bacterias lcticas presentes de manera natural en la uva por el cual el cido mlico se convierte en cido lctico

Investigaciones corrientes proporcionan una nueva oportunidad de cambiar las

propiedades aromticas de vino y la percepcin de sabor por destacando el impacto
potencial de bacteria sobre componentes y las propiedades sensoriales de vino limitado.
Adems
compuestos de diacetilo , O. oeni pueden metabolizar los precursores presentes en
vino durante la FML para formar steres y puede alterar la qumica
composicin de vino.
El dominio de los genes relacionados con el sabor de O.oeni
involucrada en el perfil aromtico del vino, tales como esterasas , bglucosidase ,
proteasas, peptidasas, o descarboxilasa del cido fenlico ,
sigue siendo relativamente inexplorada
Teniendo en cuenta el gran nmero de
cidos y alcoholes presentes en el vino , una amplia gama de steres se pueden
formar durante el proceso de elaboracin del vino. steres de vino son
principalmente
steres C4eC10 etlicos de cidos orgnicos, steres de acetato de alcoholes
superiores,
o steres etlicos de cidos grasos de cadena lineal y son , si no se
exclusivamente , los principales responsables del aroma afrutado del vino joven
los steres deriva del cido carboxlico y el alcohol de los que procede. As, en el etanoato (o acetato) de metilo
encontramos dos partes en su nombre: La primera parte del nombre, etanoato (o acetato),proviene del cido etanoico
(actico).

La mayora de los steres se encuentran en rastro

cantidades en el producto final en concentraciones inferiores a la deteccin
lmite. Sin embargo, mientras que los steres estn presentes en pequeas
cantidades en la
vino, que estn involucrados en la complejidad aromtica del vino, y una
pequeo cambio en la concentracin puede tener un efecto dramtico sobre la
perfil aromtico de vino
Actualmente , cuatro
genes que codifican las esterasas se han descrito en Ooeni28 , una
O. oeni cepa comercializado por Lallemand ( Montreal , Canad ) :
estA2 , estA7 , ESTC y ESTB .
Estudios anteriores han demostrado que purifica O. oeni esterasas ,
EstCOo8 , EstC34 , y EstB28 , tienen una preferencia por los de cadena corta
sustratos sintticos tales como butanoato de p - nitrofenilo ( PNP- butanoato )
o PNP -acetato y son capaces de actividad de esterasa en winelike
condiciones pertinentes para la elaboracin del vino con un pH de 3,5 y en el
presencia de etanol ( 13 %)
Sin embargo, esta actividad dual
observado in vitro con esterasas purificados no se pueden extrapolar a
Se necesita medio del vino y de la investigacin . Por otra parte, la
papel de esta doble actividad de steres relacionadas con el vino es an
desconocida
y por lo tanto an no se conocen en el vino . En este punto , sin
investigacin de la capacidad de las esterasas O. oeni en condiciones enolgicas
se ha informado debido a la evidente falta de gentica
herramientas de expresin . Recientemente, le ofrecemos una nueva expresin
eficaz
herramienta, el vector pSIPSYN ( Darsonval et al., 2015 ) .

En este punto, sin

investigacin de la capacidad de las esterasas O. oeni en condiciones enolgicas
se ha informado debido a la evidente falta de gentica
herramientas de expresin. Recientemente, le ofrecemos una nueva expresin
eficaz
herramienta, el pSIPSYN vector El objetivo de la
Este estudio es el uso de esta nueva herramienta gentica para investigar la
impacto de O. oeni esterasas EstA2 y la actividad EstA7 en el ster
sustratos presentes de forma natural en el vino. Por lo tanto, hemos transferido
en O.oeni, vectores recombinantes derivados de pSIPSYN de
sobre-expresa estA2 y genes estA7 y evaluar, por primera vez,
el impacto de la expresin de estos dos genes en esterasas
perfiles de vinos-ster durante la elaboracin del vino. La novela biotecnolgico
sistema de expresin se evalu mediante el ensayo de la actividad enzimtica
sobre un sustrato sinttico, PNP-butanoato. O. oeni recombinante
cepas que exhiben una mayor actividad esterasa se utilizaron para inocular
un vino Aligot. El perfil de sabor de los vinos experimentales fue
establecido por microextraccin en fase slida seguida de cromatografa de gases
acoplada a espectrometra de masas (SPME-GC-MS), y
de este modo se identificaron sustratos ster de los esterasas estudiados
Por lo tanto, hemos transferido
en O.oeni , vectores recombinantes derivados de pSIPSYN de
sobre- expresa estA2 y genes estA7 y evaluar , por primera vez ,
el impacto de la expresin de estos dos genes en esterasas
perfiles de vinos - ster durante la elaboracin del vino . La novela biotecnolgico
sistema de expresin se evalu mediante el ensayo de la actividad enzimtica
sobre un sustrato sinttico, PNP- butanoato . O. oeni recombinante
cepas que exhiben una mayor actividad esterasa se utilizaron para inocular
un vino Aligot . El perfil de sabor de los vinos experimentales fue
establecido por microextraccin en fase slida seguida de cromatografa de gases
acoplada a espectrometra de masas ( SPME -GC- MS) , y
sustratos ster de los esterasas estudiados fueron as identificados
2.1. Deformacin, medios de cultivo y condiciones de transformacin
Las cepas bacterianas utilizadas en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
O. oeni cepa ATCC BAA-1163 es una cepa acidfilo, aislado de
vino tinto. O. oeni se cultivaron a 30C en medio FT80m (pH 5,3)
(Cavin et al., 1989).
En la preparacin para los experimentos, O. oeni eran
precultivados a partir de medio de glicerol almacenada a 80 C en FT80m
medio suplementado con 20 mg.ml1 de vancomicina, 20 mg.ml1
de lincomicina, y 20 mg.ml1 de eritromicina cuando sea necesario.
Los cultivos usados en los ensayos de actividad de esterasa se inocularon a partir
de
los precultivos y se incubaron durante 20 horas a 30 C.
Para los ensayos enzimticos,
extractos celulares se prepararon a partir O. oeni crecido hasta el midexponential
fase (DO600nm 0,8).
Escherichia coli cepa K12
GM2163 se utiliz como cepa husped para la clonacin y mantenimiento
de plsmidos. Para experimentos de clonacin, E. coli se hicieron crecer a 37 C en
LuriaeBertani (LB) complementado con eritromicina
cuando sea necesario (250 mg.ml1
). E. coli GM2163 se transformaron por

electroporacin con una mezcla de ligacin (Taketo, 1988). Positivo

clones fueron seleccionados en placas de LB suplementado con eritromicina
(250 mg.ml1
). La electroporacin tambin se utiliz para transformar O. oeni como
se ha descrito previamente (Assad-Garca et al., 2008), con la seleccin de
placas FT80m suplementado con eritromicina, vancomicina, y
lincomicina (20 mg.ml1 cada uno).
La presencia de plsmidos fue vericado mediante amplificacin por PCR de colonias con los pares de cebadores que
coincida con el
secuencia de plsmido, Olcg303 / Olcg302, Olcg303 / estA2E, o Olcg303 /
estA7E. La presencia de la pSIPSYN vector no modifica el
los parmetros de crecimiento de las cepas de ingeniera (datos no publicados).
2.2.

2.2. el aislamiento de ADN y la manipulacin

Aislamiento de ADN de O. oeni se logr utilizando un InstaGene
Kit de matriz (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.UU.).
Cebadores dirigidos a la intemperie marco de lectura (ORF) de los genes de
esterasa oeni O. se adquirieron
de Eurogentec (Lieja, Blgica) y se disearon basndose en la
publicada BAA-1163 secuencia del genoma O.oeni ATCC
(AAUV00000000) (Tabla 2).
PCR se realiz con Phusion
De alta fidelidad ADN polimerasa (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, EE.UU.) en un ciclador trmico de T100 (Bio-Rad) de acuerdo con los
parmetros
que acompaa a la polimerasa.
Los plsmidos de E. coli eran
preparado con un Kit GeneJET plsmido Miniprep (Thermo Fisher
Scientific) de acuerdo con el protocolo proporcionado por el fabricante.
Los fragmentos de ADN se purificaron con un kit de purificacin de PCR GeneJET
(Thermo Fisher Scientific). ADN ligasa T4 y otras endonucleasas de restriccin
se adquirieron de New England Biolabs Inc. (New
England Biolabs, Ipswich, MA, EE.UU.) y se utiliza como se recomienda
por el fabricante para los experimentos de clonacin.
Los plsmidos
pSIPSYNestA2 y pSIPSYNestA7 se construyeron insertando el
estA2 amplificado y esterasa estA7 ORFs en el de clonacin mltiple
sitios de la E. coli / LAB vector lanzadera pSIPSYN (darsonval et al.,
2015) bajo el control de un promotor constitutivo sinttico. los
ORFs de estA2 y estA7 fueron amplificados por PCR usando el cebador
parejas estA2N / estA2E y estA7N / estA7E respectivamente (Tabla 2).
fragmentos resultantes se clonaron betwelinken restriccin NcoI y EcoRI
sitios de pSIPSYN para obtener pSIPSYNestA2 y pSIPSYNestA7
(Tabla 1).
2.3 . secuenciacin de ADN y anlisis de la secuencia
Las secuencias de ambas cadenas de genes clonados en esterasa
pSIPSYN se confirmaron por secuenciacin de nucletidos , con el etiquetado
y la separacin capilar en un AB3730xl realizada por Beckman
Coulter Genmica ( Essex, Reino Unido ) . El olcg303 y

estA2E o estA7E cebadores se utilizaron para este propsito. Nucleotidesequencing

resultados fueron analizados utilizando el software LALIGN ( www.ch.
Se realizaron embnet.org/software/LALIGN~~number=plural ) y la secuencia de
alineaciones
utilizando ClustalW2 ( http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/
clustalw2 / ) y el software Boxshade ( http : . //www.ch.embnet org /
software / BOXform.html ) .
2.4. Determinacin y caracterizacin de la actividad esterasa
Los ensayos de esterasa se realizaron utilizando PNP-butanoato de metilo como
sustrato
basado en el protocolo de Matthews et al. (2007). Celular
extractos se cosecharon a partir de 25 ml de cultivos se recogieron por
centrifugacin
a 6500g durante 5 min a temperatura ambiente. Los sedimentos celulares se
transferidos en 800 ml de 1 PBS (solucin salina tamponada con fosfato, Biosolve,
Dieuze, Francia: NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4,
1,8 KH2PO4 mM, pH 7,4) y se lisaron dos veces con accin Precellys
(60se20se60s a 6500g, Pars, Francia). La suspensin se
centrifug a 13,200g durante 15 min a 4 C para eliminar los desechos celulares.
Las mezclas de reaccin se prepararon mediante la mezcla de 760 ml de la reaccin
tampn (0,1 M K2HPO4, cido 0,2 M ctrico, pH 5, 0,1% de goma rabe,
0,005% Triton X-100) con 100e200 ml de extracto celular y
completado con 1X PBS (volumen final de 960 ml). Despus de una preincubacin
a 37C durante 5 min para estabilizar la temperatura de reaccin,
la reaccin enzimtica se inici mediante la adicin de 40 ml de pNPbutanoate
(25 mM en etanol absoluto, Sigma-Aldrich, St. Louis,
MO, EE.UU.) y despus se incub a 37C durante un tiempo mximo de 1 hora.
La reaccin se detuvo mediante la adicin de 50 ml de NaOH (0,5 M). los
lanzado p-nitrofenol se cuantific midiendo la absorbancia
a 410 nm utilizando un espectrofotmetro SmartSpec Plus (BioRad).
El volumen de extracto celular y el tiempo de reaccin eran
ajustado de acuerdo a la actividad de la muestra con el fin de medir una
absorbancia entre 0,1 y 1 (0,1 <A410nm <1). total celular
protenas en los sobrenadantes se sometieron a ensayo utilizando una protena BioRad
Ensayo de tinte reactivo concentrado basado en el mtodo de Bradford
de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Bio-Rad).
Las actividades especficas se calcularon y luego corrigieron para no enzimtica
la degradacin del sustrato de ster usando un enzymefree
control con la misma mezcla de reaccin. Los datos fueron tambin
corregido para la degradacin no especfica del sustrato de ster usando
la cepa nativa-vector con la misma mezcla de reaccin. todos los ensayos
y los controles se trataron de la misma manera y llevaron a cabo en
triplicado.
2.5. ensayos de fermentacin malolctica y anlisis de compuestos voltiles
Se llevaron a cabo ensayos FML para determinar el perfil de ster de vino
de cada condicin experimental. Un vino Aligot (pH 3,1, 3,2 g.l 1
cido mlico, el 11,8% de etanol) procedente de la bodega de Borgoa
Universidad (Marsannay-la-Cote, Francia) se utiliz en este estudio. ^
El vino se recogi despus de la FA y se ajust a pH 3,5 con KOH
(1 N, VWR BDH Prolabo, Radnor, PA, EE.UU.) y despus se filtr a travs
un filtro de 0,22 mm (Millipore, Darmstadt, Alemania) para eliminar la
flora endgena. 100 ml de vino filtrado se dividi en alcuotas en
12 100 ml botellas. Para iniciar la FML, el vino fue inoculada con tres
cepas recombinantes, cada una por triplicado, a 105 cells.ml1 y se incubaron
a 22C sin agitacin. la concentracin de cido mlico era
control usando un kit de anlisis de enzimas de espectrofotomtrico (Biosentec,

Auzeville Tolosane, Francia). MLF se consider

completar cuando la concentracin de cido mlico fue 0,2 g.l1
.A
la finalizacin de la FML, las muestras se trataron con dixido de azufre a
30 mg.l1 y se dividieron en tubos de 50 ml. Los tubos se cerraron
bajo una atmsfera de nitrgeno y se almacena a 20 C para evitar cualquier
cambios en la concentracin de ster. Todas las muestras se analizaron dentro de
un mes. Despus de la FML, los vinos resultantes se analizaron mediante SPME-GCMS
para cuantificar e identificar los steres liberados durante la FML y establecer
su perfil de sabor. El ensayo se realiz como se describe por
Sumby et al., (2013) con algunas modificaciones. En pocas palabras, la longitud de
Lengeta

Resultados

3.1. El anlisis de secuencia

Basndose en la secuencia de O. oeni Ooeni28 estA2 (JX215243.1) y
estA7 (JX215244) genes ( Sumbyetal.,2013 ) (Lallemand, Nuovi
Ceppi OO2, ( Matthewsetal.,2006 ), dos ORFs eran similares idenficados a partir de O. oeni cepa ATCC BAA-1163. Estos dos genes putativos
fueron llamados posteriormente por homologa: estA2 (KT454793) y
estA7 (EAV39250.1). El estA2 ORF constaba de 792 pb que codifica una
protena deducida de 263 aminocidos. El ORF estA7 consista
804 pb que codifica una protena deducida de 268 aminocidos. tanto pusecuencias de pptidos tativos deducidas a partir de las secuencias de
nucletidos
fueron alineados con las secuencias de O. esterasas oeni Ooeni28. los
O. oeni ATCC BAA-1163 secuencia estA2 exhibi 8 nucletidos
sustituciones y 2 inserciones de nucletidos en comparacin con O. oeni
Secuencia Ooeni28 estA2, resultando en cuatro sustituciones de aminocidos
y una insercin de aminocido (97,4% aa identidad). Por el contrario, la
secuencia de nucletidos de O. oeni ATCC BAA-1163 estA7 fue del 100%
idnticos a los de O. oeni Ooeni28 estA7. El aminocidos deducida
secuencias de EstA2 y EstA7 de O. oeni cepa ATCC BAA-1163
se analizaron para motivos clave enzima lipoltica y se compararon
con otras secuencias de esterasa conocidos y predichos disponibles de
GenBank (base de datos NCBI). Sobre la base de estas alineaciones, el
putativo
trada cataltica formada por tres residuos, SDH / E, fue identificado en
tanto esterasas estudiados ( Higo. 1 ). El codo nuclefila putativa
estructural GXSXG motivo que rodea el residuo de serina del sitio activo
Tambin se identific, lo que demuestra que ambos pertenecen a la familia de
esterasas V
enzimas lipolticas bacterianas ( ArpignyyJaeger,1999 ). El putativo
GX motivo, posiblemente un agujero de oxianin, tambin se identific con
esta

alineacin.
3.2. Clonacin de genes de esterasa y la determinacin de la actividad de
esterasa
La O. oeni ATCC BAA-1163 estA2 y estA7 genes fueron clonados
bajo el control de un promotor constitutivo sinttico usando el
E. coli / LAB pSIPSYN vector lanzadera ( Darsonvaletal.,2015 ). Despus
verificacin de las secuencias de nucletidos de la clonacin estA2 y estA7
genes por secuenciacin, E. cepas recombinantes de E. coli que llevan nativo
pSIPSYN vector (Ecsyn, control) o vector recombinante pSIPSYNestA2 y pSIPSYNestA7 (EcestA2 y EcestA7) se utilizaron para probar
la funcionalidad de genes de esterasa clonados. La actividad enzimtica se
ensayaron usando el sustrato sinttico p NP-butanoato y las clulas se
extrada de E. cepas recombinantes de E. coli en crecimiento exponencial
fase (Ver seccin de Materiales y mtodos). La actividad de esterasa
se normaliz a la actividad esterasa basal de una cepa que lleva
plsmido pSIPSYN nativo (Ecsyn). Tanto E. recombinante cepas de E. coli,
EcestA2 y EcestA7 tienen actividad esterasa en relacin significativamente
4,93 veces y 5,74 veces mayor que Ecsyn (cepa de control) respectivo
tivamente ( Fig.2 UN). Habiendo establecido que en el E. recombinante coli
cepas, EcestA2 y EcestA7 tienen una actividad esterasa significativamente
aumentado en E. recombinante cepas de E. coli en comparacin con el control
cepa (Ecsyn), plsmidos y pSIPSYNestA2 pSIPSYNestA7 eran
transferido a O. oeni ATCC BAA-1163 (OoestA2 y OoestA7)
usando pSIPSYN como control (Oosyn, cepa de control). Una vez que la
presin
cia de los plsmidos en O. oeni se confirm por PCR, la actividad esterasa
Los ensayos se llevaron a cabo en las cepas recombinantes de O. oeni ATCC
BAA-1163 que anteriormente realiz en E. coli ( Fig.2 B). tanto recobinant O. cepas oeni, OoestA2 y OoestA7 tienen esterasa relativa
actividad significativamente 5,80 veces y 12,83 veces mayor que el control
cepa (Oosyn).
3.3. Impacto del aumento de la actividad esterasa de ster de vino per fi les
Despus de haber confirmado que tanto O. recombinante cepas oeni tenan
una
aumento de la actividad significativa esterasa detectable en comparacin con
la actividad de la cepa de control, se llevaron a cabo ms investigaciones
en el vino. Para determinar si el gen de la esterasa puede ser
responsables de un perfil particular, MLF de vino de la Aligot correo
Se llevaron a cabo variedad de uva para evaluar los cambios-esterasa
especfica en
la concentracin del ster. Diferentes etilo y acetato de steres fueron identificado y cuantificado por SPME-GC-MS. Un ANOVA seguido de
Se llev a cabo la prueba de comparacin mltiple de Tukey para determinar

cambios significativos en la composicin de ster de vino. LaTabla3 presenta

los
los medios de las concentraciones de ster cuantificados en el vino sin
inoculacin y despus del paso de la FML. Un vino inoculado se
analizado para proporcionar un control. En primer lugar, nuestro anlisis
indica que la FML
cambios provocados en la composicin de ster de vinos con los tres
O. oeni cepas recombinantes. Como era de esperar, el mayor incremento en
Se encontr de concentracin durante la FML de lactato de etilo. los
la concentracin de este compuesto se dobl por los tres recocepas binant estudiaron con respecto a la condicin no inoculado, pero
no super el umbral aroma de 150.000
metro
g.ml
A1
( Sumby
et al., 2013 ). Lacuantificacindeestesterconfirmla
capacidades fermentativas de O. oeni ATCC BAA-1163, una cepa de
laboratorio
aislado de vino tinto en la dcada de 1980 ( Maicasetal.,1999 ). Despus de
la
MLF paso por la cepa OoestA2, adems del aumento en lactato de etilo
concentracin, slo disminuye en las concentraciones de otros steres
fueron observados ( Tabla3 ). La concentracin de acetato de isoamilo
(pltano y aromas de pera), hexanoato de etilo (verde aroma de manzana),
acetato de isobutilo (aromas frutales) y acetato de hexilo (aroma de pera)
fueron todos significativamente y, respectivamente, disminuy en un 42,7%,
23,4%,
51.5% y 28.9% en comparacin con la cepa control (cepa Oosyn)
M. Darsonval et al. / 60 Microbiologa de los Alimentos (2016) 21 e 28
24
pgina 5

( Tabla3 ). Los cambios en las concentraciones de ster de acetato de

isobutilo y
acetato de hexilo estaban por debajo del umbral de aroma reportado en el vino
( Tabla3 ). Despus de la FML por la cepa OoestA7, la principal seal
el cambio en la concentracin de ster significa- observado un aumento del
22,7% en
acetato de hexilo en comparacin con el control de traccin (Oosyn). No hay
disminucin se
observado despus de la FML con la cepa OoestA7. Cambio en acetona hexilo
concentracin tate era tambin por debajo de aroma del umbral reportado en
vino ( Tabla3 ). Otras concentraciones de ster monitorizados, incluyendo

acetato de etilo (afrutado), octanoato de etilo (fruta madura), y acetato de

butadieno
noate (fresa), no mostr cambios significativos.

4. Discusin
En este estudio, hemos investigado el impacto de dos expresada
O. oeni esterasas en los perfiles aromticos de vino mediante el uso de
por ingeniera gentica cepas de llevar a cabo la FML. Por primera vez,
genes con inters enolgico, estA2 y estA7, se clonaron y se
expresado en O. oeni. Recombinante O. oeni cepas se inocularon en
E vino Aligot para realizar MLF y las concentraciones de steres
potencialmente utilizado por estos dos esterasas se midieron puesto
FML paso. Presencia de vectores en cepas recombinantes se evalu
antes de la inoculacin y la presin de seleccin mediante la adicin relevante de antibiticos se
mantuvo durante la elaboracin del vino. Estudios previos han
ya planteado la hiptesis de que la explotacin de las esterasas como pupreparaciones enzimticas rified o cultivos microbianos como con intrnseca
actividades de esterasa se pueden utilizar para modular la composicin de ster de
vino ( Matthews et al, 2007., 2006; Sumby et al., 2013, 2012a ). Esta
investigacin se centr en EstA2 y EstA7 en O. oeni ATCC BAA-1163
identificado por homologa de secuencia con las secuencias publicadas
de esterasas de O. oeni cepa Ooeni28.
Como ya se ha notado por Sumby et al. (2012b) , la secuencia de EstA7 amino-cido a partir
de O. oeni
ATCC BAA-163 es idntica a la secuencia de O. oeni Ooeni28,
y a todas las secuencias publicadas de estA7 O. cepas oeni. Sin seal
las secuencias se encuentran en secuencias de aminocidos EstA2 y EstA7,
lo que sugiere que estas enzimas tienen una localizacin citoplasmtica ( Nakai
y Horton, 1999 ). Dado que O. oeni no es fcilmente genticamente
manipulado, nuestra eleccin cepa fue dictada principalmente por tcnicos
limitaciones debido a la pobre capacidad de transformacin de la O. oeni ( AssadGarca et al., 2008; Dicks, 1994 ). De hecho, la mejor electrola eficiencia de transformacin se obtiene con la O. oeni ATCC BAA1163 (5,8 a 10
3
por
metro
g de ADN) ( Assad-Garca et al., 2008 ).
Para superar las dificultades de purificacin y para evitar in vitro
investigacin, ambos genes de esterasa se clonaron y se expresa en
E. coli y luego en O. oeni. En E. coli, la actividad mxima de la esterasa fue
observado en la cepa EcestA7 con un aumento de 5,74 veces en la relacin
actividad, seguido de cerca por EcestA2 con un aumento de 4,93 veces. Esta
etapa del ensayo de actividad de esterasa fue esencial, en primer lugar para validar la
sistema y segunda clonacin para validar la funcionalidad de ambos
esterasas codificadas por genes de esterasa. Posteriormente, los plsmidos
que albergan estA2 o estA7 genes fueron trasladados en O. oeni.
Ensayos de esterasa realizaron para O. cepas recombinantes de alto iluminado un aumento de
12,83 veces en la actividad esterasa relativa para
OoestA7 y un aumento de 5,80 veces para OoestA2. Estos hallazgos validar
la fecha la utilizacin de pSIPSYN como la clonacin y el sistema de expresin enO. oeni. Por
primera vez en O. oeni, hemos expresado con xito genes que codifican protenas funcionales,

EstA2 y EstA7, mostrando una actividad enzimtica cuantificable. Por otra parte, la
comparacin de perfiles de ster de cepas genticamente modificadas demostraron la
participacin de estas esterasas en la sntesis y la hidrlisis de ster en condiciones de vino
durante la FML. Aunque las actividades enzimticas de EstA2 y EstA7 no se han evaluado en el
vino, la diferencias significativa observadas en las composiciones de ster entre el probado
cepas probablemente reflejan la real vivo en la actividad esterasa durante
la elaboracin del vino. Aunque se ha demostrado in vitro que O. oeni esterases exhiben actividad enzimtica en condiciones de vino relevante
(PH 3,5 y la presencia de etanol) ( Sumby et al., 2012a, 2009 ), nuestra
estudio es el primer reporte de una actividad esterasa existente en vivo en
condiciones enolgicas en Aligot e vino.
Hacer cuadro paralelo sobre los esteres.reduccion y expresin de sabores y aromas
Por lo tanto, hemos basado nuestro estudio sobre ocho steres principales responsables
de sabores frutales en el vino (acetato de etilo, acetato de isobutilo, etilo
butanoato, acetato de isoamilo, hexanoato de etilo, acetato de hexilo, acetato de
lactato, y octanoato de etilo) dio a conocer durante la FML ( Vianna y
Ebeler, 2001 ). Perfiles de ster de los tres O. oeni recombinante
cepas se establecieron en el Aligot e vino por SPME-GC-MS
Mtodo ( Vianna y Ebeler, 2001 ). En nuestra condicin experimental
ciones que combinan la O. oeni cepa ATCC BAA-1163 con nativos
plsmidos, los principales cambios en la composicin de ster fueron el incremento
de lactato de etilo (aroma de la leche) y octanoato de etilo (maduro aroma de fruta),
y la disminucin de acetato de isoamilo (aromas de pltano y pera) y
acetato de isobutilo (aroma de pltano). Estos resultados sugieren una reduccin
cin del aroma de pltano con una intensificacin paralela de la madura
nota frutas y fueron considerados como un perfil de modelo para el laboratorio
cepa ATCC BAA-1163 en Aligot e vino por el que comparar los dos
otras cepas recombinantes que sobreexpresan genes de esterasa.
Como se predijo, acetato de etilo fue cuantitativamente, con lactato de etilo,
el ster predominante en todos los tratamientos ( de Revel et al., 1999;
Maicas et al., 1999 ). No hay diferencia entre las condiciones era
detectados, lo que sugiere que EstA2 y EstA7 no tienen detectable
actividad hidrolytic o sinttico hacia este ster. estas observaciones
son coherentes con la in vitro estudio de Sumby et al. (2013) quien
informado de que EstA2 no tiene actividad hidroltica y muy poco sinactividad tico hacia acetato de etilo. Del mismo modo, el lactato de etilo es produjo a la mayor concentracin durante la FML ( Maicas y col.,
1999 ) Y aument significativamente despus de la FML realizada por Oosyn,
OoestA2, y OoestA7 cepas relativos al vino sin inocular
sin diferencias significativas entre los tres con- inoculacin
condiciones. Esto sugiere que EstA2 y EstA7 tambin tienen no detectable
actividad hidroltica o sinttico hacia lactato de etilo. Teniendo en cuenta que su
formacin se correlaciona con el grado de degradacin de a.mlico, y as, con la liberacin de
cido lctico, durante la FML, estos resultados
no son sorprendentes ( de Revel et al., 1999; Maicas et al., 1999 ).
Hemos observado que EstA2 causada principalmente de- significativa
pliegues en las concentraciones de acetato de isoamilo (pltano y pera
aromas), acetato de isobutilo (aroma de pltano). Por lo tanto, parece EstA2
tener una preferencia de la actividad hidroltica hacia steres de la familia
de sabores afrutados, ms precisamente el aroma de pltano, con una mayor
preferencia por cadenas de cidos grasos C4eC6. Nuestros resultados son distintos
de los reportados por Sumby et al. (2013) para la EstA2 purificada,
la cual se muestra un aumento de la actividad hidroltica de ster C4eC8

cadenas de cidos grasos, con la ms alta actividad relativa para C8 (acetato de

octanoato). EstA2 tena una actividad hidroltica hacia acetato de hexilo,
que se asocia con la pera y pltano descriptores aromticos
buscado en el vino, de acuerdo con el vino especfico. Si bien no tenemos
demostrado que EstA2 tena actividad hidroltica hacia acetato de isoamilo
y acetato de isobutilo, reduciendo su concentracin a la mitad, la
concentracin de acetato de isoamilo todava se mantuvo por encima del umbral reportado de
aroma (30e160metro gl A1) Y acetato de isobutilo fue todava
por debajo del umbral de aroma (1600 metro gl A1). Sin embargo, incluso si
la mayora de los steres estn presentes en el vino en concentraciones alrededor o por debajo
el umbral de aroma se informa, son con- extremadamente importante
tribuidores al perfil de sabor de vino por tener un efecto sinrgico
para impactar colectivamente en aroma del vino ( Bartowsky, 2005; Bartowsky
y Borneman, 2011; Ferreira et al., 2000; G Omez-Mguez et al.,
2007; Swiegers et al., 2005 ). Por esta razn, la concentracin menor
cambios podran tener un efecto dramtico sobre el sabor del vino ( Ferreira et al.,
2000; G Omez-Mguez et al., 2007; Sumby et al., 2009 ). la reduccin
cin tanto de acetato de isoamilo y acetato de isobutilo podra ser una
efecto deseable en un ramo vino tpico, debido a que el banano
sabor es potente y puede dominar otros sabores ms sutiles.
A pesar de un porcentaje de homologa de la secuencia cerca de 59,9% con
EstA2, poco se sabe acerca de EstA7 O. oeni porque es inestable
y difciles de purificar in vitro reportado por Sumby et al. (2012b) .
Sumby et al. explorado la expresin de estA7 gen en presencia
de sustratos naturales y sugiri que podra desempear un EstA7 ms
papel importante en la sntesis de ster en lugar de en la hidrlisis. Nuestra
hallazgos finalmente destacar que EstA7 tiene actividad sinttica hacia
acetato de hexilo al provocar un aumento significativo de 22,7% en este ster
concentracin (aromas de pltano y pera) en condiciones enolgicas.
El aumento de acetato de hexilo podra tener un efecto deseable sobre el vino
mediante la reduccin de los precursores de steres correspondientes, cido actico y
hexanol, que son responsables de la descomposicin actico y herbcea
aromas, respectivamente ( Swiegers et al., 2005 ). Por lo tanto, un alto nivel de
estA7 expresin podra ser una ventaja para aumentar aromas frutales,
a saber, pera y pltano aromas, mediante la reduccin de pre-acetato de hexilo
cursores (hexanol y hexanal), que son responsables de herbaceous notas. La proyeccin de LAB enolgico cepas segn
su capacidad de expresar estA7 podra ser utilizado como un mtodo para alterar la
perfil ster de vino. Este estudio proporciona evidencia de primera elucidar
los cambios en la concentracin de ster siguientes MLF observado en muchos
estudios ( Delaquis et al., 2000; Maicas et al., 1999; Matthews et al.,
2004; Pozo-Bay en et al., 2005; Ugliano y Moio de 2005 ). Nuestra
resultados muestran por primera vez que esterasas en O. oeni son capaces
de hidrolizar o la sntesis de steres de vino durante la FML. Hasta
Ahora, la mejor prueba de que el vino asociado LAB-son capaces de exhibir
la actividad esterasa ha sido a partir de estudios que han investigado el vino
perfiles de ster durante la FML mediante el establecimiento de los cambios en la concentracin
tracin de steres individuales ( Delaquis et al., 2000; Maicas et al.,
1999; Pozo-Bay en et al., 2005; Ugliano y Moio, 2005; Vianna
y Ebeler, 2001 ) O los estudios que han caracterizado in vitro -puriesterasas especificar ( Sumby et al., 2013, 2012a, 2009 ). Por el contrario, nuestra
M. Darsonval et al. / 60 Microbiologa de los Alimentos (2016) 21 e 28
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in vivo estudio muestra que EstA2 y EstA7 no tienen influencia en acetato de

butanoato, acetato de etilo, acetato o lactato concentraciones, significado
que estas esterasas no tienen impacto en la sntesis o hidrlisis
de estos steres en Aligot e vino.
En consecuencia, nuestro trabajo es el primer paso para proporcionar se- enolgica
lection criterios basados en el impacto de estA2 y estA7 en ster
perfil durante la FML e indica que el nivel de expresin de estA2
y estA7 genes podran ser utilizados como una aplicacin directa a la pantalla
futuras MLF comerciales. Esto permitira a los enlogos de usar
O. oeni fermentaciones de acuerdo con los beneficios de la caracterizados
O. oeni enzimas. El papel de O. oeni esterasas en el perfil de ster es mucho
de ser completa. De hecho, Versari et al. (1999) utilizaron el trmino
"Complejidad" para describir la contribucin de los microorganismos durante
ing envejecimiento del vino y no se oponen a los resultados sobre el efecto de la FML
en el sabor del vino.
Ahora, la expresin de esterasas en O. oeni se lleva a cabo en una
bacteria hostil que no es fcil de manipular genticamente y la
investigacin de los otros genes de esterasa en O. oeni , ESTC y ESTB,
que se han caracterizado in vitro, podra ser considerado ( Sumby
et al., 2012a, b ). Ms all del inters enolgico, este estudio confirma
la importancia de las herramientas moleculares desarrollado en el laboratorio para
el estudio de la funcionalidad de los genes relacionados con el vino en O. oeni en el vino
condiciones. Eso LAB enolgico, como O. oeni , puede ser genticamente
manipulada es de inters biotecnolgico, aunque en la actualidad esta
enfoque plantea dilemas sociales. Por otra parte, nuestro estudio en prctica
mentos una estrategia de auto-clonacin usando un sistema de expresin de calidad alimentaria
que podran utilizarse en lugar de la adicin de enzimas bacterianas, una tcnica
que las preferencias de los consumidores se oponen en la industria alimentaria en la actualidad
( Maischberger et al., 2010; Nguyen et al., 2011; Peterbauer et al.,
2011; S rvig et al., 2005 ).
Higo. 1. Los bloques de secuencias conservadas en torno a los residuos del sitio activo
en O. oeni ATCC BAA-1163 EstA2 y EstA7 (EAV39250.1) alineado con: AAF62860.1
(tributirina esterasa, L. lactis
subsp. cremoris MG1363 ( Helecho Andez et al., 2000 )), AGU56224.1 (tributirina esterasa
ESTA, Staphylococcus aureus subsp. Aureus 6850 ( Fraunholz et al., 2013 )), CCC80473.1
(acetil
esterasa, Lactobacillus plantarum WCFS1 ( Siezen et al., 2012 )), IY91553.1 (ESTA, Bacillus
subtilis subsp. Str subtilis. 168 ( Barbe et al., 2009 )), JX215243.1 (esterasa putativo
EstA2Oo28,
O. oeni Oeni28, Sumby KM, sin publicar) y JX215244.1 (EstA7Oo28 esterasa
putativo O.oeni Ooeni28, Sumby KM, sin publicar).
;
Los residuos de aminocidos que pertenecen a la
trada cataltica. ** El motivo GX putativo que contiene el agujero oxianin N-terminal es
indicada. Regiones idnticas estn sombreadas en negro y regiones conservadas estn
sombreados en gris. (Http: //
www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/ ). ( http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html ).
Higo. 2. La actividad esterasa relativa en E. coli (A) y O. oeni (B) de las cepas
recombinantes. Las clulas se cultivaron en medio LB a 37
C (E. coli) o en medio FT80m (O. oeni) hasta exponencial
fase de crecimiento. La actividad enzimtica se determin con extracto celular en 37
C sobre el sustrato p NP-butanoato sinttico. Los valores son los medios de los triplicados
desviacin estndar.

Los valores se muestran en relacin con la actividad basal detectado en cepas portadoras de
plsmido nativo (Ecsyn y Oosyn), que fue designado arbitrariamente 0. Las diferencias
significativas se basan en
pruebas t pareadas y unilaterales. ***, P
0,0005; **, P
0,005; *, P
0.05.