The effect of pre-incubation of cell extract on PDC specific activity of selected isolates and control isolates.
KESIMPULAN
Isolat D-2124 memilki karakter yang cukup bagus untuk
dijadikan sebagai isolat unggul dalam sistem produksi
etanol. Dengan kemampuan tumbuh pada suhu tinggi,
penggunaan substrat yang luas, dan tingkat produksi
etanol yang cukup tinggi menjadikan isolat ini ideal untuk
dikembangkan lebih lanjut. Kemampuannya untuk
memanfaatkan xylosa sebagai substrat memungkinkan
biaya produksi etanol dimasa depan akan lebih murah
mengingat gula ini sangat berlimpah di alam dengan nilai
ekonomi yang rendah.
PDC yang dihasilkan oleh isolat D-2124 ini
menunjukkan stabilitas terhadap pemanasan. Aktivitasnya
pada suhu 60oC meningkat pada saat PDC dari Z. mobilis
hilang total.
Untuk meningkatkan kemampuan produksi etanol dari
isolat D-2124, diperlukan penelitian lebih lanjut. Optimasi
kondisi fermentasi, formulasi medium dan kestabilan
karakter isolat tersebut menjadi faktor yang bisa digunakan
dalam penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Alvarez, F.J., J. Ermer., G. Hubner., A. Schellenberger., and R. L.
Schowen. 1991. Catalytic power of pyruvate decarboxylase.
Rate limiting events and microscopic rate constant from
primary carbon and secondary hydrogen isotope effects. J.
Am. Chem. Soc. 113: 8402-8409.
Aristidou, A., and M. Penttil. 2000. Metabolic engineering
applications to renewable resource utilization. Current opinion
in biotechnology. Vol. 11 (2): 187-198.
Blanc, M., L. Marrilley., T. Beffa., and M. Aragno. 1997. Rapid
identification of heterotrophic, thermophilic, spore-forming
bacteria isolatd from hot compost. Int. J. of Sys. Bacteriol.
Vol. 47(4): 1246-1248.
7
Jabs, M.K., S. Konig., S. Hohmann., and G. Hubner. 1996.
Purification and characterization of pyruvate decarboxylase
from a haploid strain of Saccharomyces cerevisiae. Biol. Chem.
377: 313-317.
Lee, J. 1997. Biological conversion of lignocellulosic biomass to
ethanol. J. Biotechnology. Vol. 56 (1): 1-24.
Lynd, L. R. 1989. Production of ethanol from lignocellulosic
materials using thermophilic bacteria: critical evaluation of
potential and review. Adv. In Biochem. Eng./Biotechnol.
Springer-Verlag. 38: 1-52.
Neveling, U., R. Klasen., S. bringer-Meyer., and H. Sahm. 1998.
Purification of pyruvate dehydrogenase multienzyme complex
of Zymomonas mobilis and identification and sequence analysis
of the corresponding genes. J. Bacteriol. Vol. 180(6): 15401548.
Tolner, B., B. Poolman., and W. N. Konings. 1997. Adaptation
of microorganisms and their transport systems to high
temperatures. Comparative Biochem. And Physiol. Vol. 118
(3): 423-428.
Zeikus, J.G., C. Vieille., and A. Savchenko. 1998. Thermozymes:
Biotechnology and structure-function relationship.
Extremophiles. 21: 179-183.