ISOLASI DNA

Diajukan sebagai Salah Satu Persyaratan Kelulusan bagi

Matakuliah Praktikum Bioteknologi

DISUSUN OLEH :
Yuni Widyastuti

(13040051)

Suti Susilawati

(13040046)

Syifa Nurul Aini

(13040053)

Rahmawati

(13040037)

Nurul Aini W

(13040034)

Ummu Imaroh

(13040048)

Rita Mahfudoh Z

(13040040)

Dosen Penuntun Praktikum : Dina Pratiwi, M.Si., Apt

LABORATORIUM BIOLOGI TERPADU
SEKOLAH TINGGI FARMASI MUHAMMADIYAH TANGERANG
Jl. KH. Syekh Nawawi KM.4, Matagara, Tigaraksa, Kab.Tangerang
Telp (021) 29867307 Kode Pos 15720
Website : www.stfm.ac.id

KATA PENGANTAR
Puji syukur kehadirat Alloh Swt. yang telah melimpahkan
berbagai macam nikmat dan karunia-Nya kepada kita semua,
sehingga kami dapat menyelesaikan laporan resmi praktikum
Bioteknologi ini dengan baik sesuai dengan waktu yang telah
ditentukan.
Laporan resmi praktikum bioteknologi ini telah kami susun
sedemikian rupa tentunya dengan bantuan berbagai macam
pihak untuk membantu menyelesaikan tantangan dan hambatan
selama proses pembuatan makalah ini. Oleh karena itu, kami
mengucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada semua
pihak yang telah membantu dalam penyusunan laporan resmi
praktikum ini sebagai salah satu syarat standar kelulusan nilai
bagi matakuliah bioteknologi.
Namun tidak terlepas dari semua itu, kami menyadari
bahwa masih banyak kekurangan yang mendasar pada laporan
resmi praktikum ini. Oleh karena itu, kami mengundang para
pembaca untuk memberikan saran serta kritik yang dapat
membangun kami.
Akhir kata penulis mengharapkan semoga makalah ini
dapat memberikan manfaat bagi kita sekalian.
Tangerang, 25 Desember 2015

Penulis

DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR

...

DAFTAR ISI
II
BAB I

PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
B. Rumusan Masalah ..
C. Tujuan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

A.
B.
C.
D.
E.
F.
G.

Pengertian Isolasi DNA dan PCR

Uji Kualitas DNA
Tahapan Isolasi DNA
Komponen dan Tahapan PCR ..
Manfaat PCR .
Elektroforesis
Prinsip Kerja Elektroforesis ..
10

BAB III METODOLOGI

A. Alat dan Bahan .
11
B. Cara Kerja .
11
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi DNA ..
15
B. Elektroforesis
16
BAB V

PENUTUP
A. Kesimpulan
17
B. Saran

..

18
DAFTAR PUSTAKA ..
III

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
DNA adalah asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk
kehidupan secara seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitikondria, dan
kloroplas. DNA memiliki struktur pilinan utas ganda yang anti pararel
dengan komponen-komponennya, yaitu gula pentosa (deoksiribosa), gugus
fosfat dan pasangan basa. Sebuah sel memiliki DNA yang merupakan
materi genetik dan bersifat herediter pada seluruh sistem kehidupan.
Genom adalah set lengkap dari materi genetik (DNA) yang dimiliki suatu
organisme dan terorganisasi menjadi kromosom. DNA juga dapat diisolasi,
baik pada manusia maupun tumbuhan. DNA manusia dapat diisolasi
melalui darah. Komponen darah yang diisolasi yaitu sel darah putih,
karena memiliki nukleus dimana terdapat DNA didalamnya.
DNA yang diisolasi dari tanaman seringkali terkontamoinasi oleh
polisakarida dan metabolit sekunder seperti tannin, pigmen, alkaloid, dan
flavonoid. Salah satu kesulitan isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah
proses destruksi dinding sel untuk melepaskan isi sel. Hal ini disebabkan
karena tanaman memiliki dinding sel yang kuat, dan pada beberapa
tanaman kontaminasi sulit dipisahkan dari ekstrak asam nukleat.
Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim,
misalnya DNA tidak sensitive oleh enzim retriksi dsan mengganggu proses
amplifikasi DNA dengan PCR.
Elektroforesis dengan Agarose merupakan metode standar untuk
memisahkan, mengidentifikasi, mengkarakterisasi dan purifikasi dari
molekul

DNA/RNA.

Cara

pemisahan

dengan

elektroforesisi

merupakan alat pendukung yang sangat pokok dalam teknologi DNA

ini

rekombinan, dengan aplikasi yang begitu luas baik untuk pemisahan untai
tunggal atau untai ganda molekul DNA.
B. Rumusan Masalah
1. Apakah yang dimaksud dengan Isolasi DNA?
2. Teknik apakah yang digunakan dalam Isolasi DNA?
3. Metode apakah yang digunakan dalam Isolasi DNA?
C. Tujuan
1. Memahami pengertian Isolasi DNA
2. Memahami metode isolasi DNA
3. Memahami teknik PCR

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Pengertian Isolasi DNA dan PCR
Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA
murni yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa.
DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel, karena DNA
terletak di dalam inti sel (Aditya, 2010).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari
DNA. Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi
merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar
akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada
bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang
terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah
(Campbell dkk. 2002: 115). Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan
untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran (Alberts dkk. 1994:
254).
Polymerase Chain Reacton (PCR) adalah suatu teknik sintesis dan
amplifikasi DNA secara in vitro. Teknik ini pertama kali dikembangkan
oleh Karry Mullis pada tahun 1985. Teknik PCR dapat digunakan untuk
mengamplifikasi segmen DNA dalam jumlah jutaan kali hanya dalam
beberapa jam (Handayono dan Rudiretna, 2000).
Ekstraksi atau isolasi DNA merupakan teknik dasar yang harus
dikuasai dalam teknologi DNA rekombinan hal ini dikemukakan oleh
Abdul Hamid (2001). Isolasi DNA ini dimaksudkan untuk mendapatkan
DNA murni. Selain itu Muladno (2002) menjelaskan bahwa cara ekstraksi
DNA dari berbagai sumber pada prinsipnya adalah sama, akan tetapi ada
beberapa modifikasi tertentu yang biasanya dilakukan agar dapat
menghancurkan inhibitor pada masing-masing sumber tersebut.

Isolasi DNA dapat dilakukan dengan menggunakan perlakuan

deterjen. Detergen telah lama dikenal masyarakat sebagai bahan bantu
dalam proses mencuci, karena detergen memilki sifat sebagai bahan
pengemulsi yang baik. Detergen memiliki ikatan kimia dengan gugus
hidrofil yang bersifat polar dan gugus hidrofob yang bersifat non polar.
Gugus hidrofob inilah yang bertanggung jawab dalam pengikatan kotoran
dari bahan cuci, karena mampu mengikat senyawa non polar (protein dan
lipid) dari lingkungan sekitar dan membentuk protein-lipid-detergen
kompleks, hal inilah yang menyebabkan detergen menjadi salah satu
polutan bagi lingkungan perairan, karena kemampuan membentuk
protein-lipid-detergen kompleks dapat mengakibatkan rusaknya membran
sel orgaisme (Machmud, 2006).
B. Uji Kualitas DNA
Pengukuran secara kualitas, dilakukan pengecekan hasil isolasi
DNA pada gel agarose, horizontal elektroforesis. Sebanvak 4 ml DNA
sampel dan 1 ml loading dye di-running dalam tangki elektroforesis
agarose 1% pada 100 volt selama 30 menit. Gel hasil elektroforesis
kemudian direndam dalam larutan ethidium bromide selama 10 menit.
Kemudian pola pita yang dihasilkan dilihat di bawah UV transilluminator
dan difoto dengan kamera Polaroid MP4. Jika muncul pita berarti DNA
hasil isolasi siap untuk digunakan sebagai template untuk PCR (Saili,
2012).
C. Tahapan Isolasi DNA
Prinsip teknik isolasi DNA ada berbagai tahap reaksi dengan tujuan
yang berbeda-beda pada setiap tahapnya. Tahap pertama adalah
penghancuran dinding sel, tahap ini dapat dilakukan secara mekanis dan
enzimatis. Tahap kedua adalah melisis sel, cara ini tergantung dari jenis
selnya. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA dari sisa-sisa molekul
penyusun sel, seperti protein dan lain-lain.

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau

penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan
tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel
(Holme dan Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki
beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan
menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau dengan
menggunakan metode freezing-thawing dan iradiasi (Giacomazzi et al.,
2005).
Cara lain yakni dengan menggunakan kimiawi maupun enzimatik.
Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti penggunaan detergen
yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi
destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik
seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada
sel darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular
maupun rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki
(2000).
Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan
sodium dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel.
Detergen tersebut selain berperan dalam melisiskan membran sel juga
dapat berperan dalam mengurangi aktivitas enzim nuklease yang
merupakan enzim pendegradasi DNA (Switzer, 1999). Selain digunakan
SDS, detergen yang lain seperti cetyl trimethylammonium bromide
(CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan membran sel pada isolasi
DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007).
D. Komponen dan Tahapan PCR
1. Komponen PCR
Komponen- komponen yang diperlukan pada proses PCR adalah
templat DNA; sepasang primer, yaitu suatu oligonukleotida pendek
yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan

nukleotida DNA templat; dNTPs (Deoxynucleotide triphosphates);

buffer PCR; magnesium klorida (MgCl2) dan enzim polimerase DNA.
1) Templat DNA
Fungsi DNA templat di dalam proses PCR adalah sebagai
cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru yang sama.
Templat DNA ini dapat berupa DNA kromosom, DNA plasmid
ataupun fragmen DNA apapun asal di dalam DNA templat tersebut
mengandung fragmen DNA target yang dituju.
Penyiapan DNA templat untuk proses PCR dapat dilakukan
dengan menggunakan metode lisis sel ataupun dengan cara
melakukan isolasi DNA kromosom atau DNA plasmid dengan
menggunakan metode standar yang ada. Pemilihan metode yang
digunakan di dalam penyiapan DNA templat tergantung dari tujuan
eksperimen.
2) Primer
Keberhasilan suatu proses PCR sangat tergantung dari
primer yangdigunakan. Di dalam proses PCR, primer berfungsi
sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan
sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3 yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
Perancangan primer dapat dilakukan berdasarkan urutan
DNA yang telah diketahui ataupun dari urutan protein yang dituju.
Data urutan DNA atau protein bisa didapatkan dari database
GenBank. Apabila urutan DNA maupun urutan protein yang dituju
belum diketahui maka perancangan primer dapat didasarkan pada
hasil analisis homologi dari urutan DNA atau protein yang telah
diketahui mempunyai hubungan kekerabatan yang terdekat.

3) dNTPs (deoxynucleotide triphosphates)

dNTPs merupakan suatu campuran yang terdiri atas dATP
(deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat) , dCTP
(deoksisitidin trifosfat) dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat).

Dalam proses PCR dNTPs bertindak sebagai building block DNA

yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTP akan
menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari primer membentuk
untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat.
Konsentrasi optimal dNTPs untuk proses PCR harus ditentukan.
4) Buffer PCR dan MgCl2
Reaksi PCR hanya akan berlangsung pada kondisi pH
tertentu. Oleh karena itu untuk melakukan proses PCR diperlukan
buffer PCR. Fungsi buffer di sini adalah untuk menjamin pH
medium. Selain buffer PCR diperlukan juga adanya ion Mg2+, ion
tersebut berasal dari berasal MgCl2. MgCl2 bertindak sebagai
kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA polimerase.
Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi primer
dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP
(senyawa antara).
Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh pada
spesifisitas dan perolehan proses. Umumnya buffer PCR sudah
mengandung senyawa MgCl2 yang diperlukan. Tetapi disarankan
sebaiknya antara MgCl2 dan buffer PCR dipisahkan supaya dapat
dengan mudah dilakukan variasi konsentrasi MgCl2 sesuai yang
diperlukan.
5) Enzim Polimerase DNA
Enzim polimerase DNA berfungsi sebagai katalisis untuk
reaksi polimerisasi DNA. Pada proses PCR enzim ini diperlukan
untuk tahap ekstensi DNA. Enzim polimerase DNA yang
digunakan untuk proses PCR diisolasi dari bakteri termofilik atau
hipertermofilik oleh karena itu enzim ini bersifat termostabil
sampai temperatur 95 C. Aktivitas polimerase DNA bergantung
dari jenisnya dan dari mana bakteri tersebut diisolasi . Sebagai
contoh adalah enzim Pfu polimerase (diisolasi dari bakteri
Pyrococcus furiosus) mempunyai aktivitas spesifik 10x lebih kuat
dibandingkan aktivitas spesifik enzim Taq polymerase (diisolasi

dari bakteri Thermus aquaticus). Penggunaan jenis polimerase

DNA berkaitan erat dengan buffer PCR yang dipakai.
Dengan menggunakan teknik PCR, panjang fragmen DNA
yang dapat diamplifikasi mencapai 35 kilo basa. Amplifikasi
fragmen DNA pendek (kurang dari tiga kilo basa) relatif lebih
mudah dilakukan. Untuk mengamplifikasi fragmen DNA panjang
(lebih besar dari tiga kilo basa) memerlukan beberapa kondisi
khusus, di antaranya adalah diperlukan polimerase DNA dengan
aktivitas yang kuat dan juga buffer PCR dengan pH dan kapasitas
tinggi (High-salt buffer).
(Handayono dan Rudiretna, 2000).
2. Tahapan pada proses PCR
Proses PCR melibatkan beberapa tahap yaitu: (1) pra-denaturasi
DNA templat; (2) denaturasi DNA templat; (3) penempelan primer
pada templat (annealing); (4) pemanjangan primer (extension) dan (5)
pemantapan (postextension). Tahap (2) sampai dengan (4) merupakan
tahapan berulang (siklus), di mana pada setiap siklus terjadi duplikasi
jumlah DNA.
(Handayono dan Rudiretna, 2000).
Penjelasan tentang tahapan PCR adalah sebagai berikut:
a. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama
30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah
menjadi utas tunggal.
b. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran
40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan
bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang
komplemen dengan sekuen primer.
c. Ekstensi/elongasi

Dilakukan

dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja

optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada

tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang
sesuai pada pasangannya, jika basa pada template adalah A,
maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A
adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan
memperpanjang rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu
ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan diamp
lifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp
(Science, 2009).
E. Manfaat PCR
Polymerase Chain Reaction (PCR) dapat digunakan untuk:
a. Amplifikasi urutan nukleotida.
b. Menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami
mutasi.
c. Bidang kedokteran forensik.
d. Melacak asal-usul sesorang dengan membandingkan finger print
(Mahmuddin, 2010).
F. Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan
listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung
sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya
DNA yang bermuatan negatif.
Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub
negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung

10

pada nisbah muatan terhadap massanya serta tergantung pula pada bentuk
molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan dengan gaya Lorentz, yang
terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan kondisi
elektris lingkungan:
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah
medan listrik.
Secara umum,

elektroforesis

digunakan

untuk

memisahkan,

mengidentifikasi, dan memurnikan fragmen DNA.

G. Prinsip Kerja Elektroforesis
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein
dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul
tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak
listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk
tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik mmune tive
untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain
seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau mmuneblotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.

BAB III
METODOLOGI
A. Alat dan Bahan
1. Alat yang dibutuhkan, yaitu :
a. Batang kayu
b. Timbangan digital
c. Tabung mikrosentrifus
d. Beaker
e. Waterbath
f. pH meter
g. Kertas absorben
h. Tabung reaksi
i. Spidol
j. Vortex
k. Mikrosentrifus
l. SDS
m. Pipet mohr
2. Bahan yang dibutuhkan, yaitu :
a. Minuman isotonic
b. Stok Proteinase K (100 mikrogram/mL)
c. EDTA
d. NaCL
e. HCl 1N
f. Akuades
g. Etanol dingin
B. Cara Kerja
1. Pengumpulan sel-sel
Gosok pipi bagian dalam menggunakan batang kayu selama
30 detik (Jangan ditelan)

11

12

Ambil minuman isotonic, lalu kumur-kumur sebanyak 10 mL,

sekaligus menggosok pipi selama 1 menit

Hasil berkumur ini jangan ditelan, tapi dikeluarkan dalam

beaker, ini yang menjadi larutan sel epitel yang akan diisolasi
DNA nya
2. Pemecahan sel (lisis sel) dan pencernaan protein

Atur temperature 560C pada waterbath

Ambil 1,5 mL larutan sel epithelial menggunakan pipet mohr,

kemudian masukkan kedalam tabung mikrosentrifus

Masukkan tabung mikrosentrifus kedalam sentrifus selama 30

detik dengan kecepatan 10.000 rpm dan menggunakan sampel
orang lain sebagai penyeimbang

Hasil sentrifus yang didapat -> supernatan dibuang, kemudian

tambahkan larutan selnya lagi

13

Langkah 5 dan 6 diulang sebanyak 2 kali, agar endapan (pellet)

yang terbentuk semakin banyak

Kemudian tambahkan 1 mL buffer tris-EDTA kedalam tabung

mikrosentrifus

Tabung mikrosentrifus di vortex selama 30 detik (sampai

endapan hancur)

Tambahkan 50 mikroliter Proteinase K (enzim untuk mencerna

protein) dan masukkan dalam waterbath (560) selama 10 menit
3. Pengendapan DNA

Masukkan 100 mikroliter NaCl 2,5M kedalam tabung

mikrosentrifus, aduk isi tabung agar tercampur baik, dengan
cara membolak-balikkan tabungnya

Pindahkan semua isi tabung mikrosentrifus ketabung lain yang

bersih dan kering (hati-hati agar tidak banyak muncul busa)

Pelan-pelan tambahkan 1 mL etanol dingin (untuk

mengendapkan atau menggumpalkan DNA) agar terlihat batas
jelas, biarkan selama 5 menit

Simpan tabung mikrosentrifus kecil dilemari pendingin pada

suhu 00

14

DNA akan menggumpal diantara batas buffer dan etanol

(terlihat seperti ada benang melayang berwarna putih)

Ambil DNA menggunakan batang kaca atau besi, taruh ditabung

sentrifugasi kecil yang bersih (gunakan tissue bersih untuk
menghisap sisa etanol)

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Isolasi DNA
Pada praktikum kali ini menggunakan metode praktikum visualisasi
yaitu menyaksikan bagaimana proses Isolasi DNA dan Elektroforesisnya.
Pada proses Isolasi DNA hal yang pertama dilakukan adalah menyiapkan alat
dan bahan yang akan digunakan. Sampel yang digunakan pada praktikum ini
adalah daun mint, daging, dan serangga. Praktikum ini bertujuan untuk
mengambil DNA yang ada pada sampel tersebut. Hal pertama yang dilakukan
adalah mengambil sebagian kecil sampel lalu menaruhnya dengan
menggunakan pinset didalam kapsul sentrifugasi. Jangan lupa memberi tanda
pada kapsul sentrifugasi agar tidak terjadi kekeliruan saat menggunakan
sampel. Begitu selanjutnya dengan sampel daging dan serangga. Setelah
masing-masing sampel diletakkan pada kapsul sentrifugasi selanjutnya
menuju tahap ekstraksi.
Tahapan selanjutnya adalah ekstraksi dari tiap sampel dengan cara
dilakukan

penggerusan

dengan

penambahan

Nitrogen

cair

untuk

mempermudah penggerusan dan menjaga agar DNA tidak mengalami

kerusakan, selanjutnya dilakukan penggerusan dengan menekan sampel
dengan batang penekan pada kapsul sentrifugasi. Penggerusan dilakukan
hingga di dapatkan sampel yang telah hancur. Selanjutnya dilakukan
penambahan Buffer Tris-EDTA untuk melisiskan membran sel. Kemudian
kocok sampel yang telah ditambahkan dengan Buffer Tris-EDTA. Selanjutnya
letakkan kapsul sampel kedalam alat sentrifugasi. Selanjutnya dilakukan
sentrifugasi pada sampel selama 15 menit.
Tahap selanjutnya adalah tahapan

melisiskan

DNA

dengan

menambahkan NaCl. Penambahan NaCl bertujuan untuk melisiskan membran

sel, tetapi bekerja pada molekul oligosakarida dan glikoprotein pada
membran. Kedua molekul ini akan dilisiskan oleh NaCl. Selain itu keadaan

15

16

hipertonis

yang

ditimbulkan

oleh

penambahan

garam

juga

dapat

mengakibatkan sel mengalami lisis.

Tahapan terakhir adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan
menambahkan alkohol dingin 96 %. Alkohol berfungsi untuk memisahkan
DNA dengan molekul-molekul yang lain, seperti protein. Alkohol mempunyai
molekul yang lebih padat dan ringan daripada air sehingga akan berada di
atas permukaan campuran. Protein dan lemak akan berada pada bagian bawah
sedangkan DNA akan memisah dan berada pada daerah alkohol.
B. Elektroforesis
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel
bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju
kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel bermuatan positif (kation)
akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug & Cummings 1994: A-6).
Pada praktikum ini digunakan gel agarose untuk memisahkan
(separation), dan purifikasi DNA. Gel aagrose yang telah ditambahkan
Etidium bromida (EtBr) dituangkan ke dalam cetakan gel dan dibiarkan
mengeras. Sampel DNA bisa dimasukkan (loading) dalam sumur (well) gel
yang kemudian bisa terpisah dengan menggunakan arus listrik.

Sampel

molekul ditempatkan ke dalam sumur (well) pada gel yang ditempatkan di

dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya. Molekul-molekul
sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu kutub
listrik sesuai dengan muatannya.
Hasil elektroforesis ini dapat diamati dengan bantuan sinar UV. Dari
pengamatan yang dilakukan kami melihat terbentuknya pita-pita DNA yang
terdiri atas beberapa line dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya.
Dengan membandingkan masing-masing fragmen/ pita dengan posisi pada
pada DNA marker dapat diketahui Perkirakan ukuran masing-masing
fragmen/pita tersebut.

BAB V
PENUTUP
A. Kesimpulan
1. Isolasi DNA merupakan suatu proses untuk mendapatkan DNA murni
yang dapat digunakan untuk keperluan pemeriksaan atau diagnosa.
DNA dapat di isolasi dari berbagai sel yang memiliki inti sel, karena
DNA terletak di dalam inti sel (Aditya, 2010).
2. Prinsip teknik isolasi DNA ada berbagai tahap reaksi dengan tujuan
yang berbeda-beda pada setiap tahapnya. Tahap pertama adalah
penghancuran dinding sel, tahap ini dapat dilakukan secara mekanis
dan enzimatis. Tahap kedua adalah melisis sel, cara ini tergantung dari
jenis selnya. Tahap ketiga adalah pemurnian DNA dari sisa-sisa
molekul penyusun sel, seperti protein dan lain-lain
3. Tahapan PCR adalah sebagai berikut:
1. Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama
30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas ganda akan memisah menjadi
utas tunggal.
2. Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran
40-60oC selama 20-40 detik untuk memberikan kesempatan bagi
primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang
komplemen dengan sekuen primer.
3. Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja
optimum enzim DNA polymerase, biasanya 70-72oC. Pada tahap
ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada
pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan
dipasang dNTP, begitu seterusnya (ingat pasangan A adalah T, dan
C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang

17

18

rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi

bergantung pada panjang daerah yang akan diamp lifikasi, secara
kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp (Science, 2009).
4. Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah
medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan.
5. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat
dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut
dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di
dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran
molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk
tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik mmune
tive untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metodemetode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau

mmune-blotting yang merupakan metode-metode

karakterisasi lebih lanjut.

B. Saran
Praktikum kali ini menggunakan metode visualisasi video
mengenai Isolasi DNA dan Elektroforesis, semoga di lain hari praktikan
dapat melakukan praktikum sesungguhnya dengan alat dan bahan yang
terkait.

DAFTAR PUSTAKA

Aditya.

2010.

Retrieved

10

2012,

aditya.blogspot.com/2010/03/isolasi-DNA.html.

from
Diakses

http://sharkesttanggal

25

Desember 2015.
Albert.B.et al.1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. Jakarta :

PT.Gramedia Pustaka Utama

Handayono dan Rudiretna. 2000. Jurnal : Prinsip Umum Melaksanakan
Polymerase Chain Reaction PCR. Surabaya : Pusat Studi Bioteknologi,

Universitas Surabaya.
Toha, Abdul Hamid. 2001. Deoxiribosa Nuclear Acid. Bandung: Alfabeta
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka

Wirausaha Muda.
Machmud, wildan. 2006. Penentuan LC 50 48 Jam Detergen dan
Pengaruhnya Terhadap Mortalitas Larva Ikan Mas (Cyprus Corpio) Ras
Punten dengan tipe Ploidi Yang Berbeda. Skripsi tidak diterbitkan.

Malang: Program Sarjana Biologi

Saili.
(2012,
02
03).

Retrieved

20

2012,

from

http://takdirsaili.wordpress.com/2010/02/03/analisis-molekuler-tingkat

kekerabatan/.
Holme, D. J. & Hazel P. 1998. Analytical biochemistry .England : Pearson

Education Limited
Giacomazzi, S., Lerol, F., Joffraud, J.J., 2005. Comparison of three
methods of DNA extraction from cold-smoked salmon and impact of

physical treatments. Journal of Applied Microbiology 98, 12301238.

Surzycki, S. 2000. Basic techniques in molecular biology. Germany :

Springer-Verlag Berlin Heidelberg

Khosravinia, H. & Ramesha, K. P.2007. Influence of EDTA and
magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of
polymerase chain reaction. African Journal of Biotechnology Vol. 6 (3),
pp. 184-187

Switzer. 1999. Experimental biochemistry. Oxford : Blackwell Scientific

Pub.
Science.

http://sciencebiotech.net/mengenal-pcr-polymerase-chain-reaction/.
Mahmuddin.
(2010,
08
31).
Retrieved
10
2012,

(2009,

05

07).

Retrieved

10

2012,

from
from

http://mahmuddin.wordpress.com/2010/08/31/polymerase-chain-reactionpcr/#more-292.