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Tcnicas Bsicas de Biologia

Molecular
Diamar Costa-Pinto
FIOCRUZ

Viso da Apresentao

PCR
Bibliotecas genmica e de expresso
Fragmentao - digesto
Separao - eletroforese
Clonagem molecular
Sequnciamento

Southern, Northern e Western blotting

By Diamar

Diagnstico do sculo 21
- Podemos fazer anlises genmicas,
pois a maioria dos cromossomo j esto
mapeados.
- O projeto genoma tem sido uma
grande ferramenta para unir genomas e
laboratrio clnico.

Mapas Genticos, Citolgicos e


Fsicos
EST Sequncias expressas marcadas.
cDNA curtos que ligam mapas fsicos a
genticos
RFLP- Polimorfismo dos comprimentos
dos fragmentos de restrio
By Diamar

Procurar um gene dentro de um genoma


humano comparvel a procurar uma pessoa
sem sobrenome em uma casa sem endereo
em uma rua desconhecida em uma cidade no
identificada de um pas estrangeiro.
Solange Farah

By Diamar

Enzimas de Restrio

1953 a eficincia de replicao de um


bacterifago dependia da clula hospedeira
Verificou-se, ento, a presena de nucleases
Bactria restringe o crescimento do fago e
protege o seu DNA metilando-o (modificando)
Fenmeno chamado restrio/modificao
Advento das endonucleases de restrio
Stio normalmente uma palndrome

By Diamar

Enzimas de Restrio
(continuao)

Palndrome:
ARARA
ARARA
OMO
OMO
ANA
ANA
By Diamar

Enzimas de Restrio
(continuao)

Reconhecem seqncias de 4 a 8 pares de


bases
Cortes com extremidades abruptas ou coesivas
Primeira letra maiscula gnero e as duas
outras minsculas so espcies
1073 foram usadas para clonagem molecular
Pode-se recombinar DNA humano com qualquer
outra espcie
Fragmentos separados por eletroforese

By Diamar

Enzimas de Restrio
(continuao)

By Diamar

By Diamar

Vdeo de Enzima de
Restrio

By Diamar

Eletroforese

J conhecida desde 1930


Difundida em 1950-1960
Movimentao de molculas submetidas a
campo eltrico
Usa um substrato: papel, agarose,
poliacrilamida
Separa protenas por cargas e peso molecular
Separa cido nuclicos por peso molecular

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Eletroforese

Fonte de eletroforese

Vertical

Visualizao do gel de agarose

Horizontal

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Eletroforese

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Vdeo de Eletroforese

By Diamar

Clonagem Molecular

Consiste no isolamento e propagao de


molculas de DNA idnticas

Primeiro: inserto + vetor = rDNA

Segundo: rDNA + clula hospedeira =


transformao

By Diamar

By Diamar

Engenharia Gentica (1970): o DNA recombinante permite isolar um


gene especfico, com uma caracterstica desejada, e transfere este
gene para outro organismo vivo
Clula humana

Bactria
DNA
Plasmdeo
Transformao

Digesto

Enzima de restrio
Tesoura gentica
Clonagem

DNA da bactria

rDNA

DNA da clula humana

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O DNA recombinante

No se limita a organismos de uma mesma espcie

A compatibilidade sexual torna-se irrelevante

Permite modificaes em uma nica gerao, o que


antes levaria dezenas ou centenas de geraes

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Vdeo de Clonagem
Molecular

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Vetor

So molculas de transporte
Molculas de DNA
Diversos tipos: plasmdeos, cosmdeos, fagos,
vrus, YACs, etc.
Diferenas de tamanho de inserto
Podem ter comportar linear e/ou circular

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Vetor
(continuao)

Vetores de expresso procariticos

Promotores fortes
Stios de ligao a ribossomos
Stios de clonagem

Vetores de expresso eucariticos

Origem de replicao eucaritica


Regio de controle de transcrio e traduo,
poliadenilao de mRNA, capping
Sinais especiais para processamento e secreo
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Vetor
(continuao)

Caractersticas gerais

Regio promotora
Stio Mltiplo de Clonagem - Polylinker
Gene de resistncia a antibiticos
Origem de replicao
Gene reprter

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Vetor
(continuao)

PLASMDEOS:

Penetra naturalmente nas bactrias


Fita dupla
Circular
Extracromossmico
Resistncia a antibiticos
Vetores shuttle
Insertos at 4000 pb
pUC 18, pUC 19
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Vetor
(continuao)

FAGOS

Vrus de bactrias
Fago o mais utilizado
Fita dupla linear
Recirculariza durante a infeco na bactria
Aceita at 20 mil pb

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Vetor
(continuao)

COSMDEOS

Pequeno tamanho 4 a 6 Kb
Engenherado: empacota rDNA no capsdeo do
fago para infectar bactria
Possuem seqncias cos
Aceitam insertos de at 50 mil pb

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COSMDEOS

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Vetor
(continuao)

YACs (Yeast Artificial Chromosome)

Clulas hospedeiras as leveduras


Comportam-se como cromossomos
Aceitam 400 mil pb
Possuem seqncias de DNA especficas de
levedura: telmero, centrmero e origem de
replicao

ARS: Seqncia de replicao autnoma


CEN: Seqncias centromricas

By Diamar

Engenharia Gentica Produo em srie

- Hormnio de crescimento
- Insulina humana
- Vacina da Hepatite B
- Hormnio sexuais
By Diamar

Sequenciamento

Frederick Sanger (1977), Inglaterra


Segundo Prmio Nobel
Sntese de DNA in vitro por trmino
didesoxi
Mapa fsico dos genes e dos
cromossomos
By Diamar

Sequenciamento
(continuao)

Hood: Semi-automatizado (1986)


Venter: Genoma de bactria usando
ddNTPs fluorescentes automatizados,
robticas e PCR (1995)
Perkins-Elmer Corp: Comercializado o
Sequenciamento totalmente automatizado
(1999)
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Consideraes
P

P
A

BN

C5
C4

C4

Ribose
C3
C2

OH

NTP
cido ribonucleico
5

O - Necessrio
para ligao
fosfodister

Polimerizao

C1

G
T

Pentose
C3
C2

OH

OH

BN

C5

C1

OH

ddNTP
dNTP (Didesoxinucleotdeo)
cido desoxirribonucleico
3

By Diamar

Estuda a integridade da sequncia de um DNA


molde. Analisa diferentes tamanhos de
fragmentos formados a partir de um primer e da
insero randmica de dNTPs (polimeriza) e
ddNTPs (para a reao) em gel de poliacrilamida.

Sequenciamento
A

DNA molde
Primer
DNA polimerase

ddNTP

G
dNTP

dNTP

dNTP

ddNTP

Fragmento 1

Fragmento 2

dNTP

ddNTP

dNTP

dNTP

Fragmento 3

By Diamar

Sequenciamento automatizado

Vdeo do Sequenciamento
(Cycseqpc)

By Diamar

Southern Blotting

E. M. Southern (1975)
Fragmentos de DNA so separados em gel de
agarose
Transferidos para membranas por ao capilar
DNA desnaturado antes ou durante a
transferncia
Sonda radioativa de DNA hibrida com o DNA na
membrana
Detecta polimorfismo de DNA ou mutao
By Diamar

Southern blot
Descrio:
- Digesto do DNA em teste com enzimas
de restrio;
- Resoluo dos fragmentos com
eletroforese em gel de agarose;
- Transferncia do DNA para membrana de
nylon;
- Hibridao com uma sonda de DNA ou
RNA marcada com radioatividade ou
quimioluminescentes
Aplicao: Alteraes em um nico
nucleotdeos; deteco de inseres, delees
e rearranjos; ordenamento de fragmentos do
DNA em um mapa fsico; fragmentos de
cromossomo.
Com o advento da PCR seu uso tornou-se
limitado.

By Diamar

Southern blot

Sonda de cDNA para o


gene humano ligado ao X
de receptor de andrgeno
hibridando no genoma
digerido do paciente.

46, XY.Sndrome da insensibilidade


andrognica. Vagina em fundo de
saco, sem tero ou tubas uterinas.
1:20.000. Testculos no abdome ou
canal inguinal (confundidos com
hrnias, na infncia). Defeito
molecular:
varia
de
deleo
completa do gene a mutaes de
ponto nos domnios de ligao de
andrgenos ou ligao ao DNA da
protena receptora de andrgeno.

Exemplo da especificidade das


sondas.

By Diamar

Vdeo de Southern blot


(DNA _DetectivePC)

Northern blotting

Corrida de RNA totais ou mRNA em gel de


agarose
RNAs devem ser desnaturados (formaldedo)
Sensibilidade a RNAses
Transferncia para membrana por ao capilar
Sondas de RNA ou DNA para hibridar

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Northern blotting
(Continuao)

teis em estudo de expresso gnica


Estudo de diferentes tecidos
Estuda o padro temporal de expresso
de genes durante o crescimento do
indivduo

By Diamar

Northern blotting

Marcadores
rRNA

RNAs totais de razes (R), folhas (L) e flores (F).


A sonda de -tubulina hibrida todos
B - sonda de 1- tubulina hibrida s flores
C - sonda de 3- tubulina hibrida todos
By Diamar

Western blotting

Corrida de protenas em gel de poliacrilamida


Separao e caracterizao de protenas
Uso de SDS (sdio dodecil sulfato) para
desnaturao
Transferncia para membrana por fora eltrica

By Diamar

Western blotting
(continuao)

Protena alvo identificada por anticorpo mono


ou policlonal
Revelao do sistema com anticorpo secundrio
fluorescente ou radioativo
Informa o tamanho e a quantidade das protenas

By Diamar

Western blotting

By Diamar

Western blotting
Anlise de protenas por anticorpos especficos aps
eletroforese e transferncia para membrana.

By Diamar

Vdeo Immunoblotting
(3EIMMBLOT)

RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrio

Uso de enzimas de restrio


Produo de fragmentos de DNA de tamanho
adequados para serem utilizados
As Enzimas de restrio so: previsveis, pouco
frequentes e clivam fragmentos stio-especficos de
DNA
Aplicao: compara alelos normais e afetados para
cada mutao estudada.

Mapa de Restrio

By Diamar

PCR - RFLP

By Diamar

RFLPs
Polimorfismo dos comprimentos dos
fragmentos de restrio

Um caso de erro inato do metabolismo:


G-6-P-D (glicose-6-fosfato-desidrogenase)
By Diamar

RFLP de Planta
DNAs genmico de
Arabidopis digerido
com EcoRI.
Southern blotting
com sonda azul e
verde.
F1 heterognio
possui fragmentos de
ambos os genitores.
F1 autopoliniza:
1:2:1 Ecotipo
diferentes: CColombia, NNiederzenzes e H
Heterozigoto.

Oligonucleotdeo aleloespecfico (ASO)

Descrio:
- Hibridao preferencial de sonda
marcada para testar DNA com composio
de bases complenmentar nica.
Aplicao:
- Alelos de composio conhecida.

Mutao conhecida. Revela uma nica


alterao de base. Distingue hetero ou
homozigotos para a sequncia. A anlise
restrita a mutao familiar conhecida ou para
distrbios genticos com n finito de
mutaes diferentes. Ex: beta-talassemia.
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FISH
Hibridao in situ com fluorescncia

Detecta DNA localizados dentro de cromossomos


Usa lminas de microscopia
Cromossomos esto em metfase, anfase e
interfase
Usa sondas de DNA especficas

By Diamar

FISH
(Hibridao in situ com fluorescncia)

Prader-Willi: Imprinting genmico deleo no


cromossomo 15 paterno.

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FISH
(Hibridao in situ com fluorescncia)
Relao evolutiva
entre cromossomos.
DNA de gibo
Hylobates lar
sondado com DNA
Humano.
Setas indicam
cromossomo 8 do
gibo.

Cromossomo
humano 4 hibrida
com cromossomo
(laranja) do macaco
verde africano.
Evoluo cromossmica em mamferos

SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples


) Mtodo baseado na
mobilidade eletrofortica.

Protocolo Bsico

) Gel no desnaturante.

) PCR do gene alvo.

) Sensvel para

) DNA desnaturado.

tamanho e forma da fita


simples.

) Detecta a mudana
de uma base.

(eletroforese)

) Mobilidade diferente
da normal indica
mutao.

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SSCP
Single-strand conformational polymorphism

Polimorfismo Conformacional da Fita Simples


Heterozigoto
) Fragmentos at
200 pb 90% de
sensibilidade.
) Fragmentos
maiores que 400 pb
- 80% de
sensibilidade.
(digesto )

Microarray Chip de DNA


Microarranjos de DNA

Southern blotting em lmina


Chips de genes

Pode conter mais de 10.000 sondas oligonucleotdicas

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Microarray Chip de DNA


Microarranjos de DNA

Microdisposio de oligo ou de sondas


- Microssntese de oligos in situ (no chip)
- Distribuio de sondas oligonucleotdicas pr
fabricadas
- Distribuio de fragmentos de DNA ou cDNA

Hibridao com mRNA ou cDNA fluorescentes

Leitura por scanners


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Microarray
Microarranjos de DNA Chips de DNA
 uma tcnica que emprega arranjos (arrays),
que contm um grande nmero de genes
roboticamente distribudos de forma ordenada em
uma placa de vidro.
Pode comparar a expresso de um grande
nmero de gene, simultaneamente.
 Existem lminas de 400.000 pontos.
So feitas com ponteiras de titneo.

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Microarray Chip de DNA


Microarranjos de DNA

Deteco de mutaes gnicas e de polimorfismos

Deteco de Expresso gnica em diferentes tecidos


sob condies normais e anormais

Sequenciamento do DNA e genotipagem

Microarray Chip de DNA


Microarranjos de DNA
Contras

Utilizao

Tcnica cara

- Mapear mutaes

Sensibilidade reduzida

- Oncogenes

Lminas no so reutilizadas

- Expresso das vias


metablicas

Repetir vrias vezes

- Regies regulatrias
de genes de levedura

Grande quantidade de
mRNA (2 a 5 g)

- Expresso de genes
annimos
- Analisar 10.000 amostras
em 12 horas

Microarray Chip de DNA Microarranjos de DNA

Descrio:
- Hibridao do DNA em
teste com disposies
ordenadas de nucleotdeos
em chip de silicone.

Aplicao:
- Deteco de DNA em
teste com composio
conhecida.

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Referncias Bibliogrficas:

MARSHALL, A., and HODGSON, J. 1998. DNA chips: array


of possibilities. Nature Biotechnology, 16:27-31.
MULLINS, K. B. 1990. The unusual origin of polymerase
chain reaction. Sci. Amer. 262(4): 56-65.
SANGER, F., Nickelen, S. And Coulson, A. R. 1977. DNA
sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S. 74:5463-5467.
SOUTHERN, E.M. 1975. Detection os specific sequences
among DNA fragments separated by gel eletrophoresis. J.
Mol. Biol. 98:503-517.

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Obrigada!

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