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Alessandra Splendore

Estudo molecular do gene TCOF1 em


pacientes portadores da sndrome de
Treacher Collins

So Paulo
2002

Alessandra Splendore

Estudo molecular do gene TCOF1 em pacientes


portadores da sndrome de Treacher Collins

Tese

apresentada

ao

Instituto

de

Biocincias da Universidade de So Paulo, para a


obteno de Ttulo de Doutor em Cincias, na
rea de Biologia/Gentica.

Orientadora: Dra. Maria Rita Passos Bueno

So Paulo
2002

SPLENDORE, ALESSANDRA
Estudo molecular do gene TCOF1
em pacientes portadores da sndrome de
Treacher Collins
105 pp
Tese (Doutorado) - Instituto de
Biocincias da Universidade de So
Paulo. Departamento de Biologia.
1. Sndrome de Treacher Collins
2. TCOF1 I. Universidade de So Paulo.
Instituto de Biocincias. Departamento de
Biologia.

Para o Dans,
com todo meu amor
... and Ill never forget

AGRADECIMENTOS

Dra. Maria Rita Passos-Bueno pela orientao, interesse e incentivo;


s minhas colegas e amigas (e amigos tambm) do laboratrio, que muito me
ensinaram, com quem dividi minhas alegrias e frustraes, e cuja convivncia foi uma parte
muito importante desses anos que passamos juntos;
Aos companheiros de outros laboratrios, e s muitas chcaras de acar trocadas...
A todos os mdicos e geneticistas, cuja colaborao foi essencial;
FAPESP pelo apoio financeiro em todas as etapas do desenvolvimento desse
trabalho;
Aos meus pais que, apesar de reclamarem que eu trabalho demais, sempre me
incentivaram e apoiaram;
toda minha famlia, que sempre torceu por mim;
E, por fim, um agradecimento especial ao Daniel, por toda sua infinita pacincia, pela
longa espera, e por todas as milhas acumuladas na ponte area...

NDICE

CAPTULO I: INTRODUO
I.1. Histrico e caractersticas clnicas.........................................................................................2
I.2. Patognese e diagnstico diferencial .....................................................................................4
I.3. Mapeamento e clonagem do gene TCOF1 ............................................................................6
I.4. Caracterizao da protena treacle .........................................................................................8
I.5. Modelos animais....................................................................................................................10
I.6. Questes no resolvidas ........................................................................................................13
I.7. Objetivos................................................................................................................................14

CAPTULO II: PACIENTES E MTODOS


II.1. Pacientes e colaboradores.....................................................................................................16
II.2. Extrao de DNA .................................................................................................................18
II.3. Amplificao dos fragmentos de DNA ................................................................................18
II.4. Triagem de mutaes ...........................................................................................................21
II.5. Seqenciamento ...................................................................................................................22
II.6. Microssatlites......................................................................................................................23
II.7. Clonagem .............................................................................................................................25

CAPTULO III: TRIAGEM DE MUTAES EM PACIENTES PORTADORES DA SNDROME DE


TREACHER COLLINS: DESCRIO DE NOVAS MUTAES E IDENTIFICAO DE
PONTOS QUENTES NO GENE TCOF1
Abstract........................................................................................................................................28
Resumo .......................................................................................................................................28
Introduo ...................................................................................................................................29
Pacientes e Mtodos ....................................................................................................................30
Resultados ...................................................................................................................................30
Discusso .....................................................................................................................................35

CAPTULO IV: TRIAGEM

DE MUTAES NO GENE TCOF1 EM PACIENTES DE DIFERENTES


POPULAES: CONFIRMAO DE PONTOS QUENTES E DESCRIO DE UMA
NOVA MUTAO MISSENSE QUE SUGERE UM DOMNIO FUNCIONAL NA
PROTENA TREACLE

Abstract .......................................................................................................................................40
Resumo .......................................................................................................................................40
Introduo ...................................................................................................................................41
Pacientes e Mtodos ....................................................................................................................42
Resultados ...................................................................................................................................42
Discusso ....................................................................................................................................43

CAPTULO V: MUTAES

NO GENE

TCOF1

NO PARTICIPAM DA ETIOLOGIA DE DISTRBIOS

ENVOLVENDO O PRIMEIRO E SEGUNDO ARCOS BRANQUIAIS

Abstract........................................................................................................................................48
Resumo ........................................................................................................................................48
Introduo ....................................................................................................................................49
Pacientes e Mtodos.....................................................................................................................51
Resultados e Discusso ................................................................................................................51

CAPTULO VI: ORIGEM

PARENTAL DE MUTAES NA SNDROME DE

TREACHER COLLINS:

POSSVEL PAPEL DO MECANISMO DE REPARO

Abstract........................................................................................................................................56
Resumo ........................................................................................................................................56
Introduo ....................................................................................................................................57
Pacientes e Mtodos.....................................................................................................................58
Resultados....................................................................................................................................60
Discusso .....................................................................................................................................64

CAPTULO VII: EXISTE UMA FORMA AUTOSSMICA RECESSIVA DA SNDROME DE TREACHER


COLLINS?
Abstract........................................................................................................................................71
Resumo ........................................................................................................................................71
Introduo ....................................................................................................................................72
Pacientes e Mtodos.....................................................................................................................74
Resultados e Discusso ................................................................................................................75

CAPTULO VIII: SUMRIO E CONCLUSES


Sumrio e Concluses .................................................................................................................78
Summary and Conclusions ..........................................................................................................81

REFERNCIAS
Referncias bibliogrficas ...........................................................................................................88
Referncias eletrnicas ...............................................................................................................94

ANEXOS
Modelo da ficha clnica dos pacientes
Biografia

ii

LISTA DE ABREVIAES

A, C, G, T Adenina, Citosina, Guanina, Timina


AD Autossmico dominante
AR Autossmico recessivo
ARMS Amplification refractory mutation system: amplificao alelo-especfica
bp Base pairs: pares de bases
CEGH Centro de Estudos do Genoma Humano
DNA cido desoxiribonucleico
JHUSM Johns Hopkins University School of Medicine
Kb Quilobases (1000 pares de bases)
KDa Quilodaltons
NMD Nonsense mediated decay: degradao do RNAm mediada por codon de parada prematuro
nt(s) Nucleotdeo(s)
pb Pares de bases
PCR Polymerase Chain Reaction: reao de polimerizao em cadeia
RNAm cido ribonucleico, mensageiro
SNP Single Nucleotide Polymorphism: polimorfismo de nucleotdeo nico
SSCP Single Strand Conformational Polymorphism: polimorfismo de conformao de fita simples
STC Sndrome de Treacher Collins
TCS Treacher Collins syndrome
USP Universidade de So Paulo
UTR Untranslated region: regio no traduzida

CORRELAO DE TERMOS USADOS EM INGLS


Annealing hibridao (ligao de um oligonucleotdeo com a seqncia de DNA)
Frameshift alterao na fase de leitura
Missense troca de sentido (aminocido)
Nonsense sem sentido, cdigo de parada
Primer oligonucleotdeo iniciador
Sense e antisense sentido e anti-sentido (orientao de leitura do DNA)
Splice site regio de emenda ou processamento do RNAm

iii

NDICE DE FIGURAS

Figura I.1. Fcies caracterstico dos pacientes portadores da STC .................................................................. 3


Figura I.2. Os arcos branquiais ........................................................................................................................ 5
Figura I.3. Estrutura predita para a protena treacle a partir da seqncia de aminocidos ............................. 8
Figura I.4. Imuno-histoqumica mostrando a localizao da protena treacle em clulas COS-1.................... 9
Figura I.5. Imunofluorescncia com anticorpos que reconhecem a poro N-terminal da protena treacle .... 10
Figura I.6. Embrio de camundongo no 9o dia de vida embrionria................................................................ 11
Figura I.7. Camundongo nocaute para o gene Tcof1 ....................................................................................... 12
Figura II.1. Exemplo de uma eletroforese em gel de agarose 1,5% ................................................................ 21
Figura II.2. Exemplos de SSCP ....................................................................................................................... 22
Figura II.3. Trecho do eletroferograma de um segmento analisado no ABI Prism 377............................... 22
Figura II.4. Anlise de microssatlites ............................................................................................................ 24
Figura II.5. Determinao do sexo parental com marcadores especficos para os cromossomos X e Y ......... 24
Figura II.6. Vetor TOPO (Invitrogen) ............................................................................................................. 25
Figura III.1. Mutaes descritas no gene TCOF1 ........................................................................................... 36
Figura IV.1. Alinhamento dos 61 aminocidos codificados pelo exon 22 humano......................................... 45
Figura IV.2. Comparao entre a seqncia de aminocidos codificada pelos exons 1 e 2............................. 46
Figura VI.1. Eletroforese em gel desnaturante de produtos amplificados com primers alelo-especficos....... 62
Figura VI.2. Seqenciamento de produtos amplificados com primers alelo-especficos ................................ 62
Figura VI.3. Seqenciamento de produtos clonados........................................................................................ 62
Figura VII.1. A famlia Hutterite descrita por Lowry et al. (1985)................................................................. 73
Figura VII.2. Heredogramas das famlias cujo probando no apresentou mutao no gene TCOF1 .............. 74
Figura VII.3. Anlise de segregao de marcadores da regio 5q31-q34........................................................ 75
Figura VIII.1. Esquema destacando as mutaes patognicas descritas no gene TCOF1............................... 84
Figura VIII.2. Freqncias dos diferentes tipos de mutao descritos no gene TCOF1.................................. 86

iv

NDICE DE TABELAS

Tabela II.1. Nmero de propsitos e familiares recebidos por centro ............................................................. 18


Tabela II.2. Dados dos primers utilizados na amplificao do gene TCOF1 .................................................. 19
Tabela II.3. Primers usados na amplificao de segmentos intrnicos............................................................ 20
Tabela II.4. Primers usados na amplificao alelo-especfica ......................................................................... 20
Tabela II.5. Condies de SSCP para os 27 amplicons do gene TCOF1......................................................... 21
Tabela II.6. Marcadores empregados na confirmao da paternidade............................................................. 23
Tabela II.7. Marcadores empregados na composio de hapltipos do cromossomo 5................................... 23
Tabela II.8. Marcadores utilizados para confirmao do sexo......................................................................... 24
Tabela III.1. Alteraes patognicas detectadas em pacientes brasileiros portadores da TCS ........................ 31
Tabela III.2. Polimorfismos no gene TCOF1 e sua freqncia entre pacientes e controles brasileiros........... 32
Tabela III.3. Mutaes aparentemente no-patognicas que no foram encontradas entre os controles ......... 34
Tabela III.4. Freqncia dos principais sinais clnicos entre os pacientes....................................................... 34
Tabela IV.1. Trinta e sete mutaes no gene TCOF1 detectadas por SSCP em 63 pacientes.......................... 44
Tabela V.1. Achados clnicos de 24 pacientes triados para mutaes no gene TCOF1 ................................... 53
Tabela VI.1. Primers alelo-especficos............................................................................................................ 59
Tabela VI.2. Famlias investigadas quanto informatividade dos polimorfismos........................................... 61
Tabela VI.3. Famlias informativas e origem parental de mutaes novas...................................................... 63
Tabela VI.4. Mdia de idade materna e paterna das famlias testadas ............................................................ 64
Tabela VI.5. Origem parental de mutaes em outras sndromes.................................................................... 67
Tabela VIII.1. Mutaes patognicas descritas no gene TCOF1..................................................................... 85

CAPTULO I

INTRODUO

Captulo I

CAPTULO I

INTRODUO

I.1. Histrico e caractersticas clnicas


A sndrome de Treacher Collins (STC, OMIM 154500) um distrbio do
desenvolvimento craniofacial que afeta 1 em 50.000 recm-nascidos (Connor & FergusonSmith, 1993). A primeira referncia sndrome na literatura mdica atribuda a Thomson
(1846), mas o nome que tem sido associado a ela o de Treacher Collins, oftalmologista
ingls que descreveu dois pacientes com colobomas de plpebra associados hipoplasia malar
no incio do sculo XX (Treacher Collins, 1900). Na dcada de 40, Franceschetti e
colaboradores realizaram um extenso trabalho de reviso dos casos descritos, definiram o
quadro clnico completo e propuseram o termo disostose mandibulofacial para designar a
sndrome (Franceschetti & Zwahlen 1944; Franceschetti & Klein, 1949). Por causa desses
trabalhos, a doena tambm chamada de sndrome de Franceschetti-Klein, FranceschettiZwahlen-Klein ou Treacher Collins-Franceschetti.
O quadro clnico composto principalmente por fendas palpebrais em inclinao antimongolide, coloboma na plpebra inferior (freqentemente acompanhado de ausncia de
clios), hipoplasia malar, micrognatia, palato alto e estreito (ocasionalmente fendido),
crescimento atpico de cabelo na regio pr-auricular e malformaes do pavilho auricular e
dos ossculos do ouvido mdio, o que pode levar surdez condutiva (Franceschetti & Klein,
1949). As anomalias costumam ser bilaterais e simtricas e apresentam grande variao
fenotpica, tanto inter como intra-familial, incluindo desde casos que passam desapercebidos
ao diagnstico at a morte perinatal causada pelo colapso das vias respiratrias nas condies
mais graves (The Treacher Collins Collaborative Group, 1996; Hansen et al., 1996). Esta
grande variabilidade na expresso fenotpica torna o diagnstico e o aconselhamento gentico
bastante difceis em alguns casos, principalmente se no existem outros afetados na famlia. A
Figura I.1 ilustra dois exemplos de portadores do quadro tpico da STC.

Captulo I

Figura I.1. Fcies caracterstico dos pacientes portadores da STC (Gorlin et al., 1990)

O padro de herana da sndrome autossmico dominante com penetrncia quase


completa (Rovin et al., 1964). Existem alguns poucos relatos de no-penetrncia (reviso em
Gollop, 1981), mas Dixon et al. (1991a) afirmam que, em vrios casos onde h suspeita de
no penetrncia, um exame clnico mais detalhado, incluindo avaliao radiolgica,
freqentemente revela sinais menores da sndrome. Existe apenas um relato comprovado de
no penetrncia, onde um dos membros de uma famlia com vrios afetados herdou o
cromossomo em risco (determinado atravs de estudo de ligao), mas no apresentava
nenhum sinal da STC, mesmo aps avaliao radiolgica (Dixon et al., 1994).
Apesar de o padro de herana ser claro na maioria dos casos familiais, existem cerca
de dez relatos de recorrncia de afetados na prognie de pais normais (reviso em Gollop,
1981; Lowry et al., 1985; Richieri-Costa et al., 1993), alm da ocorrncia de afetados na prole
de casamentos consangneos (Lowry et al., 1985; Richieri-Costa et al., 1993). Essas
observaes levaram os autores a sugerir a existncia de uma forma autossmica recessiva da
sndrome (disostose mandibulofacial, tipo Treacher Collins, autossmica recessiva, OMIM
248390), embora a possibilidade de no penetrncia ou mosaicismo gonadal em um dos pais
no possa ser descartada nesses casos.
A observao de casos familiais onde os filhos apresentam manifestaes clnicas
mais graves que o genitor afetado j levou alguns autores a sugerir que a STC apresenta
antecipao (reviso em Gollop, 1981). Existem vrios relatos de famlias em que, aps o
nascimento do probando com a forma clssica da STC, outros membros da famlia so
tambm diagnosticados, embora os mesmos no se julgassem portadores da sndrome (Rovin
et al., 1964; Fazen et al., 1967). Outros autores, entretanto, ressaltam que, nessas famlias

Captulo I

com vrias geraes de afetados, nem sempre os filhos tm quadro mais grave que o genitor
afetado e creditam a aparente antecipao a um vis de averiguao (Le Marec et al., 1974).
A proporo entre casos familiais e isolados na STC de cerca de 40:60, indicando
assim que a maior parte dos casos so decorrentes de mutaes novas (Jones, 1997). Para
algumas outras sndromes de herana autossmica dominante, como a acondroplasia e as
sndromes de Apert e Marfan, j havia sido notado que, nos casos espordicos, os pais dos
propsitos possuam idade avanada (Penrose, 1957; Blank, 1960; Murdock et al., 1972). A
explicao para essa observao que as espermatognias se dividem continuamente ao
longo da vida e, quanto maior for a idade de um homem, maior o nmero de replicaes por
que passaram suas clulas germinativas, aumentando assim a probabilidade de ocorrncia de
mutaes novas (Penrose, 1955; Vogel & Rathenberg, 1975). Em 1975, Jones et al. fizeram
uma reviso de 98 casos isolados de STC descritos na literatura e concluram que os pais
desses pacientes tambm apresentavam idade aumentada, sugerindo ento que as mutaes
novas associadas STC devem surgir na linhagem germinativa masculina, como
conseqncia do maior nmero de replicaes celulares associadas ao aumento de idade.

I.2. Patognese e diagnstico diferencial


As estruturas que se apresentam comprometidas na STC tm origem embrionria no
primeiro e segundo arcos branquiais (Poswillo, 1975). Os arcos branquiais comeam a se
formar a partir da 4a semana do desenvolvimento embrionrio, quando clulas da regio
ceflica da crista neural iniciam sua migrao a partir da regio dorsal do embrio (onde as
pregas neurais se juntam para a formao do tubo neural) para formar o mesnquima dos
arcos branquiais. So essas clulas de origem neuroectodrmica que vo dar origem aos
tecidos conjuntivos e esquelticos da parte inferior da face e da regio anterior do pescoo
(Larsen, 1997; Carlson, 1999). A figura I.2 ilustra os 4 arcos visveis em um embrio humano
no incio da 5a semana de desenvolvimento e as estruturas que sero formadas a partir da
cartilagem desses arcos.
Atravs do estudo de modelos animais para anomalias dos arcos branquiais produzidos
atravs da administrao de teratgenos, foi proposto que o quadro clnico observado nos
pacientes deva resultar de um distrbio na migrao ou diferenciao das clulas da crista
neural que vo formar o mesnquima dos arcos branquiais (Poswillo, 1975; Sulik et al.,
1987).

Captulo I

martelo

bigorna
estribo

cartilagem de Meckel

processo
estilide
ligamento estilide
pequeno corno
grande corno

corpo do hiide
cartilagem
tireide
cartilagem
cricide

(www.med.unc.edu/embryo_images)

(www.med.unc.edu/embryo_images)

Figura I.2. Os arcos branquiais: a) embrio humano no incio da 5a semana do desenvolvimento,


destacando o 1o e 2o arcos branquiais; b) estruturas derivadas da cartilagem dos arcos branquiais

O diagnstico diferencial da STC deve excluir outras sndromes caracterizadas por


malformaes das estruturas derivadas do primeiro e segundo arcos branquias. Entre estas,
podemos destacar as seguintes:
a) Sndrome de Nager (disostose acrofacial, OMIM 154400): apresenta anomalias
faciais semelhantes s encontradas na STC e pode ser diferenciada desta pelos defeitos praxiais nos membros, como sinostose rdio-ulnar, aplasia de rdio e alteraes nos polegares,
que podem apresentar hipoplasia, falange tripla ou at estarem ausentes. Existem poucos
casos descritos, sendo que a maioria destes so isolados, mas h relatos tanto de recorrncia
na irmandade de afetados como de transmisso vertical, sendo possvel que haja
heterogeneidade gentica (Gorlin et al., 1990; Jones, 1997).
b) Sndrome de Miller (sndrome de Gene-Wiedemann, disostose acrofacial psaxial, OMIM 263750): tambm apresenta hipoplasia malar, micrognatia e alteraes nos olhos
e pavilhes auriculares semelhantes aos pacientes portadores da STC, mas se distingue desta
por ausncia, hipoplasia ou sindactilia de 5o dgito, tanto nos ps como nas mos. Existem
poucos casos descritos e o padro de herana parece ser autossmico recessivo (Gorlin et al.,
1990; Jones, 1997).
c)

Espectro

culo-aurculo-vertebral

(sndrome

de

Goldenhar,

microssomia

hemifacial, seqncia fcio-aurculo-vertebral, OMIM 164210): provavelmente formam um


grupo heterogneo de malformaes caracterizadas por envolvimento das estruturas derivadas
do 1o e 2o arcos branquiais (micrognatia, hipoplasia malar, displasia dos pavilhes
auriculares), que pode ser unilateral ou bilateral. Outros sinais que podem ser encontrados so
5

Captulo I

lipodermides

epibulbares,

apndices

pr-auriculares,

hipoplasia

de

vrtebras

ou

hemivrtebras. O quadro clnico bastante varivel e acredita-se que o padro de herana


seja multifatorial, pois a maioria dos casos so espordicos e o risco de recorrncia na
irmandade de afetados, determinado empiricamente, da ordem de 3% (Gorlin et al., 1990;
Jones, 1997).
d) Disostose maxilofacial (OMIM 155000): caracterizada por fendas palpebrais em
inclinao anti-mongolide, encurtamento antero-posterior da maxila, atraso na aquisio da
fala e disartria. No apresenta malformaes dos pavilhes auriculares e o padro de herana
autossmico dominante (Gorlin et al., 1990).
importante ressaltar que nenhuma dessas sndromes tem sua base gentica
conhecida. Entretanto, algumas aberraes cromossmicas j foram descritas em associao
ao quadro clnico de algumas delas. Duas anomalias cromossmicas foram descritas em
pacientes portadores da sndrome de Nager, uma translocao equilibrada t(X;9)(p22.1;q32)
(Zori et al., 1993) e uma deleo envolvendo o brao longo do cromossomo 1,
del(1)(q12q21.1) (Waggoner et al., 1999), mas dessas observaes no surgiu ainda um gene
candidato. J a sndrome de Goldenhar foi associada a diversas anomalias cromossmicas
(reviso em Kobrynski et al., 1993) e um estudo de ligao, envolvendo duas famlias com
vrios afetados e padro de herana autossmico dominante, obteve valores positivos de lod
score com marcadores da regio 14q32 em uma das famlias. A segunda famlia, contudo, no
apresentou ligao com marcadores dessa mesma regio, indicando que existe
heterogeneidade gentica (Kelberman et al., 2001).

I.3. Mapeamento e clonagem do gene TCOF1


Na ausncia de um gene candidato para a STC, a tentativa de clonagem posicional do
gene responsvel pela sndrome de Treacher Collins iniciou-se atravs do estudo de pacientes
portadores da STC que apresentavam alguma aberrao cromossmica, como translocaes
equilibradas ou delees. Haviam sido descritas trs diferentes aberraes cromossmicas
associadas sndrome: Balestrazzi et al. (1983) descreveram a translocao equilibrada
t(5;13)(q11;p11) em uma paciente; Dixon et al. (1991a) tambm encontraram uma
translocao equilibrada t(6;16)(p21.31;p13.11) em trs de seus pacientes (me e dois filhos)
com STC; e Jabs et al. (1991a) observaram um paciente com um quadro grave de STC e
deleo em 4p15.32-p14.

Captulo I

Estudos de ligao com marcadores dos cromossomos 4p, 6p e 16p permitiram a


excluso dessas regies candidatas (Jabs et al., 1991a; Dixon et al., 1991a). No mesmo ano,
Dixon et al. (1991b), conduziram um estudo de ligao em 12 famlias com STC testando
como regies candidatas aquelas envolvidas no caso com a translocao equilibrada
t(5;13)(q11;p11), previamente descrita por Balestrazzi et al. (1983). Neste estudo, valores
positivos de lod score foram obtidos com marcadores do cromossomo 5q, sugerindo pela
primeira vez que o loco do gene responsvel pela STC estava mapeado em 5q31-34. Estudos
posteriores confirmaram a ligao com a regio 5q31-34 e o isolamento de novos marcadores
possibilitou a restrio da regio candidata e a criao de um mapa de transcrio englobando
a regio crtica da STC (Jabs et al., 1991b; Dixon et al., 1992; Dixon et al., 1993; Jabs et al.,
1993; Loftus et al., 1993; Loftus et al., 1996).
Em 1996, durante uma investigao dos genes candidatos presentes no intervalo
crtico para a STC, um grupo de pesquisadores isolou um segmento de um novo gene de
funo desconhecida (The Treacher Collins Syndrome Collaborative Group, 1996). A anlise
por northern blot revelou que esse gene era expresso em uma gama variada de tecidos
adultos, como corao, crebro, pulmo, fgado e pncreas. Ao se analisar esse gene em
famlias de afetados por STC, identificaram-se 5 mutaes (uma mutao de ponto e quatro
inseres) que causariam uma alterao na fase de leitura do RNAm (frameshift), levando ao
aparecimento de codons de parada prematuros. Assim, o gene recebeu o nome de TCOF1
(Treacher Collins-Franceschetti 1, OMIM 606847) e foi identificado como responsvel pela
sndrome de Treacher Collins.
A identificao da seqncia completa do RNAm do TCOF1 s foi concluda no ano
seguinte, em 1997, por Dixon et al. (1997b), atravs da tcnica de amplificao de
extremidades de cDNA (Rapid Amplification of cDNA Ends - RACE). Verificou-se assim que
o gene TCOF1 composto por 26 exons, que possuem de 49 a 561 pares de bases (pb). O
exon 1, alm do sinal iniciador de transcrio, contm uma UTR 5 (untranslated region regio no traduzida) de 93 pb. O exon 25 contm as ltimas bases traduzidas e o sinal de
parada, seguido por 22 pb da UTR 3. O exon 26 composto por mais 485 pares de bases da
UTR 3.
A anlise de mutaes em pacientes portadores da STC revelou a existncia de
mutaes patognicas ao longo de quase toda a seqncia codificadora do gene. As mutaes
so especficas para cada famlia, com duas excees: uma troca de nucleotdeos no intron 3,
que altera o processamento do RNAm, encontrada em duas famlias independentemente e

Captulo I

uma deleo de 5 pb no exon 24 que estava presente em 7 probandos (Edwards et al., 1997).
A maior parte das mutaes patognicas descritas so pequenas delees (de 1 a 5 pb), mas
inseres, mutaes sem sentido (nonsense), mutaes em stios de emenda do RNA
(splicing) e uma mutao missense (troca de aminocidos) tambm foram observadas (The
Treacher Collins Syndrome Collaborative Group, 1996; Gladwin et al., 1996; Wise et al.,
1997; Edwards et al., 1997). Nenhum desses autores conseguiu traar uma correlao entre o
tipo ou local da mutao com a gravidade do quadro clnico, e alguns sugerem influncia
ambiental, interao de outros genes e variaes polimrficas no alelo selvagem do TCOF1
para explicar a variabilidade clnica observada entre os pacientes (Edwards et al., 1997).
Tendo em vista que, com uma nica exceo, as mutaes patognicas conhecidas
resultam no trmino prematuro da traduo, o mecanismo molecular mais aceito para explicar
o quadro clnico da STC o de haploinsuficincia, mas alguns autores ressaltam que no se
pode descartar a possibilidade de a protena mutante exercer um efeito dominante negativo
sobre o produto do alelo normal (Gladwin et al., 1996; Wise et al., 1997).

I.4. Caracterizao da protena treacle


A protena codificada pelo gene TCOF1, chamada treacle, possui 144 KDa e baixa
complexidade. A partir da anlise da seqncia de aminocidos predita a partir do cDNA,
observou-se que a treacle apresenta uma srie de unidades repetidas de funo desconhecida,
sendo cada unidade codificada por um exon. Essas unidades de repetio se estendem do exon
7 ao 16 no gene, com exceo do exon 14, e contm o sinal consenso de fosforilao pela
casena quinase II (S/T-X-X-D/E). A extremidade carboxi-terminal da protena apresenta
sinais de localizao nuclear e nucleolar (K-K/R-X-R/K), codificados pelos exons 23, 24 e 25
(Dixon et al., 1997b; Wise et al., 1997). Um esquema da estrutura da protena treacle est
representado abaixo, na Figura I.3.

C
unidades repetitivas com
sinal de fosforilao

sinal de localizao
nucleolar

Figura I.3. Estrutura predita para a protena treacle a partir da seqncia de aminocidos,
destacando em vermelho os domnios repetitivos com potenciais stios de fosforilao e em
azul o sinal de localizao nucleolar presente na extremidade C-terminal

Captulo I

A treacle apresenta uma fraca homologia com um grupo de fosfoprotenas nucleolares


descritas no rato (Nopp 140, Meier & Blobel, 1992), no sapo (xNopp 180, Cairns & McStay,
1995) e no homem (p130 ou NOPP 140, Pai et al., 1995; Chen et al., 1999). Essas protenas
apresentam domnios repetitivos com stios de fosforilao e um sinal de localizao
nucleolar, mas sua funo permanece desconhecida. Especula-se que participem da gnese
nucleolar ou que atuem no transporte entre o nuclolo e o citoplasma como chaperonas.
Devido similaridade com essas protenas, sugeriu-se que a treacle pudesse exercer funo
semelhante (Dixon et al., 1997b; Wise et al., 1997).
Estudos de imuno-histoqumica realizados no ano de 1998 (Marsh et al. e Winokur &
Shiang) abordaram o efeito do truncamento da protena treacle em sua localizao subcelular,
confirmando que a perda da poro carboxi-terminal impede que a protena seja corretamente
localizada no nuclolo (Figura I.4). Jones et al. (1999) demonstraram ainda que a treacle pode
ser fosforilada in vitro e in vivo pela casena quinase II e pela protena quinase C.
a

Figura I.4. Imuno-histoqumica mostrando a localizao da protena treacle em clulas COS-1. a) a


treacle selvagem se localiza no nuclolo; b) poro N-terminal da protena, localizao citoplasmtica;
c) apenas a poro C-terminal da protena, tambm se localiza no nuclolo (Marsh et al., 1998)

Isaac et al. (2000) investigaram os nveis de treacle em fibroblastos de pacientes e


controles normais atravs das tcnicas de imuno-fluorescncia e western blot e no
detectaram diferena nos nveis de treacle selvagem entre os fibroblastos de pacientes e
controles, sugerindo que existe um mecanismo de compensao de dose capaz de manter
nveis celulares apropriados da protena a partir de um nico alelo funcional (Figura I.5). Os
autores observaram ainda que no possvel detectar a presena da protena mutante no
citoplasma das clulas dos pacientes, indicando que a protena truncada instvel ou que o
RNAm contendo um codon de parada prematuro degradado pelo mecanismo de NMD
(nonsense-mediated RNAm decay), o que favorece o mecanismo de haploinsuficincia em
detrimento de um modelo dominante-negativo.

Captulo I

Figura I.5. Imuno-fluorescncia com anticorpos que reconhecem a poro N-terminal da protena treacle
em fibroblastos de um paciente portador da STC (D) e um controle normal (G), mostrando que a protena
se localiza no nuclolo, no h diferena de intensidade de marcao entre o paciente e o controle e no
se detecta a presena da protena truncada no citoplasma do paciente (Isaac et al., 2000)

Recentemente, Emes & Ponting (2001) identificaram um motivo na regio N-terminal


da treacle, denominado LisH (LIS1 homology motif), presente em mais de 100 protenas
intracelulares. Os autores propem que esse motivo esteja envolvido na regulao da cintica
de microtbulos e no transporte de partculas mediadas por eles. Entre o grande nmero de
protenas conhecidas que apresentam o motivo LisH, aquelas que so associadas a doenas
conhecidas, como a treacle, LIS1 e Cxorf5, tm em comum o fato de o quadro clnico ser
resultante de uma alterao no padro de migrao celular, sugerindo assim uma possvel
funo associada ao motivo LisH.

I.5. Modelos animais


Conforme mencionado no item I.2, fenocpias da STC foram produzidas em ratos e
camundongos atravs da administrao de derivados de vitamina A (retinides) fmeas
grvidas entre o 9o e 10o dias de gestao. No trabalho realizado por Sulik et al. (1987), a
prognie de camundongos fmeas expostas ao cido 13-cis retinico apresentou maxilar
pequeno, anomalias nas orelhas, apndices pr-auriculares, diminuio das plpebras
inferiores e fenda palatina em diversos graus. interessante ressaltar que 5% (3/58) dos
camundongos

afetados

tambm

apresentaram

anomalias

ps-axiais

nos

membros

(oligodactilia), tal como observado na sndrome de Miller. Esses resultados apontam para um
mecanismo comum no desenvolvimento dos membros e dos arcos branquiais, levantando a
hiptese que as sndromes de Treacher Collins, Miller e Nager possam ser entidades allicas.
Um segundo trabalho descreveu um camundongo mutante (far) onde os homozigotos
apresentam anomalias bilaterias das estruturas derivadas do 1o arco branquial. Quando os
mutantes far eram cruzados com camundongos de linhagens diferentes, 38% dos
heterozigotos (far/+) de uma das linhagens apresentavam compromentimento unilateral das
estruturas derivadas do primeiro arco, o que no ocorria com os camundongos heterozigotos
10

Captulo I

da outra linhagem. Os autores atriburam essas observaes a uma alterao na dominncia da


mutao, dependente do contexto genotpico do camundongo portador e traaram um paralelo
com as anomalias de primeiro arco em humanos, ressaltando que, nos camundongos, formas
unilaterais e bilaterais podem ser atribudas ao mesmo gene mutante (Juriloff et al., 1987).
Em 1997, o gene homlogo ao TCOF1 foi isolado no camundongo atravs da
hibridao de bibliotecas de cDNA murino com uma sonda feita a partir da seqncia do
cDNA humano (Dixon et al., 1997a; Paznekas et al., 1997). A seqncia do gene Tcof1
possui 74,3% de identidade com a seqncia humana, apesar de ser mais curta em 273
nucleotdeos. Ao nvel da protena, existe 61,4% de identidade e 71,6% de similaridade. Uma
anlise da expresso temporal e espacial do gene Tcof1 em embries de camundongo,
utilizando uma sonda de RNAm anti-senso, mostrou que o gene expresso em todo o embrio
durante todo seu desenvolvimento, mas h um pico de expresso durante o 9o e 10o dias, na
regio dos arcos branquiais e das pregas neurais, retornando depois aos mesmos nveis basais
detectados nos outros tecidos (Figura I.6). Essa observao permitiu relacionar o padro de
expresso do gene com o quadro clnico dos pacientes, elucidando porque apenas as estruturas
derivadas do 1o e 2o arcos branquiais so afetadas, apesar de o gene ser expresso em diversos
tecidos adultos e embrionrios (Dixon et al., 1997a).

Figura I.6. Embrio de camundongo no 9o dia de vida embrionria, mostrando que


o gene Tcof1 expresso por todo o embrio, com expresso mais intensa na regio
dos arcos branquiais e das pregas neurais (Dixon et al., 1997a)

No ano 2000, foi desenvolvido um modelo animal para a sndrome, com a substituio
do exon 1 do gene Tcof1 em camundongos por um cassete de resistncia neomicina,

11

Captulo I

produzindo assim um alelo nulo. Os camundongos Tcof1+/ apresentam atraso do


desenvolvimento, hipoplasia do processo frontonasal, comprometimento das estruturas
derivadas do primeiro arco branquial, anoftalmia e morrem antes do nascimento (Figura I.7).
A anlise dos embries heterozigotos durante o desenvolvimento embrionrio permitiu
aos autores concluir que existe aumento do nvel de apoptose nas clulas que migram das
cristas neurais para formar o mesnquima dos arcos branquiais. Essa observao sugere que
uma dosagem apropriada da protena treacle importante na manuteno das clulas da crista
neural ceflica durante o processo de migrao (Dixon et al., 2000).

Figura I.7. Camundongo nocaute para o gene Tcof1 em comparao com um


camundongo selvagem da mesma ninhada (Dixon et al., 2000)

Recentemente, Haworth et al. (2001) clonaram o gene homlogo ao TCOF1 em ces.


A identidade entre a seqncia do cDNA do co e do homem de 80%, sendo que a
seqncia canina no possui o equivalente ao exon 10 humano e apresenta uma seqncia
extra de 252 pb, localizada entre os exons 16 e 17. Alm dessas diferenas, o TCOF1 canino
apresenta ainda o processamento (splice) alternativo do exon 19, sendo que em um mesmo
tecido ambas as formas de mRNA com ou sem a incluso do exon 19 podem ser
encontradas. A identidade observada entre as protenas humana e canina de 71%, sendo que,
a exemplo do que j havia sido observado na comparao das protenas humana e do
camundongo, a identidade maior na poro N-terminal da treacle (Dixon et al., 1997;
Paznekas et al., 1997; Haworth et al., 2001).

12

Captulo I

I.6. Questes no resolvidas


Apesar dos recentes avanos no estudo da sndrome e na caracterizao da protena
treacle, o mecanismo atravs do qual a falta de nveis adequados da protena leva alterao
da migrao das clulas provenientes da crista neural permanece desconhecido. Alm disso,
ainda no se descartou a hiptese de a sndrome ter uma natureza heterognea, isto , podem
existir outros genes que levem ao mesmo quadro clnico, pois apenas 60% dos pacientes
triados apresentaram mutaes no gene TCOF1 (Edwards et al., 1997). Alm disso, embora
todos os casos familiais estudados apresentem ligao com a regio 5q31-32 (Edery et al.,
1994), existem relatos de casos isolados da sndrome associados a delees em outras regies
cromossmicas, como 4p15.32-p14 e 3p23-p24.12 (Jabs et al., 1991a; Arn et al., 1993).
A identificao de outro(s) gene(s) que tenham um papel importante no processo de
migrao das clulas da crista neural, quer em interao direta com a protena treacle ou no,
pode vir a esclarecer tambm a razo da grande variabilidade clnica encontrada entre os
pacientes, que no pode ser associada ao tipo ou local da mutao no gene TCOF1. Outras
possveis razes para a variabilidade clnica so polimorfismos no alelo selvagem do TCOF1
e polimorfismos na regio promotora que aumentem ou diminuam os nveis de transcrio. J
foi sugerido por alguns autores (Franceschetti & Klein, 1949; Sulik et al., 1987) que a
sndrome de Treacher Collins e as disostoses acrofaciais (sndromes de Miller e Nager)
podem ser allicas, ou seja, diferentes manifestaes fenotpicas de mutaes no mesmo gene.
At o momento, nenhum paciente portador de outras sndromes que comprometem as
estruturas derivadas do 1o e 2o arcos branquiais foi testado para mutaes no gene TCOF1.
Uma das questes que merece ser abordada a das famlias onde o padro de herana
sugere um mecanismo autossmico recessivo para a sndrome. Como nenhuma dessas
famlias foi testada molecularmente para mutaes no gene TCOF1, determinar se o quadro
clnico nessas famlias causado por mutaes no gene TCOF1 ou se existe heterogeneidade
gentica com diferentes padres de herana de fundamental importncia para o
aconselhamento gentico, pois os riscos de recorrncia para prole e irmandade de afetados
muda radicalmente se o padro de herana for recessivo em vez de dominante.
Alguns autores j consideraram que a antecipao clnica observada em algumas
famlias com STC no um fenmeno biolgico verdadeiro, mas resultado de um vis de
averiguao (Le Marec et al., 1974). Atualmente, sabe-se que existe uma correlao entre
mutaes em genes dinmicos, isto , mutaes patognicas que decorrem de expanses de
unidades repetitivas (tri ou tetra nucleotdeos) e a antecipao e a gravidade do quadro clnico.
13

Captulo I

Apesar de o gene TCOF1 no ser um gene dinmico, a hiptese de que existe antecipao
clnica no voltou a ser abordada aps a constatao por parte da comunidade cientfica que,
ao menos em certos casos, a antecipao no decorrente de um vis de averiguao e pode
ser explicada por um mecanismo biolgico.
Outra hiptese que nunca foi testada a da origem paterna de mutaes novas no gene
TCOF1 relacionadas ao aumento da idade reprodutiva, que j foi confirmada molecularmente
para outras sndromes de herana autossmica dominante, como a sndrome de Apert e a
acondroplasia (Moloney et al., 1996; Wilkin et al., 1998). Existem ainda muitas outras
questes sem resposta no estudo da STC, e este trabalho se props a abordar algumas delas.

I.7. Objetivos
Estabelecer um mtodo eficiente para deteces de mutaes no gene TCOF1;
Caracterizar o espectro de mutaes no gene TCOF1 associadas STC e determinar a
freqncia dos casos de STC que podem ser atribudos a mutaes neste gene na
amostra brasileira;
Testar a hiptese de que os casos isolados e familiais da STC obedecem proporo
60:40 entre os pacientes brasileiros;
Testar a hiptese que outras sndromes que afetam o desenvolvimento do 1o e 2o arcos
branquiais so tambm causadas por mutaes no gene TCOF1;
Testar a hiptese que as mutaes espordicas na STC ocorrem preferencialmente no
cromossomo paterno e tm correlao positiva com o aumento de idade;
Verificar se as famlias que sugerem herana autossmica recessiva so fruto de
mosaicismo ou no-penetrncia de mutaes no gene TCOF1;

14

CAPTULO II

PACIENTES E MTODOS

Captulo II

CAPTULO II

PACIENTES E MTODOS

II.1. Pacientes e colaboradores


Este trabalho contou com a colaborao de diversos geneticistas clnicos e um
cirurgio plstico, que encaminharam seus pacientes para atendimento no Centro de Estudos
do Genoma Humano (CEGH), ou, quando o encaminhamento no era possvel, coletaram e
enviaram uma amostra de 10ml de sangue ou 50mg de DNA. Os pacientes atendidos no
Centro foram avaliados com auxlio de um geneticista clnico (Dr. Lus Garcia Alonso ou
Dra. Rita de Cssia Pavanello) e uma ficha clnica com os principais sinais observados na
sndrome de Treacher Collins preenchida para cada paciente (Apndice I). No caso dos
pacientes cujo material foi enviado pelo correio, o geneticista encaminhante se encarregou do
preenchimento da ficha clnica.
A amostra encaminhada ao CEGH atravs dos nossos colaboradores composta por
38 propsitos com diagnstico clnico de sndrome de Treacher Collins (STC). Doze outros
pacientes foram encaminhados com suspeita de STC, para diagnstico diferencial da STC ou
com diagnstico de sndrome de Goldenhar. Apresento abaixo a lista de colaboradores:

Dr. Alberto Rosa


Instituto de Investigacin Mdica Mercedes y Martn Ferreyra. Crdoba, Argentina

Dr. Antnio Richieri


Hospital de Pesquisa e Reabilitao de Leses Palatais, USP. Bauru, SP

Dra. Denise Pontes Cavalcanti


Departamento de Gentica Mdica, UNICAMP. Campinas, SP

Dr. Elias Oliveira da Silva


Servio de Gentica Mdica, Instituto Materno-Infantil de Pernambuco. Recife, PE

Dr. Gerson Carakushansky


Instituto de Pediatria Martago Gesteira, UFRJ. Rio de Janeiro, RJ

Dr. Lus Garcia Alonso e Dr. Dcio Brunoni


Disciplina de Gentica, Escola Paulista de Medicina-UNIFESP. So Paulo, SP

16

Captulo II

Dr. Nivaldo Alonso


Diviso de Cirurgia Plstica, Hospital das Clnicas, USP. So Paulo, SP

Dra. Tmis Maria Flix


Departamento de Gentica, Hospital de Clnicas de Porto Alegre. Porto Alegre, RS

Dra. Rita de Cssia Pavanello


Centro de Estudos do Genoma Humano, USP. So Paulo, SP

A partir de 1999, iniciamos um estudo colaborativo com a Dra. Ethylin Wang Jabs, do
Johns Hopkins University School of Medicine (Baltimore, MD, EUA). Recebemos atravs da
Dra. Jabs DNA de 48 pacientes com diagnstico ou suspeita clnica de STC, e 6 DNAs de
pacientes com diagnstico de outras sndromes que tambm envolvem malformaes dos
arcos branquiais (sndromes de Miller e Nager) ou sem diagnstico clnico definido.
Alm disso, recebemos 12 pacientes encaminhados para realizao do diagnstico
molecular atravs de universidades europias. Desses pacientes, 6 possuiam o quadro clnico
tpico de STC, enquanto 6 foram encaminhados como casos atpicos, para confirmao ou
excluso do diagnstico. Tambm nesses casos, a ficha clnica foi preenchida pelo mdico
responsvel por cada paciente e, quando possvel, foram anexadas fotografias. Esto
relacionados a seguir os geneticistas que encaminharam seus pacientes para diagnstico.

Dr. Jan Miertus


Servizio di Genetica Medica, Instituto per LInfanzia. Trieste, Itlia

Dr. Martin Hergersberg


Institut fr Medizinische Genetik der Universitt Zrich. Zurique, Sua

Dr. Lionel Van Maldergem


Centre de Gntique Mdicale. Loverval, Blgica

Dr. Jukka Moilanen


Department of Clinical Genetics, Oulu University Hospital. Oulu, Finlndia

Dra. Kristina Lagerstedt


Department of Clinical Genetics, Karolinska Hospital. Estocolmo, Sucia

Dra. Livia Garavelli


Ambulatorio di Genetica Clinica, Arcispedale S. Maria Nuova. Reggio Emilia, Itlia

No total, foram testados 92 pacientes encaminhados com diagnstico de STC e 24


propsitos encaminhados para diagnstico diferencial ou portadores de outras sndromes com
sobreposio de sinais clnicos com a STC. Quando possvel, outros membros da famlia
tambm foram testados, totalizando 220 pessoas. A Tabela II.1 discrimina quantos pacientes

17

Captulo II

com diagnstico de STC ou com outros diagnsticos e seus familiares compem cada grupo
amostral (Centro de Estudos do Genoma Humano CEGH, encaminhados pela Dra. Jabs e
encaminhados por centros europeus).
Tabela II.1. Nmero de propsitos e familiares recebidos por centro
Propsitos STC
38
Amostra CEGH
48
Amostra Dra. Jabs
6
Amostra Europa
92
Total

Familiares
64
25
6
95

Outros propsitos
12
6
6
24

Familiares
2
3
4
9

Total
116
82
22
220

II.2 Extrao de DNA


A extrao de DNA foi relizada a partir de amostras de sangue perifrico (5-10ml)
segundo o mtodo de Miller et al. (1988) ou a partir de esfregao de mucosa bucal segundo o
protocolo descrito por Richards et al. (1993). As amostras de DNA extradas de sangue
perifrico foram quantificadas atravs da leitura da absorbncia no comprimento de onda de
260nm em espectrofotmetro (Beckman) e 40ng de DNA foram utilizados para amplificao.
O mtodo de extrao de DNA a partir de esfregao de mucosa bucal resulta em
concentraes entre 5 a 15ng/l e, nesse caso, 3l foram utilizados para amplificao sem
quantificao prvia.

II.3 Amplificao dos fragmentos de DNA


O DNA foi amplificado atravs da reao em cadeia da polimerase (PCR
Polymerase Chain Reaction, Saiki et al., 1985) nas seguintes condies: 4 minutos de
desnaturao a 95C; 35 ciclos de 30 segundos a 95C, 40 segundos na temperatura de
hibridao (annealing) calculada para cada par de primers e 40 segundos a 72C, seguidos de
uma etapa de extenso de 6 minutos a 72C.
Os primers (oligonucleotdeos iniciadores) utilizados para amplificao dos 26 exons
do gene TCOF1 foram publicados por The Treacher Collins Syndrome Collaborative Group
(1996), Gladwin et al. (1996), Edwards et al. (1997) e Wise et al. (1997). A seqncia
completa dos primers, bem como o exon amplificado, tamanho do amplicon, temperatura de
hibridao e as respectivas referncias esto na Tabela II.2.

18

Tabela II.2. Dados dos primers utilizados na amplificao do gene TCOF1


Exon
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Nome
TCOF1-F
TCOF1-R
TCOF2-F
TCOF2-R
TCOF3-F
TCOF3-R
TCOF4-F
TCOF4-R
TCOF5-F
TCOF5-R
TCOF6-F
TCOF6-R
TCOF7-F
TCOF7-R
TCOF8-F
TCOF8-R
TCOF9-F
TCOF9-R
TCOF10-F
TCOF10-R
TCOF11-F
TCOF11-R
TCOF12-F
TCOF12-R
TCOF13-F
TCOF13-R
TCOF14-F
TCOF14-R
TCOF15-F
TCOF15-R

Tamanho

Ref.

Exon

AGG CGG GGC GTG CAG GTA


CCG CTG ATC TCC ACA TCT TG

58C

205 pb

16

TGC TGG GGA TTA ATT GTG GC


TTC CAA GCT GAG TTG CTT GG

55C

158 pb

17

GTT GTT CTG TCA CCC AGT TG


GGT AGA CTC TAC CCT AGA AC

55C

251 pb

18

TCA TCT GGC TCC TTT AGC AG


TAG GCA ATA GCT TGG AAG GC

55C

143 pb

19

TTG GGT TCA GAT GCA AGT GG


AAG TTC TGG GGA CTA GGT TC
TGG AAA GGG AGT CCC TCA GT
GTT CCT GGA AGG GTT AGA GG

55C

306 pb

20

57C

173 pb

21

GTT TTC ACA AGC AGG AGA GC


AGA AGG CCT TCT GGG GAT G

55C

313 pb

22

GTG TCC TGT GTC TCC TCA C


TTT AGG CAT GGG GCT ACT CT

55C

299 pb

ACC TTT GCC ACA TCC AGC TC


TCT TTT GAG GCA GGG CAC AG

57C

332 pb

ACT CCC TCC CTA ATC TTG TC


GAA AGA GCC TTA CAG GAA GG

55C

279 pb

CTC TCC CGA TCC TGT GTA TC


ATC AGG CCA TGT AGC AGC CT

57C

255 pb

24

TCT CCA GCC TTT CTT TGG TG


GTC CAA AGG ACC ACG TAG G

55C

336 pb

25

GGA GAC ACC TCT CTT CCC CT


GGA TGG GCC TGC TCC TTC TA

59C

257 pb

CAA TCT CAC CTT CTC CCT CCT


AAC CCT CCA CAC CTC CTG TG

59C

219 pb

GGG AGT GGG ACC TGA AAG AA


CCC ATG TAG GGG ATG ATC TC

57C

277 pb

Seqencia do primer

23

26

Nome
TCOF16-F
TCOF16-R
TCOF17-F
TCOF17-R
TCOF18-F
TCOF18-R
TCOF19-F
TCOF19-R
TCOF20-F
TCOF20-R
TCOF21-F
TCOF21-R
TCOF22-F
TCOF22-R
TCOF23a-F
TCOF23a-R
TCOF23b-F
TCOF23b-R
TCOF23c-F
TCOF23c-R
TCOF24-F
TCOF24-R
TCOF25-F
TCOF25-R
TCOF26a-F
TCOF26a-R
TCOF26b-F
TCOF26b-R

Tamanho

Ref.

AGG CTC TCT CAT CCT GTT TC


TTC TGA GGA GTG AGT GTT GG

55C

276 pb

TTT CCC TGG CCA AGC CTT TA


TCA ATG TGG GGC AGT GCT G

55C

298 pb

ATG GGC TTT TGT GCC CTG AT


CAT CAG CAC ATG TGG GTA AG

55C

260 pb

ACT TGT GAG TCT GAG GGC TA


AAC CAA GTG CAG AGG TCA TG

55C

260 pb

TTC CAT TCC TTC TCC TTT CAC


CCA CAC AAC ACC CTC TTC C
CCA ACA GGA TAC TGT GCT TC
TAT GGG CTG CCA GTC CTC T

55C

302 pb

55C

143 pb

TGG CAG CTC TTT CAC AAT GG


TGT CCT GCT ATG TCC CTC C

55C

247 pb

ATC TGT GAC CCC ACA TTC TC


GTG TCC ACC ACC TTC TTT CT

55C

246 pb

TCA GTG GTG AAG GTC CTG AC


CAA GAG ACC CCT TCC CTT TC

57C

286 pb

GAG AGA CAA AGC AAG TGG TG


TAC ATG GGA GGA ATG AGA CC

55C

269 pb

TTA CCA TCT GTT GTT CAG GAA C


TCT CCT TCC TTC CCC AAC AC

57C

365 pb

GCA GTG GGT GGG GAA AAG


CCA CAG GGG ACA CCA GAG

55C

168 pb

ATG CCA GAT TTC ATT TTC


CTG TGG AGC AAG GTG GTG

56C

406 pb

AGT GAC CTC CTC TCC TTC


TAG TTT AGA TGC CAC CTC

56C

411 pb

Seqencia do primer

(1) The Treacher Collins Syndrome Collaborative Group, 1996; (2) Gladwin et al., 1996; (3) Edwards et al., 1997; (4) Wise et al., 1997

Captulo II

Alm daqueles apresentados na Tabela II.2, novos primers foram desenhados atravs
do programa Primer3 (http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3.cgi) para a amplificao
de segmentos intrnicos. As seqncias dos primers, bem como a temperatura de hibridao
utilizada e o tamanho do segmento amplificado (amplicon) esto dispostos na Tabela II.3.
Tabela II.3. Primers usados na amplificao de segmentos intrnicos
Nome
Int6-F
Int6-R
Int13a-F
Int13a-R
Int13b-F
TCOF14-R
Int16-F
TCOF17-R
Int17-F
Int17-R
Int22-F
Int22-R
Int23a-F
Int23a-R
Int23b-F
Int23b-R
Int24-F
Int24-R

Tamanho

56C

612 pb

57C

570 pb

59C

736 pb

55C

794 pb

61C

591 pb

56C

672 pb

57C

660 pb

55C

650 pb

57C

524 pb

Seqencia do primer
CAG CCT GCA CTT TCT GCA T
TGA TAC TTT GGC CAC ACT GG
CTT GAC TGG GGG CTA GTG TT
AGC CAG GCA CTC TCT CAT TC
CTT TTG GGG GTT CTC TGG AT
GGA TGG GCC TGC TCC TTC TA
TGG TAT AGC TGG GGA GTT TCA
TTC TGA GGA GTG AGT GTT GG
GGA CAG GAC ACT GGC TGA GT
GGC TGG TCT TGA ACT CCT GA
ACA AAG GCT GCA CCA GAA GT
TGG AGA GAG AATGTG GGG TC
CAG CAC CTG GTC TCA TTC CT
AGA GAC AAG ATG GGG TTT GG
CCA TGG ATG GGA CAG AAA TC
TTT TCT TCT GGG ACG GTG AC
CTC AGG CCA GAA AAC AGA CC
CTC AGA CCT GCA GCT TTT CC

Os primers para amplificao alelo-especfica (ARMS Amplification Refractory


Mutation System, Newton et al., 1989) foram desenhados atravs da anlise manual do
segmento gnico de interesse e utilizados em conjunto com um dos primers j disponveis
para amplificao desse trecho. Em um caso, a diferena de temperatura de hibridao entre o
primer alelo-especfico e o primer complementar em uso era muito grande e um novo primer
complemetar, com uma temperatura de hibridao mais alta foi desenhado (Exon24-F). Os
primers utilizados para a amplificao alelo-especfica esto apresentados na Tabela II.4.
Tabela II.4. Primers usados para a amplificao alelo-especfica
Nome

Seqencia do primer

13wt-R
13del-R
7wt-R
7del-R
I439-C
I439-A
I350-C
I350-G
Exon24-F

CTT TCA CCT GGG TGA CTG TAG


CTT TTC AGC TTT CAC CTG TAG G
CCT TCC CAG GGG GTG CT
TGC CTT CCC AGG GGG TAG
GAC CTC CAA GGG CAG AGG
GAC CTC CAA GGG CAG AGT
AGG TGC TAA GGC CCC GG
AGG TGC TAA GGC CCC GC
TGA CCC CAG CAC TTA GGA TT

Primer
complementar

Tamanho

TCOF11-F

57C

856 pb

Int6-F

54C

995 pb

TCOF24-F

54C

595 pb

Exon24-F

59C

523 pb

I350-C/I350-G

59C

523 pb

20

Captulo II

O sucesso da amplificao por PCR foi verificado atravs da eletroforese em gel de


agarose 1,5%, corado com brometo de etdeo (0,5g/ml) e visualizado sob luz ultra-violeta,
conforme ilustrado na Figura II.1.

Figura II.1. Exemplo de uma eletroforese em gel de agarose 1,5%

II.4 Triagem de Mutaes


A triagem de mutaes no gene TCOF1 foi realizada atravs da tcnica de
polimorfismo conformacional de fita simples, ou simplesmente SSCP (Single Strand
Conformation Polymorphism, Orita et al., 1989). Esse mtodo se baseia na diferente
velocidade de migrao de fragmentos amplificados por PCR em gel no desnaturante. O
SSCP foi realizado em trs condies distintas: a) eletroforese vertical em gel MDE Gel
Solution (BioWhittaker Molecular Applications) com adio de 2,5% glicerol (8w, 12-14
horas); b) eletroforese vertical em gel de acrilamida 5% com adio de 10% de glicerol (12w,
5-6 horas); c) eletroforese horizontal no sistema eletrofortico PhastSystem (Pharmacia),
com o gel PhastGel, do mesmo fabricante (300-360 avh). Os produtos de PCR foram
acrescidos de SSCP loading buffer (formamida 95%, EDTA 0,02M, xilenocianol 0,5%,
bromofenol blue 0,5%) na proporo 1:1, sendo que 5l da mistura foram utilizados para
eletroforese vertical e 1l para eletroforese no sistema PhastSystem. Em todos os casos, os
produtos foram visualizados atravs da colorao com nitrato de prata descrita por Bassam et
al. (1991). Os gis verticais, aps corados, foram fotografados em filme Typopaque TR-DO
18 (Typon). A Tabela II.5 sumariza qual a condio de SSCP utilizada na anlise de cada
exon do gene TCOF1. A Figura II.2 ilustra o padro de migrao de bandas em cada uma das
trs condies de SSCP.
Tabela II.5. Condies de SSCP para os 27 amplicons do gene TCOF1
Condio de anlise
PhastSystem
Acrilamida 5%
MDE

Exons
1, 2*, 21
5, 9, 10*, 11, 22
3, 2*, 4, 6, 7, 8, 10*, 12, 13, 14, 15, 16,
17, 18, 19, 20, 23a, 23b, 23c, 24, 25

* os exons 2 e 10 so triados em duas condies de SSCP

21

Captulo II

Figura II.2. Exemplos de SSCP: a) gel MDE; b) gel PhastGel; c) gel de acrilamida 5%

II.5. Seqenciamento
Os produtos de PCR foram purificados com os kits Wizard PCR Preps (Promega) ou
QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), segundo protocolos dos fabricantes. Para os
produtos que apresentaram mais de uma banda no gel de agarose (inespecificidade), a
purificao teve mais um passo: a eletroforese em gel de agarose LMP (low melting point)
2%, seguida de exciso da banda de interesse e purificao utilizando um dos kits
mencionados acima.
Depois de purificados os produtos de PCR, o seqenciamento foi realizado em ambas
as direes com o kit BigDye Terminator Cycle Sequencing (Applied Biosystems), nas
seguintes condies: 30-100ng de produto de PCR purificado, 2l de BigDye Mix, 1,6pmol de
primer e gua para completar o volume de reao para 10l. A mistura foi amplificada em 25
ciclos de 10 segundos a 95C, 5 segundos a 50C e 4 minutos a 60C. Os produtos foram
ento analisados em um seqenciador ABI Prism 377 (Applied Biosystems). A Figura II.3
apresenta um eletroferograma do seqenciamento, gerado pelo software Sequencing Analysis
3.4.1. (Applied Biosystems). Os eletroferogramas obtidos atravs do seqenciamento foram
examinados manualmente e comparados com a seqncia do gene TCOF1 publicada por
Dixon et al. (1997) (acesso GeneBank: U40847).

Figura II.3. Trecho do eletroferograma de um segmento analisado no ABI Prism 377

22

Captulo II

II.6. Microssatlites
Marcadores polimrficos tipo microssatlite foram utilizados para a confirmao da
paternidade e construo de haptipos. Na Tabela II.6 esto relacionados os marcadores
empregados para confirmao de paternidade. Os marcadores selecionados para esse fim so
tetranucleotdeos com alta taxa de heterozigozidade. A PCR foi realizada conforme descrito
no item II.3, seguida de eletroforese vertical em gel de acrilamida desnaturante (acrilamida
6,5%, uria 40%) a 90w por 1-2 horas. As bandas foram visualizadas atravs da colorao
com nitrato de prata (Bassam et al., 1991).
Tabela II.6. Marcadores empregados na confirmao da paternidade
Marcador Localizao
Tipo
D3S1754
3q27
tetranucleotdeo
D5S820
5q33.3
tetranucleotdeo
D6S477
6p25.3
tetranucleotdeo
D7S821
7q22.1
tetranucleotdeo
D12S391
12p13.2
tetranucleotdeo

Temperatura
58C
58C
58C
58C
58C

Tamanho
~187 pb
190-218 pb
~239 pb
238-270 pb
225-233 pb

Os marcadores utilizados na construo de hapltipos para o cromossomo 5,


flanqueando o gene TCOF1, esto dispostos na Tabela II.7. Para esses marcadores, a reao
de PCR foi feita com deoxicitosina (dCTP) marcada com fsforo radioativo (P32). Os
produtos foram submetidos eletroforese vertical em gel de acrilamida desnaturante
(acrilamida 6,5%, uria 40%) a 90w por 1-2 horas e visualizados atravs de auto-radiografia
usando filmes X-Omat (Kodak), por 2-24 horas.
Tabela II.7. Marcadores empregados na composio de hapltipos do cromossomo 5
Marcador Localizao
D5S816
5q31.1
D5S210
5q31.3
D5S434
5q32
D5S413
5q32
D5S376
5q32
5q33.1
TCOF1
D5S209
5q33.1
D5S820
5q33.3
D5S527
5q34
D5S422
5q34

LDB (Kb)
142.743
152.609
155.051
156.380
156.608
161.371
163.242
166.497
173.010
174.370

NCBI (Kb)
Tipo
136.395
tetranucleotdeo
159.130
dinucleotdeo
151.800
dinucleotdeo
152.799
dinucleotdeo
no disponvel
dinucleotdeo
155.346
no disponvel
dinucleotdeo
161.197
tetranucleotdeo
172.797
dinucleotdeo
164.059
dinucleotdeo

Temperatura
58C
55C
55C
55C
56C
55C
58C
56C
55C

Tamanho
225-253 pb
212-232 pb
246-258 pb
264-276 pb
117-129 pb
196-214 pb
190-218 pb
143-169 pb
114-134 pb

A localizao dos marcadores em relao ao gene TCOF1 (mapa fsico) foi obtida
atravs da consulta s pginas LDB The Genetic Location Database (http://cedar.genetics.
soton.ac.uk/public_html/ldb.html) e NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/Entrez/
map_search), pela Internet. Existe discordncia quanto ordem de certos marcadores e sua

23

Captulo II

distncia em relao ao gene TCOF1 entre os dois bancos de dados, como pode ser observado
pela localizao ao longo do cromossomo 5 (em quilobases) apresentada na Tabela II.7.
Optamos por seguir a ordem fornecida pelo LDB, pois alguns dos marcadores utilizados no
constavam do mapa fsico do NCBI. A localizao citogentica de cada marcador tambm foi
obtida na pgina do LDB. A Figura II.4 apresenta exemplos da anlise de microssatlites
corados com prata ou marcados com P32.
a

Figura II.4. Anlise de microssatlites. a) Marcador D5S820, colorao por nitrato de prata;
b) Marcadores D5S376 e D5S434, PCR com istopo radioativo (P32) e auto-radiografia

Por fim, marcadores especficos para os cromossomos X e Y foram utilizados para a


confirmar o sexo dos pais dos pacientes e assegurar que no houve troca de amostras paterna
e materna. As caractersticas de ambos marcadores esto descritas na Tabela II.8. A PCR foi
feita independentemente para cada marcador, segundo descrito no item II.3, e os produtos
amplificados de uma mesma pessoa combinados para aplicao em gel de agarose 1,5%.
Desse modo, enxergamos duas bandas (uma correspondente amplificao do cromossomo Y
e outra do cromossomo X) para os homens e apenas uma para as mulheres, conforme
ilustrado na Figura II.5.
Tabela II.8. Marcadores utilizados para confirmao do sexo
Marcador

Nome
alternativo

DXZ1

sWXD125

DYZ1

DYF17251

Seqncia

Temperatura

Tamanho

55C

500 pb

58C

124 pb

ATA ATT TCC CAT ACC TAA ACA CA


TGT GAA GAT AAA GGA AAA GGC TT
TGG GCT GGA ATG GAA AGG AAT CGA AAC
TCC ATT CGA TTC CAT TTT TTT CGA GAA

Figura II.5. Determinao do sexo parental com


marcadores especficos para os cromossomos X e Y

24

Captulo II

II.7. Clonagem
Para a clonagem, empregamos o TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen). O vetor TOPO
apresenta genes de resistncia ampicilina e canamicina e um gene de fuso LacZ-ccdB, cuja
expresso, regulada pelo promotor do LacZ, letal. O vetor fornecido na forma linear, e o
stio de clonagem interrompe o gene de fuso LacZ-ccdB (Figura II.6). A seleo de bactrias
que contm o inserto de interesse feita atravs da seleo por meio de antibiticos
(ampicilina ou canamicina), e o gene letal ccdB, quando expresso, vai impedir a proliferao
de colnias que tenham sido transformadas pelo vetor sem a presena do inserto.
Para a clonagem, foram utilizados de 1 a 4l de produto de PCR, 1l de soluo salina
(50mM NaCl, 2.5mM MgCl2), 1l do vetor TOPO e gua para completar o volume de reao
para 6l. A ligao do inserto com o vetor foi realizada temperatura ambiente (repouso por
5 a 10 minutos). Em seguida, 2l da reao de clonagem foram acrescentados a 50l de
bactrias E. coli eletrocompetentes (TOP10, Invitrogen). A transformao das bactrias foi
realizada em um eletroporador Gene Pulser II (BioRad), utilizando cubetas de 0,1cm3
(parmetros: 1,5kV, 25F, 200).

Figura II.6. Vetor TOPO (Invitrogen), destacando o stio de clonagem, a


localizao dos primers M13 e os principais stios de restrio

25

Captulo II

Depois de transformadas, as bactrias foram incubadas em 350l de meio SOC


(0,5% extrato de levedura, 2% triptona, 10mM NaCl, 2,5mM KCl, 10mM MgCl2, 10mM
MgSO4, 20mM glicose), sob agitao a 37C por uma hora. Aps a incubao, 30 a 60l do
meio SOC foram espalhados sobre uma placa contendo meio LB slido (extrato de levedura
0,5%, triptona 1%, NaCl 0,5%, glicose 0,1%, agarose 0,75%) com ampicilina (100g/ml) e
deixado novamente em incubao a 37C por 12 a 16 horas. As colnias resultantes foram
testadas para a presena do inserto atravs de PCR com o par de primers M13 (Invitrogen)
fornecidos com o kit e anlise em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etdeo
(0,5g/ml). A reao de seqenciamento foi feita diretamente a partir da PCR das colnias
que contivessem o inserto de interesse, conforme descrito no item II.5.

26