Kelompok

Materi

PeralatandanProsed 1. Mikroskop
ur2. TeknikMempelajarimikroorganism
ProsedurLaboratori
esecaramikroskopik
um
3. Teknikbiakanmurnimikroorganis
me
4. TeknikPencirianMikroorganisme
NutrisidanMetabolis 1. NutrisiatauNutrien
meMikroorganisme 2. FungsiNutrienbagimikroorganism
e
3. Penggolonganmikroorganismebe
rdasarkanataskebutuhan nutrient
4. Enzim
5. Metabolisme
PertumbuhandanPe 1. Pertumbuhanbakteri
rbanyakanMikroorg 2. Faseanisme
fasepertumbuhanmikroorganism
e
3. Analisispadapertumbuhanpopula
simikroorganisme
4. Konstantakecepatanpertumbuha
n
5. Pengaruhkadar nutrient
terhadappertumbuhan

PerhitunganKuantit
aifMikroorgansme

IntisariMateri

1. Perhitungansecaralangsung
2. Perrhitungansecaratidaklangsun
g
SterilisasidanDensif 1. Perlakuanfisik
eksi
2. Cara mekanik
3. Cara kimia
AntimikrobaatauAnt 1. Antibiotika
iinfeksi
2. Antiseptika
3. Densifektansia
4. Preservatif
ResistensiAntimikro MekanismeResistensiAntimikroba
ba
VirulensidanKolonis 1. Kapsul
asiMikroorganisme
2. FimbriedanPilus
3. EnterotoksindanEnzim
GenetikaMikroorgan 1. Pewarisan cirri dankeragaman
isme
2. Perubahanfenotipeakibatperubah
anlingkungan
3. Tipe-tipemutanbakteri
IsolasidanIdentifika 1. IsolasidanIdentifikasibakteri
siMikroorganisme
2. Kulturmurni
3. Uji-ujiIdentifikasi
4. Kunciidentifikasi

PEMBAGIAN KELOMPOK BERDASARKAN NO STAMBUK TERAKHIR

KELOMPOK 1 = STAMBUK AKHIR O
KELOMPOK 2 =STAMBUK AKHIR 2
KELOMPOK 3 = STAMBUK AKHIR 7
KELOMPOK 4 = STAMBUK AKHIR 8 DAN 9
KELOMPOK 5 = STAMBUK AKHIR 5 DAN 6
KELOMPOK 6 = STAMBUK AKHIR 1 DAN 4
KELOMPOK 7 = STAMBUK AKHIR 3

Isolasi merupakan cara untuk memisahkan atau memindahkan mikroba tertentu

dari lingkungan, sehingga diperoleh kultur murni atau biakkan murni. Kultur murni
ialah kultur yang sel-sel mikrobanya berasal dari pembelahan dari satu sel tunggal.
Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi mikrooraganisme antara cara
goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate), cara sebar (spread plate),
cara pengenceran ( dilution plate) serta micromanipulator (Pleczar, 1986).

Populasi mikroorganisme yang ada dialam sekitar kita ini sangatlah

besar dan cukup kompleks. Berates spesies mikroba mengausai setiap
bagian tubuh kita. Mereka terdapat dalam jumlah yang cukup besar. Sebagai
contoh, sekali kita bersin dapat menebarkan beribu-ribu mikroorganisme.
Sutu gram tinja dapat mengandng jutaan bakteri. Alam sekitar kita, baik itu
tanah, air maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme.
Penelitian yang layak menganai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini
memerlukan teknik unuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini,
atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni ini
terdiri dari satu populasi sel yang semuanya barasal dari suatu sel induk
(Pelczar, 1986).
Jika kita pertama kali mengadakan piaraan biasanya yang kita peroleh
itu suatu piaraan campuran. Misalnya kita ambil bahan ampel dari udara,
dari tanah, dari kotoran; jika bahan itu disebarkan pada medium steril, akan
tumbuh beraneka kolni yang masing-masing mempunyai sifat-sifat khas. Jika
kita mengambil bahan dari suatu koloni tersebut, kemudian bahan itu kita
tanam pada medium baru yang steril, maka bahan itu akan tumbuh menjadi
koloni yang murni, asalkan pemindahan itu dilakukan dengan cermat

menurut teknik aseptic, yaitu menggunakan alat-alat yang setril dan aturan
laboratorium tertentu (Dwidjoseputro, 2005).
Pemindahan bakteri dari medium lama kemedium yang baru atau
dikenal dengan istilah inokulasi bakteri ini memerlukan banyak ketelitian.
Terlebih dahulu kita harus mengusahakan agar semua alat-alat yang akan
dignakan untuk pengerjaan medium dan pengenceran inokulasi benar-benar
steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi, yaitu masuknya
mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh didalam
medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam keadaan yang sebanarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri
yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali
bakteri pathogen kedapatan bersama-sama dengan bakteri saproba. Untuk
menyendirikan suatu spesies dikenal dengan beberapa cara, yaitu:
1. Pengenceran
Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister pada tahun 1865. Ia berhasil
memelihara Streptococcus Laktis dalam piaraan murni yang diisolasi dalam
sempel susu yang sudah masam. Suatu sempel dari suatu supensi yang
berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung
yang tersendiri. Dari hasil pengenceran ini kemudian diambil kira-kira 1 ml
untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil
0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar
akan didapatkan beberapa koloni yang akan tumbuh dalam medium
tersebut, akan tetapi mungkin juga hanya akan memperoleh satu koloni saja.
Dalam hal yang demikian ini dapat dijadikan piaraan murni. Jika belum yakin,
bahwa koloni tunggal yang diperoleh tersebut merupakan koloni yang murni,
maka dapat mengulang pengenceran dengan menggunakan koloni sebagai
sampel (Dwidjoseputro, 2005).
2. Penuangan
Robert Koch (1843-1905) mempunyai metode lain, yaitu dengan mangambil
sedikit sampel campuran bakteri yang mudah diencerkan dan sampel ini
kemudian disebarkan didalam suatu medium yang terbuat dari kaldu dan

gelatin encer. Dengan demikian akan diperoleh suatu piaraan adukan.

Setelah mediaum tersebut mengental maka selang beberapa jam kemudian
nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan
mengulang pekerjaan diatas maka akhirnya akan diperoleh piaraan murni
yang lebih terjamin (dwidjoseputro, 2005).
Ada beberapa metode yang biasanya dilakukan untuk menanam
biakan didalam medium diantarany adalah:
1. Metode Cawan Gores
Metode ini memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan dan waktu,
namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan yang
lumayan yang biasanya diperoleh dari pegalaman. Metode cawan gores yang
dilakukan

dengan

baik

kebanykan

akan

menyebabkan

terisolasinya

mikroorganisme yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum

dilakukan adalah ttidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaikbaiknya untuk digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjad
kurang larut dan cenderung untuk menggunakan inokolum terlalu banyak
sehingga menyulitkan pemisahan sel-sel yang digores (Galung, 2009).
2. Metode Cawan Tuang
Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme ialah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium
agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian dicawankan.
Karena konsentrasi sel-sel mikroba didalam eksperimen pada umumnya
tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa
tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diatara cawan-cawan tersebut
mengandung koloni-koloni terpisah diatas permukaan maupun didalam agar.
Metode ini memboroskan waktu dan bahan namun tidak memerlukan
keterampilan yang terlalu tinggi (Galung, 2009).
Proses pemisahan/ pemurnia dari mikroorganisme lain perlu dilakukan
karena semua pekerjaan mikrobiologi, misalnya telaah dan identifikasi
mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdii dari satu

macam mikroorganisme saja. Teknik tersebut dikenal dengan isolasi mikroba.

Terdapay berbagai cara mengisolasi mikroba, yaitu:
1. Isolasi Pada Cawan Agar
Prinsip

metode

isolasi

pada

agar

cawan

adalah

mengencerkan

mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan

dari mikroorganisme lain. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada
cawan tersebut seletah inkubasi berasal dari atu sel tunggal. Terdapat
beberapa cara dalam metode isolasi pada cawan agar, yaitu: metode gores
kuadrat dan metode agar cawan tuang. Metode gores kuadart bila metode ini
dilakukan dengan baik akan menghasilkan terisolasinya mikroorganisme
dimana setiap koloni baresal dari satu sel. Metode agar tuang berbeda
dengan etode gores kuadrat, cawan tuang menggunakan medium agar yang
dicairkan dan didinginkan 50 oC, yang kemudian dicawankan. Pengenceran
tetap perlu dilakukan sehingga pada cawan yang terakhir mengandung
koloni-koloni yang terpisah diatas permukaan/ didalam cawan (Galung,
2009).
2. Isolasi Pada Medium Cair
Metode ini dilakukan bila mikroorganisme tiadak adapat tumbuh pada agar
cawan (mediaum padat), tepapi hanya dapat tumbuh pada kultur cair.
Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa serial
pengencerran. Semakin tinggi pengenceran, peluang untuk mendapatkan
satu sel semakin besar (galung, 2009).
3. Isolasi Sel Tunggal
Metode ini dilakukan untuk mengisolasi sel mikroorganisme berukuran besar
yang tidak dapat diisolasi dengan metode cawan/ medium cair. Sel
mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100 kali.
Kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang
sangat halus ataupun mikomanipulator yang dilakukan secara aseptis
(Galung, 2009).
Penetapan jumlah bakteri dalam suatu polulasi mungkin saja akan
hambatan. Hal ini karena tidak semua sel yang ada didalam suatu biakan itu

mampu untuk hidup secara terus menerus. Jadi dalam perhitungan ini maka
yang dianggap sebagai sel hidup adalah sel yang membentuk koloni didalam
medium biakan atau dapat juga digunakan bakteri yang mampu membentuk
suspense didalam medium biakan. Sel-sel yang mampu hidup terus adalah
yang dihitung dengan berbagai metodeuntuk menetapkan jumlah selnya.
Pada jumlah total sel, maka ikut dihitung semua sel yang tampak atau yang
dapat dihitung dengan cara yang lainnya, sehingga dengan demikian sel-sel
mati dan cacat akan ikut erhitung. Untuk menentukan jumlah bakteri yang
ada didalam suatu medium maka apat digunakan beberapa cara sebagai
berikut:
1. Jumlah bakteri secara keseluruhan. Pada cara ini dihitung semua bakteri
yang ada didalam suatu medium biakan baik yang hidup maupun yang mati.
2. Jumlah bakteri yang hidup. Cara ini menggambarkan jumlah sel yng hidup
saja sehingga lebih tepat jika dibandingkan dengan cara yang petama
(muslin, 2011).
Pada

metode

perhitungan

cawan

dilakukan

pengenceran

yang

bertingkat yang mana ditujukan untuk membentuk konsentrasi dari suatu

suspense bakteri. Samel yang telah diencerkan ini dihitung kedalam cawan
baru kemudian dituang kemediumnya. Kemudian setelah diinkubasi selama
24-48 jam, diamati koloni-koloni yang tumbuh (Muslim, 2011).
Adapun prinsp dari metode cawan ini adalah jika sel jasad renik yang
masih hidup ditumbuhkan pada suatu medium agar, maka sel jasad renik
tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat
langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan alat bantu seperti
mikroskop dan sebagainya. Metode hiting cwan ini merupakan cara yang
paling sensitive untuk menentukan jumlah jasad renik karena beberapa hal
yaitu:
1. Hanya sel yang masij hidup yang dihitung
2. Beberapa jasad renik dapat dihitung sekaligus

3. Dapat digunakan untuk mengisolasi dan identifikasi jasad renik kerena koloni
yang terbentuk mungkin berasal dari suatu jasad renik yang mempunyai
penampakan yang spesifik (Muslim, 2011).
Berikut ini beberapa sifat-sifat koloni pada agar lempeng mengenai
bentuk, permukaan dan tepi yaitu:
1.

Bentuk koloni dilukiskan sebagai titik-titik, bulat, berbenang, takteratur

seruapa akar dan serupa kumparan

2. Permukaan koloni dapat datar, timbul mendatar, timbul melengkung, timbil

mencembung, timbul membukit dan timbul berkawah
3. Tepi koloni ada yang utuh, ada yang berombak, ada yang berbelah-belah,
ada yang berigi, ada yang berbenang-benang dan ada yang keriting
(Dwidjoseputro, 2005).

http://maulidafarmasi.blogspot.com/2012/07/isolasi-dan-identifikasimikroba_9099.html

Isolasi dan identifikasi bakteri

Pembiakan dan identifikasi bakteri bersumber dari spesimen yang merupakan hasil proses
infeksi, sedangkan infeksi itu sendiri dapat berasal dari berbagai sumber,beberapa tahapan
terjadinya proses infeksi :
Infeksi memerlukan tempat masuk yang sesuai (port of entry) misalnya saluran pernafasan,
saluran pencernaan, kontak langsung, gigitan serangga.

 Tempat masuknya bakteri biasanya spesifik terutama untuk bakteri patogen, bakteri harus tumbuh
dan berkembang dalam tubuh hospes dan menyebar melalui system limfa dan aliran darah
menyebar ke seluruh jaringan,
Penyebaran infeksi memerlukan jalan keluar unuk menginfeksi hospes lainnya (port of exit). .
Istilah mikroorganisme yang biasanya merupakan penyebab penyakit disebut patogen dan
patogenitas adalah kemampuan mikroorganisme menyebabkan sakit. Virulensi berhubungan
dengan derajat patogenitas bakteri. Patogenitas dan virulensi berkaitan dengan penyebaran atau
toksigenitas. Penyebaran artinya kemampuan bakteri untuk masuk untuk masuk , menyebar dam
berkembangbiak di dalam jaringan hospes. Toksigenitas berhubungan dengan kemampuan
bakteri

menghasilkan

toksin.

Virulensi

dinyatakan

dengan

LD50

yaitu

konsentrasi

mikroorganisme yang menyebabkan 50 persen hewan percobaan sakit. Proses ketika

mikroorganisme patogen masuk dikenal dengan infeksi, selama proses ini hospes dapat menjadi
sakit, infeksi terselubung atau sehat menjadi carrier
Aspek patogenitas bakteri
Patogenitas bakteri terutama disebabkan oleh adanya kapsul pada bakteri tersebut, bakteri
yang tidak berkapsul lebih mudah untuk difagosit oleh sel leukosit. Hilangnya kapsul bakteri
berhubungan dengan hilangnya virulensi bakteri karena kapsul diketahui sebagai faktor
pengganggu. (contohnya bakteri pneumococcus)
Toksin bakteri
Toksin bakteri diketahui memiliki peranan penting dalam kemampuan bakteri
menimbulkan penyakit. Toksin dibagi dalam kelompok eksotoksin dan endotoksin.
a. Eksotoksin
Eksotoksin di hasilkan oleh bakteri ke lingkungan dan potensial serta spesifik untuk jaringan
hospes, kemampuan menghasilkan eksotoksin biasanya pada bakteri gram positif batang seperti
Clostridium dan Corynebacterium. Eksotoksin merupakan antigen kuat, tidak tahan panas,
merupakan substansi protein, hancur oleh enzim proteolitik kecuali Clostridium botulinum, efek

toksin dapat hancur oleh formalin, panas dan penyimpanan yang lama tetapi tidak untuk sifat
antigeniknya, contohnya toxoid untuk program imunisasi
b. Endotoksin.
Endotoksin ditemukan intraseluler, terdapat pada dinding sel bakteri dan toksin ini dilepaskan
oleh bakteri setelah bakteri hancur, endotoksin biasanya berhubungan dengan bakteri gram
negatif dan bersifat antigen lemah. Endotoksin bersifat tahan terhadap panas, polisakaridanya
tidak dapat dicerna oleh enzim proteolitik, endotoksin bersifat toksin lemah dan menginduksi
reaksi demam pada hospes dan dapat menyebabkan syok
Enzim ekstraseluler
Beberapa mikroorganisme memproduksi enzim ekstraseluler yang ikut berperan dalam
patogenitas, enzim tersebut adalah:
a. Enzim koagulase, berhubungan dengan patogenitas Staphylococcus. Uji koagulase dilakukan
menggunakan plasma menyebabkan terjadinya koagulasi.
b. Kolagenase adalah enzim yang dibentuk oleh Clostridium, bersifat dapat menghancurkan kolagen
sehingga menyebabkan bakteri menyebar ke jaringan
c. Hialuronidase adalah enzim yang diketahui sebagai faktor penyebaran bakteri. Enzim ini
diproduksi oleh Staphylococcus, Clostridium, Streptococcus dan Pneumococcus.
d. Streptokinase dikenal pula sebagai enzim fibrinolisin, diproduksi oleh Streptococcus,
Staphylococcus, dan Clostridium perfringens. Streptokinase merupakan enzim proteolitik plasma
yang disebut plasmin, plasmin dapat melarutkan plasma yang terkoagulasi dan aktifitas tersebut
memungkinkan bakteri menyebar
e. Hemolisin merupakan kelompok substansi terlarut yang diproduksi oleh Staphylococcus,
Pneumococcus, beberapa Clostridium, dan Steptococcus, hemolisin bersifat merusak jaringan.
Streptolisin memiliki kemampuan melisiskan eritrosit.
f. Leukosidin dalah substansi yang merusak leukosit, mereka diproduksi oleh streptococcus dan
staphylococcus

Bakteri berdasarkan kebutuhan energi, dibagi dalam dua kelompok, yaitu

Bakteri autotrof
Bakteri autotrof memperoleh energi dan tumbuh pada anorganik media, membutuhkan
karbondioksida sebagai sumber karbon
Bakteri heterotrof
Bakteri heterotrof mendapatkan energi dari sumber karbon organik.Bakteri heterotrof
membutuhkan penambahan gula, asam amino, purin, pirimidin dan vitamin pada media kultur.
Fermentasi gula merupakan sumber energi utama
Morfologi bakteri
Ukuran bakteri coccus berdiameter 1 micron (), bakteri batang memiliki lebar 0.5 dan
panjang of 2 , sedangkan spirochaeta berbentuk ulir dengan lebar 0.2 dan lebar 10 .
Bentuk-bentuk bakteri:
Struktur bakteri
Struktur umum bakteri terdiri dari
Dinding sel
Membrane sitoplasma
Sitoplasma
Inti
Struktur khusus bakteri:
Kapsul, merupakan substansi eksretori, sebagai benteng pertahanan melawan fagositosis oleh sel
darah putih dan penetrasi virus

 Flagel , berasal dari protein elastin yang berada di sitoplasma dan keluar badan bakteri berfungsi
sebagai organ pergerakan
Spora, bentuk vegetatif bakteri untuk bertahan pada lingkungan yang kurang menguntungkan
Inclusion bodies, vakuola yang berfungsi sebagai tempat sisa material di sitoplasma
Metode mikroskopis adalah merupakan upaya mendapatkan informasi sementara terhadap
bakteri penyebab infeksi, akan tetapi pembiakan biasanya diperlukan untuk identifikasi secara
pasti dan mengenal sifat bakteri.Tujuan dari pembiakan bakteri adalah terdiri dari tiga tujuan
utama yaitu:
1) Untuk menumbuhkan dan mengisolasi seluruh bakteri yang ada dalam spesimen
2) Untuk penentuan jenis bakteri mana yang pertumbuhannya paling menyerupai bakteri penyebab
infeksi dan bakteri mana yang sepertinya merupakan kontaminan
3) Untuk mendapatkan pertumbuhan bakteri yang cukup terhadap bakteri yang sesuai secara klinik
sehingga dapat diidentifikasi sesuai sifat pertumbuhannya
Media perbenihan
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari campuran zatzat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk pertumbuhannya. Mikroorganisme
memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-molekul kecil yang dirakit untuk menyusun
komponen sel. Dengan media pertumbuhan dapat dilakukan isolasi mikroorganisme menjadi
kultur murni dan juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya sesuai kebutuhan bakteri.
Oleh karena bakteri yang berbeda memerlukan kebutuhan akan nutrisi yang berbeda pula ,
sehingga dikembangkan berbagai macam media pertumbuhan untuk digunakan dalam diagnosa
mikrobiologi.
Media perbenihan terdiri dari dua bentuk yaitu bentuk cair dan padat (agar). Pada media cair,
bahan-bahan gizi dilarutkan dalam air sehingga pertumbuhan bakteri ditandai dengan perubahan
warna madia menjadi keruh, semakin banyak bakteri tumbuh akan semakin keruh larutan.

Diperlukan jumlah bakteri 106 sehingga dapat terlihat adanya pertumbuhan tanpa mikroskop.
Media padat dibuat dengan penambahan bahan pengeras pada campuran bahan gizi dan air.
Biasanya digunakan agarosa yang memiliki sifat cair pada suhu 95C tetapi berbentuk padat
pada suhu dibawah 50C. Dengan kondisi inkubasi yang sesuai bakteri dapat tumbuh dan
berkembang dalam jumlah yang banyak sehingga dapat dilihat tanpa menggunakan mikroskop.
Pertumbuhan bakteri membentuk kelompok yang terdiri dari satu jenis bakteri yang disebut
koloni, dengan kata lain dalam satu koloni adalah bakteri yang sama genus dan spesiesnya
memiliki karakteristik gen dan fenotip yang sama. Pembiakan bakteri yang terdiri dari satu
macam koloni yang seragam disebut dengan pembiakan murni. Pembiakan yang murni
diperlukan untuk identifikasi bakteri, untuk memudahkan pengambilan koloni yang sama ketika
ditanam pada media identifikasi
Bahan-bahan media pertumbuhan
1. Bahan dasar
a. Air (H2O) sebagai pelarut
b. Agar (dari rumput laut) yang berfungsi untuk pemadat media. Agar sulit didegradasi oleh
mikroorganisme pada umumnya dan mencair pada suhu 45C.
c. Gelatin adalah polimer asam amino yang diproduksi dari kolagen. Kekurangannnya adalah lebih
banyak jenis mikroba yang mampu menguraikannya dibanding agar.
d. Silica gel, yaitu bahan yang mengandung natrium silikat. Fungsinya juga sebagai pemadat media.
Silica gel khusus digunakan untuk memadatkan media bagi mikroorganisme autotrof obligat.
2. Nutrisi atau zat makanan
a. Nikroba dapat menggunakan sumber N anorganik seperti urea. Media harus mengandung unsurunsur yang diperlukan untuk metabolisme sel yaitu berupa unsur makro seperti C, H, O, N, P;
unsur mikro seperti Fe, Mg

b. Sumber karbon dan energi yang dapat diperoleh berupa senyawa organik atau anorganik sesuai
dengan sifat mikrobanya. Jasad heterotrof memerlukan sumber karbon organik antara lain dari
karbohidrat, lemak, protein dan asam organik.
c. Sumber nitrogen mencakup asam amino, protein atau senyawa bernitrogen lain dan sejumlah
vitamin.
3. Bahan tambahan
Bahan-bahan tambahan yaitu bahan yang ditambahkan ke medium dengan tujuan
tertentu, misalnya phenol red (indikator asam basa) ditambahkan untuk indikator perubahan pH
akibat produksi asam organik hasil metabolisme. Antibiotik ditambahkan untuk menghambat
pertumbuhan mikroba nontarget/kontaminan.
4. Bahan lain yang sering digunakan dalam pembuatan media
a. Peptone, peptone adalah produk hidrolisis protein hewani atau nabati seperti otot, liver, darah,
susu, casein, lactalbumin, gelatin dan kedelai.Komposisinya tergantung pada bahan asalnya dan
bagaimana cara memperolehnya.
b. Meat extract. Meat extract mengandung basa organik terbuat dari otak,limpa, plasenta dan daging
sapi.
c. Yeast extract. Yeast extract terbuat dari ragi pengembang roti atau pembuat alcohol. Yeast extract
mengandung asam amino yang lengkap & vitamin (Bcomplex).
d. Karbohidrat. Karbohidrat ditambahkan untuk memperkaya pembentukan asam amino dan gas dari
karbohidrat. Jenis karbohidrat yang umumnya digunakan dalam amilum, glukosa, fruktosa,
galaktosa, sukrosa, manitol, dll.Konsentrasi yang ditambahkan untuk analisis fermentasi adalah
0,5-1%.
Klasifikasi dan fungsi media:
1. Medium berdasarkan sifat fisik

 Medium padat yaitu media yang mengandung agar 15% sehingga setelahdingin media menjadi
padat..
Medium setengah padat yaitu media yang mengandung agar 0,3-0,4% sehingga menjadi sedikit
kenyal, tidak padat, tidak begitu cair. Media semisolid dibuat dengan tujuan supaya pertumbuhan
mikroba dapat menyebar ke seluruh media tetapi tidak mengalami percampuran sempurna jika
tergoyang. Misalnya bakteri yang tumbuh pada media NfB (Nitrogen free Bromthymol Blue)
semisolid akan membentuk cincin hijau kebiruan di bawah permukaan media, jika media ini cair
maka cincin ini dapat dengan mudah hancur. Semisolid juga bertujuan untuk mencegah/menekan
difusi oksigen, misalnya pada media Nitrate Broth, kondisi anaerob atau sedikit oksigen
meningkatkan metabolisme nitrat tetapi bakteri ini juga diharuskan tumbuh merata diseluruh
media.
Medium cair yaitu media yang tidak mengandung agar, contohnya adalah NB (Nutrient Broth),
LB (Lactose Broth),TSB (Trypticase Soy Broth)
2. Medium berdasarkan komposisi
Medium sintesis yaitu media yang komposisi zat kimianya diketahui jenis dan takarannya secara
pasti, misalnya Glucose Agar, Mac Conkey Agar.
Medium semi sintesis yaitu media yang sebagian komposisinya diketahui secara pasti, misanya
PDA (Potato Dextrose Agar) yang mengandung agar, dekstrosa dan ekstrak kentang. Untuk
bahan ekstrak kentang, kita tidak
dapat mengetahui secara detail tentang komposisi senyawa penyusunnya.
Medium non sintesis yaitu media yang dibuat dengan komposisi yang tidak dapat diketahui secara
pasti dan biasanya langsung diekstrak dari bahandasarnya, misalnya Tomato Juice Agar, Brain
Heart Infusion Agar, Pancreatic Extract.
3. Medium berdasarkan tujuan
Media untuk isolasi

Media ini mengandung semua senyawa esensial untuk pertumbuhan mikroba, misalnya Nutrient
Broth, Blood Agar.
Media selektif/penghambat
Media yang selain mengandung nutrisi juga ditambah suatu zat tertentu sehingga media tersebut
dapat menekan pertumbuhan mikroba lain dan merangsang pertumbuhan mikroba yang
diinginkan. Contohnya adalah Luria Bertani medium yang ditambah Amphisilin untuk
merangsang E.coli resisten antibotik dan menghambat kontaminan yang peka, Ampiciline.
Saltbroth yang ditambah NaCl 4% untuk membunuh Streptococcus agalactiae yang toleran
terhadap garam.
Media diperkaya (enrichment)
Media diperkaya adalah media yang mengandung komponen dasar untuk pertumbuhan
mikroba dan ditambah komponen kompleks seperti darah,serum, kuning telur. Media
diperkaya juga bersifat selektif untuk mikroba tertentu. Bakteri yang ditumbuhkan dalam
media ini tidak hanya membutuhkan nutrisi sederhana untuk berkembang biak, tetapi
membutuhkan komponen kompleks, misalnya Blood Tellurite Agar, Bile Agar, Serum
Agar, buffer charcoal yeast extract agar yang mengandung L-cystein dan bahan gizi lain
untuk pertumbuhan legionella pneumophila penyebab penyakit legionnair.
Media untuk menentukan kebutuhan nutrisi spesifik.
Media ini digunakan unutk mendiagnosis atau menganalisis metabolism suatu mikroba.
Contohnya adalah Kosers Citrate medium, yang digunakanuntuk menguji kemampuan
menggunakan asam sitrat sebagai sumber karbon.
Media untuk karakterisasi bakteri
Media yang digunakan untuk mengetahui kemampuan spesifik suatu mikroba. Kadang-kadang
indikator ditambahkan untuk menunjukkan adanya perubahan kimia. Contohnya adalah Nitrate
Broth, Lactose Broth,Arginine Agar.
Media diferensial

Media ini bertujuan untuk mengidentifikasi mikroba dari bakteri lainnya yang sama-sama
tumbuh dalam media perbenihanberdasar karakter spesifik yang ditunjukkan pada media
diferensial,misalnya TSIA (Triple Sugar Iron Agar) yang mampu memilih Enterobacteria
berdasarkan bentuk, warna, ukuran koloni dan perubahan warna media di sekeliling koloni,
media Mac conkey agar merupakan media diferensial dan slektif karena tidak dapat
menumbuhkan bakteri gram positif.
Dari sekian banyak macam media, media yang paling sering digunakan untuk identifikasi
bakteri adalah :
1. Brain-Heart infusion (BHI) / perbenihan cair.
BHI adalah media penyubur yang berguna untuk pertumbuhan berbagai macam bakteri baik
bentuk cair maupun agar. Bahan utama terdiri dari beberapa jaringan hewan ditambah
pepton, buffer posfat, dan sedikit dekstrosa. Penambahan karbohidrat memungkinkan bakteri
dapat menggunakan langsung sebagai sumber energi. BHI biasanya digunakan untuk media
pertumbuhan spesimen darah
2. Perbenihan cair Gram negative (GN broth).
Media selektif gram negatif digunakan untuk pembiakan bakteri patogen saluran pencernaan
( salmonella spp dan shigella spp) dari spesimen faeces dan rectal swab. Larutan berisi
beberapa bahan aktif termasuk natrium sitrat dan natrium deoksikolat yang menghambat
pertumbuhan organisme gram positif dan mempercepat pertumbuhan bakteri gram negatif.
Untuk mengoptimalkan selektfitas media, GN broth setelah diinkubasi 6-8 jam setelah
penanaman pertama harus diisolasi ulang dan diinkubasikan kembali, apabila melewati
waktu tersebut bakteri nonenterik patogen akan tumbuh melampaui pathogen
3. Columbia CNA mengandung darah
Agar Columbia CAN adalah media dasar yang mengandung tiga komponen sumber pepton dan
darah domba 5% yang tidak mengandung fibrin. Media ini juga dapat membedakan reaksi
bakteri berdasarkan kemampuan dalam menghemolisa darah. CNA adalah merupakan
antibiotic Colistin (C) dan Nalidixic acid (NA) yang ditambahkan ke dalam media untuk
menghambat mikroorganisme gram negatif dan menumbuhkan bakteri gram positif.

Contohnya untuk perbenihan Lactobacillus spp dari specimen secret vagina, streptococcus
yang menyebabkan infeksi pada vagina dan wanita hamil.
4. Hektoen Enteric agar (HE)
Terdiri dari garam empedu dan zat warna indikator (brom thymol blue dan fuchsin acid)
untuk memperlambat bakteri non patogenik gram negatif batang yang terdapat di saluran
pencernaan dan memberi kesempatan salmonella dan shigella tumbuh. Media HE juga
merupakan media differensial karena bakteri non enterik patogen akan tumbuh koloni
berwarna oranye sampai merah muda kekuningan. Koloni ini timbul dari organisme yng
memiliki

kemampuan

menfermentasi

laktosa

dalam

media,

kemampuan

meragi

menghasilkan asam yang akan menurunkan pH media dan meyebabkan perubahan indikator
bromthymol blue. Shigella tidak meragi laktosa sehingga sehingga warna media biru
kehijauan tidak berubah seperti karakteristik media diferensial, media mengandung feri
ammonium sitrat yang mendeteksi adanya produksi gas H 2S seperti salmonella spp. Dapat
terlihat melalui adanya presipitasi warna hitam pada media.
5. Mac conkey agar
Mac conkey agar adalah media selektif dan differensial yang paling sering digunakan. Media
ini terdiri dari zat warna Kristal violet untuk menghambat pertumbuhan bakteri gram positif
dan jamur dan memungkinkan beberapa macam bakteri gram negatif batang tumbuh , netral
red sebagai pH indikator memberikan warna pink sampai merah pada koloni misalnya
salmonella spp. Untuk bakteri yang tidak meragikan laktosa misalnya shigella spp
memberikan warna koloni jernih transparan
Gambar 1. Media Mac conkey (meragi laktosa/kiri) dan (tidak meragi laktosa/kanan)
6. Phenyl ethyl alcohol (PEA)
PEA adalah agar darah domba yang ditambahkan phenyl etil alcohol untuk menghambat
pertumbuhan bakteri gram negatif darah domba 5% dalam PEA menyediakan kebutuhan
nutrisi untuk bakteri gram positif coccus seperti enterococcus, streptococcus dan
staphylococcus

7. Perbenihan cair tioglikolat

Perbenihan cair tioglikolat adalah media penyubur, yang mengandung bahan-bahan nutrisi
seperti casein, ragi dan ekstrak daging sapi serta vitamin untuk mempercepat pertumbuhan ,
bahan lain yang ditambahkan indikator oksidasi-reduksi (resazurin), dextrose, vitamin K1
dan hemin biasa ditambahkan pada media modifikasi thayer martin sebagai tambahan pada
media ditambahkan 0,075% untuk mencegah pengaruh oksigen langsung terhadap larutan ,
bahan tambahan ini diberikan untuk memberikan suasasana anaerob pada bagian dasar
tabung sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh
8. Agar darah
Gambar 2. Agar darah steril (kiri), - hemolisa (tengah) dan -hemolisa (kanan)
Agar darah merupakan media yang paling banyak digunakan unuk penanaman bakteri yang
sukar tumbuh karena pada agar darah domba mengandung nutrisi yang dibutuhkan bakteri.
Kemudian pula koloni yang tumbuh pada media ini biasanya spesifik dan mudah dikenali.
Media pada dasarnya terdiri dari sumber protein(pepton), protein kedelai olahan
(mengandung KH),NaCl, agar dan darah domba 5%. Bakteri penghasil enzim ekstraseluler
yang dapat melisiskan sel darah merah domba pada agar (hemolisis). Aktifitas ini ditandai
dengan adanya zona jernih disekeliling koloni (beta hemilisis), kehijauan (alpha hemolisis)
dan untuk bakteri yang tidak menghemolisa darah tidak terjadi perubahan pada sekeliling
koloni bakteri ( gamma /non hemolisis)
9. Agar coklat dan Thayer martin
Agar coklat sama seperti agar darah tetapi pada agar coklat darah yang digunakan di lisiskan
terlebih dahulu sebelum dimasukan ke larutan agar. Setelah darah lisis sel eritrosit
mengeluarkan

bahan-bahan

intraseluler

seperti

haemoglobin,

hemin,dan

koenzim

nicotinamide adenine dinucleotida (NAD) yang dapat digunakan oleh bakteri yang sukar
tumbuh. Darah yang lisis memberikan warna coklat pada media sehingga disebut dengan
agar coklat. Biasanya bakteri patogen yang tumbuh pada media agar coklat yaitu: Neisseria
meningitidis ,Haemophilus spp (terlibat dalam infeksi saluran pernafasan dan telinga)

Agar Thayer martin

Thayer martin agar adalah media diperkaya dan selektif untuk isolasi Neisseria gonorhoeae.
Penambahan antibiotik colistin bertujuan untuk menghambat bakteri gram negatif,
vancomisin untuk menghambat bakteri gram positif dan nistatin menghambat pertumbuhan
ragi. Antibiotik trimetropin jugsa ditambahkan untuk menghambat perumbuhan Proteus spp,
dan bakteri lainnya yang akan tumbuh menyebar di seluruh permukaan agar dan dapat
meghalangi koloni bakteri yang akan diidentifiasi Neisseria spp. pada mredia modifkasi
Thayer martin lewis, antibiotik nistatin diganti dengan ansamisin
Gambar 3. Perumbuhan pada agar coklat dan thioglykolat
Sterilisasi media
Bahan media yang telah dilarutkan , baik media cair maupun untuk meda pdat harus dilakukan
terlebih dahulu melalui proses sterilisasi menggunakan Autoclave yaitu alat untuk mensterilkan
berbagai macam alat dan bahan yang digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas
bertekanan. Tekanan yang digunakan pada umumnya 15 Psi atau sekitar 2 atm dan dengan suhu
121C (250F). Jadi tekanan yang bekerja ke seluruh permukaan benda adalah 15 pon tiap inchi 2
(15 Psi = 15 pounds per square inch). Lama sterilisasi yang dilakukan selama 15 menit. dan
waktu harus dihitung dimulai ketika suhu telah mencapai 121 C . Setelah di autoclave media
harus mencapai suhu sekurangnya 50 C sebelum dituang ke dalam cawan petri steril (biasanya
25 ml untuk satu cawan petri) sedangkan untuk penambahan bahan-bahan seperti darah,
antibiotik, vitamin dan mineral harus ditambahkan pada saat agar dingin sebelum dituang ke
cawan petri. Untuk komponen media yang tidak tahan panas dapat dilakukan sterilisasi dengan
cara filtrasi membran
Lingkungan yang dibutuhkan untuk pertumbuhan mikroba
Kondisi lingkungan yang optimal akan mendukung pertumbuhan bakteri pada media
pembiakan, empat faktor lingkuangan yang paling penting, yaitu:
a) Tersedianya oksigen atau karbondioksida

Kebanyakan bakteri klinik adalah terdiri dari bakteri aerob, anaerob fakultatif atau anaerob
obligat. Bakteri aerob adalah bakteri yang menggunakan oksigen sebagai reseptor elektron.
Bakteri anaerob fakultatif dapat tumbuh pada kondisi aerob dan anaerob. Tetapi untuk bakteri
seperti Pseudomonas spp, Neisseria spp, Bordetela spp, Brucella spp dan Francisella spp adalah
bakteri obligat aerob yaitu bakteri yang tidak dapat tumbuh tanpa ada oksigen. Sedangkan
bakteri yang membutuhkan oksigen dalam jumlah sedikit disebut bakteri mikroaerofilik
b) Suhu
Bakteri pathogen biasanya tumbuh sangat baik pada suhu yang sama dengan suhu jaringan
dan organ tubuh hospes yaitu 37C walaupun demikian suhu pembiakan biasanya berada pada
rentang 35-37C. akan tetapi beberapa bakteri memerlukan suhu tertentu untuk inkubasinya
mislnya: campylobacter jejuni (42 C), listeria monocytogenes dan yersinia enterocolitica (dapat
tumbuh pada suhu 0 C tapi suhu optimum antara 20 dan 40 C
c) pH
pH adalah pengukuran konsentrasi ion hydrogen pada lingkungan mikroorganisme.nilai pH 7
menunjukkan kondisi netral, sedangkan pH lebih kecil dari 7 disebut asam dan lebih besar dari 7
disebut basa. Kebanyakan bakteri klinik menyukai kondisi pH diantara pH netral sekitar 6,7-7,5,
kebanyakan media yang diperjualbelikan telah mengandung buffer sehingga pengecekan ph
sudah tidak diperlukan lagi
d) Kelembaban
Air merupakan komponen yang sudah terdapat dalam media, baik pada media padat
ataupun cair tapi untuk penyimpanan dalam jangka waktu yang lama saat pembiakan bakteri
akan menyebabkan kehilangan sebagian besar kadar air yang timbul karena proses evaporasi.
Kehilangan air dari media dapat mengganggu petumbuhan bakteri melalui dua cara yaitu:
o berkurangnya air yang merupakan komponen penting yang akan digunakan untuk
metabolisme bakteri

o dengan berkurangnya air maka konsentrasi zat terlarut dalam media akan meningkat,
dengan meningkatnya konsentrasi zat terlarut akan meningkatkan tekanan osmotik
sehingga akan menekan sel bakteri dan sel akan lisis
Isolasi bakteri
Isolasi atau pembiakan adalah proses menumbuhkan mikroorganisme dari tempat infeksi
(lingkungan in vivo) melalui berbagai spesimen dan menumbuhkan dalam lingkungan tiruan di
laboratorium (lingkungan invitro). Ketika bakteri tumbuh pada media, pada umumnya populasi
bakteri akan mudah diamati tanpa mikroskop karena berada dalam jumlah yang banyak berupa
koloni bakteri sehingga memungkinkan untuk identifikasi laboratorik selanjutnya . Keberhasilan
pemindahan bakteri dari lingkungan in vivo ke in vitro memerlukan nutrisi dan lingkungan yang
dibutuhkan oleh bakteri patogen tersebut. Karena pada lingkungan in vivo bakteri dapat
menggunakan berbagai hasil metabolik dan jalur fisiologik untuk pertumbuhan selama berada di
dalam tubuh hospes kemudian secara tiba-tiba harus dapat menyesuaikan diri dengan kondisi
tiruan di laboratorium. Dengan demikian sangatlah penting untuk menyediakan nutrisi yang
dibutuhkan dan lingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan bakteri
Di dalam tubuh, populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri
dari campuran berbagai macam jenis bakteri untuk memisahkan bakteri patogen perlu dilakukan
isolasi di laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur murni yang terdiri dari
satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan biokimiawinya.
Untuk memperoleh hasil yang baik dalam pertumbuhan bakteri maka perlu cara kerja
yang aseptik, dan sterilisasi ose sebelum digunakan mengambil koloni yang dicurigai sebagai
penyebab infeksi.
Inkubasi
Metode-metode yang digunakan untuk mengoptimalkan kondisi inkubasi :
inkubasi dilakukan pada suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri (35C-37C) dan
kelembaban udara yang mengandung CO2 sekitar 3-5%

untuk pertumbuhan bakteri yang memerlukan CO2 lebih banyak diperlukan inkubasi pada
tempat khusus yang mengandung CO2 (tablet natrium bikarbonat dengan kelembaban dan
penutupan yang sangat erat akan menghasilkan CO2 yang cukup , sebagai alternatif dapat juga
dilakukan inkubasi pada sungkup lilin yang dapat menghasilkan CO2 3%
Identifikasi bakteri
Setelah isolasi, bakteri yang tumbuh pada media perbenihan dilakukan identifikasi
dengan tahapan sebagai berikut:
1) Evaluasi morfologi koloni
Evaluasi morfologi koloni dengan memperhatikan warna koloni, bentuk koloni (seperti titik,
bundar, berfilamen,atau tidak beraturan), elevasi koloni (cembung, cekung, datar), serta batas
koloni (halus atau tidak beraturan)
2) Pemeriksaan mikroskopis
Pemeriksaan mikroskopis dengan cara pewarnaan gram dengan melihat diferensiasi
(termasuk bakteri gram positif atau negatif), bentuk (coccus, batang, koma, atau pleimorf),
susunan (sendiri-sendiri, diplo, berantai, atau seperti anggur)
3) Uji biokimia
Uji biokimia dilakukan untuk melihat karakteristik bakteri melalui reaksi biokimia, yang
biasa dilakukan diantaranya:
1. TSIA (Tripel Sugar Iron Agar)
Digunakan untuk identifikasi bakteri gram negatif batang, untuk melihat kemampuan meragi
glukosa dan sukrosa atau laktosa. Contohnya hasil untuk Escherichia coli (acid/acid),
Salmonella thypii (alkali/acid+H2S) sedangkan Pseudomonas aerugenosa (alkali/alkali)
Gambar 5. Hasil uji pada TSIA
2. Fermentasi karbohidrat/gula-gula
Gambar 6. Hasil positif (tabung berwarna kuning) fermentasi gula-gu

3. MR/VP (methyl red /voges proskauer)

Uji ini dilakukan untuk menentukan organisme yang memproduksi dan mengelola asam dan
produk-produknya dari hasil fermentasi glukosa, memperlihatkan kemampuan sistem buffer dan
menentukan organism yang menghasilkan prosuk netral (asetil metal karbinol atau aseton) dari
hasil fermentasi glukosa
Gambar.7 hasil uji MR(kiri) dan VP(kanan)
4. SIM(sulfur, indol, motility)
Uji ini untuk mengetahui pergerakkan bakteri, produksi indol dan pembentukkan gas H2S
Gambar 8. Hasil uji pada media SIM
5. Simon citrate
Uji ini dilakukan untuk menentukkan bakteri yang menggunakan sitrat sebagai sumber karbon
Gambar 9. Hasil uji simon citrate (positif warna biru)
http://masselekang.blogspot.com/2010/12/isolasi-dan-identifikasi-bakteri.html

Di alam populasi mikroba tidak terpisah sendiri menurut jenisnya, tetapi terdiri dari campuran
berbagai macam sel. Di dalam laboratorium populasi bakteri ini dapat diisolasi menjadi kultur
murni yang terdiri dari satu jenis yang dapat dipelajari morfologi, sifat dan kemampuan
biokimiawinya. Sehingga diharapkan dapat diidentifikasi dengan mudah, cepat, dan tepat
(Galung, 2009).
Penelitian mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk
memisahkan populasi campuran yang rumit, atau yang biasanya dikenal dengan istilah biakan
campuran, menjadi spesies yang berbeda- beda yang dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan
murni tersebut terdiri dari satu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar,
1986).
http://primanandafauziah.blogspot.com/2012/09/isolasi-dan-identifikasimikroorganisme.html

Cara isolasi modern adalah dengan menggunakan alat yang canggih yaitu dengan alat
mikromanipulator. Alat ini terdiri dari alat manipulator yang dapat dilihat melalui suatu
mikroskop (Mulyono, 1992).
Karakterisitik Utama Mikroorganisme

Untuk identifikasi dan klasifikasi suatu mikroorganisme perlu diketahui karekteristiknya

sebanyak mungkin, karakteristiknya adalah:
1. Karakteristik kultural
Berbagai mikroorganisme memerlukan media yang bersifat khusus, utamanya berteknologi
memerlukan bakteri tertentu untuk dapat tumbuh dan berkembangbiak. Jenis kapang dapat tahan
keasaman sampai kira-kira pH3, sedangkan bakteri pada umumnya tidak tahan asam.
2. Karakteristik Mikroskopik
Untuk melihat wujud suatu mikroba. Terutama bakteri, diperlukan suatu mikroskop dengan
pembesaran sekitar 1000 kali.
3. Karakteristik Metabolik
Dari bentuknya saja seringkali mencukupi untuk menentukan karakter organisme tertentu.
4. Karakteristik Kimiawi
Dalam hal ini diperlukan analisis kimia untuk dapat mengetahui zat atau unsur kimia
maupun susunan kimia yang terdapat dalam bakteri tersebut, bahkan bagian-bagian suatu bakteri
perlu dianalisis pula.
5. Karakteristik Antigenik
Disini diperlukan hewan besar tertentu untuk disuntik dengan mikroba yang tidak diketahui,
diambil serumnya untuk dilakukan reaksi antigen antibiotik yang bersifat sangat spesifik.
6. Karakteristik Genetik
Kini telah dilakukan karakteristik mikroorganisme atas dasar susunan DNA yang ternyata
bersifat konstan pada suatu mikroorganisme tertentu. Dinyatakan dalam % (G+C) Guanine dan
Cytosine (Mulyono, 1992).
http://semuacoretankuliah.blogspot.com/2013/09/laporan-mikrobiologi-isolasidan.html

KUNCI IDENTIFIKASI (MORFOLOGI KOLONI, MORFOLOGI SEL DAN PEWARNAAN GRAM)

http://biologipedia.blogspot.com/2011/01/kunci-identifikasi-bakteri.html
Pada saat kita mendapatkan tugas untuk mencari tahu jenis suatu isolat bakteri,
maka hal pertama yang dilakukan adalah mengamati ciri-ciri morfologi koloni,
morfologi sel dan sifat gramnya.
Pastikan isolat yang akan diuji adalah kultur murni, benar-benar murni dan telah
yakin tentang kemurniannya. Jadi jika diperoleh suatu kultur murni dari suatu
lingkungan dan diyakini belum murni maka haruslah diisolasi ulang, maksudnya
dimurnikan lagi sampai benar-benar pasti. Lihat gambar berikut : adapun yang
dapat dilakukan sebagai berikut

1 jika tidak yakin benar ini kultur murni atau tidak.

2 lakukan streak kuadran, minimal ke dua cawan (karena kalau salah satu gagal
membentuk koloni tunggal, maka masih ada cadangannya).
3 lihat hasil streak kuadran, apakah tampak koloni tunggal?, koloni tunggal adalah
koloni yang timbul/tumbuh dari satu sel atau beberapa kumpulan sel (untuk
staphylococcus misalnya), bukan dari beberapa ratus sel. Istilah yang paling
mendekati adalah CFUs. Jadi dipastikan satu koloni itu adalah satu jenis bahkan
satu strain. Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil(misalnya E.coli,1-2mm), ada juga
yang besar. Faktor-faktornya mungkin adalah kecepatan pertumbuhannya dan
stuktur sel itu sendiri (bayangkan sel E.coli yang sendiri-sendiri akan mudah
terpisah saat digoreskan ke permukaan agar dibanding sel streptococcus.
4 jika didapatkan koloni tunggal, segera diamankan dengan menumbuhkan pada
media baru (minimal 5). Kenapa harus banyak?, karena untuk menanggulangi
cawan yang kontaminan, membuat stok kultur dan mencegah kejadian yang tidak
diinginkan (kehilangan cawan misalnya).
5 setiap menumbuhkan ke medium baru, sebaiknya harus dicek koloninya, apakah
sama dengan cawan induknya atau tidak. Jika perlu cek juga morfologi selnya.
6 sekarang kita telah memiliki beberapa kultur murni dan siap untuk diidentifikasi.

Salah satu cawan dari kultur murni tersebut lalu dikarakterisasi morfologi koloninya.
Ciri-ciri koloni yang perlu diperhatikan dan dicatat yaitu bentuk koloni, tepian koloni,
elevasi dll. Tapi perlu diingat jika hanya mencatat karakteristik berdasarkan ciri di
atas, kita tidak terlalu hafal oleh karena itu perlu untuk digambar. Menggambar
koloni itu tidak mudah. Yang perlu digambar adalah koloni tunggal, bukan koloni
yang besar.jika menginginkan hasil lebih bagus sebaiknya memakai kamera dijital.
Umumnya koloni tunggal itu kecil-kecil dengan satuan mm. Jadi beberapa saran
untuk menggambar koloni yaitu:

1. cari koloni tunggal lalu gambar hati-hati dengan pensil (sebaiknya dengan
skala 1:1) tanpa perbesaran. Gambar dengan mata telanjang.
2. gambar koloni lebih detail dengan mikroskop stereo atau mikroskop cahaya.
Saya sarankan untuk menggunakan mikroskop cahaya. Mula-mula dengan
perbesaran 4X10. jika menggunakan mikroskop cahaya penempatan cawan
di meja benda harus hati-hati. Perlu digambar tampak atas dan bawah
cawan. Jika menginginkan perbesaran yang lebih tinggi dapat digunakan
perbesaran 10X10, tapi jangan sampai lensa mengenai media atau biakan.
(bacaan lebih lanjut tentang morfologi koloni ada di sini)

Saya yakin setelah melakukan hal di atas Anda akan merasa lebih dekat, lebih
memiliki, lebih intim terhadap bakteri yang diteliti. Sering saya melihat mahasiswa
mengkarakterisasi koloni hanya dengan mencatat cirinya dan menggambar
seadanya. Setelah koloni dikarakterisasi, dilanjutkan dengan memperhatikan bentuk
sel. Ini merupakan tahap dimana menuntut mata untuk berlelah-lelah di
mikroskop.Untuk melihat sel maka hal yang harus dilakukan :
o Membuat preparat ulas. Saya sarankan jangan membuat preparat ulas dari biakan
cair, karena dikhawatirkan yang tumbuh bukan yang kita harapkan. Buatlah

preparat ulas dari biakan padat (koloni tunggal) sehingga milyaran bakteri dalam
preparat ulas tersebut adalah satu jenis. Fiksasi di atas api sebaiknya jangan
dilakukan terlalu lama. Intinya fiksasi adalah menguapkan air di atas slide, bukan
membakar slide dengan api. Dikhawatirkan panas akan mempengaruhi struktur sel.
o Melihat dengan mikroskop. Apakah Anda menginginkan melihat sel tersebut
dalam keadaan hidup atau mati? Jika hidup keuntungannya adalah dapat mengecek
motilitasnya. Namun sel bersifat transparan dan sulit terlihat bagi mata yang tidak
terlatih. Jika mati (hasil fiksasi) maka sel dapat diwarnai dengan zat pewarna dan
akan terkonsentrasi untuk melihat morfologinya saja. Untuk melihat sel gunakan
100X10.
Catatan : ada beberapa catatan pentingyang terkait dengan keahlian mencari
lapang pandang yang relevan, bagus dan jelas.
=Kadang-kadang waktu membuat preparat ulas, kita seringkali menyebarkan
suspensi tidak merata (seperti gambar). Kita harus tahu kira-kira dimana
tempat/letak lapang pandang yang menampakkan sel-sel terpisah satu sama
lain.untuk mendapatkan gambar yang bagus, harus dicari dimana kira-kira bagian
slide yang memiliki jumlah sel yang tepat. Pada saat perbesaran 4X10, geser-geser
dan cari daerah pinggiran, maksudnya jika pemfiksasian tidak rata pasti terdapat
penumpukan sel di suatu tempat atau pengonsentrasian sel, jadi kalau memilih di
pinggir, kita dapat melihat sel-sel yang jelas.

=Seingkali ditemukan pada preparat ulas basah

(hidup) sel dari bakteri bacilli yang berbentuk
coccus.. Sel bakteri berukuran sangat kecil dan
tebal lapisan air tipis diantara cover glass dan
object glass masih bisa menampung beberapa
bakteri bacilli yang ditumpuk vertikal, artinya
tebal tersebut masih bisa digunakan sel untuk
berenang ke atas dan ke bawah. Jangan
menganggap gambar yang terlihat pada
mikroskop adalah gambar datar 2D. Lihat
gambar

=Gunakan kontrol. Kontrol sangat penting,

meskipun sulit untuk mendapatkannya. Akan lebih
baik jika bakteri yang dilihat dapat dibandingkan
dengan bakteri lain yang telah diketahui
bentuknya dengan pasti.
Data yang dihasilkan sampai tahap ini berupa
karakteristik morfologi koloni dan sel yang dapat
dipercaya. Tahap selanjutnya berupa pewarnaan
gram. Pewarnaan gram menurut saya tidak hanya
menambahkan semua pewarna dan reagen secara berurutan tetapi kita harus dapat
membayangkan apa yang terjadi dengan bakteri tersebut.
Sebelum melakukannya, hal yang harus diperhatikan adalah:
Cek tanggal pembuatan zat warna dan reagen, umumnya zat warna lebih tahan
lama. Namun lebih baik menggunakan yang baru. Paling tidak tidak lebih dari
setengah tahun.
Persiapkan kontrol, kontrol yang ampuh adalah E. coli dan B. Subtilis. Kontrol juga
harus dalam keadaan murni. Kontrol juga dapat diperoleh dengan mengambil
lapisan film langit-langit mulut atau gigi. Di dalamnya mengandung bakteri gram
positif dan negatif. Namun sering kali sulit membedakan antara kotoran dan bakteri.
Pastikan semua kultur berumur tidak lebih dari 24 jam. Kultur muda lebih baik dari
kultur tua karena seringkali gram positif kehilangan kemampuan membentuk
dinding selnya pada kultur tua.
CV-----------;Kalium Iodida-----------Alkohol 95%--------Safranin
Inti dari pewarnaan gram adalah membedakan sifat kulit sel dalam
mempertahankan kompleks CV-KI dari pelunturan (dekolorisasi) oleh etanol/alkohol
95%. Jadi dengan menganalisa dan membuat tahapan ini menjadi meyakinkan
sebenarnya sudah cukup untuk mengambil kesimpulan tentang sifat gram bakteri
uji. Pengontras hanya untuk memperkuat perbedaan saja.
Saran1

Hasil tiap perlakuan dilihat dengan mikroskop sehingga dapat benar-benar tahu apa
yang terjadi pada sel. Warna CV sebelum ditambah KI berwarna ungu cerah, tapi
setelah ditambah KI menjadi biru kehitaman.
Saran 2

.
Benar-benar diperhatikan tahapan paling krusial dalam pewarnaan gram yaitu
dekolorisasi. Alkohol dapat diteteskan pada sela-sela cover glass dan object glass
sehingga dapat diamati detik-detik terjadinya pelunturan. Disarankan dari berbagai
sumber pelunturan dilakukan selama 5 detik dan ada yang menyebutkan 10 detik.
Bakteri gram+ tidak selalu dapat mempertahankan kompleks CV-KI, namun hanya
mempertahankannya lebih lama dibanding gram-. Jadi diperlukan stopwatch untuk
menghitung waktu pelunturan dari bakteri uji dan kontrol. Untuk menekan
kesalahan lakukan hal ini beberapa kali.
Saran 3

Buatlah preparat ulas dari ketiga bakteri (kontrol +&- dan

uji) dalam satu slide. Usahakan jangan sampai tercampur
dan dalam satu luasan cover glass melingkupi ulasan 3
bakteri ini. Tujuannya supaya memudahkan dalam membandingkan bakteri uji
dengan kontrol dan juga memperkecil kesalahan saat pelunturan karena semua
bakteri diberi perlakuan yang sama.
Saran 4. kroscek hasil pewarnaan gram konvensional dengan metode lain yaitu
dengan KOH 3%. Setelah tahapan ini selesai maka didapatkan data yang diyakini
benar, kemudian dapat dilanjutkan ke pengerucutan identifikasi berikutnya dengan
melihat BERGEYS, kitabnya para bacteriologist.