Keep an Eye on PPi: The Vacuolar-Type H+-Pyrophosphatase Regulates

Postgerminative Development in Arabidopsis

Jauhkan Eye on PPi: The vakuolar-Type H -Pyrophosphatase Mengatur
Postgerminative Pembangunan di Arabidopsis
+

Pengantar
ATP adalah molekul utama untuk penyimpanan dan transfer biokimia
energi di semua organisme hidup, dari yang paling sederhana sampai yang paling
kompleks. Namun, di hampir 200 reaksi biokimia yang dikenal,
Hidrolisis ATP rilis pirofosfat (PPi), yang menjadi
inhibitor metabolik pada konsentrasi tinggi dalam sel dan
harus dihidrolisis segera untuk memfasilitasi biosintesis
berbagai makromolekul (Heinonen, 2001). Pada tumbuhan biji, pada
imbibisi, biji terhidrasi beralih dari ketenangan ke yang sangat
metabolisme aktif untuk mengatasi pertumbuhan postembryonic cepat.
Pada awal perkecambahan minyak sayur, ketika mereka masih tidak dapat
melakukan fotosintesis karena kurangnya fungsional dibedakan
kloroplas, embrio terutama dipelihara oleh
daur ulang dari protein penyimpanan dan lipid yang menyediakan nitrogen
dan sumber karbon, masing-masing. Secara bersamaan, metabolisme aktif,
termasuk proses biosintesis untuk makromolekul seperti
protein, DNA, RNA, dan selulosa dimulai bersama dengan
asam lemak b-oksidasi dan metabolisme Suc. Akibatnya, banyak
reaksi biokimia ini menghasilkan PPi sebagai oleh-produk
(Maeshima, 2000; Heinonen, 2001) dan meningkatkan konsentrasi PPi
dalam sitosol.
Dalam Arabidopsis thaliana, yang vacuolar H + -translocating pyrophosphatase
(V-PPase) menggunakan energi dari hidrolisis PPi untuk
daya aktif proton transportasi melintasi membran (Martinoia
et al., 2007). Umumnya, aktivitas V-PPase tinggi di muda
jaringan ditandai dengan aktivitas proliferasi tinggi (Martinoia
et al., 2007). Pentingnya pyrophosphatases telah dilaporkan
di beberapa organisme lain. Misalnya, gen ppa adalah
penting untuk pertumbuhan Escherichia coli; pada kenyataannya, ketika pyrophosphatase
yang
tingkat menurun, tingkat PPi meningkat dan
Pertumbuhan berhenti (Chen et al., 1990). Demikian pula, di Saccharomyces
cerevisiae, protein IPP1 sangat penting untuk kelangsungan hidup
ragi sel (Lundin et al., 1991). Selain itu, mutan nol PYP-1, sebuah
cacing (Caenorhabditis elegans) gen PPase, mengungkapkan perkembangan
menangkap pada tahap larva awal dan dipamerkan cacat kotor di
morfologi usus dan fungsi (Ko et al., 2007). Dalam Arabidopsis,
V-PPase loss-of-fungsi mutan avp1-1 telah
dilaporkan memiliki perkembangan sangat terganggu akar, menembak,
dan bunga dan menjadi subur (Li et al., 2005). ini perkembangan
kelainan avp1-1 diinterpretasikan sebagai kegagalan proton
memompa yang akhirnya dapat menyebabkan pantas auksin distribusi
(Li et al., 2005). Namun demikian, peran biologis dan efek
dari PPi in vivo sebagian besar tetap tidak diketahui di Arabidopsis ini

mutan.
1 Alamat surat menyurat ke ferjani@u-gakugei.ac.jp~~V.
2 Alamat sekarang: Showa Sangyo Co, Penelitian dan Pengembangan
Center, 2-20-2 Hinode, Funabashi-shi, Chiba 273-0015, Jepang.
Penulis bertanggung jawab untuk distribusi bahan integral
temuan yang disajikan dalam artikel ini sesuai dengan kebijakan yang dijelaskan
dalam Petunjuk untuk Penulis (www.plantcell.org) adalah: Ali Ferjani
(ferjani@u-gakugei.ac.jp).
CSome angka dalam artikel ini akan ditampilkan dalam warna online tapi hitam
dan putih dalam edisi cetak.
Versi WOnline berisi data Web-satunya.
Artikel OAOpen Access dapat dilihat secara online tanpa berlangganan.
www.plantcell.org/cgi/doi/10.1105/tpc.111.085415
Artikel ini adalah Plant Cell muka Online Publikasi. Tanggal penampilan pertama online
adalah tanggal resmi publikasi. Artikel ini telah
diedit dan penulis telah dikoreksi bukti, tapi perubahan kecil bisa dibuat sebelum versi final
diterbitkan. Posting versi ini secara online
mengurangi waktu untuk publikasi oleh beberapa minggu.
The Plant Cell Preview, www.aspb.org 2011 American Society of Tanaman biologi. Seluruh
hak cipta. 1 dari 14
Kami tertarik pada mekanisme organogenesis dan memiliki
telah berfokus pada morfogenesis daun. Meskipun perkembangan daun
dinamisme telah menjadi subyek dari penelitian yang kuat
(Donnelly et al, 1999;. Putih, 2006; Ferjani et al, 2007;. Usami
et al., 2009), sedikit yang diketahui tentang ukuran-koordinasi daun mekanisme
(Ingram dan Waites, 2006; Anastasiou dan Lenhard,
2007; Ferjani et al., 2008; Tsukaya, 2008; Micol, 2009; Krizek,
2009). Baru-baru ini, data yang muncul menunjukkan bahwa organ-lebar
koordinasi proliferasi sel dan ekspansi sel postmitotik
mendasari daun organogenesis dan mengatur ukuran daun (Tsukaya,
1998, 2002, 2005, 2006, 2008; Horiguchi et al., 2006a). Seperti itu
koordinasi organ-lebar disarankan oleh fenomena menarik
bahwa kita disebut kompensasi (Tsukaya, 1998, 2002) di mana
jumlah sel menurun di primordia daun memicu biasa
peningkatan ekspansi sel postmitotik itu, dalam kasus yang ekstrim,
hasil dalam lebih besar dari peningkatan dua kali lipat di daerah lintas sel
(Mizukami dan Fischer, 2000; De Veylder et al, 2001;. Horiguchi
et al., 2005; Ferjani et al., 2007; Fujikura et al., 2009).
Baru-baru ini, kami menunjukkan bahwa dua kualitatif berbeda
mode, yaitu non-sel-otonom dan sel-otonom
mode, terlibat dalam koordinasi proliferasi sel
dan ekspansi sel postmitotik dalam mengembangkan daun (Kawade
et al., 2010). Temuan ini harus memberikan pemahaman baru ke
mekanisme kontrol ukuran organ pada tumbuhan. Untuk itu,
kompensasi menawarkan kasus Model untuk menyelidiki hubungan antara
proliferasi sel dan ekspansi sel postmitotik di
tingkat organ, yang mungkin, pada gilirannya, membantu ukuran Menguraikan peraturan
mekanisme (Tsukaya, 1998, 2002, 2005, 2006). Dari
beberapa mutan kompensasi-menunjukkan bahwa kita telah mengisolasi
dan ditandai (Ferjani et al., 2007), di sini, kami melaporkan

temuan kami pada mutan fugu5, yang rusak di

Fungsi V-PPase.
HASIL
Mutan fugu5 Apakah Diubah Kotiledon
Dalam Arabidopsis, kotiledon terbentuk selama embriogenesis,
dan proliferasi sel embrio diaktifkan kembali segera setelah
perkecambahan (Tsukaya et al, 1994;. Stoynova-Bakalova et al,.
2004). Mobilisasi senyawa penyimpanan mendukung singkat
periode pertumbuhan heterotrofik sampai aparat fotosintesis
didirikan. Kotiledon mutan fugu5 adalah persegi panjang
dan mengandung lebih sedikit (; 60%) dan sel-sel yang lebih besar (; 175%) dari
Jenis liar ketika tumbuh pada media anorganik (rockwool; Gambar 1A;
melihat Tambahan Gambar 1A online; Ferjani et al., 2007). Perbandingan
dari jumlah sel di proximodistal dan mediolateral
sumbu kotiledon embrio dan matang mengungkapkan bahwa
jumlah sel di fugu5-1 tetap konstan di kedua arah
(Gambar 1B). Namun, jumlah sel bersama medio-lateral sumbu di
kotiledon dewasa hampir dua kali lipat dalam tipe liar (Gambar 1B).
Hasil ini menunjukkan bahwa di fugu5-1, pembelahan sel hampir
benar-benar menghambat dalam kotiledon postembryonically. Juga, kompensasi
terjadi pada pasangan pertama dari daun di fugu5-1, tetapi untuk
tingkat lebih rendah daripada di kotiledon (lihat Gambar Tambahan 1A
dan 1B online). Dengan demikian, kita fokus analisis kami terutama pada
kotiledon.
Suc Apakah Cukup untuk Menyelamatkan fugu5 Fenotipe Mutant
Yang penting, kami mengamati bahwa fenotipe morfologi fugu5-1
pulih pada Murashige dan Skoog (MS) menengah (Gambar
1A, panel kanan), menunjukkan bahwa fenotipe fugu5-1 tersebut tergantung
dan mungkin dipengaruhi oleh beberapa komponen (s) dari
medium pertumbuhan. Komponen (s) yang mungkin? Pertama, untuk
mengidentifikasi komponen (s) bertanggung jawab untuk menyelamatkan fugu5-1 yang
fenotipe, kita tumbuh tanaman pada media MS dengan berbeda
Komposisi gula dan vitamin (lihat Tambahan Gambar 2
on line; Angka 1C dan 1D) dan kemudian ditentukan indeks daun
dan jumlah sel dalam kotiledon 8 d setelah tanam (DAS; lihat
Tambahan Gambar 2 online; Angka 1C dan 1D). Menariknya,
kami menemukan bahwa Suc cukup untuk menyelamatkan kotor fugu5-1
fenotip (lihat Tambahan Gambar 2 online; Gambar 1C) dan
membangun kembali sel nomor ke tingkat normal (Gambar 1D). Selanjutnya, kita
meneliti pertumbuhan fugu5-1 pada media MS yang mengandung sejenis
konsentrasi GLC, Fru, atau keduanya (Angka 1C dan 1D). glc
menirukan efek Suc, tapi Fru tidak (Angka 1C dan 1D).
Selain itu, kami menemukan bahwa sorbitol dan 3-O-methylglucose (a nonmetabolizable
analog ofGlc) gagal menyelamatkan fenotipe fugu5-1
(lihat Tambahan Gambar 3 online). Di sisi lain, oleh berskala
skrining (Horiguchi et al., 2006b), kami juga mengidentifikasi dua
alel mutan tambahan gen FUGU5, yaitu, fugu5-2 dan
fugu5-3 (lihat Tambahan Gambar 4A online). Kedua alel
dipamerkan fenotipe mirip dengan fugu5-1 yang pulih ketika Suc
disediakan dalam media tumbuh (lihat Gambar Tambahan 4A ke

4D online). Secara bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa Suc adalah

metabolit penting untuk memulai kembali tepat postembryonic
pembangunan di mutan fugu5 ini.
Karena penurunan jumlah sel memicu pembesaran sel yang tidak biasa
diamati dalam mutan kompensasi-menunjukkan (Ferjani
et al, 2007, 2008.; Tsukaya, 2008), kita selanjutnya menilai apakah
eksogen disediakan Suc mempengaruhi ukuran sel di kotiledon sepenuhnya diperluas.
Konsisten, sel sizewas normal dalam fugu5-1mutants grownin
kehadiran Suc (Gambar 1E). Bersama-sama, temuan ini menunjukkan
yang Suc dapat membangun kembali sel nomor dan, sebagai hasilnya, mencegah
pembesaran sel yang berlebihan di latar belakang mutan fugu5-1.
Untuk memastikan bagaimana Suc bertindak untuk merangsang proliferasi sel, kami
meneliti aktivitas sel bersepeda di CYCB1 fugu5; 1pro: GUS
baris reporter (GUS isb-glucuronidase). Dalam tipe liar sel tumbuh onMS
media tanpa Suc, sinyal GUS yang terdeteksi di kotiledon
48 jam setelah onset imbibisi; Namun, tidak ada signalwas diamati di
fugu5-1 (lih Tambahan Gambar 5B dan 5J online). Sebaliknya,
pada pertumbuhan pada media MS yang mengandung 2% Suc, kedua tipe liar
dan fugu5-1 menunjukkan sinyal GUS di kotiledon 72 jam setelah
imbibisi (lih Tambahan Gambar 5G dan 5O online). Heran,
RT-PCR analisis menunjukkan bahwa tingkat mRNA dari gen cyclin
CYCB1; 1 dan beberapa siklus sel inti lainnya geneswere sebanding
mutan fugu5-1 dan tipe liar pada 48 jam setelah onset imbibisi
(lihat Tambahan Gambar 5Q online), menunjukkan posttranscriptional
Peraturan CYCB1 tersebut; 1 gen di latar belakang fugu5-1.
fugu5 Apakah bermutasi di AVP1, yang mengkode Key enzim di
PPi Hidrolisis
Untuk mengkloning gen bermutasi di fugu5, kami menggunakan peta berbasis
Pendekatan untuk mengidentifikasi mutasi titik di At1g15690 yang mengakibatkan
2 dari 14 The Plant Cell
Gambar 1. Morfologi dan Seluler Fenotipe dari fugu5 Mutan.
(A) Pengaruh komposisi media tumbuh pada fenotipe bruto mutan fugu5. Tipe liar (WT) dan
bibit mutan fugu5-1 ditanam selama 8
DAS baik di rockwool (kiri panel) atau standar MS menengah (panel kanan). Bar = 2 mm.
(B) proliferasi sel terganggu di fugu5 kotiledon setelah perkecambahan. Jumlah sel-sel
jaringan palisade mesofil bersama proximodistal dan
sumbu mediolateral baik kotiledon embrio (dibedah dari biji kering menyerap) atau kotiledon
dewasa ditentukan setelah pertumbuhan di rockwool
untuk 25 DAS. Data adalah sarana dan SD (n = 8). Cot, kotiledon; PD, proximodistal; ML,
mediolateral.
(C) Pengaruh berbagai karbohidrat pada fenotipe bruto kotiledon fugu5. Pengaruh eksogen
disediakan Suc, GLC, dan Fru (58 mM masing-masing) di
kotiledon fenotipe ditampilkan. Pengaruh penambahan simultan GLC dan Fru juga diuji.
Bibit delapan hari-tua dari jenis liar (panel kiri)
dan fugu5-1 (panel kanan) akan ditampilkan. Bar = 2 mm.
(D) Pengaruh berbagai jenis karbohidrat pada jumlah sel kotiledon fugu5-1. Jumlah sel
jaringan Palisade mesofil di bibit baik alam liar
Jenis atau mutan fugu5-1 ditentukan 8 DAS. Data adalah sarana dan SD (n = 8). NS, tidak
ada perbedaan yang signifikan antara dua genotipe (jenis liar
dan fugu5-1) di bawah kondisi pertumbuhan yang ditunjukkan.

(E) Pengaruh eksogen disediakan Suc pada pembesaran sel kompensasi. Kotiledon
dikumpulkan dari jenis liar dan mutan fugu5-1 ditanam di
Media MS dengan atau tanpa 2% Suc selama 21 DAS. Data adalah sarana dan SD (n = 8).
NS, tidak ada perbedaan yang signifikan antara dua genotipe (jenis liar dan
fugu5-1). Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <0,01.
Peran H + -PPase di Plant Pembangunan 3 dari 14
dalam penggantian Ala-709 oleh THR dalam mutan fugu5-1 (Gambar
2A; melihat Tambahan Gambar 6 online). At1g15690 mengkodekan
V-PPase, yang sebelumnya dilaporkan sebagai AVP1 (Li et al., 2005). berikut
sequencing dari At1g15690 mengungkapkan bahwa Glu-272 adalah
digantikan oleh Lys di mutan fugu5-2 dan Ala-553 adalah
digantikan oleh THR, ditambah residu dari Leu-554 ke Ala-558 yang
dihapus di transmembran domain 12 di mutan fugu5-3
(Gambar 2A, lihat Tambahan Gambar 6 online). The fugu5 mutasi
situs dan topologi membran V-PPase dari Arabidopsis,
sebagai kesimpulan dari yang Streptomyces coelicolor (Mimura et al.,
2004), ditunjukkan (lihat Tambahan Gambar 6 online).
Selanjutnya, untuk mengevaluasi efek dari mutasi di atas pada
fungsi AVP1 protein / FUGU5, PPi aktivitas hidrolisis adalah
diukur secara langsung di fraksi membran mentah. Yang penting, tidak ada
Kegiatan hidrolisis PPi terdeteksi di salah satu dari tiga fugu5
alel mutan (Gambar 2B, atas). Dengan demikian, muncul kemungkinan bahwa
mutan fugu5 ini alel mutan nol dari V-PPase. Selanjutnya,
ketika aktivitas hidrolisis substrat V-ATPase
Gambar 2. V-PPase dan V-ATPase Aktivitas di fugu5 Mutan Alel.
(A) Skema representasi dari gen / FUGU5 AVP1. Ekson ditampilkan sebagai persegi panjang
diisi. Lesi molekul di setiap fungsi kerugian-of-tiga
alel fugu5 ditandai dengan tanda bintang. Dalam fugu5-1, residu Ala-709 digantikan oleh
Thr. Dalam fugu5-2, residu Glu-272 digantikan oleh Lys. Di fugu5-3,
residu Ala-553 digantikan oleh THR, dan lima residu dari Leu-554 ke Ala-558 akan dihapus.
(B) aktivitas Substrat hidrolisis V-PPase (atas) dan V-ATPase (bawah) di membran mentah
disiapkan dari tipe liar (WT) dan mutan fugu5. tanaman
ditumbuhkan dalam medium kultur tanpa Suc untuk 17 DAS. Membran mentah disiapkan
dari tunas lebih dari 240 tanaman dan digunakan untuk enzim
tes seperti yang dijelaskan dalam Metode.
(C) ke level Protein (F) pompa membran vacuolar proton, BIP, dan aquaporin. Aliquots
membran mentah (2 mg protein) dari fraksi membran
dipisahkan dengan SDS-PAGE dan kemudian immunoblotted dengan anti-V-PPase (C), antisubunit A dan anti-subunit a dari V-ATPase (D), anti-BIP (E),
dan anti-TIP1s (F). Massa molekul jelas band immunostained ditampilkan di setiap panel.
Intensitas sinyal relatif immunostained
band itu secara kuantitatif diukur dan dihitung sebagai rasio dengan yang ada pada tipe liar
setiap protein. V-PPase protein tidak terdeteksi di fugu5-3 yang
baris mutan.
4 dari 14 The Plant Cell
juga diukur, kami mengamati ada perbedaan yang signifikan
antara jenis dan fugu5 liar mutan (Gambar 2B, bawah).
Namun, SDS-PAGE dan imunobloting berikutnya dengan
anti-V-PPase mengungkapkan secara signifikan menurun tingkat protein di
fugu5-1 dan fugu5-2, sedangkan protein V-PPase tidak terdeteksi

di mutan fugu5-3 (Gambar 2C). Selain itu, tingkat protein

subunit A dan V-ATPase, BIP, dan aquaporin (Tip1) mengungkapkan
ada perbedaan besar dalam setiap alel mutan fugu5 dibandingkan dengan
jenis liar (Angka 2D ke 2F). Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa
fenotip diamati dalam mutan fugu5 secara spesifik
disebabkan oleh kerugian total aktivitas V-PPase.
AVP1 / FUGU5 tidak berfungsi sebagai
Regulator auksin-Terkait
AVP1 / FUGU5 telah dilaporkan menjadi penting untuk regulasi
pembangunan organ auksin-dimediasi, dan mutan avp1-1
alel ditunjukkan untuk menunjukkan transport auksin berkurang (Li et al.,
2005). Untuk memeriksa fenotipe tersebut, pola ekspresi
DR5: GUS, gen reporter respon auksin sintetik (Ulmasov
et al., 1997), dianalisis di kedua fugu5-1 dan tipe liar latar belakang
(Angka 3A ke 3F). Tanpa diduga, hasil kami menunjukkan
tidak ada perbedaan dalam distribusi DR5: sinyal GUS antara
fugu5-1 dan tipe liar (Angka 3A ke 3F). Selain itu, sedangkan
avp1-1 tumbuh dengan eksogen disediakan auksin, seperti indole3-acetic acid dan asam 1-naphthaleneacetic, dilaporkan
menghasilkan kalus (Li et al., 2005), pertumbuhan fugu5-1 bawah yang sama
Kondisi itu sangat terhambat, pada tingkat yang sama sebagai liar
jenis, yang merupakan respon khas untuk konsentrasi tinggi
auxins, dan tidak ada pembentukan kalus terjadi (Angka 3G dan 3H).
Sebenarnya, tidak ada fenotipe alel melaporkan avp1-1 mutan,
seperti akar terganggu dan pengembangan menembak dan infertilitas,
diamati pada setiap alel mutan fugu5. Bahkan, sementara avp1-1
tanaman mutan tidak dapat mengatur benih karena pertumbuhan yang parah dan
cacat perkembangan (Li et al., 2005), semua galur mutan fugu5
dikembangkan bunga yang normal dan subur sebagai tipe liar
Gambar 3. Ekspresi DR5: GUS dan Pengaruh eksogen Auxins.
(A) ke pola (F) Ekspresi DR5: gen pelapor GUS di bibit muda. Ekspresi DR5: GUS dalam
bibit dari jenis liar (A) dan fugu5-1
mutan (B) di 6 DAS. Ekspresi DR5: GUS di tipe liar akar dan lateral akar primordial di 6
DAS, masing-masing ([C] dan [D]). Ekspresi DR5: GUS di
fugu5-1 akar mutan dan lateral akar primordial di 6 DAS, masing-masing ([E] dan [F]).
Sinyal GUS sekitar akar meristem apikal (panah hitam), di: DR5
sistem vaskular (panah terbuka), dan di lateral akar primordia (tanda bintang) muncul. Bar =
2 mm di (A), 1 mm di (B), dan 100 mm di (C) ke (F).
(G) Pengaruh auksin eksogen terhadap pertumbuhan fugu5 mutan. Bibit dari jenis liar (WT)
dan fugu5-1 tumbuh di MS saja, MS + 2% Suc, MS +
indole-3-asam asetat (5 mM), dan MS asam + 1-naphthaleneacetic (5 mM) 8 di DAS. Bar = 2
mm.
(H) Pengaruh auksin eksogen pada jumlah sel dalam kotiledon. Jumlah sel rata-rata sampel
yang dijelaskan dalam (G) yang ditentukan. Data adalah sarana dan SD
(n = 8). NS, tidak ada perbedaan yang signifikan antara dua genotipe (jenis liar dan fugu5-1).
Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <0,01.
Peran H + -PPase di Plant Pembangunan 5 dari 14
(lihat Tambahan Gambar 7 online). Akhirnya, kami menganalisis nol
alel vhp1-1, yang merupakan garis penyisipan T-DNA dari AVP1 / FUGU5. Di
vhp1-1, T-DNA dimasukkan dalam ekson keenam, dan 27 basis yang

dihapus di lokasi penyisipan. Secara konsisten, kami menemukan bahwa kedua

fenotipe kotor dan seluler dari vhp1-1 yang identik dengan yang
dari alel fugu5 lainnya (lihat Tambahan Angka 8A untuk 8D
on line). Bersama-sama, hasil ini sangat menyarankan bahwa V-PPase adalah
tidak terlibat dalam regulasi perkembangan organ auksin-dimediasi
dan bahwa fenotipe dilaporkan dalam avp1-1 cenderung
alel tertentu.
Mobilisasi Storage Protein Tidak Terkena di fugu5
Jadi, apa fungsi utama dari AVP1 / FUGU5 dalam pembangunan pabrik?
V-PPase memiliki dua fungsi, yaitu, hidrolisis
sitosol PPi dan pengasaman vacuolar (Martinoia et al.,
2007). Pada tumbuhan tingkat tinggi, protein penyimpanan benih disimpan di
vakuola penyimpanan protein dan merupakan sumber nitrogen untuk
mempertahankan pertumbuhan setelah benih berkecambah (MU NTZ, 1998). vakuola
adalah situs utama dari proteolisis seluler, dan spesifik ini
Fungsi mendominasi pada saat perkecambahan ketika amino
Asam telah dimobilisasi dalam vakuola penyimpanan protein, oleh
vacuolar pengasaman, untuk memelihara embrio (MU NTZ, 2007). Untuk
meneliti kontribusi V-PPase sebagai pompa proton di
mobilisasi protein penyimpanan, jumlah protein penyimpanan
dievaluasi dalam biji kering dan bibit muda juga. Kami
Hasil penelitian menunjukkan bahwa jumlah awal 12S globulin dan 2S
Albumin dalam biji kering, dua bentuk utama dari protein penyimpanan di
Arabidopsis, yang sebanding dalam jenis liar dan fugu5-1 (Gambar
4A, jalur 1 dan 2). Pada 48 jam, jumlah mereka secara signifikan
berkurang (Gambar 4A, jalur 3 dan 4), kemudian benar-benar habis
di kedua jenis liar dan mutan fugu5-1 pada 72 jam setelah onset
dari imbibisi (Gambar 4A, lajur 5 dan 6). Hasil ini jelas
menunjukkan bahwa degradasi protein penyimpanan tidak terpengaruh
dengan hilangnya aktivitas proton-memompa dari V-PPase.
Penghapusan spesifik PPi oleh IPP1 Fenotipe fugu5 Diselamatkan
Selanjutnya, kami berusaha untuk mengevaluasi kontribusi PPi hidrolisis
saja, fungsi lain dari V-PPase, dan hubungannya dengan
fenotipe fugu5. Untuk melakukan hal ini, kami memperkenalkan IPP1 sitosol
gen dari S. cerevisiae (Perez-Castineira et al., 2002) di bawah
kontrol dari AVP1 / FUGU5 promotor ke mutan fugu5-1
dan latar belakang tipe liar. The pyrophosphatase anorganik terlarut
IPP1 hanya menghidrolisis PPi sitosol tanpa mengganggu
pengasaman vacuolar, sehingga memberikan alat pilihan untuk secara terpisah
menyelidiki dua fungsi dari tanaman V-PPase. RTPCR
analisis gen IPP1 dalam enam AVP1Pro independen:
Garis transgenik IPP1 bahwa kita memperoleh menegaskan bahwa IPP1
gen itu benar dinyatakan (Gambar 4B). Di antara mereka, AVP1Pro:
IPP1 # 4-4 dan AVP1Pro: IPP1 # 8-3 dipilih sebagai wakil
baris untuk analisis lebih lanjut. Menariknya, hasil kami menunjukkan
bahwa fugu5-1 fenotipe kotor mutan, seperti kotiledon
bentuk dan ukuran (Gambar 4C), dan keterlambatan pertumbuhan diamati di
tanaman mutan fugu5-1 ditemukan oleh pengenalan
AVP1Pro: IPP1 transgen (Angka 4D untuk 4G).
Untuk lebih menilai efek dari ekspresi IPP1 pada ukuran organ,

jumlah sel, dan ukuran sel, parameter ini ditentukan di

kotiledon sepenuhnya diperluas (25 DAS). Secara konsisten, kami menemukan bahwa
daerah kotiledon, jumlah sel, dan ukuran sel dalam AVP1Pro: IPP1
garis transgenik pulih ke tingkat tipe liar (Gambar 4H). pada
Sebaliknya, ketika IPP1 diperkenalkan ke dalam tipe liar, ada
tidak berpengaruh pada jumlah sel atau ukuran sel dalam kotiledon (lihat
Tambahan Gambar 9A online) dan daun pertama (lihat Tambahan
Gambar 9B online). Secara keseluruhan, hasil ini jelas menunjukkan
bahwa penghapusan PPi dari sitosol dari fugu5 mutan oleh
aksi IPP1 perlu dan cukup untuk menyelamatkan mereka
fenotipe dengan mempromosikan proliferasi sel, sehingga menjaga
sel dan organ akhir yang normal ukuran.
Benih Lipid Cadangan Apakah Benar Dikerahkan di fugu5
Mengapa fugu5 perlu Suc untuk pertumbuhan normal? selama postgerminative
pertumbuhan bibit, asam lemak dilepaskan dari trigliserida
(TAG) disimpan dalam tubuh lipid dari minyak sayur yang
dimetabolisme untuk menghasilkan Suc (Hayashi et al, 1998;. Eastmond
et al., 2000; Rylott et al., 2001; Penfield et al., 2005; Arai et al.,
2008). Jalur biokimia diperlukan untuk pemanfaatan karbon
dari biji toko TAG adalah proses multi langkah yang melibatkan
komponen asam lemak b-oksidasi peroxisomal, glioksilat yang
siklus, dan glukoneogenesis (Hayashi et al, 1998;. Eastmond
et al., 2000; Rylott et al., 2001; Penfield et al., 2005; Arai et al.,
2008). Cacat pada b-oksidasi muncul untuk menghambat konversi
cadangan benih lipid ke Suc, yang diperlukan sebagai sumber karbon
untuk pertumbuhan heterotrofik sebelum fotosintesis dimulai. Untuk menentukan
apakah cadangan lipid di fugu5-1 yang benar terdegradasi,
isi lipid pada biji kering serta di muda etiolated
bibit dikuantifikasi (Arai et al., 2008). Kami menemukan bahwa ada
tidak ada perbedaan yang signifikan dalam degradasi cadangan lipid
antara tipe liar, fugu5-1, dan AVP1Pro: IPP1 # 8-3 (lihat
Tambahan Gambar 10A online).
Telah dilaporkan bahwa dalam peroksisom, b-oksidasi
mengubah senyawa beracun 2,4-dichlorophenoxybutyric
asam ke dalam beracun auksin analog 2,4-D, sebuah fitur yang dieksploitasi
di layar genetik untuk mengisolasi mutan cacat di b-oksidasi
(Hayashi et al., 1998). Kemudian, untuk memeriksa lebih lanjut fungsi tersebut
dari peroksisom, pertumbuhan di hadapan tingkat beracun dari 2,4asam dichlorophenoxybutyric diperiksa dan mengungkapkan bahwa
Pertumbuhan fugu5-1 terhambat ke tingkat yang sama seperti yang dari alam liar
ketik (lihat Tambahan Gambar 10B online). Oleh karena itu, hasil ini
secara konsisten menunjukkan bahwa asam lemak b-oksidasi fungsional
di fugu5-1.
V-PPase Disfungsi sebagian Kompromi
Glukoneogenesis di Mutan fugu5
Mutan dengan cacat pada b-oksidasi yang baik mematikan atau pameran
perkecambahan penangkapan setelah radikula munculnya; mereka membutuhkan Suc untuk
pertumbuhan di kedua terang dan gelap (Penfield et al., 2005). Itu
pertumbuhan mutan lainnya, cacat dalam siklus glioksilat atau
glukoneogenesis, dikompromikan di hipokotil perpanjangan hanya

dalam gelap, kecuali disertakan dengan sumber karbon alternatif

(Penfield et al., 2005). Tingkat perkecambahan tidak terpengaruh
sama sekali dalam mutan fugu5 (Gambar 5A), konsisten dengan fungsional
b-oksidasi. Selanjutnya, sebagian besar tanaman tumbuh normal,
sementara tingkat tertentu hambatan pertumbuhan itu mencetak
6 dari 14 The Plant Cell
Gambar 4. Degradasi Badan Protein di fugu5 dan morfologi dan Seluler Fenotip dari
AVP1Pro: IPP1 transgenik Garis.
(A) Pengaruh disfungsi V-PPase pada mobilisasi protein penyimpanan benih. Sampel protein
dikumpulkan pada 0, 48, 72, dan 96 h (waktu setelah transfer ke
Suhu pertumbuhan) baik dari 30 benih atau bibit dari jenis liar dan mutan fugu5-1. Protein
dipisahkan menggunakan SDS-PAGE dan
kemudian diwarnai dengan Coomassie biru. Lanes 1, 3, 5, dan 7 adalah tipe liar sampel. Jalur
2, 4, 6, dan 8 adalah sampel mutan fugu5-1. hasil
yang direproduksi dalam tiga percobaan independen.
(B) Ekspresi heterolog dari IPP1 di latar belakang mutan fugu5-1. RT-PCR analisis IPP1
dilakukan di enam AVP1Pro independen: IPP1
garis transgenik yang kita dibangun. RT (_) = tidak ada reverse transcriptase. WT, tipe liar.
(C) Ekspresi heterolog dari IPP1 menyelamatkan fenotipe kotor fugu5. Morfologi kotor bibit
dari jenis liar, fugu5-1, dan dua
garis perwakilan dari AVP1Pro: IPP1 tanaman transgenik di 7 DAS. Bar = 2 mm.
(D) ke (G) Ekspresi heterolog dari penyelamatan IPP1 tertunda pertumbuhan fugu5.
Morfologi kotor dari jenis liar, fugu5-1, dan AVP1Pro: IPP1 # 4-4
dan AVP1Pro: IPP1 # 8-3 tanaman transgenik, masing-masing, di 28 DAS. Bar = 2 cm.
(H) Ekspresi heterolog dari gen IPP1 benar-benar menyelamatkan fugu5 fenotipe selular.
Rata-rata daerah, jumlah sel, dan ukuran sel kotiledon dari
tipe liar, fugu5-1, dan dua baris mewakili AVP1Pro: IPP1 ditanam di rockwool untuk 25
DAS. Data adalah sarana dan SD (n = 8). Asterisk menunjukkan
perbedaan yang signifikan pada P <0,01 dibandingkan dengan tipe liar.
Peran H + -PPase di Plant Pembangunan 7 dari 14
di mutan fugu5 (Gambar 5B). Jadi, di bawah kondisi cahaya
dan bahkan dalam ketiadaan pasokan Suc, mutan fugu5 bisa
tumbuh normal. Menariknya, kami menemukan bahwa hipokotil yang
pemanjangan mutan fugu5-1 dalam kegelapan itu sangat
dikompromikan dengan tidak adanya Suc (Angka 5C dan 5D).
Anehnya, pertumbuhan AVP1Pro: IPP1 # 8-3 dipulihkan
ke tingkat tipe liar dalam gelap bahkan dalam ketiadaan Suc
(Angka 5C dan 5D), dan fugu5-1 hambatan pertumbuhan hipokotil
dipulihkan ketika Suc disediakan dalam gelap (Angka 5C
dan 5D). Memasok Suc tidak meningkatkan AVP1Pro: IPP1 # 8-3
Pertumbuhan hipokotil (Gambar 5D), menunjukkan bahwa Suc dan IPP1
bertindak dalam jalur yang sama. Dengan demikian, tampak bahwa penghapusan
PPi oleh aksi V-PPase diperlukan untuk glioksilat yang tepat
siklus atau glukoneogenesis yang mendukung reaktivasi
proliferasi sel setelah perkecambahan.
Selanjutnya, untuk membedakan antara di atas dua kemungkinan,
jumlah dari Suc dan PPi dikuantifikasi dalam tipe liar
dan fugu5 mutan. Bibit Etiolated tumbuh di piring MS
tanpa Suc digunakan untuk mengevaluasi hanya jumlah Suc
dihasilkan dari TAG. Sangat penting, di mutan fugu5, yang

Isi PPi adalah; 2,5 kali lipat lebih tinggi dan isinya Suc yang
hanya 50% yang dari jenis liar (Angka 6A dan 6B). Ini
Hasil jelas menunjukkan bahwa itu adalah glukoneogenesis,
daripada siklus glioksilat, yang terhambat karena
peningkatan kadar PPi sitosol. Dalam kebanyakan kasus yang dilaporkan,
Isi PPi yang diamati dalam berbagai jaringan tanaman berkisar
antara 10 dan 50 nmoles / g berat segar (diringkas dan
dibahas dalam Heinonen, 2001). Tingkat PPi ditunjukkan pada Gambar
6B setara dengan 51.063.4 nmoles / g berat basah dan 10.268,8
nmoles / g berat segar di alam liar-jenis dan fugu5-3 bibit,
Gambar 5. Tingkat perbenihan, Postgerminative Pertumbuhan, dan Bibit Pertumbuhan
Fenotip dari fugu5 Mutan in the Dark.
(A) tingkat perkecambahan tidak terpengaruh dalam tiga fugu5 alel mutan. Seratus biji
masing-masing genotipe (tiga set) ditaburkan pada rockwool, dan
tanaman ditanam di 16/8-jam cahaya / siklus gelap. Tingkat perkecambahan yang berarti nilai
relatif dan SD dari tiga percobaan independen. WT, liar
mengetik.
Mutan (B) fugu5 menunjukkan keterlambatan pertumbuhan postgerminative sedikit. Tingkat
perkecambahan dan fenotipe pertumbuhan postgerminative tanaman yang mencetak gol di
12 dan 21 DAS, masing-masing. Data yang berarti nilai relatif dan SD dari tiga percobaan
independen. Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <
0,05 dibandingkan dengan tipe liar. Normal, tanaman tanpa penundaan pertumbuhan yang
signifikan; semi-dwarf, tanaman ukuran berkurang; 50% dibandingkan dengan normal
tanaman; kerdil, ukuran tanaman berkurang; 75% dibandingkan dengan tanaman normal.
(C) dan (D) hipokotil elongasi adalah sangat menghambat dalam fugu5-1 dalam gelap tanpa
adanya Suc.
(C) Foto-foto hipokotil bibit etiolated dari jenis liar, fugu5-1, dan AVP1Pro: IPP1 # 8-3
tumbuh selama 4 DAS dalam gelap di kedua MS sendiri
(top panel) atau MS + Media Suc (panel bawah). Bar = 5 mm.
(D) hipokotil panjang bibit etiolated ditentukan pada 4 DAS. Data adalah sarana dan SD (n =
20). Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <
0,001 dibandingkan dengan tipe liar.
8 dari 14 The Plant Cell
masing-masing. Oleh karena itu, isi PPi ditentukan dalam penelitian ini
setuju juga dengan yang dilaporkan sebelumnya.
Meskipun pertumbuhan bibit, sebelum memulai fotosintesis,
bergantung pada Suc diproduksi oleh glukoneogenesis dari lipid benih
cadangan, Suc diduga tersedia di photosynthetically
jaringan aktif, seperti daun yang diproduksi di kelenjar yang lebih tinggi.
Menariknya, kami menemukan bahwa berbeda dengan kotiledon dan
daun pertama, di mana kompensasi diinduksi di fugu5-1, sel
angka dan ukuran pada daun ketiga dan kelima yang normal,
dibandingkan dengan tipe liar (lihat Tambahan Gambar 1C
on line). Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa hilangnya
Kegiatan V-PPase sangat penting untuk fungsi sel di organ terbentuk
pada tahap awal pembangunan postgerminative tapi tidak
pada mereka photosynthetically organ aktif yang terbentuk di kemudian
tahapan.
Hal ini juga ditetapkan bahwa tonoplast diberi energi oleh dua
pompa proton yang berbeda, V-ATPase dan V-PPase tersebut; namun,

kedua pompa proton tampaknya memainkan peran diferensial selama tanaman

pengembangan (Krebs et al., 2010). Meskipun efek dari hilangnya
fungsi dari beberapa subunit V-ATPase pada pH vacuolar telah
jelas menunjukkan (Krebs et al., 2010), kontribusi
V-PPase sendiri ke pengasaman vacuolar tetap sulit dipahami.
Wethus menyelidiki vacuolarpHin jenis liar, fugu5-1, dan
AVP1Pro: IPP1 # 8-3.Whereas vakuola di tipe liar sel akar memiliki
pH 5,76, vakuola fugu5-1 ditemukan bergeser ke pH 5,99 (Gambar
6C). Di sisi lain, vakuola dalam AVP1Pro: IPP1 # 8-3 memiliki
pH 6.08, membenarkan bahwa ekspresi heterolog dari
IPP1does sitosol tidak mengganggu vacuolarpH. Bersama-sama,
Temuan jelas menunjukkan, di satu sisi, bahwa hilangnya V-PPase
Kegiatan menyebabkan alkalinisasi sedikit vacuolarpH, menunjuk ke
kontribusi V-PPase ke vakuolar pengasaman. Namun, pada
Sebaliknya, ketika kita membandingkan pH vacuolar di fugu5 dan
AVP1Pro: IPP1 # 8-3, jelas bahwa pengasaman dari vakuola adalah
memang bukan alasan utama untuk fenotipe fugu5.
DISKUSI
Dalam empat dekade terakhir, tubuh besar data telah diterbitkan
menunjukkan bahwa PPi dapat mempengaruhi banyak biokimia serta fisiologis
reaksi; Namun, demonstrasi langsung dari biologi
Efek dari PPi in vivo tetap sulit dipahami (diringkas dan
dibahas dalam Heinonen, 2001).
Arabidopsis memiliki tiga gen untuk H + -PPases: gen tunggal untuk
tipe I enzim, Pada VHP1; 1 (juga disebut AVP1); dan dua gen
untuk enzim tipe II, Pada VHP2; 1 dan Di VHP2; 2 (Drozdowicz
dan Rea, 2001; Segami et al., 2010). Sebuah biokimia komparatif
karakterisasi antara AVP1 / FUGU5 dan AVP2 (VHP2; 1; a
Jenis II H + -PPase), setelah ekspresi heterolog dalam ragi, mengungkapkan
yang AVP2 juga kompeten di kedua PPi hidrolisis dan
H + -translocation (Drozdowicz et al., 2000), oleh karena itu menyarankan
peran dari kedua H + -PPase jenis di PPi homeostasis, namun ini harus
ditunjukkan langsung pada tanaman (Rea dan Sanders, 1987). Di
penelitian terbaru kami, jumlah protein total enzim tipe II
dikuantifikasi menjadi <2,0 ng / mg protein dalam mikrosomal yang
fraksi (Segami et al., 2010). Jumlah ini <0,2% dari yang dari
tipe I enzim. Juga, enzim tipe II terlokalisasi tidak
vacuolarmembrane, tetapi dalam aparatus Golgi. Oleh karena itu,
kontribusi fisiologis jenis II H + -PPases di vacuolar yang
Gambar 6. Pengaruh Hilangnya V-PPase Aktivitas di Suc dan PPi Isi dan vakuolar pH.
(A) Jumlah Suc yang menurun secara signifikan dalam mutan fugu5-3. Jumlah Suc di tipe
liar (WT) dan mutan fugu5-3 yang
ditentukan selama pertumbuhan postgerminative di bibit etiolated 3-d-tua yang tumbuh di
MS-satunya media (empat ratus bibit etiolated per eksperimen)
seperti yang dijelaskan dalam Metode. Data adalah sarana dan SD dari tiga percobaan
independen. Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <0,05 dibandingkan
dengan tipe liar.
(B) Jumlah PPi meningkat secara signifikan dalam mutan fugu5-3. Bibit tumbuh di bawah
kondisi yang sama dan dikumpulkan pada tahap yang sama seperti

diuraikan dalam (A) digunakan untuk kuantifikasi PPi. Data adalah sarana dan SD dari tiga
percobaan independen. Asterisk menunjukkan signifikan
Perbedaan pada P <0,05 dibandingkan dengan tipe liar.
(C) Kehilangan aktivitas V-PPase menyebabkan alkalinisasi sedikit pH vacuolar di mutan
fugu5-1. The vacuolar pH bibit 10-d-lama tumbuh di MS
mediumwithout Suc ditentukan dengan menggunakan neon sel-permeant dye BCECF-AM
seperti yang dijelaskan (Krebs et al., 2010). Hilangnya aktivitas V-PPase
meningkatkan pH vacuolar dalam sel akar sebesar 0,25 unit pH. Data adalah sarana dan SD
dari 23 pengukuran dari 10 bibit (jenis liar), 25 pengukuran
dari sembilan bibit (fugu5-1), dan 26 pengukuran dari 10 bibit (AVP1pro: IPP1 # 8-3).
Asterisk menunjukkan perbedaan yang signifikan pada P <0,005
dibandingkan dengan tipe liar. NS, tidak ada perbedaan yang signifikan antara dua genotipe
(fugu5-1 dan AVP1pro: IPP1 # 8-3).
[Lihat artikel online untuk versi warna angka ini.]
Peran H + -PPase di Plant Pembangunan 9 dari 14
fungsi dan negara PPi dalam sitoplasma mungkin dapat diabaikan karena
untuk tingkat ekspresi yang sangat rendah.
Di sini, identifikasi dan analisis avp1 Arabidopsis /
fugu5 loss-of-fungsi mutan memberikan kemajuan substansial
untuk pengetahuan kita tentang peran V-PPase in vivo di
tanaman. Penelitian ini juga menjelaskan bahwa disfungsi dari PPi
removal di mutan fugu5 menyebabkan represi proliferasi sel
dan memicu kompensasi. Berdasarkan temuan kami, kami pertimbangkan
model berikut untuk peristiwa yang terjadi di mutan fugu5
latar belakang dan mengusulkan implikasi dari V-PPase awal
perkembangan tanaman. sintesis Suc de novo itu sebagian terhambat
di mutan fugu5, meskipun mereka mampu memobilisasi TAG hingga
langkah tertentu hilir b-oksidasi (Gambar 7). Ini bisa
dijelaskan oleh penghambatan reaksi biokimia yang mengikuti
b-oksidasi, seperti glukoneogenesis, yang tampaknya
kemungkinan menjadi sasaran utama dari PPi penghambatan. Hal ini sangat wajar
karena PPi terakumulasi dalam sitosol mana semua glukoneogenesis
reaksi berlangsung. Atau, pada tahap ini, kemungkinan
bahwa jumlah metabolit kunci lain dan enzim
kegiatan segera hulu glukoneogenesis mungkin
terpengaruh dalam fugu5 tidak dapat dikesampingkan.
Dalam glukoneogenesis aktif di berkecambah minyak sayur, PPidependent
fosfofruktokinase mengkatalisis konversi
Fru-1,6-bifosfat untuk Fru-6-fosfat (Fru-6-P) dan menghasilkan
PPi (Lim et al., 2009). Sintesis dari Suc mengkonsumsi Fru-6-P
dan UDP-GLC. UDP-GLC dikonversi dari GLC-1-fosfat oleh
UDP-GLC pyrophosphorylase, dan PPi dihasilkan secara bersamaan
(Gambar 7). Dengan demikian, akumulasi PPi pada tingkat kelebihan di
sitosol dari mutan fugu5 mungkin menekan dua reaksi ini
dan, sebagai hasilnya, berhenti sintesis Suc di kotiledon. Menariknya,
Stitt (1989) telah menunjukkan bahwa in vitro Pi menghambat reaksi
arah Fru-6-P fosforilasi (glikolisis) dan PPi adalah
Gambar 7. Sintesis Suc dan PPi Generation Proses selama perbenihan di Oilseeds.
Jalur metabolisme yang ditampilkan di sini yang disimpulkan dari Taiz dan Zeiger (2010).
asam lemak dari TAG dikonversi menjadi asetil-CoA oleh b-oksidasi dan

kemudian menjadi suksinat oleh siklus glioksilat beroperasi di glyoxysomes. PPi dihasilkan
oleh reaksi dari asil lemak-CoA sintase (a). suksinat adalah
ditransfer intomitochondria dan dikonversi ke malat oleh reaksi siklus asam sitrat. Malat
diekspor ke sitosol teroksidasi untuk oksaloasetat dan
dikonversi ke fosfoenolpiruvat. Selama glukoneogenesis dari fosfoenolpiruvat, PPi dihasilkan
oleh reaksi PPi-dependent
fosfofruktokinase (b). PPi juga diproduksi oleh reaksi dari UDP-GLC pyrophosphorylase (c),
yang menyediakan UDP-GLC. sintesis
makromolekul, seperti selulosa, juga menghasilkan PPi sebagai oleh-produk (d). PPi dalam
sitosol dikonsumsi oleh V-PPase / AVP1 / FUGU5.
10 dari 14 The Plant Cell
penghambatan reaksi berlawanan (glukoneogenesis) menggunakan PPi:
Fru-6-P phosphotransferase dimurnikan dari kentang (Solanum tuberosum)
umbi. Konsentrasi reaktan yang dekat dengan
ekuilibrium dalam sitoplasma tanaman (Kubota dan Ashihara, 1990); karena itu,
reaksi mudah reversibel jika konsentrasi berubah.
Beberapa bukti pendukung lainnya untuk pentingnya PPases
dalam metabolisme Suc telah dilaporkan dalam literatur, tetapi mereka
menghubungkan hubungan tetap sulit dipahami. Sebagai contoh, transgenik
tembakau (Nicotiana tabacum) tanaman mengekspresikan E. coli ppa
gen menunjukkan perubahan dramatis dalam partisi photoassimilate,
ditandai dengan tingginya akumulasi Suc di daun sumber (Sonnewald,
1992). Sekali lagi, ini menunjukkan hubungan mendasar antara
Kegiatan PPase dan metabolisme Suc. Sebaliknya, Suc disediakan di
media pertumbuhan untuk mutan fugu5 dapat digunakan sebagai utama
sumber karbon untuk perkecambahan yang normal dan pengembangan. Juga,
konsumsi eksogen Suc dapat berkontribusi untuk mengurangi
tingkat PPi di bibit tumbuh. Jika ada, peran-peran yang masuk akal
V-PPase benar-benar berbeda dari pemahaman yang sebenarnya, seperti
Peraturan transportasi auksin. Untuk selanjutnya, laporan ini mendorong kita untuk
kembali pengetahuan kita tentang peran V-PPase in vivo.
METODE
Bahan tanaman dan Kondisi Pertumbuhan
Jenis liar yang digunakan dalam penelitian ini adalah Columbia-0 (Kol-0), dan semua mutan
dan tanaman transgenik berada di Col-0 latar belakang. Isolasi fugu5
mutan dilaporkan sebelumnya (Horiguchi et al, 2006b;.. Ferjani et al,
2007). Garis mutan vhp1-1 dipilih dari penyisipan T-DNA besar
perpustakaan Arabidopsis thaliana, yang disiapkan oleh DNA Kazusa
Institusi penelitian. Sebelum analisis, semua mutan yang disilangbalikkan
untuk Col-0 setidaknya tiga kali. Seedswere ditaburkan di rockwool (Nitto BOSEKI),
disiram setiap hari dengan 0,5 g solusi L21 Hyponex (Hyponex Jepang), dan
ditanam di ruang pertumbuhan dengan 16/8-jam cahaya / siklus gelap dengan cahaya putih
lampu neon di; 50 mmol m22 S21 di 228C. Untuk mengetahui pengaruh
komposisi medium pertumbuhan, biji disterilkan ditaburkan pada media MS
(Wako) atau media MS dengan 2% (w / v) Suc, vitamin B5 Gamborg ini,
atau senyawa lainnya di tempat yang ditentukan dan dipadatkan menggunakan 0,5% (w / v)
gusi gellan (Murashige dan Skoog, 1962;. Gamborg et al, 1968). Itu
benih kemudian diinkubasi pada 48C dalam kegelapan selama 3 d. setelah dingin
pengobatan, bibit yang ditanam untuk waktu yang ditunjukkan.
Pengamatan mikroskop dan Analisis fenotipik

Untuk mengukur daerah daun dan jumlah sel, daun difiksasi dengan formalin /
asetat asam / alkohol dan dibersihkan dengan larutan chloral (200 g kloral
hidrat, 20 g gliserol, dan 50 mL air deionisasi) seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Tsuge et al., 1996). daun dan sel daun seluruh diamati
menggunakan mikroskop stereoskopik (MZ16a; Leica Microsystems) dan
mikroskop dilengkapi dengan Nomarski gangguan kontras diferensial
(DMRX E; Leica Microsystems), masing-masing. jumlah sel sepanjang
sumbu melintang dihitung pada titik terluas kotiledon, dan
mereka sepanjang sumbu kotiledon memanjang dihitung pada singkat
jarak dari midvein tersebut. Ukuran sel ditentukan sebagai rata-rata
area sel 20 sel palisade per daun (n = 8), diamati dari dana paradermal
melihat. nilai indeks daun dihitung sebagai rasio panjang kotiledon ke
lebar kotiledon. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan dua ekor
Uji t siswa. Tipe liar dan tanaman mutan membawa CYCB1 a; 1pro: GUS
gen atau DR5: GUS gen menjadi sasaran GUS pewarnaan seperti yang dijelaskan
(Donnelly et al., 1999). Tanaman GUS-bernoda dibersihkan di kloral yang
solusi untuk observasi.
Pemetaan genetik AVP1 / FUGU5
Sebuah populasi pemetaan dihasilkan oleh melintasi mutan fugu5-1
dengan Landsberg erecta. DNA genom dari tanaman F2 yang menunjukkan
fugu5-1 fenotipe mutan yang dipilih dan dikenakan peta yang berbasis
kloning. The AVP1 / FUGU5 lokus secara genetik dipetakan ke hulu
daerah kromosom 1 menggunakan berbagai penanda genetik (sederhana
urutan panjang polimorfisme, dibelah polimorfisme diperkuat, dan
kecil penyisipan / penghapusan) sesuai dengan informasi urutan yang tersedia
di The Information Resource Arabidopsis basis data (http: // www.
Arabidopsis.org/index.jsp).
Generasi Transgenik Tanaman
The 4.4-kb full-length daerah promotor AVP1 / FUGU5 diamplifikasi oleh
PCR menggunakan B4F-pAVP1-FW / B1R-pAVP1-RV primer set (lihat Tambahan
Tabel 1 online). Fragmen PCR-diperkuat diklon ke dalam
pDONRP4-P1R vektor dengan melakukan BP rekombinasi (Invitrogen). Itu
wilayah coding dari IPP1 fromSaccharomyces cerevisiae diamplifikasi byPCR
menggunakan IPP1-FW / IPP1-RV primer set (lihat Tambahan Tabel 1 online).
Produk dari reaksi PCR pertama menjadi sasaran putaran kedua
PCR dengan B1 / B2 primer set (lihat Tambahan Tabel 1). Produk
reaksi kedua yang tergabung dalam pDONR201 dengan melakukan BP rekombinasi
(Invitrogen). vektor yang dihasilkan menjadi sasaran reaksi LR
dengan theR4 gerbang biner vectorR4pGWB501 (Nakagawa et al., 2008). Itu
constructwas akhir yang dihasilkan digunakan untuk transformwild-jenis dan mutan fugu5-1
tanaman dengan metode dip bunga (Clough dan Bent, 1998). beberapa independen
T3 garis homozigot mengekspresikan gen IPP1 bawah AVP1 /
FUGU5 promotor froma T-DNA tunggal penyisipan lokus diidentifikasi di kedua
-Tipe liar dan latar belakang fugu5-1. nomor baris AVP1Pro: IPP1 # 4-4 dan
# 8-3 (di latar mutan fugu5) dan garis nomor AVP1Pro: IPP1 # 2-15
dan # 6-4 (di-tipe liar background) dipilih untuk studi lebih lanjut.
RNA Isolasi dan Analisis RT-PCR
RNA total diekstraksi menggunakan RNeasy mini tanaman kit (Qiagen). RNA
Sampel kemudian diobati dengan DNase I (Life Technologies), diikuti oleh
transkripsi terbalik menggunakan transkripsi pertama-untai sintesis cDNA kit

(Invitrogen). RT-PCR dilakukan dengan ABI 9700 (Life Technologies).

Kebanyakan urutan untuk primer RT-PCR untuk gen siklus sel inti yang
ditemukan di http://atrtprimer.kaist.ac.kr/ (Han dan Kim, 2006). primer
urutan digunakan tercantum dalam Tambahan Tabel 1 online.
Minyak mentah Membran Persiapan
Tunas dari tipe liar dan fugu5 tanaman mutan (240-270 tanaman) yang
homogen dalam 25 mL 50mMTris-asetat, pH 7,5, 0.25Msorbitol, 1%
polivinilpirolidon, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, dan 20 mM p- (amidinophenyl)
methanesulphonyl fluoride hidroklorida dengan mortir dan
alu. homogenat itu disaring melalui tiga lapisan kain tipis
dan disentrifugasi (10.000 g, 10 menit). Setelah sentrifugasi supernatan
lagi (100,000g, 40 menit), pelet diperoleh dihentikan di 20 mM
Tris-asetat, pH 7,5, 0.25Msorbitol, 1mMEGTA, 1mM MgCl2, and2mM
DTT dan digunakan sebagai membran mentah. kadar protein ditentukan
menggunakan kit uji protein (Bio-Rad).
SDS-PAGE dan Analisis Immunobloiting
sampel protein dianalisis dengan menggunakan SDS-PAGE dan imunobloting.
Setelah elektroforesis, protein dipindahkan ke sebuah Immobilon-P
membran (Millipore). Antibodi primer usedwere disiapkan sebelumnya:
antibodi untuk V-PPase (antigen peptida urutan, DLVGKIERNIPEDDRN;
. Kobae et al, 2006), V-ATPase subunit A (TKAREVLQREDDLNEI; Kobae
. Et al, 2006), V-ATPase subunit a (ELVEINANNDKLQRSYNEL; Kobae
Peran H + -PPase di Plant Pembangunan 11 dari 14
. Et al, 2004), BIP (SKDNKALGKLRREC;. Kobae et al, 2004), dan TIP1s
(Antibodi terhadap protein murni;. Higuchi et al, 1998). Antigen pada
membran divisualisasikan dengan lobak protein peroksidase-coupled
A dan reagen chemiluminescent ECL (GE Healthcare). Gambar dan
intensitas band immunostained yang secara kuantitatif diukur dengan
densitometri dengan sistem didinginkan kamera CCD (Light-Capture II; Atto
Bersama.).
enzim Tes
PPi hidrolisis oleh V-PPase diukur pada 308C seperti yang dijelaskan sebelumnya
(Maeshima dan Yoshida, 1989). Media reaksi yang terkandung 1 mM
Na4PPi, 50 mM KCl, 1 mM Na-molibdat, 0,2% Triton X-100, 1 mM
MgSO4, 0,5 mM KF, dan 30 mM Tris-Mes, pH 7,2. ATP aktivitas hidrolisis,
oleh V-ATPase, wasmeasured di 308C seperti yang dijelaskan sebelumnya (Schumacher
et al., 1999) dalam media reaksi yang mengandung 1 mM NaN3, 0.1mMsodium
molibdat, 0,5 mM natrium vanadat, 0,03% Triton X-100, 3 mM ATP,
3mMMgSO4, dan 30mMTris-Mes, pH 7,2. Kegiatan tersebut ditentukan
ada atau tidak adanya KCl atau NaNO3. Nitrat-sensitif dan
Kegiatan klorida-dirangsang didefinisikan sebagai aktivitas V-ATPase.
Analisis kuantitatif Jumlah TAG
Jumlah cadangan lipid benih yang terkandung dalam biji kering dan 1, 2, 3,
dan bibit etiolated 4-d-lama weremeasured dengan menentukan jumlah
total TAG menggunakan assay kit Trigliserida E-Test (Wako). Baik 20 kering
benih atau 20 bibit homogen dalam mortar dalam 100 mL steril
air sulingan. Homogenat dicampur dengan 0,75 mL buffer reaksi
disediakan dalam kit seperti yang dijelaskan sebelumnya (Arai et al., 2008). konsentrasi
TAG dalam sampel ditentukan menurut produsen
protokol.

Analisis kuantitatif Suc dan PPi

Jumlah Suc dan PPi di bibit etiolated 3-d berusia diukur
dengan menentukan jumlah total Suc dan PPi dengan ion
Sistem kromatografi (DX-500; Dionex Co) menggunakan CarboPAC PA1
kolom untuk Suc dan AS11 IonPac untuk PPi, masing-masing. Untuk
kuantifikasi PPi, kita hati-hati diekstraksi ion organik dan anorganik
dari bibit. Setiap bibit etiolated dikumpulkan dari piring dan
segera dimasukkan ke dalam nitrogen cair untuk menghindari hidrolisis PPi di
jaringan. Empat ratus bibit beku yang homogen di dingin 80%
etanol, vortexed selama 10 menit, dirawat di 808C selama 30 menit, dan kemudian
disentrifugasi pada 20,000g selama 5 menit. Endapan disuspensi di
dingin 80% etanol dan disentrifugasi. Pertama dan kedua supernatant
digabungkan dan dikeringkan dengan evaporator sentrifugal. Sebuah alikuot
air ditambahkan ke dalam tabung, dan senyawa yang larut dalam air yang
diekstrak. Ekstrak disaring dengan September-Pak Cahaya C18 penyaring (Waters)
dan kemudian dengan Dismic-13cp (Advantec). Selama proses, fosfatase
tidak memiliki kesempatan untuk menghidrolisis PPi dalam jaringan dan ekstrak.
Biasanya, nasib standar internal, seperti gula dan ion anorganik,
diikuti dan diperiksa untuk memverifikasi pemulihan yang lebih dari 85%. Untuk
menentukan isi PPi, sampel pra-perawatan menggunakan ASRS300 anion diri regenerasi penekan kolom (Dionex) sebelum
IonPac AS11 kolom pertukaran anion untuk mengurangi kebisingan latar belakang.
Dalam percobaan ini, kita dapat dengan jelas membedakan PPi dari Pi, polifosfat,
Asam anorganik, atau asam organik.
Pengukuran vakuolar pH
The vacuolar pH bibit 10-d-lama tumbuh di piring MS tanpa Suc
ditentukan dengan menggunakan neon sel-permeant dye BCECF-AM
(Invitrogen) seperti yang dijelaskan (Krebs et al., 2010). Pemuatan pewarna itu
dilakukan di 10 mM BCECF-AM dan 0,02% Pluronic F-127 (Invitrogen).
Setelah 1 jam pewarnaan dalam kegelapan dengan agitasi lembut, bibit
dicuci sekali dalam air suling. BCECF fluoresensi terdeteksi
menggunakan Olympus FV1000-D confocal laser scanning mikroskop. Itu
gambar yang diperoleh dengan menggunakan software Fluoview confocal dan
UPLSAPO 360 perendaman air objektif. fluorophore itu bersemangat
pada 488 dan 440 nm, masing-masing, dan emisi yang terdeteksi antara
530 dan 550 nm. Semua gambar yang direkam dalam sepenuhnya memanjang
wilayah sel akar tanpa rambut akar. gambar rasio yang dihasilkan menggunakan
alat rasio / konsentrasi software Olympus Fluoview, dan
gambar diolah dengan menggunakan software Adobe Photoshop. Kemudian rasio
nilai-nilai yang diperoleh dengan menggunakan software Olympus Fluoview. terintegrasi
kepadatan pixel diukur dan nilai-nilai dari 488-nm bersemangat
Gambar-gambar tersebut dibagi dengan nilai-nilai dari gambar bersemangat 440-nm. Itu
chromatic aberration dari tujuan hati-hati diperiksa dan dipertimbangkan.
Rasio ini kemudian digunakan untuk menghitung nilai pH atas dasar suatu
kurva kalibrasi. In situ kalibrasi BCECF dilakukan dengan 10-Dold
bibit Arabidopsis sarat dengan pewarna. Bibit yang
diinkubasi di pH equilibrium buffer (De Angeli et al., 2006) 15 menit sebelum
pengukuran. Buffer yang terkandung 50mMMES-BTP, pH 5,38-6,4, atau
50 mM HEPES-BTP, pH 6,8, dan 50 mM amonium asetat. Itu
kurva kalibrasi diperoleh dengan memplot nilai rasio rata-rata

delapan bibit terhadap pH.

Nomor aksesi
Data urutan dari artikel ini dapat ditemukan dalam GenBank / EMBL
database atau database Arabidopsis Genome Initiative di bawah
berikut nomor aksesi: Arabidopsis AVP1 / FUGU5 (juga disebut
VHP1; 1), At1g15690; VHP2; 1, At1g78920; VHP2; 2, At1g16780; CYCB1; 1,
At4g37490; CYCB1; 2, At5g06150; CDKA; 1, At3g48750; CDKB1; 1,
At3g54180; CDKB1; 2, At2g38620; dan TUBULINb 4, At5g44340; S.
cerevisiae IPP1, YBR011C; vhp1-1 T-DNA penyisipan mutan, referensi Kazusa
nomor KG8420.
data tambahan
Bahan-bahan berikut ini tersedia dalam versi online dari artikel ini.
Gambar Tambahan 1. Kompensasi di fugu5 Apakah Terbatas untuk
Kotiledon dan Pertama Daun.
Tambahan Gambar 2. Fenotip Wild-Type dan fugu5 Mutan
Bibit muda Tumbuh di MS Media dengan Suplemen yang berbeda.
Tambahan Gambar 3. Efek dari GLC Analog dan Stres osmotik
pada Fenotipe fugu5.
Tambahan Gambar 4. Pengaruh Suc pada Kotiledon Fenotip dari
Alel yang berbeda dari Mutant fugu5.
Tambahan Gambar 5. Pengaruh Suc pada Ekspresi
CYCB1; 1pro: GUS Reporter dan Beberapa Inti Gen Siklus Sel.
Tambahan Gambar 6. Tempat Mutasi dan Membran Topologi
V-PPase.
Tambahan Gambar 7. Gross Morfologi Wild-Type dan fugu5
Tanaman alel mutan.
Tambahan Gambar 8. vhp1-1 Mutant, T-DNA Penyisipan Garis
Alel dari fugu5, Pameran Kompensasi.
Tambahan Gambar 9. Fenotip dari AVP1pro: IPP1 (Wild-Type)
Tanaman transgenik.
Tambahan Gambar 10. Mobilisasi Seed Lipid Cadangan dan
Pengaruh 2,4-DB di Mutant fugu5.
Tambahan Tabel 1. Daftar Primer Digunakan dalam Studi ini.
12 dari 14 The Plant Cell
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami berterima kasih kepada J. Celenza (Boston University) untuk menyumbangkan
CYCB1; 1pro:
GUS biji line, TJ Guilfoyle (University of Missouri) untuk menyediakan
DR5: biji garis GUS, T. Nakagawa (Shimane University) untuk
R4pGWB501 vektor biner, dan Y. Kamada (Institut Nasional untuk
Biologi dasar) untuk menyediakan S. cerevisiae DNA genom. Kami juga berterima kasih
M. Asaoka dan C. Sato (Nagoya University) untuk bantuan ahli mereka dengan
yang PPi dan kuantifikasi Suc, A. Miyaka (Nagoya University) untuk
pengukuran pH vacuolar, dan Y. Nakanishi dan M. Inagaki
(Universitas Nagoya) untuk isolasi lini mutan vhp1-1. Kami berterima kasih
H. Iida dan Y. Nakayama (Gakugei Universitas Tokyo) untuk menyediakan
fasilitas laboratorium dan dukungan teknis untuk analisis SDS-PAGE dan
E. (Takabe) Itoh (Universitas Tokyo) untuk dukungan teknis. Pekerjaan ini
didukung oleh Hibah-in-Aid dari Jepang Masyarakat untuk
Promosi of Science (Grant 16-04179 ke AF), Grant-in-Aid for Young

Ilmuwan (B) (ke AF), Creative Penelitian Ilmiah (untuk HT), Scientific
Penelitian (A, untuk HT dan GH, B, ke MM), Scientific Research di
Area Prioritas (untuk HT), Ilmuwan Muda (B) dan Penelitian eksplorasi
(Ke GH), dan Kementerian Pendidikan, Kebudayaan, Olahraga, Ilmu, dan
Teknologi Jepang, serta hibah dari Program Bio-Desain
Departemen Pertanian, Kehutanan, dan Perikanan Jepang (untuk HT)
dan Toray Science Foundation (untuk HT).