A. TUJUAN
1. Mempelajari cara mencari dan mendapatkan data dari gene bank
2. Menganalisa data sekuens menggunakan program BLAST
3. Mempelajari cara dan mendapatkan desain primer dari genbank
B. DASAR TEORI
1. Searching dan Browsing Data Base
NCBI (National Centre for Biotechnology Information) merupakan suatu institusi yang
konsen sebagai sumber informasi perkembangan biologi molekuler. NCBI membuat
database yang dapat diakses oleh publik, merangsang riset biologi terkomputasi,
mengembangkan software penganalisis data genome, dan menyebarkan informasi
biomedical yang kesemuanya diharapkan mengarah pada pemahaman yang lebih baik
tentang proses-proses molekuler yang mempengaruhi manusia dan kesehatannya.
Situs akses NCBI : www.ncbi.nlm.nih.gov.
Salah satu tools yang tersedia dalam situs NCBI ini adalah BLAST.
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan suatu alat pencari yang dapat
menyesuaikan dan mencari sekuen yang mirip dengan sekuen meragukan yang kita miliki
melalui perbandingan sekuen melalui GenBank DNA database dalam waktu singkat.
Ada 5 program utama dalam BLAST, yaitu :
1. nucleotide blast (blastn) : membandingkan suatu sekuen nukleotida yang kita miliki
dengan database sekuen nukleotida
2. protein blast (blastp) : membandingkan suatu sekuen asam amino yang kita miliki
dengan database sekuen protein
3. blastx : membandingkan produk translasi konsep 6-frame sebuah sekuen nukleotida
(translated nucleotide) yang kita miliki dengan database sekuen protein
4. tblastn : membandingkan suatu sekuen protein yang kita miliki dengan database
sekuen nukleotida yang secara dinamis ditranslasi pada semua pembacaan 6 frame.
5. tblastx : membandingkan suatu translasi 6 frame dari nukleotida.
Blastn
Blastn dapat digunakan untuk mengidentifikasi suatu sekuen nukleotida meragukan
(query sequence) yang kita miliki dengan database nukleotida, sehingga output yang
didapat berupa identitas nukleotida tersebut, antara lain nama gen dan spesies penghasil
dari sekuen lengkapnya.
Blastp
Blastp dapat digunakan untuk mencari protein homolog dari protein yang kita miliki.
2. Analisis Alligment
Sekuen yang diperoleh dari hasil penelitian di laboratorium dapat dianalisis dengan data serupa
yang telah dipublikasikan sebelumnya di gen bank. Salah satu bentuk analisis yang dapat
dilakukan misalnya adalah anlisis penyejajaran. Analisis penyejajran dapat digunakan untuk
membandingkan dua sekuen atau lebih. Program yang digunakan untuk analisis penyejajaran
yaitu program BLAST (Basic Local Allignment Search Tools). Program ini dapat diakses melalui
website National Center for Biotechnology Information at The National Library of Medicine in
Washington, DC (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
3. Desain Primer PCR (Polimerase Chain Reaction)
PCR melibatkan tiga langkah berikut: denaturasi, annealing dan ekstensi. Pertama, materi genetik
(DNA) didenaturasi, mengubah untai ganda molekul DNA menjadi untai tunggal. Kedua, Primer
kemudian mengikat ke DNA komplementer nya (annealing). ketiga, DNA akan
digandakan/diperpanjang oleh DNA polimerase. Semua langkah ini sangat tergantung dengan
suhu/ suhu sensitif yang pada umumnya terjadi berkisar pada suhu 94 o C (denaturasi), 60o C
(analling) dan 72o C (elongasi). Desain primer yang baik sangat penting untuk keberhasilan reaksi
PCR.
D. CARA KERJA
1. Searching dan Browsing Data Base
Mengetik http://www.ncbi.nlm.nih.gov pada location bar pencarian
Memilih preferensi pencarian yang digunakan (pada contoh ini dipilih nucleotide) dan ketikkan juga
molekul yang ingin dicari sebagai kata kunci pencarian (pada contoh ini diketikkan IGF1R) dan
diketik GO.
Muncul berbagai pilihan sekuens yang berkaitan dengan IGF1R dan dipilih (dengan cara mengklik kode)
sekuens sesuai kebutuhan. Sekuens dengan kode awal NM menunjukkan sekuens nukleotida sedangkan
NP menunjukkan sekuens protein. Pada contoh ini dipilih kode NM_000875 dari Homo sapiens.
Kursor di scroll ke bawah sampai diperoleh sekuens protein IGF1R. Sekuens yang dibutuhkan untuk
program BLAST adalah CDS, oleh sebab itu sekuens pada CDS dicopy.
Cara lain dalam searching dan browsing data dari Gen Bank
Memilih preferensi pencarian yang digunakan (pada contoh ini dipilih nucleotide) dan ketikkan juga
molekul yang ingin dicari sebagai kata kunci pencarian (pada contoh ini diketikkan INS) dan
diketik GO
Muncul berbagai pilihan sekuens yang berkaitan dengan INS dan dipilih (dengan cara
mengklik kode) sekuens sesuai kebutuhan. Sekuens dengan kode awal NM menunjukkan
sekuens nukleotida sedangkan NP menunjukkan sekuens protein.
Berdasarkan pulihan tersebut maka akan diperoleh tampilan sebagai berikut
Pada tampilan tersebut discroll ke bawah. Terdapat beberapa kode yaitu NM dan NP. NM menunjukkan
kode untuk memperoleh informasi mengenai nukleotida, sedangkan NP menunjukkan kode untuk
memperoleh informasi mengenai protein.
Mengklik link FASTA untuk memperoleh sekuen nukleotida dari INS dalam bentuk FASTA
Pada tampilan tersebut, terdapat beberapa pilihan penyejajaran, antara lain program BLAST untuk
nukleotida dan untuk protein
Mengklik kolom Allign two or more sequences untuk membandingkan 2 sekuen nukleotida.
Kemudian dimasukkan sekuen yang ingin dibandingkan pada kolom yang telah tersedia. Sekuen
yang dimasukkan harus dalam format FASTA.
Setelah sekuen dimasukkan diklik tanda BLAST pada bagian bawah
Pada tampilan tersebut terdapat suatu skala yang menunjukkan tingkat kesamaan sekuaen yang
dibandingkan. Berdasarkan hasil tampilan tersebut terdapat suatu garis berwarna merah, hal ini
menunjukkan bahwa kedua sekuen tersebut memiliki urutan yang sangat mirip yaitu lebih dari 200
nukleotida
genbank (misal INS), untuk mempeoleh desain primer dari sekuen nukleotida tersebut dapat
dilakukan dengan memilih Analyze This Sequence>Pick primer
Hasil dari pemilihan tersebut adalah halaman untuk mengisikan karakter-karakter primer yang
diharapkan, kemudian pada bagian akhir diklik GET PRIMER.
Tampilan yang diperoleh adalah beberapa alternatif desain primer sebagai berikut.
NCBI merupakan server yang memuat database tentang informasi kesehatan dan bioteknologi.
Data base terus menerus di update sesuai dengan penemuan-penemuan terkini yang menyangkut
DNA, protein, senyawa aktif dan taksonomi. Disamping data base, NCBI juga menyediakan
berbagai macam software untuk analisis DNA, protein 3D, pencarian primer, pencarian converse
domain dan lain sebagainya. NCBI merupakan salah satu BANK DATA GEN, protein dan
literature khususnya dibidang kesehatan yang terlengkap dan di acu oleh para peneliti dunia.
NCBI memiliki database dan software (analysis tools), yang sering digunakan untuk analisis.
Dari 10 primery yang didapat, dipilih 3 primery yang mempunyai nilai self compementarity
paling kecil. Primery tersebut dicari dengan cara memasukkan kode atau nama ilmiah dari hewan
yang akan diteliti. Pada praktikum kali ini kelompok 3 menngunakan hewan kalkun atau turkey
dengan kode 9103.
Berikut table kode beberapa hewan :
Table diatas berisi kode genetic dari macam-macam organism yang akan digunakan sebagai
pembanding.
Primer yang digunakan yaitu primer 2, primer 7, dan primer 8. Ketiga primer tersebut akan
dibandingkan lagi dengan 5 macam hewan, yaitu : sapi (bos Taurus), ayam (chicken), kuda (equus
callus), domba (ovis aries), dan kambing (capra aegagrus).
Dalam praktikum ini, pertama memasukkan kode kalkun atau turkey kedalam kolom organism.
Seperti berikut :
Kemudian klik tombol get primers dibagian pojok kiri bawah, yang kemudian akan dihasilkan 10
primers sebagai berikut.
Primer adalah molekul oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas sekitar 30 basa.
Primer berfungsi sebagai penginisiasi reaksi polimerisasi DNA secara in vitro karena tanpa
primer. Reaksi polimerisasi DNA tidak akan terjadi meskipun enzim dankomponen lainnya
sudah tersedia. Selain itu, primer juga berfungsi untuk membatasi daerah mana yang akan
diamplifikasi pada reaksi PCR (Sari, 2007). Primer spesifik untuk mengamplifikasi suatu
fragmen DNA dirancang berdasarkan informasiurutan nukleotida dari gen yang sama yang dapat
diakses menggunakan program Primer3 yang dapat diakses secara online
(http://www.biotools.umassmed.edu/),dengan memperhatikan beberapa parameter seperti ukuran
dan posisi fragmen DNA target, titik leleh (Tm), komplementasi pada ujung 3 dan lain
sebaginya (Budiani dan Purba, 2010).
Fungsi primer sebagai inisiator sekaligus pembatas daerah yang akan diamplifikasi, maka
idealnya primer memiliki urutan basa nukleotida yang tepat berpasangan dengan urutan basa
DNA target yang akan diamplifikasi dan tidak menempel di bagian lainnya. Oleh sebab itu,
primer dirancang (perancangan primer) untuk menentukan keseimbangan antara spesifisitas dan
efisiensi. Spesifisitas didefiniskan sebagai frekuensi terjadinya mispriming (kesalahan
penempelan) primer pada tempat yang tidak seharusnya. Primer dengan spesifisitas buruk akan
terlihat dari banyaknya pita-pita yang tidak diinginkan saat produk PCR divisualisasi
denganelektroforesis gel, sedangkan efisiensi adalah seberapa dekat perolehan jumlah
produk PCR dengan nilai teoritis yang seharusnya dicapai (ingat bahwa setelah n siklus
PCR maka akan dihasilkan 2n kopi produk). Menurut Prasetyo (2009), proses perancangan
primer dapat dilakukan dengancara manual maupun menggunakan software. Perancangan primer
PCR secara manual berbekal beberapa aturan dasar. Kelebihan dari desain primer secara manual
adalahkita dapat mendesain primer PCR yang efektif dengan karakteristik yang mungkin"tidak
diijinkan" oleh program yang ada. Perancangan primer dengan menggunakan Software yaitu
MEDUSA, Primer3, PrimerQuest, dan lain-lain. Penggunaan program semacam ini sangat
disarankan untuk mendesain protokol PCR baru.
Aturan dasar tersebut adalah sebagai berikut (Budiani dan Purba, 2010):
Panjang primer sebaiknya antara 18-30 nukleotida (kecuali untuk tujuan tertentu).
Sekuens dalam primer sebaiknya tidak mengandung daerah komplementariinternal.
Sebaiknya dalam sepasang primer tidak ada daerah yang saling berkomplementari.
Dalam primer tidak ada struktur sekunder.
Memiliki kandungan GC (guanosine dan cytosine) 50%. Hindari ketidakseimbangan distribusi
daerah kaya G/C dan A/T.
Untuk PCR diagnostik pilih primer PCR yang mengamplifikasi daerah yang stabil secara
genetik.
Perbedaan suhu anealing dalam suatu pasangan primer jangan lebih dari 50.
Dari kesepulu primer yang didapat dipakai 3 primer, yaitu primer 2, primer 7, dan primer 8.
1. Primer 2
Kemudian forward primer dan reverse primer dimasukkan dalam kolom yang ada dalam primer
Kamudian klik icon blast dan akan dihasilkan data seperti berikut :
Kemudian hasil primer tersebut akan dibandingkan dengan lima macam organism atau hewan
yang berbeda.
Ulangi langkah diatas dengan mengganti bagian data base nya, berikut adalah contohnya :
Kemudian dari masing-masing primer akan dibandingkan dengan 5 macam hewan yang
berbeda. Berikut perbandingan primer 2 dengan kelima hewan tersebut :
a. Sapi (bos taurus)
Data tersebut menyebutkan bahwa kalkun atau turkey primersnya tidak spesifik, yang artinya
RNA dari sapi (bos Taurus) bisa menempel pada RNA kalkun atau turkey begitupun sabaliknya.
b. Ayam (chicken)
Dari data tersebut menyatakan bahwa primer antara ayam atau chicken dengan kalkun atau
turkey spesifik, itu berarti RNA dari ayam dapat menempel pada RNA kalkun begitupun
sebaliknya.
c. Kuda (equus caballus)
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun spesifik dengan primer dari kuda.
Itu artinya bahwa RNA dari kalkun tidak bisa menempel pada RNA kuda, begitupun sebaliknya.
d. Domba (ovis aries)
Dari data diatas dapat diketahui bahwa primer dari kalkun spesifik dengan primer dari domba.
Itu berarti bahwa RNA dari kalkun tidak bisa menempel dengan RNA dari domba, begitupun
sebaliknya.
e. Kambing (capra aegagrus)
Hasil blast dari primer kalkun dengan kambing tidak dapat di analisis karena organism capra
aegagrus tidak ada dalam database. Hal ini bisa terjadi mungkin karena kurang ketelitian
dari praktikan dalam penulisan nama latin dari organism atau database dari organism
tersebut memang tidak tersedia.
2. Primer 7
Kemudian forward primer dan reverse primer dimasukkan dalam kolom yang ada dalam primer
BLAST. Primer yang didapat akan dibandingkan dengan lima macam hewan atau organism.
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer
dari sapi. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA sapi
begitupun sebaliknya.
b. Ayam (chicken)
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
ayam. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari ayam.
Dari data diatas dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
kuda. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari kuda.
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
domba. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari domba
begitupun sebaliknya.
Hasil blast dari primer kalkun dengan kambing tidak dapat di analisis karena organism capra
aegagrus tidak ada dalam database. Hal ini bisa terjadi mungkin karena kurang ketelitian
dari praktikan dalam penulisan nama latin dari organism atau database dari organism
tersebut memang tidak tersedia.
3. Primer 8
Kemudian forward primer dan reverse primer dimasukkan dalam kolom yang ada dalam primer
BLAST, seperti berikut :
Kemudian primer yang didapatkan akan dibandingkan dengan lima macam organism atau
hewan yang berbeda.
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
sapi. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari sapi begitupun
sebaliknya.
b. Ayam (chicken)
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
ayam. Artinya, RNA dari ayam kemungkinan dapat menempel pada RNA dari ayam begitupun
sebaliknya.
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
kuda. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari kuda begitupun
sebaliknya.
Dari data tersebut dapat diketahui bahwa primer dari kalkun tidak spesifik dengan primer dari
domba. Artinya, RNA dari kalkun kemungkinan dapat menempel pada RNA dari domba
begitupun sebaliknya.
Hasil blast dari primer kalkun dengan kambing tidak dapat di analisis karena organism capra
aegagrus tidak ada dalam database. Hal ini bisa terjadi mungkin karena kurang ketelitian
dari praktikan dalam penulisan nama latin dari organism atau database dari organism
tersebut memang tidak tersedia.
Proses penemuan gen memerlukan adanya pelacak spesifik gen tersebut. Selain itu,
pelacak spesifik juga dapat digunakan dalam mempelajari ekspresi suatu gen yang sesuai.
sekuen pada daerah terkonsevasi ini secara semimanual ataupun dengan program komputer
antara lain GeneRunner. Primer yang disintesis berdasarkan hasil rancangan tersebut digunakan
dalam PCR baik dengan cetakan (template) DNA maupun RNA total organisme sumber atau
target (Santoso, 2008).
F. KESIMPULAN
1. GenBank ini adalah database sekuen genetik, semua sekuen DNA teranotasi dan
tranlasinya yang dipublikasikan di seluruh dunia ada di sini. Data pada GenBank
selalu bertambah setiap saat. GenBank dikelola oleh NIH (National Institute of
Health) pemerintah Amerika, dan merupakan bagian dari Kolaborasi Database
Sekuen Nukleotida Internasional yang terdiri atas DNA DataBank of Japan (DDBJ),
European Molecular Biology Laboratory (EMBL), dan GenBank sendiri di National
Center for Biotechnology Information (NCBI). Ketiga organisasi ini selalu bertukar
data setiap hari agar semua datanya selalu ter-update. Blast-n digunakan untuk
mengetahui jenis organisme yang digunakan sebagai sampel. Hal tersebut dilakukan
dengan mencocokan hasil sekuens yang ada dengan yang ada di BankGen.
Pencocokan sekuens dilakukan dalam keadaan Online (Brown,2002).
2. Program yang dipakai dalam praktikum bioinformatika adalah NCBI, NEBcutter,
primer3 dan IDT oligo analyzer. NCBI atau National Centre for Biotechnology
Information dimulai dengan membuka program untuk browsing dibuka dan kemudian
masuk Google. Pencarian Google dimulai dengan mengetik ncbi blast kemudian
dimulai search. Akan ditemukan hasil pencarian ncbi blast, lalu pilih pada bagian
yang paling atas yaitu BLAST: Basic Local Alignment Search Tool NCBI dan
diklik. Ketika masuk halaman web BLAST- NCBI, pada bagian Basic BLAST
dipilih program nucleotide blast. Setelah masuk pada halaman nucleotide blast
terdapat kolom tempat meletakkan sekuens yang akan diblast. Sekuens di Copy yang
terdapat pada Notepad hasil alignment. Dilakukan pengaturan beberapa hal, seperti
pada set Database pilih Others (or etc.) setelah itu pastikan setting -an Other
Databases pada Nucleotidecollection (nr/nt). BLAST diklik pada bagian bawah untuk
mulai melakukan blast. Selanjutnya akan terlihat halaman hasil blast berupa Graphic
Summary yang menjelaskan nilai dari hasil alignment sekuens, Descriptions yang
menunjukan produk-produk yang terdapat pada GenBank dari hasil sekuens dan
Alignments yang menampilkan urutan dari setiap pasangan basa pada sekuens.
Bagian Descriptions terdapat banyak pilihan yang memiliki urutan sekuens yang
hampir sama. Salah satu yang memiliki nilai persentasi kesamaan yang tinggi
(biasanya paling atas 90% - 100%) dipilih, maka akan terlihat urutan sekuens
yangdimasukan dengan sekuens dari gen bank.
G. DAFTAR PUSTAKA
- Introduction to NCBI, http://cnx.org/content/m10995/latest/
- NCBI, http://en.wikipedia.org/wiki/National_center_for_Biotechnology_Information
- http://arfinwijayacyber.wordpress.com/2011/11/13/apa-itu-ncbi/