ISSN 0568-3076

agron. 17(2): 7 - 24, 2009

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES DE PLANTAS DE ORIGEN

BITICO

scar Adrin Guzmn-Piedrahita*, Jairo Castao-Zapata* y Bernardo Villegas-Estrada*

*

Programa de Maestra en Fitopatologa, Facultad de Ciencias Agropecuarias, Universidad de Caldas, Manizales. Correo electrnico: oscar.guzman@ucaldas.edu.co
Recibido: 18 de enero; aprobado: 28 de abril de 2009.

Diagnstico de enfermedades de plantas es un arte. Progreso es el resultado de prctica. Es similar al

progreso obtenido jugando golf o tocando violn, asumiendo que uno tiene aptitud para ello. Se requiere
mucho tiempo desarrollar destreza. No hay sustituto para la experiencia.
Rubert B. Streets, SR; 1972

RESUMEN
Las enfermedades de las plantas ocasionadas por
microorganismos infecciosos como hongos, bacterias,
nematodos y protozoarios flagelados, y por agentes
como virus y viroides, son el producto de la interaccin
dinmica entre un patgeno, un hospedante y el medio
ambiente. El primer paso para el manejo correcto de una
enfermedad es conocer su verdadera etiologa. Se conocen
ms de 1.300 especies de hongos que causan enfermedades
en los principales cultivos alimenticios, adems de 4.105
especies de nematodos fitoparsitos, 950 especies de
virus y 30 de viroides, y alrededor de 100 especies de
bacterias fitopatgenas. Existen varios procedimientos
para determinar la etiologa de enfermedades de plantas
tales como, la observacin directa del agente causante al
microscopio compuesto, tcnicas inmuno-enzimticas,
bioqumicas y moleculares, y microscopa electrnica. Para
un diagnstico correcto, se debe disponer de laboratorios
adecuados de Diagnstico Fitosanitario, a los cuales deben
enviarse muestras frescas y representativas de plantas que
presenten sntomas tpicos de la enfermedad, para poder
conocer con exactitud su etiologa. El diagnstico es el
fundamento tcnico y cientfico para adoptar medidas de
manejo rpido y oportuno.

Palabras clave: bacteria, etiologa, hongos, nematodos,

patgeno, viroides, virus.

ABSTRACT
DIAGNOSIS OF PLANT DISEASES OF
BIOTIC ORIGIN
Plant diseases caused by living infectious microorganisms
such as fungi, bacteria, nematodes, and flagellate protozoa,
and by agents such as viruses and viroids, are the result of
the dynamic interaction between a pathogen, a host and the
environment. The first step for the correct management of
a plant disease is to know its real etiology. More than 1.300
fungi species which cause diseases in the main foodstuff are
well recognized along with 4.105 phytoparasite nematodes
species, 950 viruses and 30 viroids species, and around 100
phytopathogenic species of bacteria. There exists a variety
of procedures to determine the etiology of diseases in
plants including direct observation of the causing agent
through the compound microscope, immune-enzymatic,
bio-chemical and molecular techniques, and electron
microscopy. In order to carry out a correct diagnosis,
adequate Phytosanitary Diagnosis Laboratories must be
available where fresh and representative plant samples, with
typical symptoms of the disease, can be sent in order to
know exactly their etiology. The diagnosis is the technical
and scientific fundamental to take measures for a quick
and appropriate management.

Key words: bacteria, etiology, fungi, nematodes,

pathogen, viroids, viruses.

scar Adrin Guzmn-Piedrahita, Jairo Castao-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada

INTRODUCCIN
Las enfermedades de las plantas son ocasionadas
por microorganismos infecciosos o biticos
como hongos, bacterias, nematodos y protozoarios
flagelados, y por agentes infecciosos como virus
y viroides (Figura 1); as mismo, por factores no
infecciosos o abiticos, como alteraciones edafoclimticas y toxicidad por plaguicidas, entre otros
(Agrios, 2005).
La enfermedad es una interaccin dinmica entre
un patgeno, un hospedante y el medio ambiente,
la cual causa en los hospedantes cambios anormales
de tipo fisiolgico y morfolgico. Por consiguiente,
enfermedad no es una propiedad del hospedante, sino
un producto de la interrelacin del hospedante y el
patgeno, bajo un ambiente especfico. La enfermedad
Figura 1.

A.

C.

puede considerarse tambin como las respuestas

visibles e invisibles de las clulas y tejidos de las
plantas a un agente infeccioso o factor no infeccioso,
que resulta en cambios adversos en la forma,
funcin o integridad de la planta, interfiriendo con
la formacin, traslocacin o utilizacin de nutrientes
minerales y agua, de tal manera que la planta afectada
cambia en apariencia y rinde menos que una planta sana
de la misma variedad (Agrios, 2005).
La etiologa se define como la determinacin del
agente causante de una enfermedad. Para tal fin, se
debe recolectar una muestra fresca adecuada de los
tejidos de las plantas que presenten los sntomas
tpicos de la enfermedad, que permita realizar un
anlisis correcto, para poder establecer las medidas
de manejo apropiadas (Agrios, 2005).

Enfermedades del pltano con sus respectivos microorganismos o agentes

infecciosos. A. Sigatokas negra y amarilla (Mycosphaerella fijiensis arriba y M.
musicola abajo), B. Rayado del banano (Banana streak Badnavirus, BSV), C.
Moko (Ralstonia solanacearum, raza 2) y D. Cabeza negra (Radopholus similis).
(Fotos: Autores).

B.

D.

Diagnstico de enfermedades de plantas de origen bitico

IMPORTANCIA DE LAS
ENFERMEDADES
Existen aproximadamente 350.000 especies de plantas,
de las cuales unas 3.000 son empleadas como alimento
por los humanos, constituyendo el 99% de suministro
de su alimento. De estas, solo 300 especies son
ampliamente cultivadas y solo 11 cultivos: arroz, maz,
trigo, sorgo, caa de azcar, papa, yuca, frijol, patata,
banano y coco, constituyen el 95% del suministro de
alimentos a la humanidad (Castao-Zapata, 1994). Ms
de 1.300 especies de hongos causan enfermedades en
estos cultivos (Farr et al., 1989).
Se conocen 26.646 especies de nematodos, distribuidas
entre especies de vida libre (10.681); y parsitos de:
invertebrados (3.501), vertebrados (8.359) y plantas
(4.105) (Hugot et al., 2001). Estos ltimos causan
prdidas anuales del 11 y el 14% en cultivos de
importancia como las leguminosas, granos, banano,
yuca, coco, remolacha azucarera, caa de azcar, papa,
hortalizas y varios frutales, equivalentes a US$80
billones ao (Agrios, 2005).
De las 2.290 especies de virus descritas por el Comit
Internacional de Taxonoma de Virus, se conocen
alrededor de 950 que afectan plantas, equivalente al
41% (ICTV, 2010). Se reportan alrededor de 30 viroides
que afectan cultivos importantes como: papa, tomate,
lpulo, aguacate y ctricos (Hammond & Owens, 2006).
Se conocen cerca de 1.600 especies de bacterias,
de las cuales 100 causan enfermedades en plantas,
equivalente al 16% (Agrios, 2005).

agron. 17 (2): 7 - 24, 2009

Las enfermedades de importancia econmica producen

prdidas en los cultivos en una o varias formas:

1. Reduccin en el rendimiento de las

plantas. Se puede generalizar que las enfermedades

de las plantas reducen el potencial de produccin en

los pases desarrollados en un 15 y 20% y an hasta
en el 100%, como el caso del Tizn tardo de la
papa [Phytophthora infestans (Mont.) de Bary], que en

1845 caus la destruccin de los cultivos de papa en

Irlanda. En Ceiln, hoy Sri Lanka, en 1868, la Roya
del caf (Hemileia vastatrix Berk. & Br.) fue responsable
de la substitucin del cultivo de caf por el t, cacao
y otros, debido a la imposibilidad de cultivar caf en
aquel pas. En Brasil, esta enfermedad causa prdidas
que oscilan entre el 20 y 30% (Zambolim & Ribeiro do
Vale, 1997). En Colombia, la Secadera del maracuy
[Nectria haematococca Berk. & Broome, anamorfo
Fusarium solani (Mart.) Sacc.], en el Valle del Cauca,
caus prdidas del 90 y 100% (Torres et al., 2000).
En musceas, la reduccin en el rendimiento por el
nematodo Barrenador (Radopholus similis Cobb.) puede
llegar hasta un 80% (Moens et al., 2003); mientras
que en soya, prdidas del 10 y 30% son ocasionadas
por el nematodo Quiste (Heterodera glycines Ichinohe)
(Davis & Tylka, 2000). La enfermedad viral de mayor
importancia que afecta al frijol en Amrica Latina es
el Mosaico dorado amarillo del frijol (Bean golden
yellow mosaic Begomovirus, BGYMV), el cual caus
prdidas entre el 40 y el100% en Argentina y Bolivia
(Morales, 2000). El Moko del pltano y banano
causado por Ralstonia solanacearum E. F. Smith raza
2, caus prdidas del 100% en la dcada del setenta
en el departamento del Caquet en donde destruy
20.000 ha de pltano (Belalczar et al., 2004).

2. Reduccin de la calidad del producto

cosechado. La Roa del maracuy [Cladosporium

herbarum (Pers.:Fr.) Link] ha tenido incidencias del

79 y el 100% (Torres et al., 2000), que demeritan la
calidad de los frutos.

3. Contaminacin del suelo. El aumento

de inculo de un patgeno en el suelo lo torna
eventualmente inapropiado para la siembra de
un cultivo susceptible en particular y requiere de
medidas directas de manejo, como tratamiento
qumico del suelo, u otra medida como rotacin de
cultivos (Castao-Zapata, 1994). Un buen ejemplo
en pasiflorceas es N. haematococca, que produce
clamidosporas, las cuales pueden sobrevivir en el
suelo por varios aos. Los nematodos Quiste de
la soya y la papa (H. glycines y Globodera rostochiensis

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scar Adrin Guzmn-Piedrahita, Jairo Castao-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada

(Wollenweber) Behrens, respectivamente) producen

quistes que les permiten sobrevivir por ms de 20
aos en el suelo (Perry & Moens, 2006).

4. Prdidas de poscosecha. En el departamento

de Boyac se ha registrado la Antracnosis de la curaba
[Glomerella cingulata (Stoneman) Spauld. & H. Schrenk,
anamorfo Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz. &
Sacc. en Penz] como responsable del 50% del ataque
de frutos (Jcome & Barreto, 1984).
5. Formacin de productos txicos. Los

patgenos de plantas, especialmente hongos, producen

toxinas como las aflatoxinas causadas por especies
de Aspergillus P. Mich. ex Link:Fr., en maz y otros
productos almacenados. Por ejemplo, la aflatoxina
B1 es producida por tres especies estrechamente
relacionadas: A. flavus Link:Fr., A. parasiticus Speare y
A. nomius Kurtzman, Horn & Hesseltine. Se conocen
unas 300 toxinas fngicas (Carrillo, 2003).

6. Incrementos en el costo de produccin.

Los patgenos causan enfermedades que resultan en

reduccin del rendimiento y calidad, lo cual provoca un
incremento en los costos de produccin como el caso
de la Sigatoka negra (Mycosphaerella fijiensis Morelet) del
banano, cuyos costos de control varan entre US$700
y 900 ha/ao, representando cerca del 13,8% de los
costos totales de produccin del cultivo y el 46% de los
costos de los agroqumicos (Chica et al., 2004).

7. Costos de manejo. El costo de la aspersin

semanal de un cultivo de maracuy con productos

cpricos para manejar la Bacteriosis [Xanthomonas
campestris (Pammel) Dowson pv. passiflorae Pereira]
se refleja posteriormente en un incremento de
precio al mayorista, al intermediario y, finalmente, al
consumidor. A mayor nmero de aspersiones, mayor
es el incremento en los costos de manejo (Botero et
al., 2006; Castillo & Granada, 2005).

8. Predisposicin a otras enfermedades.

Segn Paul Sorauer (1905), los patgenos afectan

plantas solamente si el medio ambiente las predispone

para que se tornen susceptibles. Algunos factores

biticos o abiticos pueden causar prdidas indirectas,
predisponiendo a las plantas a ataques subsecuentes
por otros patgenos como los nematodos, que
atacan las races de plantas y permiten la entrada
de otros microorganismos (Castao-Zapata, 1994).
El proceso de colonizacin de Fusarium oxysporum
Schlechtend.:Fr., en presencia de Meloidogyne javanica
(Treub) Chitwood, ha sido estudiado de tal manera
que hay mayor colonizacin de los tejidos de las
plantas por Fusarium, a medida que aumenta el
nmero de individuos de Meloidogyne (Perry et al.,
2009).
Las enfermedades que afectan las plantas pueden ser
causadas por diferentes microorganismos o agentes,
los cuales se describen a continuacin.

Hongos. Esta palabra proviene del griego sphongos,

que significa esponja (Harper, 2010). Las hifas miden

entre 2 y 10 m de dimetro hasta varios centmetros
de longitud. La mayora de las especies estn
compuestas por filamentos tubulares que pueden ser
cenocticos o septados, cuyo conjunto se denomina
micelio. Los componentes principales de las paredes
celulares de los hongos son celulosa, pectona y
quitina, y se distinguen por la carencia de clorofila,
posesin de ncleos y nuclolos con membranas
bien definidas (eucariotas). Su reproduccin se realiza
mediante esporas de origen sexual o asexual (CastaoZapata, 1994).

Bacterias. Palabra que deriva del griego bakterion, y

significa bastn pequeo cuyo tamao oscila entre 1

y 2 mm (Harper, 2010). Estos microorganismos son
unicelulares, cuyo material gentico (ADN) carece de
una membrana celular y por ello no est organizado
en un ncleo (procariotas). Sus clulas consisten
de citoplasma que contienen ADN y ribosomas
pequeos (70S). El citoplasma est rodeado por
una membrana y una pared celular. La mayora de
bacterias fitopatgenas tienen forma de bastn o
bacilo y poseen flagelos, usualmente en los polos, y
fimbrias o pili (Vidaver & Lambrecht, 2004; Agrios,
2005).

Diagnstico de enfermedades de plantas de origen bitico

Mollicutes. Nombre proveniente del latn mollis

(suave) y cutis (piel), son bacterias que carecen

de pared celular pero estn provistas de una
membrana celular trilaminar. Incluyen los llamados
anteriormente fitoplasmas y espiroplasmas, que son
organismos celulares ms pequeos con un tamao
de 0,3-1,2 m de dimetro y se autorreplican (Fletcher
& Wayadande, 2002).

Nematodos. Provienen de los vocablos griegos

nema (hilo) y eids u oidos (con aspecto de), son
definidos como animales filiformes con cuerpo sin
segmentos y ms o menos transparentes, cubierto
de una cutcula hialina, la cual est marcada por
estras o anillos; son redondeados, poseen boca y
carecen de apndices; aunque las hembras adultas
de algunos gneros son abultadas, como Meloidogyne
Goeldi y Heterodera Schmidt (Siddiqi, 2000; Perry &
Moens, 2006). La mayora son microscpicos, con
una longitud entre 300 y 1.000 mm, y entre 15 y 35
mm de dimetro (Agrios, 2005; Luc et al., 2005; Perry
& Moens, 2006).
Los nematodos parsitos de plantas tienen un estilete
hueco, tambin llamado lanza, pero hay algunos con
estilete slido modificado. El estilete es usado para
perforar o penetrar las clulas de la planta, y a travs
de l se extraen los nutrientes desde la clula (Luc et
al., 2005; Perry & Moens, 2006).

11

Virus. Proviene del latn virus, que significa veneno.

Los virus son agentes infecciosos compuestos de
una o varias molculas de cido nucleico (ADN o
ARN de cadena sencilla o doble) cubiertas por una
o varias capas de protena o lipoprotena capaces de
replicarse en las clulas de un hospedante susceptible
(Hull, 2009). Su tamao oscila entre 20 y 70 nm de
dimetro para los virus isomtricos y 150 a 2.200
nm de longitud para virus con forma de varilla. La
traduccin del genoma (para producir protenas) o
transcripcin y replicacin (para producir ms cido
nucleico) ocurre dentro de las clulas del hospedante
usando su maquinaria metablica (Adams &
Antoniw, 2010).
Viroides. Proviene de la unin de la palabra latina

virus que significa veneno y del sufijo oid que

significa imperfecto o incompleto. A diferencia
de los virus, los viroides son molculas de cido
ribonucleico (ARN) de cadena sencilla que ocasionan
enfermedades en varias especies de plantas. Sus
genomas son de 239 a 401 nucletidos de ARN
circular de cadena sencilla; adems, no codifican
protenas (Hammond & Owens, 2006).

PROCEDIMIENTOS PARA EL
DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
DE PLANTAS

Protozoarios flagelados. Provienen de las races 1. Clave para el diagnstico de agentes

griegas proto (primero) y zoo (animal), y del latn causantes de enfermedades

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flagellum, que significa flagelo, pero ms largo y capaz

de realizar movimientos (RAE, 2010).

Los protozoarios flagelados son microorganismos

unicelulares con uno o ms flagelos largos y delgados
en algunos o todos los estados de su ciclo de vida.
Los fitopatgenos pertenecen al gnero Phytomonas
(Kinetoplastida: Trypanosomatidae); tienen cuerpo en
forma de huso con extremos aguzados, entre 12 y 18
m de longitud y 1 a 2,5 m de ancho y con un flagelo
de 12 a 18 m de largo; su ncleo est situado a un tercio
del extremo anterior; se multiplican en el floema, y son
transmitidos por hempteros fitfagos (Agrios, 2005).

Una secuencia para iniciar el diagnstico consiste en

seguir la clave de French y Hebert (1982):
A1 Manchas y Chancros
B1 Signos de patgenos visibles al
microscopio estereoscpico.
C 1 Signos de hongos: Realice
preparaciones microscpicas de las
estructuras con tincin cuando sea
apropiadoI

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C2 Signos de bacterias (exudado

o manchas hmedas): Realice
preparaciones microscpicas para
observar flujo bacterial en campo
oscuro, luego efecte tincin de
Gram..II
B2 Ausencia de signos de patgenos.
C1 Incube la muestra en cmara
hmeda y luego regrese a
A1...III
C 2 Mosaicos, moteados u otros
sntomas virales posibles.
C3 Decoloracin y otros sntomas
de desnutricin.
A2 Marchitez

B1 Sistema radical afectado.

C1 Presencia de nematodos o sus
sntomas.
C2 Pudricin radical, tratar como A1
B2 Sistema vascular descolorado.
C1 Prueba de flujo bacterial en agua,
luego efecte tincin de Gram ..II
C2 Ausencia de flujo, hacer corte
para observar hongos...I

A3 Pudriciones
B1 Tallo o raz, tratar como A1
B2 rganos de reserva (tubrculos, races)
C1 Realice preparaciones
microscpicas y obser ve para
hongos, con tincin cuando sea
indicadoI
C 2 Hag a pre paraciones para
obser var bacterias en campo
oscuro (microscopio de contraste
de fase), luego realice la tincin de
Gram..II
C3 Inocule tejidos sanos con los
afectados cuando la pudricin es
avanzada; luego observe como C1
y C2.........IV

2. Secuencia para realizar un diagnstico

correcto
Para realizar un diagnstico correcto se recomienda
seguir la secuencia propuesta por Rubert Streets (1972):
a) Identifique la planta hospedante, adicionando
el nombre de la variedad.
b) Sntomas en el campo. Utilice su propia
informacin o use la proporcionada por quien
enva la muestra.
c) Condiciones de cultivo. Informacin del
tipo de suelo, prcticas de riego, fertilizacin y
aplicacin de plaguicidas.
d) Sntomas en detalle. Observacin de manchas,
aublo foliar, pudricin de semillas o frutos,
cancros en las ramas o tallos, pudricin o agallas
en las races, etc.
e) Observacin en aumento bajo. Observacin
con una lupa de alto aumento en el campo o un
estereoscopio en laboratorio de la superficie de las
lesiones o tejidos muertos; esto permitir observar
la presencia de esporas, cuerpos fructferos de
hongos o exudados bacteriales.
f) Observacin en aumento alto. Observacin
a travs del microscopio compuesto para detallar
las estructuras anteriores.
g) Aislamiento. Aislar el microorganismo
sospechoso en condiciones aspticas de laboratorio.
h) Patogenicidad. Si el patgeno observado es
el causante de la enfermedad, pero no existen
informes previos, entonces se debe recurrir a los
postulados de Robert Koch, establecidos en 1876:
1. Debe haber una asociacin constante
entre el organismo y el hospedante
enfermo.

Diagnstico de enfermedades de plantas de origen bitico

2. Se debe aislar el patgeno sospechoso

del hospedante enfermo y obtenerlo
en cultivo puro.
3. Se debe inocular un hospedante sano
con el cultivo puro del organismo
sospechoso y reproducir los sntomas
tpicos de la enfermedad.
4. Se debe reaislar el patgeno en
cultivo puro a partir del hospedante
inoculado y enfer mo y sus
caractersticas deben ser exactamente
iguales a las observadas en el cultivo
obtenido en el segundo postulado.
i) Diagnstico. Si el patgeno en observacin es
identificado con manuales especializados, o cuando
los postulados son demostrados, el patgeno
aislado es el responsable de la enfermedad.
j) Recomendaciones. Despus de diagnosticar
correctamente el agente causante de la enfermedad,
el agricultor se preguntar: qu puedo hacer
acerca de la enfermedad? y cul es el manejo?
Especificar la mejor medida de manejo de
cada enfermedad est fuera del alcance de
cualquier libro. La respuesta correcta a estos
interrogantes se obtiene consultando referencias
selectas, fundamentalmente a travs de la buena
experiencia que tenga el fitopatlogo, pues como
lo expres Rubert Streets, no hay sustituto para
la experiencia.
Si no se encuentra algn organismo o agente asociado
a la enfermedad, se asume que es causada por un
factor ambiental, el cual puede interferir con las
funciones fisiolgicas normales de las plantas.

agron. 17 (2): 7 - 24, 2009

3. Tcnicas inmuno-enzimticas
Constituyen una metodologa rpida para identificar
patgenos de plantas. El ensayo de inmuno-absorcin
ligado a una enzima (ELISA, por sus siglas en ingls)
es el ms ampliamente usado por su especificidad,
simplicidad y bajo costo. Esta tcnica que se realiza

13

en platos de poliestireno, utiliza la habilidad de los

anticuerpos (inmunoglobulinas) producidos por
el sistema linftico de un vertebrado de sangre
caliente (conejos, ratones, etc.) para reconocer
un antgeno especfico (protenas, eptopes o
determinantes antignicos), es decir, el agente,
sustancia o microorganismo extrao inyectado en
el torrente sanguneo del mismo; por lo tanto, la
reaccin ser especfica de cada anticuerpo para su
respectivo antgeno (Dewey, 2002).

4. Tcnicas bioqumicas y moleculares

La identificacin de bacterias se ha basado en
combinaciones de pruebas fisiolgicas y bioqumicas,
mientras que la identificacin de hongos se ha
realizado con base en caractersticas morfolgicas,
tales como tipo de espora, forma y color. Sin
embargo, en los ltimos 40 aos, los avances en
la bioqumica microbial y biologa molecular han
permitido la expansin de los mtodos de diagnstico
y procedimientos de identificacin de diferentes
patgenos de plantas (Bridge, 2002).
La deteccin de actividades fisiolgicas y bioqumicas
se realiza fundamentalmente sobre medios slidos o
lquidos, y se basa en la apariencia del crecimiento
o un cambio de color. Estas pruebas involucran la
adicin de sustratos apropiados al medio, junto con
un sistema que permite la deteccin bien sea de su
degradacin o de uno de los productos asociados con
ella (Bridge, 2002).
Las bacterias han sido identificadas por sus funciones
metablicas, tales como su habilidad para metabolizar
ciertos sustratos mediante el sistema API (Analytical
Profile Index) para diferenciar cepas de Erwinia y
Pseudomonas. Adicionalmente, el anlisis de protenas
solubles mediante electroforesis en geles ha sido
adoptado para hongos y bacterias (Strange, 2003).
La principal herramienta de diagnstico molecular
de microorganismos fitopatgenos es la Reaccin
en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en

14

scar Adrin Guzmn-Piedrahita, Jairo Castao-Zapata y Bernardo Villegas-Estrada

ingls) basada en los genes ribosomales. La PCR

es rpida, econmica y permite producir un gran
nmero de copias de molculas de ADN va catlisis
enzimtica, para mostrar diferencias en secuencias
de genes del ARN ribosomal (rARN) o ADN
mitocondrial (mADN) (Luc et al., 2005; Atkins &
Clark, 2004). Para el caso de agentes fitopatgenos
como los virus de ARN, es necesario sintetizar
una cadena de ADN complementario (cADN) por
medio de la enzima transcriptasa reversa (RT) como
paso previo. Esta tcnica tiene muchas variaciones
como la PCR anidada que consiste en dos PCR
sucesivas cuyos amplicones de una reaccin son
usados como molde de la siguiente. Otra variacin
incluye la captura de partculas virales mediante
anticuerpos llamada Inmunocaptura PCR (IC-PCR)
cuando las concentraciones de partculas virales son
muy bajas (Harper et al., 1999; Webster et al., 2004).
La deteccin conjunta de diferentes virus a partir de
la combinacin de cebadores especficos para cada
uno de ellos es una variacin de esta tcnica llamada
RT-PCR mltiple (Ito et al., 2002).
Hibridacin molecular mediante sondas: Se
basa en la capacidad que tienen los cidos nucleicos
de desnaturalizarse y volverse a unir con hebras
complementarias en condiciones apropiadas en
membranas de nylon o nitrocelulosa (Conci, 1999).
Las tcnicas de hibridacin ms utilizadas son
el Southern blot, la cual detecta secuencias
especficas de ADN, el cual se asla del tejido mediante
extraccin y separacin por electroforesis, se purifica
y se digiere (fragmenta) con enzimas de restriccin
especficas. Northern blot es una variante del
mtodo anterior en el que se usa el ARN como objeto
de estudio (Corvaln, 2002). Dot blot y Slot blot
son procedimientos similares al Northern blot
con la diferencia de que las muestras son colocadas
directamente sobre la membrana de nitrocelulosa
(Dijkstra & De Jager, 1998; Hull, 2002).
ARN de cadena doble (cdARN): Es utilizada para
el diagnstico de virus fitopatgenos, asociados con la
infeccin de virus de ARN monocatenario (csARN),

ya que estos durante su proceso de replicacin

forman una cadena doble intermedia con un ARN
complementario que sirve de molde para la sntesis
de ARN mensajero (Fisher, 2008).
Mapas de restriccin: Esta tcnica se basa en que
de una molcula de ADN se pueden obtener siempre
los mismos fragmentos cada vez que sea expuesta
a una enzima de restriccin particular. Una de las
tcnicas ms utilizadas es el anlisis de polimorfismos
de longitud de fragmentos de restriccin (RFLP,
por sus siglas en ingls), en la cual se determinan las
variaciones en la constitucin gentica de la poblacin
(polimorfismo gentico), demostrando diferencias
entre los individuos en cuanto al nmero y longitud
de los fragmentos producidos (Granner, 1992).

5. Tcnicas de microscopa de luz

La microscopa de luz permite la observacin
de inclusiones virales, es decir, la acumulacin
de partculas virales, protenas, material celular
modificado o mezcla de estos. Las inclusiones
deben observarse a magnificaciones de 1.000X con
el objetivo 100X. Se hacen cortes de los tejidos
epidrmicos de hojas de muestras frescas y se ponen
en contacto con soluciones de tintes como, por
ejemplo, calcomina naranja o Azure A. Esto permite
la clasificacin de varios gneros de virus (Christie &
Edwardson, 1977; Conci, 1999).

6. Tcnicas de microscopa electrnica

Permite la observacin del macerado de tejidos de
plantas infectadas con virus, con el fin de detectar
y medir el tamao de partculas virales a travs del
Microscopio Electrnico de Transmisin, usando la
tcnica de tincin negativa con acetato de uranilo.
Tambin con la ayuda de antisueros especficos se
aplica la tcnica de inmuno-microscopa electrnica
(ISEM, por sus siglas en ingls) para atraer partculas
virales a las rejillas de observacin en caso de

Diagnstico de enfermedades de plantas de origen bitico

existir relacin antignica (Morales et al., 2006). El

microscopio electrnico permite magnificar entre
200.000 y 600.000 veces el tamao de las partculas.

o base del tallo. Por consiguiente, la muestra debe

corresponder al sitio real de ataque de la enfermedad
(Figura 2F).

IMPORTANCIA DE LAS MUESTRAS

EN EL DIAGNSTICO CORRECTO DE
ENFERMEDADES

Revise la presencia de lesiones, agallas, cancros

(heridas) u otros sntomas que puedan tener las races,
tallos, ramas o frutos, para escoger las partes de la
planta que presenten los sntomas caractersticos de
la enfermedad (Figura 2G).

Para un buen diagnstico no basta con observar

los sntomas; en lo posible, debemos apoyarnos
en laboratorios de Diagnstico Fitosanitario, los
cuales requieren del envo de muestras frescas,
representativas de plantas enfermas, o partes de ella
como: races, tallos, hojas, flores o frutos (Dees et al.,
1986; Hansen & Wick, 1993; ICA, 1996; Putnam,
1995) (Figura 2A), que presenten los sntomas
tpicos de la enfermedad, para poder conocer con
exactitud la etiologa de la enfermedad bajo estudio
(Ocampo et al., 1994; Horst, 2001). El diagnstico
es el fundamento tcnico-cientfico para adoptar
medidas de manejo rpido y oportuno (ICA, 1996).
Una muestra ptima debe mostrar el tejido de la
planta realmente enfermo (Figura 2B).
La muestra colectada debe tener tejido sano y
enfermo, es decir, todos los estados de desarrollo de
la enfermedad, mostrando los sntomas iniciales y
finales de la enfermedad (Figura 2C).

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La cantidad de material vegetal recolectado debe ser

adecuado, que permita analizar el tejido enfermo
y dejar muestras para anlisis posteriores. Si las
plantas son de porte bajo o arbustos, seleccione al
menos cinco plantas completas con el problema e
incluya una planta con apariencia normal o sana para
comparacin (Figura 2D); si son rboles, seleccione
nicamente la(s) parte(s) del rbol que tenga(n) los
sntomas, es decir, hojas, partes del tallo, flores o races
afectadas (Figura 2E).
Las hojas marchitas o necrticas no necesariamente
contienen el patgeno, debido a que puede ser el
resultado de la accin de este en el sistema radical

Si sospecha que es un hongo el que est causando

la enfermedad, cercirese de que est esporulando
sobre el tejido vegetal. Si cree que es una bacteria,
observe si hay marchitamiento de la planta, pudricin
de races o cuello de la planta o lesiones foliares sin
estructuras reproductivas (Figura 2H).
No recolecte tejidos con exceso de humedad por
lluvia, riego o roco y tampoco en descomposicin,
ya que cuando estos son empacados en cajas de
cartn, el exceso de humedad favorece el crecimiento
de microorganismos secundarios que deterioran y
contaminan la muestra dificultando el diagnstico
(Figura 2I).
Procure tomar fotos de plantas completas con los
sntomas de la enfermedad, al igual que de plantas
sanas, y envelas rpido al laboratorio (Figura 2J).
En plntulas y plantas de porte bajo o anual, se
recomienda extraer la planta completa con las races
y suelo que la rodea, luego colquela en una bolsa
de plstico y sujeta con cinta, o envuelta en papel
peridico o caja de cartn, para evitar que el suelo
se desprenda de las races (Figura 2K).
En arbustos, rboles anuales, bianuales y perennes,
las races gruesas (primarias y secundarias) y delgadas
(terciarias y cuaternarias) NO deben ser lavadas con
agua para retirar el suelo. Estas se envuelven en papel
absorbente o toallas de papel, para luego empacarlas
en una bolsa de plstico o caja de cartn (Figura 2L).
Si los tejidos enfermos son tallos y ramas, se cortan
trozos del tejido afectado y en los extremos se puede
colocar parafina para evitar la prdida de humedad

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(deshidratacin). Estas muestras pueden empacarse

en sobres de manila, papel grueso parafinado o cajas
de cartn (Figura 2M).
Hojas, yemas y flores afectadas se envan secas o
sin humedad exterior, extendidas en medio de papel
toalla, servilletas, papel peridico o bolsas de papel
absorbente. Despus, se pueden envolver en papel
aluminio o protegerlas dentro de bolsas plsticas,
procurando que no se daen en el transporte (Figura
2N).
Si se trata de frutos, tubrculos y bulbos enfermos,
se seleccionan como muestra aquellos que presenten
sntomas iniciales e intermedios de la enfermedad.
Cuando se requiera, dejarlos secar al ambiente
para eliminarles el exceso de humedad y evitar
su dao. Posteriormente, se envuelven en papel
toalla, servilletas, papel peridico o bolsas de papel
absorbente; y cuando sea posible, envolverlos en
papel aluminio para luego empacarlos dentro de una
caja de cartn o bolsa de plstico (Figura 2O).
Tejidos que se sospechen estn afectadas por virus
y mollicutes no deben estar muertos o demasiado
afectados; las hojas deben presentar sntomas como
amarillamientos, mosaicos, clorosis o necrosis foliar,
deformaciones y manchas anulares; las flores con
variegacin y deformaciones, y los frutos con necrosis
y deformaciones (Figura 2P). El tejido vegetal se
envuelve en papel toalla, servilletas, papel peridico o
bolsas de papel absorbente. Para evitar que se daen
deben colocarse dentro de dos lminas de cartn,
despus empacarlas en papel aluminio y, luego,
en bolsa de papel. Nunca en bolsa plstica. Las
muestras de diferentes plantas deben empacarse por
separado, no deben mezclarse. As mismo, no deben
refrigerarse ni congelarse, y preferiblemente se deben
enviar al laboratorio inmediatamente (Figura 2Q).
De un lote donde se va establecer un cultivo y
se quiere recolectar una muestra para anlisis de
nematodos, las arvenses (malezas) y residuos deben
ser retiradas del sitio. Recolecte las muestras segn las
condiciones de suelo, muestreando por separado reas

de diferente topografa (plana, ondulada, pendiente),

reas de diferente cultivo (maz, frijol, caf) y reas
de diferente textura (arenosos, arcillosos, limosos)
(Figura 2R). La muestra debe estar conformada por
40 submuestras/ha, tomadas a la profundidad de las
races alimenticias (entre 5 y 30 cm) con un paln.
Para cubrir todo el terreno, la distancia entre sitios
donde se tomen las submuestras debe ser similares,
por ejemplo, cada 7 m (Dees et al., 1986) (Figura 2S).
En cultivos anuales o perennes la muestra se recolecta
del plato de 20 plantas que estn bien distribuidas
en una hectrea. En cada planta, se recolecta una
submuestra por punto cardinal (Oriente, Occidente,
Norte y Sur) a una distancia que vara segn el rea de
races en el plato del rbol (ejemplo: 0,5; 1,0; 1,5 y 2,0
m para frutales como guayabo y ctricos; 10, 20, 30 y
50 cm, para pltano y pitahaya) y a una profundidad
entre 5 y 30 cm, se toman 200 g de races y suelo de
cada planta, y se depositan en un balde. Despus de
recolectar las 20 submuestras, se mezclan bien para
conformar una muestra compuesta de 2 kg de suelo
y races que se depositan en una bolsa de plstico
(Figura 2T).

CONSIDERACIONES PARA TENER

EN CUENTA DESPUS DE LA
RECOLECCIN DE LA MUESTRA
1. Evite que los tejidos se deterioren por el
calor, metiendo la muestra en una caja de
icopor con hielo, nevera o en un lugar fresco,
ya que el diagnstico se dificulta cuando las
muestras llegan al laboratorio marchitas,
maltratadas o podridas.
2. La muestra debe ser entregada tan rpido
como sea posible al Laboratorio de
Diagnstico (mximo en dos das). En caso
extremo, debe colocarse en un refrigerador
o en un cuarto fro, entre 4 y 8C, para evitar
su deterioro y enviarla al da siguiente.
3. Las muestras de suelo o races para anlisis
de nematodos fitoparsitos deben conservar
humedad para evitar su muerte.

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4. La muestra recolectada debe ir acompaada

del respectivo protocolo completamente
diligenciado. En el caso de no tener el
formato, se debe anotar en una hoja
la informacin general de la finca, las

Figura 2.

A.

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B.

C.

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caractersticas principales de la muestra que

se va a procesar, los aspectos generales del
cultivo, las condiciones edafo-climticas, los
diferentes productos qumicos que se haya
aplicado, entre otros.

A. Muestra vegetal. B. Muestra ptima. C. Componentes de una buena muestra. D. Cantidad

ptima de una buena muestra. E. Muestras de plantas de porte bajo, arbustos o rboles. F.
Muestras indicando el sitio real de infeccin. G. Muestras con presencia de lesiones agallas o
cncros. H. Muestras con signos del agente causante. I. Muestras con exceso de humedad. J.
Sntomas de enfermedades en plantas completas. K. Muestras de races de plntulas y plantas
de porte bajo o anuales. L. Muestras de races de arbustos, plantas anuales, bianuales y perennes.
M. Muestras de tallos y ramas. N. Muestas de yemas y flores. O. Muestras de frutos, tubrculos
y bulbos. P. Muestas afectadas por virus y fitoplasmas. Q. Empaque de muestras afectada por
virus y Mollicutes. R. Recoleccin de muestras para nematodos. S. Recoleccin de submuestras.
T. Recoleccin de muestras en cultivos anuales y perennes. (Fotos: Autores).

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D.

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