PRACTICA 5

TECNICAS GENERALES DE EXTRACCIN Y VALORACION DE UNA DROGA

OBJETIVOS
1. Extraer el extracto total de flavonoides (sauco, calndula), de aceites
esenciales (ans estrellado, hinojo) y de alcaloides (boldo) de muestras
vegetales mediante extraccin con solventes.
2. Aislar el componente principal del extracto total: flavonoides (rutina),
aceites esenciales (anetol), alcaloides (boldina) mediante cromatografa
en capa fina.
3. Cuantificar el contenido de rutina, anetol, boldina en las muestras
mediante realizacin de una curva de calibracin.
Estrategia de trabajo sugerida
Reunir en un grupo los estudiantes con muestras de sauco y calndula, dos de
los estudiantes se dedicaran a la elaboracin de la curva de rutina y los otros
dos procesaran la muestra
Reunir en un grupo los estudiantes con muestras de ans estrellado e hinojo;
dos de los estudiantes se dedicaran a la elaboracin de la curva de anetol y los
otros dos procesaran la muestra
Reunir en un grupo los estudiantes con muestras de boldo; dos de los
estudiantes se dedicara a la elaboracin de la curva de boldina y los otros dos
procesaran la muestra
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. TRATAMIENTO DE LA MUESTRA
1.1. EXTRACCIN
1.1.2. EXTRACCIN DE ALCALOIDES POR EL MTODO ACIDO DE LAS
HOJAS DE BOLDO.
Todo el procedimiento debe realizarse en campana, el rendimiento de los
alcaloides es inferior al 1%.
PROCEDIMIENTO
1. Extraer 10 gramos de material vegetal con H2SO4 0.1N, mnimo 30 min
con constante agitacin o si es posible con ayuda de ultrasonido. El cido
debe cubrir por completo el slido y estar en exceso (1/3 parte ms)
2. Medir Ph con papel indicador
3. Filtrar el slido y recuperar la fase lquida. Para asegurar que TODOS los
alcaloides se encuentran en su forma cida o protonada y por lo tanto son
solubles en agua.

4. Desengrasar el extracto cido: para esto se realiza una extraccin

liquido-liquido con acetato de etilo por 3 veces. Recordar que la fase acuosa
es la inferior.
5. Recuperar la fase acuosa y desechar la orgnica.
6. Adicionar a la fase acuosa NH4OH al 25% hasta que haya un cambio de
color y medir Ph (el cual debe estar alrededor de 10). Agitar
constantemente por lo menos 30 min.
7. Realizar una extraccin liquido-liquido con solvente orgnico (Cloroformo
o diclorometano) por 3 veces. Recordar que la fase orgnica se encuentra
en la parte de abajo.
8. Es muy probable que se forme una emulsin: separar la fase acuosa
superior de la orgnica inferior (emulsificada), verter nuevamente la fase
orgnica en el embudo de separacin limpio, para que, la emulsin se pege
de las paredes del embudo y recuperar la fase orgnica de cloroformo
9. Rotaevaporar el cloroformo y ah se obtiene la fraccin alcaloidal.
Concentrar y pesar la fraccin de alcaloides totales
1.1.3. EXTRACCIN DE FLAVONOIDES DE FLORES DE SAUCO Y
CALNDULA:
PROCEDIMIENTO
1 gramo de muestra seco y molido seco se extrae con 3 porciones de 10 ml
MeOH a una temperatura de 60C x 10 min en ultrasonido, concentrar y
pesar la fraccin de flavonoides totales
1.1.4. EXTRACCIN DEL ACEITE ESENCIAL (ANIS ESTRELLADO, HINOJO):
PROCEDIMIENTO:
Se puede obtener la fraccin de aceites esenciales por arrastre con vapor
de agua o con extraccin con solventes en el caso particular utilizaremos
extraccin con solventes: se toma 1gr de material seco y molido y se
extrae con diclorometano (CH2CL2) cantidad suficiente para cubrir la
muestra y se lleva al (ultrasonido, con agitacin, cambiando el solvente
cada 5 minutos durante 15 min. Concentrar y pesar la fraccin de aceite
esencial total
1.2. CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA DE LA MUESTRA
PROCEDIMIENTO
Disolver la fraccin total segn corresponda y sembrar en la placa
cromatografica de 10X10 cm en forma de banda dejar un espacio en la placa
para sembrar el estndar (rutina para flavonoides, anetol para aceite esencial,
boldina para alcaloides), secar nuevamente la fraccin total y obtener el peso
sembrado de fraccin en cada placa, posteriormente eluir con el sistema
cromatografico segn corresponda, dejar secar mnimo 15 minutos las placas
1.2.1. Sistema eluente para flavonoides
Rutina:
Acoet: Ac. Frmico: Ac. Actico glacial: Agua 100:11:11:26 UV,
revelador UV 254 y 365 nm

1.2.2. Sistema eluente para aceites esenciales

Anetol:
Tolueno: ACoEt: 93:7 UV-VIS, revelador UV 254 nm
1.2.3. Sistema eluente para alcaloides
Boldina: Tolueno: AcoEt:Dietilamina: 70:20:10 revelador UV-254 nm

1.3. LECTURA EN ULTRAVIOLETA DE LA MUESTRA

PROCEDIMIENTO.
1. Raspar la fraccin de inters segn Rf del compuestos mayoritario,
consultar el libro plant drugs analysis
2. llevar la fraccin a un tubo de centrifuga limpio
3. Agregar 5,0 ml de metanol grado reactivo,
4. llevar al ultrasonido 5 minutos,
5. centrifugar 5 minutos,
6. tomar el sobrenadante (sin remover el residuo solido con pipeta pasteur)
y transferirlo a celda ultravioleta de reduccin de volumen leer segn el
mximo uv del compuesto de inters:
Anetol 259 nm,
Rutina
360 nm,
Boldina 305 nm

2. ELABORACION DE LAS CURVA DE CALIBRACION

Sustan
cia
pura

Metabol
ito

Mxim
os
de
absorci
n UV
en nm
de
la
sustan
cia

Mxim
o UV
de
lectur
a
en
nm
para
la
curva

Boldina
99,6 %
pureza
(solida)

Alcaloide
aporfinic
o

219,
284,305

305

Rutina
96%
pureza,
trihidrat
o
solida

Flavonoi
de
glicosilad
o

215,
260,
360

360

Soluci
n
madre
ppm
(mg/L)

50

50

Soluciones
a preparar
ppm

Rango de
Absorban
cia

1, 5, 10, 15,
20

0.03 0.7

6, 9,15, 18,
21

0.2 0.6

Anetol
trans
(liquido)
(dAnetol:
0.99
g/ml)

Fenil
propano

205,
259
trans
205,
254 cis

259

50

1, 2, 4, 6, 8

1.3 1.0

El solvente utilizado para blanco del quipo es metanol

Se leern 3 rplicas por concentracin y se elaborara la grafica obteniendo la
ecuacin de la recta
2.1. RUTINA
Solucin madre: 50 ppm (mg/L), Volumen final: 25.0 ml MEOH
Estndar: Rutina: Quercetin 3-D-rutinoside. Trihydrate, [153-18-4]
Pureza del estndar: 95%
Peso Molecular de la rutina trihidratada: 664,6 g/mol, C27H30O6 * 3H2O,
Peso Molecular de la rutina: 610.517 g/mol C 27H30O6
2.1.2. Preparacin solucin madre
Gramos de muestra a pesar
Modelo de clculo: Pureza
50 mg/L x 100 % = 1,32 mg
0,025 L
95 %
Entonces Peso del estndar: 1,32 mg y llevarlo a 25,0 mL de metanol?, pero la
rutina esta trihidrata

Relacin del trihidrato

1,32 mg x 10-3 g x 610,57 g rutina
= 48,50 mg/L o ppm
1 mg
0,025L

x 1000 mg : 1,213 mg x
664,6 g rutina trihidrato

1
1g

En 1.32 mg de trihidrato hay 1,213 mg de rutina

X
1,32 mg de rutina
1, 436 mg de trihidrato que se lleva 25,0 mL soy capaz de pesar esa
cantidad?
y si peso 1.5 mg del trihidrato cuanto mg de rutina tengo
1,32 mg de trihidrato 1,213 mg de rutina
en 1,5 mg de trihidrato
X = 1,4 mg de rutina x
1 = 55,13 mg /L o ppm
0,025L
2.1.3. Preparacin de las diluciones:

C1*V1 = C2*V2
5 ppm:

(5 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 906,95 uL

55.13 ppm
1 mL
Tomar 906,95 uL de la solucin madre de 55,13 ppm y llevar a 10,0 mL?
Puedo medir esa cantidad con la micropipeta que tengo?
Es mejor tomar 907 uL ? y si lo tomo as de que concentracin queda?
(907 uL x 55,13 ppm)/10000 uL = 5,000029 ppm 5 ppm
10 ppm: (10 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 1813,89 ul 1814 ul
55.13 ppm
1 mL
15 ppm:

(15 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 2720,84 uL 2721 uL

55.13 ppm
mL
Prepara primero la concentracin de 15 ppm y realizar un barrido en UV entre
200-400 nm, para confirmar que la sustancia tiene los mximos de absorcin
caractersticos y para confirmar si Cumple ley de Beer es decir que la
absorbancia a esa concentracin no est por encima de 1
20 ppm:
25 ppm:

(20 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 3627,79 uL 3628 uL

55,13 ppm
1 mL
(25 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 4534,74 uL 4535 uL
55,13 ppm
1 mL

Tabla de diluciones para la curva de rutina

Volumen en uL a tomar
de la solucin madre de
55,13 ppm
907
1814
2721
3628
4535

Volumen en mL
del
baln
volumtrico
10,0
10,0
10,0
10,0
10,0

Concentracin en ppm

5
10
15
20
25

2.2. BOLDINA
2.2.1. Preparacin solucin madre
Solucin madre: 50 ppm (mg/L) con Volumen final: 25,0 ml MeOH
Pureza del estndar: 99,6%
2.2.2. Gramos de muestra a pesar
Modelo de clculo
50 mg/L x 100 % = 1,3 mg,
0,025 L
99,6%
Peso del estndar: 1,3 mg y llevar a 25,0 mL con metanol

2.2.3. Preparacin de las Diluciones C1 x V1 = C2 x V2

Soluciones a preparar 1, 5, 10, 15, 20 ppm
Modelo de clculo:
1 ppm = (1 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 200 ul que se llevan a 10,0 ml
50 ppm
mL
2 ppm = (2ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 400 ul
50 ppm mL
5 ppm = (5 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 1000 ul UV 200-400 nm
(Cumplimiento ley de Beer)
50 ppm
mL
10 ppm = (10 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 2000 ul
50 ppm
mL
15 ppm = (2ppm x 10,0 mL) x 1000 uL : 3000 ul
50 ppm
mL
Tabla de diluciones para la curva de boldina
Volumen en uL a tomar
de la solucin madre de
50 ppm
200
400
1000
2000
3000

Volumen en mL del
baln volumtrico

Concentracin
ppm

10,0
10,0
10,0
10,0
10,0

1
5
10
15
20

2.3. ANETOL
2.3.1. Preparacin de la solucin madre
Solucin madre: 50 ppm (mg/L), Volumen final: 25.0 mL MeOH
Pureza del estndar: 100%
La sustancia es lquida y muy viscosa por lo tanto se recomienda pesar el
liquido
2.3.2. Cantidad de sustancia a pesar
Modelo de clculo: 50 mg/L = 1,25 mg
0,025 L
Peso del estndar: 1,25 mg y llevarlo a 25,0 mL de metanol
2.3.3. Preparacin de las diluciones (C1V1= C2V2):
1, 2, 3,4, 5 ppm
Modelo de clculo:
1 ppm = (1 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 200 ul que se llevan a 10,0 ml
50 ppm
mL
2 ppm = (2 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 400 ul
50 ppm
mL
4 ppm = (4 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 800 ul UV 200-400 nm
(Cumplimiento ley de Beer)
50 ppm
mL

en

6 ppm = (6 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 1200 ul

50 ppm
mL
8 ppm = (8 ppm x 10,0 mL) x 1000 uL = 1600 ul
50 ppm
mL
Tabla de diluciones para la
Volumen en uL a tomar
de la solucin madre de
50 ppm
200
400
800
1200
1600

curva de boldina
Volumen en mL del
baln volumtrico

Concentracin
ppm

10,0
10,0
10,0
10,0
10,0

1
2
4
6
8

en

DATOS NECESARIOS PARA EL INFORME

1. EXTRACCIN
peso de muestra:
Peso del extracto obtenido:
Peso del extracto sembrado:
CLCULOS:
% Aceite en la muestra: w Aceite /W muestra
2. AISLAMIENTO
Sistema cromatogrfico:
Soporte: Silicagel 60F254
Eluente:
Revelador: UV254 nm,
Fotografia de la placa: Perfil comatografico
Rf muestra:
Color:
Rf estndar:
Color
3. CUANTIFICACION: llevar a un volumen de 5.0 ml y leer absorbancia
Si la anterior solucin dio una absorbancia de 3, entonces tomar 0.1 ml y llevar
a 10.0 ml, leer nuevamente la absorbancia Cumple la ley de Beer?, Tener en
cuenta los factores de dilucin realizados para el clculo de sustancia en el
peso de muestra sembrado y en la muestra
Absorbancia: concentracin de interpolacin o de despeje de la frmula:
Tabla de datos para la curva

Concentracin
ppm (mg/L)

Ecuacin:

Y = mXB
A=mXB

A 305 nm = 0,06413 X + 0,03819, R2:0,9969

1
2
5
10
15

Replica

Replica

Replica
3

0,081
0,174
0,366
0,701
0,983

0,078
0,175
0,372
0,703
0,971

0,08
0,17
0,371
0,709
0,988

Absorbancia
Promedio

0,080
0,173
0,370
0,704
0,981

Desviacion coeficiente
esandar
de variacion

0,002
0,003
0,003
0,004
0,009

1,917
1,529
0,870
0,591
0,891

CONSULTA
% Aceite Esencial: semillas de Anis estrellado, ans comn, hinojo y hojas de
albahaca
% Componente Principal del Aceite Esencial
% Flavonoides totales: flores de saco, Clendula y pensamiento, hojas de ruda
% Rutina en:
% Alcaloides totales en hojas de boldo: % de Boldina