EXTRACCIN Y AMPLIFICACIN DE AND DE 2 TIPOS DE SUELO.

RESUMEN
El ADN presente en el suelo generalmente proviene de la flora microbiana presente en el mismo.
Se identifican dos principales tipos de suelo: de cultivo y forestales, los cuales fueron estudiados en la
presente prctica. El objetivo principal consisti en extraer y amplificar ADN proveniente de suelo
forestal y de cultivo. Para la extraccin de ADN se emplearon dos mtodos: qumico y enzimtico. Para la
amplificacin del ADN, se emple la tcnica de la PCR. Las concentraciones de ADN extrado y
amplificado fueron medidas por duplicado y triplicado respectivamente empleando NANODROP. Se
realiz adems electroforesis en gel de agarosa al 1%, tanto para la extraccin como para la amplificacin
del ADN. Los resultados obtenidos de la extraccin fueron: mtodo qumico, 28.35 ng/l (suelo forestal) y
6.93 ng/l (suelo de cultivo); mtodo enzimtico, 17.56 ng/l para suelo de cultivo y 21.74 ng/l para
suelo forestal. Con respecto a la amplificacin, se obtuvieron las siguientes concentraciones tras 35 ciclos
de reaccin; mtodo qumico en suelo forestal, 434 ng/l y para suelo de cultivo, 381.73 ng/l. Para el
mtodo enzimtico, los resultados hallados fueron de 381.4 ng/l, suelo de cultivo y 333.7 ng/l, suelo
forestal. Los resultados anteriores demuestran que tanto el mtodo qumico como enzimtico
proporcionaron valores ms altos para suelo forestal en lo referente a la extraccin, mientras que para la
amplificacin mejores resultados fueron observados en suelo forestal empleando mtodo qumico, no as
en el mtodo enzimtico, en el que el suelo de cultivo alcanz valores de amplificacin ms altos.
Palabras clave: Microorganismos, Suelo agrcola, Suelo forestal.
INTRODUCCIN
El suelo es un sistema complejo que alberga una gran diversidad de microorganismos, quienes son
el motor de los ecosistemas terrestres debido a su papel en la mineralizacin y transformacin de la
materia orgnica con lo que contribuyen a mantener la estructura del suelo actuando como agentes
cementantes que estabilizan los agregados del mismo. Mediante tcnicas convencionales de cultivo en
laboratorio se ha estudiado la diversidad microbiana y se ha propuesto que entre 80-90% de los
microorganismos que habitan el suelo son desconocidos, lo que representa una gran limitante para
descubrir el verdadero potencial gentico de estos sistemas (Diaz, et al., 2007).

Un suelo de cultivo es aquel que se utiliza con la finalidad de produccin agrcola, de modo que
sus propiedades; como seccin orgnica, pH, concentracin de nitratos y sales; han sido modificadas por
la demanda del cultivo o por la adicin de fertilizantes. Por otra parte, el suelo forestal es aquel que no ha
sido utilizado con fines productivos por lo que conserva sus propiedades. Estas diferencias tan importantes
hacen de gran inters el conocimiento de la diversidad microbiana inherente a cada tipo de suelo, gracias
al medio particular que cada uno ofrece. La utilizacin de la diversidad microbiana como indicativo de la
capacidad de los suelos para responder ante condiciones de estrs, como es el caso de los incendios
forestales, resulta clave para conocer la capacidad de los ecosistemas perturbados para recuperarse y
sustentar as la actividad biolgica (Rodrguez, et al., 2007).
Los estudios actuales de ecologa microbiana de suelos basados en biologa molecular requieren
como primer paso la extraccin de AND, que se puede alcanzar mediante lisis mecnica, qumica,
enzimtica y trmica; seguida de un adecuado proceso de purificacin que permita retirar todos los
compuestos diferentes de cidos nucleicos (Diaz, et al., 2007).
El objetivo del presente trabajo fue extraer AND de suelos de cultivo y forestal de ___ utilizando
2 mtodos, lisis qumica y lisis enzimtica; seguido de la amplificacin del gen 16 S rRNA de las
muestras.

MATERIALES Y METODOS
1) Extraccin de ADN.
Las muestras de suelos fueron proporcionadas por el laboratorio de biologa molecular.
Lisis enzimtica.
En un tubo eppendorf, la muestra de suelo lavado fue adicionada con 80 ml de lisozima (concentracin de
10 mg/ml) y 1 ml de buffer para lisozima. Se incub a 27C por 1 hora y posteriormente se adicion 1 ml
de SDS al 10% y 0.5 g de arena estril (mtodo del cido sulfrico). La mezcla fue agitada en vrtex por
15 minutos, para posteriormente ser centrifugada a 4,000 rpm por 10 minutos. El sobrenadante fue
trasvasado a un tubo eppendorf de 1.5 ml.
Lisis qumica (mtodo modificado de Hoffman y Winston, 1957).
En un tubo eppendorf, la muestra de suelo lavado fue adicionada con 700 l de solucin de lisis de
Winston, posteriormente se agreg 1 volumen de arena estril y se agit en vrtex a velocidad mxima
por 15 minutos.

Purificacin del DNA.

A la muestra lisada previamente se le adicion 1/5 de volumen de EDTA 0.5 M, pH 8 y 1/10 de volumen
de acetato de potasio 5 M, pH 5. Posteriormente, la muestra se incub a 4C por 30 minutos, para luego
ser centrifugada a 13,000 rpm a la misma temperatura por 10 minutos. Tras la centrifugacin, el contenido
fue trasvasado a un tubo estril y se realiz una extraccin adicionando 400 l de una mezcla de
cloroformo-alcohol isoamlico (24:1). La mezcla se homogeneiz en vrtex a mxima velocidad y se
centrifug nuevamente a 13,000 rpm a temperatura ambiente. La muestra nuevamente fue trasvasada tras
la centrifugacin a otro tubo estril y se repiti la extraccin con la mezcla cloroformo-alcohol isoamlico
seguida de agitacin en vrtex. El DNA de la fase acuosa de la segunda extraccin con cloroformo fue
precipitado agregando 1 volumen de PEG al 13%, seguida de agitacin en vrtex y posterior
centrifugacin a 13,000 rpm a 4C por 10 minutos. El sobrenadante fue decantado cuidando de no
eliminar la pastilla de DNA. Despus, se dio un spin en la microcentrfuga para hacer descender el alcohol
que pudiera haber quedado adherido en las paredes del tubo y con una micropipeta de 200 l fue retirado
el exceso de alcohol. La pastilla de ADN se dej secar por 10 minutos y se resuspendi en 50 l de agua
estril. Las muestras de DNA fueron corridas por electroforesis en gel de agarosa al 1% para comprobar si
la extraccin y purificacin del cido nucleico fueron llevadas a cabo empleando el procedimiento
descrito anteriormente.
2) Amplificacin de ADN
Para realizar la amplificacin del ADN obtenido se utiliza la tcnica de PCR, para lo cual se utilizaron
1L de muestra de AND extrado, 118.1L de agua PISA, 3.5 L de Buffer P/TAC, 17.5 LMgCl 2, 7 L
de BSA, 14 L de dNTPs y 0.9 L de enzima. A continuacin se sometieron las muestras a 30 ciclos de
amplificacin, iniciando un periodo de desnaturalizacin de 10 min a 95C, seguidos de 45s a la misma
temperatura, 45s a 53C, 45s a 72C, para finalizar con 10 min a 72C y permitir el enfriamiento hasta
4C. Una vez concluido el tiempo, se procedi a la cuantificacin mediante el uso de NANODROP
utilizando 1 L de muestra por triplicado (Herlemann , et al., 2011).
RESULTADOS Y DISCUSIN
1) Extraccin de ADN de suelos de cultivo y forestal.
Utilizando el mtodo qumico para lisis celular, se extrajeron 28.35 ng/l de ADN de suelo forestal (QF) y
6.93 ng/l de ADN de suelo de cultivo (QC). A partir del mtodo enzimtico se extrajeron 17.56 ng/l de
suelo de cultivo (EC), y 21.74 ng/l de suelo forestal (EF). Con los resultados obtenidos se puede observar
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como el mtodo enzimtico permite mejor extraccin de suelo de cultivo, mientras que la mayor cantidad
extrada de suelo forestal se consigue mediante lisis por el mtodo qumico.
Mediante electroforesis en gel del agarosa se comprob la presencia de ADN en las muestras,
evidenciando la degradacin de ADN de QC (Figura 2).
2) Amplificacin del ADN obtenido.
Una vez obtenido el ADN, se amplific el gen 16s rRNA demostrando que la concentracin al finalizar la
amplificacin increment 381.73 EF, 434 ng/l EC 381.4ng/l QC 333.7 ng/l QF. Con esto se evidencia
que se consigui la amplificacin incrementando en promedio 17 veces su concentracin inicial, lo cual se
puede observar con claridad en la Figura 1. La electroforesis realizada en esta ocasin demuestra la
presencia del gen 16S rRNA utilizando como control una etiqueta proporcionada por el laboratorio donde
se realizaron las pruebas.
CONCLUSIONES
Se logr la extraccin de DNA de calidad de dos tipos de suelos -forestal y de cultivo-usando dos mtodos
de extraccin, siendo el suelo forestal utilizando el mtodo qumico quien presentara la mayor cantidad de
DNA. Despus de la amplificacin de DNA usando tcnica de PCR, se obtuvo la mayor concentracin de
DNA en la muestra de suelo de cultivo extrada mediante el mtodo enzimtico incrementando, en el caso
del suelo de cultivo 54 veces su concentracin. Se verifico la calidad del DNA extrado y amplificado
mediante PCR utilizando la tcnica 1D SDS- PAGE. Esta misma tcnica demostr que el material
obtenido de la extraccin y amplificacin por PCR es DNA de calidad adecuada.

REFERENCIAS
Diaz, I., Hamdan, A., Gutirrez, M. & Ramirez , H., 2007. Extraccin y purificacin de ADN de suelos
mexicanos contaminados con hidrocarburos. Puerto Vallarta: s.n.
Herlemann , D., Labrenz, M., Jrgens, K. & Bertilsson, S., 2011. Transitions in bacterial communities
along the 2000km salinity gradient of the Baltic Sea.. Journal of Mocrobial Ecology, pp. 1571-1579.
Rodrguez, J. y otros, 2007. Anlisis molecular de la biodiversidad microbiana en suelos de Andalucia
afectados por incendios., Espaa: Wildfire.

TABLAS Y FIGURAS

450
400
350
300
250
200
150
100
50
0

QF

EF

QC

EC

Figura 1. Concentraciones (ng/L) de AND extrado (Azul) y gen 16s rRNA amplificado (naranja) de las diferentes
muestras.

Figura 2. Electroforesis en gel de agarosa del AND extrado.

Figura 3. Electroforesis en gel de agarosa para gen 16S rRNA amplificado en muestras de suelo.