Curso de Inmunologa General Laboratorio

Introduccin a la inmunologa celular

Semestre 2011-2

EJERCICIO EXPERIMENTAL 7
3XULILFDFLyQGHJ-JOREXOLQDVDSDUWLUGHSODVPDKXPDQR
OBJETI VO
3XULILFDU-globulinas del plasma humano.
CM O?
A travs de la purificacin fraccionada con sales neutras.
I NTRODUCCI N
La precipitacin con sulfato de amonio es uno de los mtodos ms comnmente usados
para extraer protenas de una solucin. Las protenas en solucin forman puentes de
hidrogeno con el agua a travs de sus grupos inicos y polares expuestos. Cuando se
adicionan altas concentraciones de pequeos iones muy cargados, estos hacen que
disminuya la solubilidad de las protenas y precipiten. Los factores que pueden afectar
la concentracin a la cual una protena particular precipite incluyen el nmero y
posicin de los grupos polares, el peso molecular de la protena, el pH de la solucin y
la temperatura a la cual se lleva a cabo el proceso.
(QHVWHPpWRGRVHSUHFLSLWDDOD-globulina mediante la adicin de solucin saturada a
temperatura ambiente de sulfato de amonio a tener una concentracin en la mezcla de
1/3 de saturacin. Esta precipitacin se realiza varias veces. El sulfato de amonio queda
DWUDSDGR HQ HO SUHFLSLWDGR TXH SRVWHULRUPHQWH VH HOLPLQD PHGLDQWH GLiOLVLV (O
producto resultante de ste mtodo no se encuentra totalmente puro, estar contaminado
con otras protenas de alto peso molecular y con protenas que quedan atrapadas en el
precipitado. Por esta razn, la tcnica se usa para concentrar y purificar parcialmente
anticuerpos de todas las fuentes y especies y se recomienda combinarla con otra como
cromatografa de intercambio inico o exclusin molecular, para mayor eficiencia en la
purificacin; es barata, fcil y conveniente para grandes volmenes.
M ATERI AL:
- 1 Vaso de precipitado de 100mL.
- 1 Agitador magntico.
- 1 Magneto
- 1 Pipeta de 10mL
- 2 tubos para centrfuga de plstico de 50mL
- 1 Pipeta Pasteur
- 1 Bulbo
- 1 Propipeta
- 1 Centrifuga con cabezal para tubos de 50mL
- 1 Frasco de 500mL
- 10 cm Bolsa de dilisis

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- Hilo camo
- Papel tornasol, papel pH o potencimetro
- 10 mL plasma humano
- 15mL Sulfato de amonio saturado.
- 20mL Solucin salina isotnica (SSI) al 0.85
- 1 mL NaOH al 2N
- 5mL BaCl2 al 10%.
- 1 L de solucin amortiguadora de fosfatos (PBS) pH 7.6.

M ETODOLOGI A:
1.- En un vaso de precipitado de 100mL con un magneto, colocar un volumen medido
de plasma o suero humano. Poner en agitacin constante a baja velocidad, evitando la
formacin de espuma.
2.- Adicionar gota a gota la cantidad adecuada de solucin saturada de sulfato de
amonio al plasma para tener 1/3 de saturacin de sal neutra (para 10mL de plasma,
adicionar 5mL de solucin saturada de sulfato de amonio). La adicin debe ser lenta
para evitar que precipiten protenas indeseables. Al principio el precipitado se
redisuelve inmediatamente y no se debe agregar otra gota hasta que esto haya sucedido,
de lo contrario quedan englobadas en el precipitado otras protenas.
3.-Una vez que se ha adicionado todo el sulfato de amonio, ajustar el pH a 7.8 con
NaOH 2N.
4.- Continuar con la agitacin durante 20min a temperatura ambiente para eliminar
mecnicamente las protenas que hayan quedado englobadas en el precipitado de .globulina.
6.- Centrifugar durante 5min a 2500 rpm. Este precipitado contiene toda la .-globulina,
pero impurificada con trazas de albmina.
7.- Eliminar el sobrenadante y resuspender el precipitado obtenido con SSI hasta tener
el volumen inicial de plasma.
8.-Despus de haber resuspendido la protena, repetir la precipitacin dos veces ms:
para la segunda precipitacin repetir los pasos 1-7 y para la tercera del 1-6. En total se
debe precipitar la protena tres veces.
9.- Despus de la tercera precipitacin y una vez centrifugado, resuspender el
precipitado con amortiguador de fosfatos en cantidad igual a la mitad del volumen
inicial de plasma (si se inici con 10mL de plasma, se afora a 5ml)
10.- Eliminar el sulfato de amonio mediante dilisis con PBS, cambiando esta solucin
cada 12-24 h y manteniendo a 4 C durante este proceso.

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11.- Continuar con el proceso de dilisis hasta que el dializado de negativo a la reaccin
para sulfatos, la cual consiste en agregar unas gotas de BaCl2 al 10% a una muestra del
dializado, si se forma un precipitado blanco de BaSO4 la dilisis an no ha terminado.
12.- Recuperar la solucin de .-globulinas purificadas de la bolsa de dilisis cuando ya
no contenga sulfato de amonio, y pasarla a un tubo de centrifuga de 50mL.
13.- Centrifugar en fro durante 10 min a 2500 rpm para eliminar partculas insolubles
que se forman durante la dilisis. La solucin final debe presentar slo una ligera
opalescencia.
14.- Envasar la .-globulina purificada en un frasco vial.
15.- Etiquetar con los siguientes datos: Nombre del producto, fecha de obtencin,
volumen, equipo.
NOTA: Para el manejo y desecho del material biolgico potencialmente infeccioso
seguir las indicaciones mencionadas en la NORMA Oficial Mexicana NOM-087ECOL-SSA1-2002.