Propsito:
Investigar la determinacin de hongos y levaduras y como se debe reportar los
resultados obtenidos de acuerdo a las tablas respectivas.
Introduccin:
La levadura Saccharomyces cerevisiae es un hongo ascomiceto unicelular. Los
hongos son organismos eucariticos (sus clulas tienen una organizacin interna
en orgnulos membranosos) quimiohetertrofos. A continuacin vamos a explicar
el concepto de quimiohetertrofo y a describir los principales grupos de hongos.
Los organismos necesitan carbono y energa para poder crecer. En la naturaleza
las fuentes de energa pueden ser qumicas (energa presente en los enlaces de
compuestos qumicos) o lumnica (energa de la luz que se transforma en energa
qumica). Por otra parte, las reaccines de xido-reduccin que tienen lugar en los
seres vivos requieren donadores de electrones que pueden ser orgnicos o
inorgnicos. Por ltimo, el carbono puede encontrarse de dos formas, como
carbono orgnico y como carbono inorgnico (CO2). Como puede verse, las
bacterias presentan una gran versatilidad metablica. Mucho mayor que la que
presentan plantas, animales u hongos. En cualquier caso, los principales
microorganismos de inters aplicado industrial pertenecen al grupo de los
quimiohetertrofos. El microorganismo responsable de la fermentacin alcohlica
de la produccin del vino es la levadura S. cerevisiae. Las levaduras son hongos
unicelulares, a diferencia de otro tipo de hongos a los que conocemos como
filamentosos. Sin embargo, biolgicamente, ambos tipos de hongos (unicelulares o
filamentosos) son similares. Las levaduras se multiplican en los medios de cultivo
como clulas aisladas individuales que se dividen y, de esta forma, aumentan su
nmero. En el caso de los hongos filamentoso, sin embargo, las clulas se
encuentran contenidas dentro de unos tubos formados por la pared celular. Estos
tubos se denominan hifas y van creciendo por sus puntoas (crecimiento apical) y
ramificndose para formar la colonia que denominamos micelio. Por consiguiente,
los hongos filamentosos tienen un crecimiento micelial, mientras que las levaduras
no.
Agua 1,0 l
Preparacin:
Cajas Petri.
Frascos de vidrio de 250 ml con tapn de rosca.
Tubos de 16 x 150 mm con tapn de rosca.
Utensilios esterilizables para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas,
tijeras, cucharas, esptulas, etc.
Todo el material e instrumentos que tengan contacto con las muestras bajo
estudio, deben esterilizarse mediante:
Horno, durante 2 h de 170 a 175C o por 1h a 180C o autoclave, durante 15
minutos como mnimo a 121 1,0C.
7. Aparatos e instrumentos
mantenga la temperatura a
45 1,0C.
Contador de colonias de
campo
oscuro,
con
luz
adecuada, placa de cristal
cuadriculada
y
lente
amplificador.
Registrador
electrnico.
Microscopio ptico.
mecnico
8. Preparacin de la muestra
La preparacin de la muestra debe ser de acuerdo a lo establecido en la NOM110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su
Anlisis Microbiolgico.
9. Procedimiento
9.1 Colocar por duplicado en cajas Petri 1 ml de la muestra lquida directa o de
la dilucin primaria, utilizando para tal propsito una pipeta estril.
9.2 Repetir el procedimiento tantas veces como diluciones decimales se
requiera sembrar, utilizando una pipeta estril diferente para cada dilucin.
9.3 Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y
mantenido a 45 1 C en un bao de agua. El tiempo transcurrido entre la
preparacin de la dilucin primaria y el momento en que es vertido el medio de
cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
9.4 Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a
izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido
contrario y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa. Permitir que
la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri reposar sobre una superficie
horizontal fra.
9.5 Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
9.6 Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1C.
9.7 Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin.
Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150
colonias. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o
si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar los conteos de 4 das de
incubacin y an de 3 das. En este caso, informar el periodo de incubacin de
3 o 4 das en los resultados del anlisis.
9.8 Si es necesario, cuando la morfologa colonial no sea suficiente, examinar
microscpicamente para distinguir las colonias de levaduras y mohos de las
bacterias.
10. Expresin de resultados
Clculo del Mtodo: Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias
como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin,
tomando en consideracin los criterios de la NOM-092-SSA1-1994. Mtodo para
la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa, para la expresin de resultados.
10.1.7 Placas corridas por duplicado, ambas placas de una dilucin dentro del
intervalo de 25 a 250 y slo una de la otra dilucin dentro del mismo. Contar
las cuatro cajas incluyendo aqulla con menos de 25 o ms de 250 colonias,
para calcular la cuenta en placa, vase el cuadro 2, ejemplo 9.
10.1.8 Despus de contabilizar las colonias en las placas seleccionadas,
multiplicar por la inversa de la dilucin para obtener el nmero de UFC por
mililitro o gramo de la muestra. Redondear la cifra obtenida en la cuenta de
manera que slo aparezcan dos dgitos significativos al inicio de esta cifra. Para
redondear, elevar el segundo dgito al nmero inmediato superior cuando el
tercer dgito de la derecha sea cinco o mayor (por ejemplo: 128 redondear a
130). Si el tercer dgito es cuatro o menos, reemplazar el tercer dgito con cero
y el segundo dgito mantenerlo igual (Por ejemplo: 2417 a 2400):
11. Informe de la prueba: Reportar como: Unidades formadoras de colonias,___
UFC/g o ml, de bacterias aerobias en placa en agar triptona extracto de
levadura o agar para cuenta estndar, incubadas ________ horas a _______ C.
CUADRO 2 Clculo de los valores de la cuenta en placa
(Ensayos por duplicado)
Ejemplo Colonias contadas UFC/g o ml
nmero 1: 100 1: 1000 1: 10000
1 > 250a 178 16 180000
> 250 190 17
2 > 250 220 25 250000
238 28
3 18 2 0 1600b
14 0 0
4 > 250 > 250 512 5000000b
> 250 > 250 495
5 > 250 240 34 290000
> 250 235 crecimiento
extendido
6 0 0 0 < 100c
7 > 250 240 24 250000
> 250 268 19
8 > 250 216 23 280000
> 250 262 42
9 > 250 215 20 230000
> 250 235 26
> 250 275 32 270000
> 250 225 26
Conclusin:
Los mohos y levaduras estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se
pueden encontrar formando parte de la flora normal de un alimento, o como
agentes contaminantes y en los equipos sanitizados inadecuadamente,
provocando el deterioro fisicoqumico de stos, debido a la utilizacin en su
metabolismo de los carbohidratos, cidos orgnicos, protenas y lpidos originando
mal olor, alterando el sabor y el color en la superficie de los productos
contaminados. Adems los mohos y levaduras pueden sintetizar metabolitos
txicos termoresistentes, capaces de soportar algunas sustancias qumicas, as
como la irradiacin y presentan capacidad para alterar sustratos desfavorables,
permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Es de gran importancia
cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al establecer la
cuenta de estos microorganismos, permite su utilizacin como un indicador de
prcticas sanitarias inadecuadas durante la produccin y el almacenamiento de los
productos, as como el uso de materia prima inadecuada. El mtodo se basa en
inocular una cantidad conocida de muestra de prueba en un medio selectivo
especfico, acidificado a un pH 3,5 e incubado a una temperatura de 25 1C,
dando como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para este tipo de
microorganismos. Esta Norma Oficial Mexicana establece el mtodo general para
determinar el nmero de mohos y levaduras viables presentes en productos
destinados al consumo humano por medio de la cuenta en placa a 25 1C. Esta
Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el Territorio Nacional
para las personas fsicas o morales que requieran efectuar este mtodo en
productos nacionales o de importacin, para fines oficiales.
Bibliografa:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/111ssa14.html
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html