LICENCIATURA EN AGROECOLOGA

GENTICA AGRCOLA MANUAL DE

PRCTICAS DE LABORATORIO
UNIDAD I. GENTICA MOLECULAR
PRCTICA 1.- EXTRACCIN DE ADN
M. en C. Erika Betancourt Velzquez

ELABORADO POR:

Chay Ortiz Pamela Ivette

Canepa Coh Paola Guadalupe
Esquivel Mezeta Eilym Narai
Hernndez Ruiz Yoan
Notario Prez Eri David

Mrida, Yucatn, Mxico. 2015

INTRODUCCIN
El ADN se encuentra en el interior del ncleo celular, disperso y muy replegado,
unido a protenas para formar la cromatina. Para extraerlo es preciso provocar una
lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los cidos nucleicos de los
restos celulares. El procedimiento de lisis idneo suele consistir en un equilibrio de
tcnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo;
pero suficientemente suave para preservar el cido nucleico diana. La digestin
enzimtica permite romper la membrana celular e inactivar las nucleasas
intracelulares al mismo tiempo. Tras la lisis celular y la inactivacin de las nucleasas,
los restos de clulas se eliminan fcilmente por filtracin o precipitacin. Para su
identificacin se puede emplear la tcnica de electroforesis en gel, que consiste en
la separacin de molculas cargadas a travs de una matriz tamponada bajo la
influencia de un campo elctrico. En el caso de los cidos nucleicos, el grupo fosfato
es el responsable de la fuerte carga negativa en condiciones de pH neutro, haciendo
que los fragmentos migren hacia el polo positivo.

OBJETIVO: Extraer y analizar el ADN, empleando tcnicas especializadas

Marco terico
El cido desoxirribonucleico, mejor conocido como ADN es un tipo de cido
nucleico, es una macromolcula que forma parte de todas las clulas. Contiene la
informacin gentica usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos
vivos conocidos y de algunos virus, siendo el responsable de su transmisin
hereditaria. Desde el punto de vista qumico, es un polmero de nucletidos, es
decir, un polinucletido. Un polmero es un compuesto formado por muchas
unidades simples conectadas entre s, divididas en diferentes secciones. En el ADN,
cada seccin es un nucletido, y cada nucletido, a su vez, est formado por un
azcar en este caso la desoxirribosa, una base nitrogenada que puede ser (A)
adenina, (T) timina, (C) citosina y (G) guanina y un grupo fosfato que acta como
enganche de cada seccin con el siguiente. Lo que distingue a una seccin
(nucletido) de otro es, entonces, la base nitrogenada, y por ello la secuencia del

ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases. Los cidos nucledos
presentan propiedades fsico-qumica importante en relacin con sus funciones de
almacenamiento, transmisin (replicacin) y expresin (transcripcin y traduccin)
de la informacin gentica. Tales como. Propiedades en disolucin, Reactividad,
Hidrlisis qumica de cidos nucleicos, Hidrlisis acida,

Hidrlisis alcalina,

Absorcin en el ultravioleta en los organismos vivos, el ADN se presenta como una

doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por
unas conexiones denominadas puentes de hidrgeno. Las secuencias de ADN que
constituyen la unidad fundamental, fsica y funcional de la herencia se denominan
genes. Cada gen contiene una parte que se transcribe a ARN y otra que se encarga
de definir cundo y dnde deben expresarse. La informacin contenida en los genes
(gentica) se emplea para generar ARN y protenas, que son los componentes
bsicos de las clulas, los "bloques" que se utilizan para la construccin de los
orgnulos celulares, entre otras funciones. Dentro de las clulas, el ADN est
organizado en estructuras llamadas cromosomas que, durante el ciclo celular, se
duplican antes de que la clula se divida. Los organismos eucariotas (por ejemplo,
animales, plantas, y hongos) almacenan la inmensa mayora de su ADN dentro del
ncleo celular y una mnima parte en los elementos celulares llamados
mitocondrias, y en los plastos, en caso de tenerlos; los organismos procariotas
(bacterias y arqueas) lo almacenan en el citoplasma de la clula, y, por ltimo, los
virus ADN lo hacen en el interior de la cpside de naturaleza proteica. Existen
multitud de protenas, como por ejemplo las histonas y los factores de transcripcin,
que se unen al ADN dotndolo de una estructura tridimensional determinada y
regulando su expresin. Los factores de transcripcin reconocen secuencias
reguladoras del ADN y especifican la pauta de transcripcin de los genes. El
material gentico completo de una dotacin cromosmica se denomina genoma y,
con pequeas variaciones, es caracterstico de cada especie.

Materiales

Centrfuga
Tubo Eppendorff estril de 1.5 ml
Puntas estriles
Micropipetas y puntas: 20,100,
1000l
Vortex
Guantes de ltex
Balanza analtica
Esptula
Horno de microondas
Equipo de electroforesis: Cubeta
horizontal
de
electroforesis - Peines para
electroforesis de 10l - Fuente
de corriente continua
Mini kit de ADN

Reactivos

Muestra de tierra

Metodologa

Extraccin de ADN

PONER UNA PEQUEA MUESTRA EN EL POWERBEAT TUBE.

AGITAR EN EL VORTEX
AGREGAR 60 UL DE LA SOLUCION 1 (PROTEINASA K)
AGITAR DE FORMA HORIZONTAL EN EL VORTEX POR 10 MINUTOS
CENTRIFUGAR POR 30 SEGUNDOS

fase 1

Extraccin de ADN

TRANSFERIR LA MUESTRA A UN TUBE COLECTOR SOLAMENTE 2 ML

AGREGAR 250 UL DE LA SOLUCION 2 Y MESCLAR EN EL VORTEX POR 5 SEGUNDOS
INCUBAR A 4 C POR 5 MINUTOS
CENTRIFUGAR POR 1 MINUTO

fase 2

Extraccin de ADN

TRANSFERIR EL SOBRENADANTE A OTRO TUBE COLECTOR LA MISMA CANTIDAD QUE LA VEZ ANTERIOR
AGREGAR LA SOLUCION 3 MEZCLAR EN EL VORTEX
VOLVER A INCUBAR
CENTRIFUGAR POR 1 MINUTO

fase 3

Extraccin del ADN

TRANSFERIR DE NUEVO EL SOBRENANTE EN OTRO TUBE COLECTOR

AGREGAR 1200 UL DE LA SOLUCION 4 (AGITAR ANTES DE USAR)
MESCLAR EN EL VORTEX
TRANFERIR 670 UL AL SPIN FILTER
CENTRIFUGAR 1 MINUTO Y DECATAR EL TUBO COLERTOR
REPETIR LA TRANSFERENCIA DE EL SOBRENANDANTE AL SPIN FILTER Y CENTRIFUGAR HASTA QUE ESTE SE ACABE

fase 4

Extraccin de ADN
fase 5

AGREGAR 500 UL DE LA SOLUCION 5

CENTRIFUGAR POR 30 SEGUNDOS
DESECHAR EL FILTRADO
CENTRIFUGAR POR 1 MINUTO
COLOCAR EL SPIN FILTER EN UN TUBO COLECTOR LIMPIO
AGREGAR 100 UL DE LA SOLUCION 6 EN EL CENTRO DEL FILTRO
CENTRIFUGAR POR 30 SEGUNDOS
DESECHAR EL SPIN FILTER Y ENVOLVER CON PAPEL ALUMINIO LAMUESTRA Y AL MACENARLA

Cuestionario
1. Describe lo que observaste al microscopio
Observamos unas pequeas rayitas muy pequeas y logramos descubrir que
tenamos ah un poco del ADN
2. Explica que parte del procedimiento permite romper primero la pared
celular, luego eliminar las protenas que envuelven al ADN.
Al ponerla en el tubo Eppendorf y agregarle la proteinASA, agitarlo en el vortex
y centrifugar.

3. Explica el procedimiento empleado en sta prctica y la funcin de cada

reactivo usado.
La muestra se coloca en un dispositivo llamado tubo Eppendorf. Una solucin
especial es aadida al tubo, a continuacin, y el tubo se coloca en el vortex
el propsito de la solucin es lisar (romper) la estructura celular del material.
Contiene dos ingredientes fundamentales: un detergente especialmente
diseado y una enzima llamada proteinasa K este pasa por la centrifugadora,
el detergente corroe la membrana celular de la muestra y la membrana
nuclear que rodea el material gentico de la clula. Una vez que estas
membranas son alteradas, la protenas K degrada una protena llamada
histona, que envuelve al ADN. El tubo Eppendorf, A continuacin se le
agrega una solucin de sal concentrada para agrupar la protena indeseada
y los restos celulares. El tubo se coloca en una pequea centrfuga, en donde
la fuerza centrfuga deja el ADN difundido en una capa de la solucin por
encima del exceso de material ms pesado. Luego el ADN se retira y se
coloca en otro tubo. Se agrega alcohol isoproplico y se mezcla
cuidadosamente. Este proceso hace que el ADN de la solucin se agrupe en
filamentos visibles. Entonces, el material se coloca otra vez en la centrfuga
para forzar a las hebras de ADN a juntarse. El alcohol se retira y el ADN se
deja secar. Una vez que se haya completado el proceso, la muestra de ADN
resultante la almacenamos en el congelador, la semana siguiente sacamos
las muestras y les pusimos azul de bromofenol aunque no es necesario,

solamente era para ver como corre el ADN durante la electroforesis ya que
recordemos que el ADN es de carga negativa, de ah esperamos que pase
el tiempo y al concluir lo sacamos de la caja de electroforesis y lo pasamos
al transluminador donde pudimos ver el recorrido de nuestro ADN.
4. Investiga e interpreta el gel obtenido
Es al que sirve para separar las molculas. En muchos casos un gel es un
polmero entrelazado de porosidad controlable. Cuando la separacin es
de protenas, ADN o cidos nucleicos pequeos, el gel est compuesto por
diferentes concentraciones de acrilamida/bis-acrilamida y un iniciador de la
polimerizacin, para producir redes de poliacrilamida de diferentes tamaos.
Para

separar

cidos

nucleicos

grandes,

la

matriz

empleada

es agarosa purificada. En ambos casos, el gel es de forma slida pero porosa.

Esta se encuentra en la electroforesis, se refiere a la fuerza elctrica que se
emplea para desplazar las molculas a travs del gel. Al situar las molculas en
el gel y aplicar una diferencia de potencial elctrico, las molculas se mueven a
diferentes velocidades, hacia el ctodo, si estn cargadas positivamente, y hacia
el nodo, si estn cargadas negativamente
5. Redacta tus conclusiones de la prctica y si el objetivo planteado fue
alcanzado
Concluimos que el ADN es fundamental para las clulas ya que ah se encuentra
contenida toda la informacin gentica de ella misma, obtuvimos ptimos
resultados ya que logramos extraer de manera correcta nuestro ADN.

Anexo 1
Viernes 19 de agosto de 2016
Primero se tom una muestra de tierra y se introdujo 0.2645g en el tubo Power Tube
para posteriormente colocarlo de manera vertical en el Vortex. Luego se le agrego
un poco de la solucin 1 y se coloc en el Vortex de forma vertical por un breve
momento y despus por 10 minutos de forma horizontal. Acabado esto se coloc en
la Centrifugadora por 30 segundos a 10 mil r/s y terminado la muestra sali con
mucha espuma, luego se puso de forma vertical por 5 segundos en el Vortex para
posteriormente llevar la muestra al congelador a una temperatura de 4C durante 5
minutos. Pasado el tiempo se volvi a introducir por un minuto en la Centrifugadora
a 10 mil r/s. luego la muestra adopto una coloracin como amarillo transparente t en
el fondo de este se qued la pastilla o residuos de un color marrn. Con ayuda de
un Micropipetas se cambi la muestra a otro Tubo Eppendorf limpio y sin tocar el
fondo de este, luego se puso brevemente en el Vortex a mxima velocidad de forma
vertical para posteriormente ponerlo en el congelador por 5 minutos a 4C, durante
el transcurso hay un cambio de coloracin ya que pasa de ser transparente a
asemejarse al nctar de manzana y que adems en la superficie tiene una burbuja.
Luego se pone en la Centrifugadora por un minuto a 10 mil r/s, luego la muestra
vuelve a tener su coloracin transparente y la pastilla en el fondo, con ayuda del
Micropipetas se toma 600 ul evitando tocar el fondo y se coloca en otro Tubo
Eppendorf y se le agrega 1200 ul de solucin C4 y luego se coloca en el Vortex por
5 segundos de forma vertical. Luego de la muestra que haba sobrado se coloc
675 ul en un Spin para la filtracin y que en el fondo de este tena un polvito blanco
y una textura como arenisca que es la que hace posible la filtracin. Luego se puso
en la Centrifugadora por un minuto a 10 mil r/s y posteriormente de desecho lo que
se filtr el cual tena una coloracin transparente y de lo que sobr se agarr 675 ul
con ayuda del Micropipetas y se puso en la Centrifugadora a 10 mil r/s por un minuto
y se vuelve hacer el mismo procedimiento. Ya finalizado esto se coloca a la muestra
500 ul de solucin C5, se pone en la Centrifugadora a 10 mil r/s por 30 segundos,
se tira el desecho y se pone por un minuto en la centrifugadora a 10 mil r/s. luego
se le agrega a la muestra 100 ul de solucin C6 al filtro al cual se cambi de

recipiente para luego meterlo a la Centrifugadora por 30 segundos a 10 mil r/s. la

muestra que quedo finalmente se le agarro una gotas con ayuda del Micropipetas y
se coloc dichas gotas en el porta objetos y se le agrego un cubre objetos de azul
de metileno para poder checar en el microscopio si hay algn rastro de ADN y lo
que sobro de la muestra se envolvi en aluminio para que no le d la luz y
posteriormente se coloc en el refrigerador. El resultado que arrogo el microscopio
fue que si haba rastro de ADN pero tambin manchas negras, pudiendo ser por
que el azul de metileno estaba infectado con hongos o el lente del microscopio
estaba sucio.

Anexo 2
Viernes 26 de agosto de 2016
Se nos proporcion una Cmara de Electroforesis en la cual est un gel de agarosa.
Antes de empezar el procedimiento se pusieron guantes de ltex aquellos
integrantes que tuvieran contacto con los instrumentos. Se abre la Cmara de
Electroforesis y se le retiro el peine. La Cmara tiene dos cables, uno de color negro
que es la carga negativa y uno de color rojo que es la carga positiva, adems de
dos pozos en la cual se deposit agua esta llenarse por completo. Luego se conect
los cables a la fuente de corriente en las entradas de lado derecho a 50V durante 5
minutos para preparar la muestra. No podamos excdenos ya que mientras ms
Voltaje ms posibilidad que la molcula se pueda romper. Pasado los 5 minutos en
las paredes del fondo de los pozos se form pequeas burbujas. Luego con ayuda
de un Micropipetas graduado a 3 se coloc 3ul de buffer de carga (azul bromofenol)
en el papel parafilm gota por gota y luego 3ul de la muestra de ADN, haciendo un
total de 6 gotas. Posteriormente con ayuda del Micropipetas graduado a 6 y se gota
por gota y se colocaron en los orificios del gel sin tocar el fondo (cada integrante
coloco una gota a excepcin de un integrante que coloco 2) posteriormente se dej
en reposo por 30 minutos a 85V. Pasado el tiempo se desconect la cmara de la
fuente de corriente y se llev a cabo una revisin pero aparentemente no mostro
nada. Luego se abri la cmara, se mojaron los dedos de los guantes ltex con un

Poco de agua y se retir el gel con mucho cuidado. Posteriormente el gel es

introducido con mucho cuidado al transluminador UV, se apagan las luces del
laboratorio y se puede observar el ADN tras una ventanilla donde todo se ve como
de un color violeta fosforescente y el ADN de color verde limn fosforescente. El
resultado arrojado fue todo un xito.

Anexo 3

Vista en el microscopio del ADN extrado del sustrato de la tierra.

Resultado final en el transluminador

Referencias
Gentica agrcola, Manual de prcticas de laboratorio/ M. en C.
Erika Betancourt Velzquez/ MERIDA YUCATN MEXICO/ P.P 3.
http://uadyvirtualcloud.uady.mx/pluginfile.php/264684/mod_resou
rce/content/1/GEN-AGRI.pdf
Electroforesis de ADN/ Francisco Fierro Fierro/ INNEC.COM
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/electroforesis.
pdf
Extraccin y purificacin de ADN/ Laura Patricia Alejos
Velzquez, Mara del Consuelo Aragn Martnez, Amelia Cornejo
Romero/ INNEC. COM
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/extraccion.pdf