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Copyright 2008 Livraria Varela, Revista Higiene Alimentar

Esta edio foi publicada com autorizao de


Nlio Jos Andrade
Todos os direitos reservados
capa, diagramao, ilustraes e projeto grfico:
www.std1.com.br
Ficha catalogrfica preparada pela Bibliotecria Tereza Cristina Cardozo da Silva CRB-3 / 260

A553h
2008

Andrade, Nlio Jos de, 1952


Higiene na indstria de alimentos: avaliao e controle da adeso e
formao de biofilmes bacterianos / Nlio Jos de Andrade.
-- So Paulo: Varela, 2008.
412p. : il.
Inclui bibliografia
1. Alimentos - Indstria - Aspectos sanitrios. 2. Alimentos - Microbiologia. 3. Bactrias - Adeso. 4. Biofilmes. 5. gua - qualidade. 6.
gua - tratamento. I. Ttulo.

CDD 22. ed. 664.07

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r

Ag

minha esposa Maria Eliza e s minhas filhas Priscila e


Patrcia, pelo apoio irrestrito.

Aos amigos que a vida me proporcionou: Renato Cruz, Frederico Siqueira, Cludio Furtado, Carlos Roberto, Bencio Chaves, Jlio Maria e Antnio Carlos, pela fraternal convivncia.

s professoras e amigas Maria Elilce Lima Martyn, Magdala


Alencar Teixeira e Nilda de Ftima Ferreira Soares, que sempre
acreditaram em mim como profissional.

Aos professores do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viosa, pelo convvio.

A Edmund A. Zottola, professor emrito da Universidade


de Minnesota, EUA, pelos ensinamentos.

Apresentao

Apresentao
A ocorrncia de processos de adeso microbiana e formao de biofilmes no
ambiente de processamento de alimentos tem de ser entendida, avaliada e controlada pelos responsveis pela produo de alimentos com qualidades sensorial, nutricional e microbiolgica, de forma a atender s expectativas dos consumidores.
Constatando a escassez de informaes sobre o tema em publicaes nacionais, os idealizadores do livro Higiene na Indstria de Alimentos Avaliao e Controle de Adeso e Formao de Biofilmes Bacterianos procuraram mesclar conhecimentos tericos com resultados de pesquisas na rea de Higiene Industrial. Esses
estudos envolveram, nos ltimos anos, mais de uma dezena de pesquisadores, doutorandos, mestrandos e estudantes de iniciao cientfica, no mbito do Programa
de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos, da Universidade Federal
de Viosa, em Viosa, Minas Gerais.
O livro divide-se em duas partes. Na primeira so abordados, em trs captulos,
os mecanismos, as tcnicas microscpicas e testes usados para avaliar a adeso e
a formao de biofilmes. Na segunda parte, em sete captulos so fornecidos conhecimentos tericos e resultados de pesquisa para controle dessas ocorrncias
indesejveis. Nessa parte do livro, enfocada a relao ambiente de processamento
de alimentos e processos de adeso bacteriana e formao de biofilmes, com informaes essenciais sobre a qualidade e tratamento da gua, o uso de detergentes e
sanitizantes, o controle microbiolgico de processos e metodologias convencionais
para avaliar e controlar a qualidade microbiolgica do ar e de equipamentos, utenslios e manipuladores.
Os autores esperam que esta publicao possa contribuir para que a indstria
de alimentos brasileira, por meio dos profissionais que nela atuam, esteja mais preparada e mais competitiva neste mercado cada vez mais globalizado e exigente.
Professor Nlio Jos de Andrade
Viosa, Minas Gerais, 2008.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Autor/Pesquisador Principal
Nlio Jos de Andrade, Engenheiro-Agrnomo e Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG e Doutor em Tecnologia de Alimentos pela UNICAMPSP. Professor Titular do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UFV-MG

Co-Autores/Pesquisadores/Colaboradores
Aurlia Dornelas de Oliveira Martins, Bacharela em Cincia e Tecnologia de
Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Cludia Alencar Vanetti, Engenheira-Agrnoma, Mestra e Doutora em Fitopatologia pela UFV-MG.

Cludia Lcia de Oliveira Pinto, Bioqumico-Farmacutica pela UFJF-MG e Mestra


e Doutora em Microbiologia Agrcola pela UFV-MG. Pesquisadora da EPAMIG-MG.

Cleuber Antnio de S Silva, Bioqumico-Farmacutico pela UFJF-MG e Mestre


e Doutor em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Eduardo Alves, Mestre em Agronomia (Fitopatologia), UFLA-MG, Doutor em




Agronomia (Fitopatologia), USP-SP e Professor Adjunto da UFLA-MG.

Ernny Marcelo Simm, Engenheiro de Alimentos e Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Gino Ceotto, Doutor em Fsica pela Unicamp e Professor Adjunto da UFV-MG.

Hamilton Mendes Figueiredo, Engenheiro-Agrnomo pela UFRA-PA e Mestre e Doutor em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG. Professor Adjunto da UFPA-PA.

logia de Alimentos pela UFV-MG.

Kelly Cristina Silva Brabes, Zootecnista e Mestra em Cincia de Alimentos pela

Apresentao

Jnia Cpua de Lima, Engenheira de Alimentos e Mestra em Cincia e Tecno-

UFLA-MG e Doutora em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Marclia Santos Rosado, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios


pela UFV-MG.

Maria Aparecida Antunes, Nutricionista pela UFV-MG e Mestra em Cincia e


Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Maria do Socorro Rocha Bastos, Engenheira de Alimentos pela UFC-CE e Mestra e Doutora em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG. Pesquisadora da
EMBRAPA, Frutas Tropicais, Fortaleza-CE.

Patrcia Campos Bernardes, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios


pela UFV-MG.


Patrcia Dolabela Costa, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Roberta Torres Careli, Bacharela em Cincia e Tecnologia de Laticnios e Mestra em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Valria Costa Salustiano, Nutricionista pela UFG-GO e Mestra e Doutora em


Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV-MG.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O livro Higiene na Indstria de Alimentos Avaliao e controle da adeso


e formao de biofilmes bacterianos um aprofundamento de temas abordados
no livro Higienizao na Indstria de Alimentos, publicado pelo mesmo autor, em
1996, pela Editora Varela.
Na obra atual, o Professor Nlio compartilha com os interressados em higiene
e microbiologia de alimentos sua experincia adquirida nos ltimos 30 anos como
professor, pesquisador e orientador de estudantes de iniciao cientfica, mestrado
e doutorado do Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos
da Universidade Federal de Viosa, em Viosa, MG. O livro fiel viso dos autores
sobre os temas abordados e ser de grande valia aos profissionais responsveis

pela produo de alimentos seguros, sob os aspectos fsicos, qumicos, microbiolgicos, sensoriais e nutritivos, com enfoque principal no ambiente de processamento
de alimentos e na sua relao com processos de adeso microbiana e formao de
biofilmes.

Apresentao

Nlio Jos de Andrade Professor Titular da rea


de Higiene e Microbiologia de Alimentos da Universidade Federal de Viosa, em Viosa, Minas Gerais.
Engenheiro Agrnomo e Mestre em Cincia e Tecnologia de Alimentos pela UFV e Doutor em Tecnologia
de Alimentos pela Universidade Estadual de Campinas,
So Paulo. Foi Professor Visitante da Universidade de
Minnesota, nos Estados Unidos da Amrica. H mais de 20 anos pesquisador do
CNPq, sendo, atualmente, classificado no nvel 1C. professor permanente do corpo docente do Programa de Ps-graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos
da UFV (PPGCTA/UFV), onde orienta ou co-orienta estudantes de Iniciao Cientfica, Mestrado e Doutorado. Participou em grande nmero de bancas de exame de
qualificao e defesa de dissertao e de teses. Desde 1977, ministra aulas para
estudantes de graduao dos cursos de Engenharia de Alimentos e Cincia e Tecnologia de Laticnios e para estudantes do PPGCTA/UFV. Profere palestras em eventos
tcnicos, simpsios e congressos, apresenta resumos em eventos cientficos e j
publicou um livro e inmeros artigos em peridicos nacionais e internacionais.

Sumrio
Captulo 01
Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

15

1. Microrganismos Envolvidos nos Processos de Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos


2. Superfcies Envolvidas em Processos de Adeso Microbiana

18
28

2.1. Ao Inoxidvel 

29

2.2. Polmeros 

32

3. Mecanismos da Adeso Bacteriana


4.
Aspectos Termodinmicos do Processo de Adeso Bacteriana
4.1. Teoria Termodinmica da Adeso 

40

4.2. Teoria DLVO

42

4.3 - Teoria DLVO Estendida

5.

37
40

Fatores Associados Adeso Microbiana e Formao de Biofilmes

42

44

5.1 Apndices Celulares

46

5.2. Estrutura e Condies Ambientais do Biofilme 

50

5.3. Hidrofobicidade, Carga Eltrica e Rugosidade das Superfcies 

52

5.4. Formao de Exopolissacardeo

6. Composio dos Biofilmes Microbianos


Referncias

55

59
60

Captulo 02
Tcnicas em Microscopia Usadas no Estudo da Adeso e da Formao de Biofilmes
Microbianos67
1.
Introduo
2. Microscopia ptica de Luz

3.

68
69

2.1. Tipos de Microscopias de Luz e suas Aplicaes

70

2.2. Microscopia Eletrnica

82

Aplicao da Microscopia no Estudo da Adeso e Formao de Biofilmes


3.1. Microscopia de Fora Atmica

99
99

3.2. Uso da Microscopia de Fora Atmica na Avaliao de Adeso de Microrganismos e Anlise de Rugosidade de Superfcies

101

3.3. Adeso Bacteriana em Diferentes Superfcies Avaliada pela Microscopia de Epifluorescncia

111

3.4. Adeso Bacteriana e Formao de Biofilmes Observada pela Microscopia Eletrnica de Varredura

113

3.5. Avaliao de Superfcie de Ao Inoxidvel por MFA

4. Concluso
Referncias

114

114
116

Captulo 03
Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e Formao de Biofilmes
Bacterianos
121
1. Introduo
2. Consideraes Sobre o Sistema Cleaning In Place (CIP)
3. Sistema-Modelo de Circulao de Leite para Estudos de Adeso Bacteriana
3.1. Adeso de Enterococcus faecium a Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Agentes Qumicos 

122
123
126
127

3.2 - Adeso de Clulas Vegetativas e Esporos Bacterianos a Superfcie de Ao Inoxidvel

133

3.3 - Adeso de esporos de Bacillus cereus em Ao Inoxidvel: Efeito do Fluxo e do Tempo de Adeso

147

3.4 - Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans a Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Sanitizantes Qumicos

150

4. Sistema-Modelo para Avaliao de Adeso Bacteriana e Eficincia Bactericida da Radiao Ultravioleta em Polietileno
de Baixa Densidade
158
4.1 - Adeso de Escherichia coli e Staphylococcus aureus a Polietileno e suas Resistncias Radiao Ultravioleta
4.2 - Adeso de Bacillus sporothermodurans ao Polietileno e sua Resistncia Radiao Ultravioleta

5. Concluso 
Referncias

161
174

178
179

Captulo 04
Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

181

1. Introduo
2. Fundamentos Bsicos da Higienizao

182
183

2.1. Superfcies Usadas no Processamento de Alimentos

184

2.2. Qualidade da Matria-Prima e da gua

184

2.3. Caractersticas dos Principais Resduos

188

2.4. Agentes Detergentes e Formulaes

188

2.5. O Passo a Passo do Procedimento de Higienizao

202

2.6. Sanitizantes

204

3. Avaliao da Eficincia do Procedimento de Higienizao

218

3.1. Teste do Swab

220

3.2. Tcnica da Rinsagem

221

3.3. Placas de Contato

221

3.4. Sedimentao de Microrganismos do Ar em Meio Slido

222

3.5. Mtodo da Seringa com Agar

222

3.6. Mtodo da Esponja

223

3.7. Impresso de Microrganismos do Ar em Meio Slido

223

3.8. Tcnica do ATP-Bioluminescncia

224

Referncias

225

Captulo 05
Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

227

1. Introduo
2. Os Fatores do Crescimento Microbiano e o Processamento de Alimentos

228
230

2.1. Fatores do Crescimento Microbiano

230

2.2. Alguns Aspectos do Processamento de Alimentos versus Fatores de Crescimento Microbiano

235

3. Avaliao de Surtos de Doenas de Origem Alimentar

239

3.1. Microrganismos Patognicos

239

3.2. Elucidao de Surtos 

256

Concluso
Referncias

265
266

Captulo 06
Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso Microbiana na Indstria de
Alimentos
1. Introduo
2. Monitoramento da Qualidade da gua

271
272
274

2.1. Caractersticas Sensoriais

276

2.2. Indicadores de Riscos Sade

277

2.3. Indicadores da Formao de Incrustaes

278

2.4. Indicadores de Poluio

282

2.5. Indicadores da Qualidade Microbiolgica

3. Aspectos do Tratamento da gua

282

289

3.1. Potabilizao da gua

289

3.2. Tratamentos Especficos da gua na Indstria de Alimentos

292

Referncias

303

Captulo 07
Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento na Indstria de Alimentos

305
1. Introduo
2. Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar

306
307

2.1. Sedimentao em Placas

308

2.2. Impresso em gar

309

3. Resultados de Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

312

3.1. Em uma Unidade de Alimentao e Nutrio

312

3.2. Em uma Indstria de Processamento de Leite 

315

3.3. Em uma Indstria de Produtos Crneos

324

3.4. Em Microindstria de Processamento de Leite

327

3.5. Em Cmaras Refrigeradas de uma Indstria de Laticnios

328

Referncias

331

Captulo 08
Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas e Equipamentos, Utenslios e
Manipuladores na Indstria de Alimentos.
333
1. Introduo

334

1.1. Mtodo do Swab

335

1.2. Mtodo da Rinsagem

337

1.3. Mtodo da Placa de Contato

337

1.4. Mtodo da Seringa com gar

338

1.5. Mtodo da Esponja

338

2. Resultados de Avaliaes das Condies Microbiolgicas de Equipamentos, Utenslios e Manipuladores

339

2.1. Em Unidades de Alimentao e Nutrio

339

2.2. Em uma Indstria Processadora de Carne

340

2.3. Em Indstria de Laticnios: Staphylococcus spp em Superfcies de Equipamentos e Manipuladores

344

2.4. Em Microindstrias de Processamento de Leite

347

Referncias

356

Captulo 09
A Tcnica de ATP Bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de Adeso
Microbiana na Indstria de Alimentos
359
1. Introduo
2. Uso de ATP-Bioluminescncia para Avaliar a Qualidade da gua
3. Adeso Bacteriana em Superfcies de Ao Inoxidvel Avaliada pela Tcnica de ATP-bioluminescncia
4. Condies Higinicas de Equipamentos para a Produo de Leite Pasteurizado Avaliadas por
ATP-bioluminescncia
5. Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans em Ao Inoxidvel avaliada pela Tcnica do
ATP-bioluminescncia
6. Interferncia de Substncias Orgnicas e de Microrganismos na Medida de ATP-Bioluminescncia

360
366
370
373
375
377

6.1. Interferncia de Substncias Orgnicas No-Aderidas a Superfcies

377

6.2. Interferncia de Substncias e Microrganismos Aderidos ao Ao Inoxidvel AISI 304, n4

383

Concluso
Referncias

385
386

Captulo 10
Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos
1. Introduo

389
390

1.1. Teste da Diluio de Uso

392

1.2. Teste de Suspenso

393

1.3. Teste do Coeficiente Fenlico

395

1.4. Teste de Capacidade

396

1.5 Teste de Ao Esporicida

2. Avaliao da Resistncia de Enterococcus faecium Isolado de Leite Cru aos Agentes Qumicos Sanitizantes
2.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso

3. Eficincia do cido Peractico sobre Esporos de Bacillus sporothermodurans Avaliada pelos Testes
de Diluio de Uso e de Suspenso

397

397
400

400

3.1. Avaliao pelo Teste da Diluio de Uso

401

3.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso

402

3.3. O teste de Suspenso versus o Teste da Diluio de Uso

403

4. Modelagem Matemtica na Relao Tempo e Concentrao de cido Peractico na Ao Esporicida sobre


Bacillus sporothermodurans
5 . Registro de Sanitizantes em rgos Governamentais

403
405

5.1. Informaes para Registro

406

5.2. Informaes para Avaliao dos Princpios Ativos

406

5.3 Rotulagem

407

5.4. Classificao de Riscos dos Sanitizantes

6. Sanitizantes Aprovados no Brasil


7. Concluso
Referncias 

408

409
410
411

de
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A io
C
B

01

1.

Microrganismos Envolvidos nos Processos de Adeso e Formao de Biofilmes


Microbianos

2.

Superfcies Envolvidas em Processos de Adeso Microbiana


2.1. Ao Inoxidvel
2.2. Polmeros

3.

Mecanismos da Adeso Bacteriana

4.

Aspectos Termodinmicos do Processo de Adeso Bacteriana


4.1. Teoria Termodinmica da Adeso
4.2. Teoria DLVO
4.3 - Teoria DLVO Estendida

5.

Fatores Associados Adeso Microbiana e Formao de Biofilmes


5.1 Apndices Celulares
5.2. Estrutura e Condies Ambientais no Biofilme
5.3. Hidrofobicidade, Carga Eltrica, e Rugosidade das Superfcies
5.4. Formao de Exopolissacardeo

6.

Composio dos Biofilmes Microbianos

7.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Cludia Lcia de Oliveira Pinto
Jnia Capua de Lima

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Os microrganismos se depositam, interagem nas superfcies, iniciam o


crescimento e, ao se liberarem, podem contaminar os alimentos.
As superfcies de equipamentos ou utenslios que entram em contato com
os alimentos durante o processo de industrializao no devem contamin-los
ou aumentar a incidncia de microrganismos, sejam alteradores ou patognicos. No entanto, sabe-se que, sob determinadas condies, os microrganismos
depositam-se, aderem, interagem com as superfcies e iniciam o crescimento
celular. Ao se multiplicarem, formam colnias e, quando a massa celular suficiente para que a ela sejam agregados nutrientes, resduos e outros microrganismos, forma-se o que denominado biofilme microbiano (SNYDER, JR., 1992;
SASAHARA; ZOTOLLA, 1993; ZOTOLLA, 1994; ZOTTOLA; SASAHARA,1994;
HOOD; ZOTOLLA, 1995; ARCURI, 2000).
O desenvolvimento de biofilmes microbianos ocorre freqentemente nas
indstrias de alimentos, onde grande quantidade de nutrientes est disponibilizada aos microrganismos, por exemplo quando vlvulas, gaxetas de borracha e
as partes internas de tubulaes de ao inoxidvel so colonizadas por microrganismos (MAFU et al., 1990; ASSANTA et al., 1998; BERESFORD et al., 2001;
LEREBOUR et al., 2004;). Nesses pontos, se no houver boa higienizao, certamente haver condies favorveis ao crescimento microbiano (CZECHOWSKI,
1990; HOLAH et al., 1990; MAFU et al.,1990; CAPENTIER; CERF, 1993; AUSTIN;
BERGERSON, 1995; ALLISON et al., 2000).
A adeso microbiana e a formao de biofilmes ocorrem devido deposio

16

de microrganismos em uma superfcie de contato, onde eles se fixam e iniciam


o crescimento (ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; ZOTOLLA,1997). Os biofilmes so
constitudos de bactrias aderidas s superfcies, que por sua vez so envolvidas
por uma camada de partculas de matria orgnica, formando depsitos, nos
quais os microrganismos esto fortemente aderidos a uma superfcie por meio
de filamentos, de natureza polissacardica ou protica, denominados glicoclix
(CRIADO et al., 1994). Os biofilmes contm, alm de microrganismos, partculas
de protenas, lipdios, fosfolipdios, carboidratos, sais minerais e vitaminas, entre
outros, que formam depsitos onde os microrganismos continuam a crescer,
resultando em um cultivo puro ou uma associao com outros microrganismos.
No biofilme, os microrganismos so mais resistentes ao de agentes qumicos
e fsicos, como aqueles usados no procedimento de higienizao (CZECHOWSKI,
1990; HOLAH; THORPE, 1990; MOSTELLER; BOULANGE-PETERMANN, 1991;
BISHOP, 1993; LECLERCQ; LALANDE, 1994).
A formao de adeso (Figura 1), ou biofilme, pode ser desejvel, em alguns
casos (Tabela 1), a exemplo daqueles existentes em biorreatores utilizados na pro-

agregando-se em fragmentos de madeira, e convertem diversos substratos em vinagre. Esses agregados microbianos so tambm usados em tratamentos aerbios
e anaerbios de guas residurias, para remoo de matria orgnica e inorgnica.
No processo de potabilizao de gua, a remoo de nitrognio, carbono biodegradvel e precursores de tri-halometanos pode ser feita por biofilmes microbianos
submersos (TAKASAKI et al., 1992).
A adeso e formao
de

biofilmes

microbianos

podem ser indesejveis, sob


diversos aspectos, na indstria de alimentos (Tabela 1),

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

duo de alimentos fermentados. As bactrias produtoras de cido actico crescem,

uma vez que eles podem


tornar menos eficiente o processo de clorao da gua
(BEER et al., 1994); reduzir
a eficincia de transferncia
de calor em trocadores de
calor; diminuir o fluxo em
tubulaes;
processos

desencadear
corrosivos;

e,

Figura 1 - Adeso de Escherichia coli 0157:H7 em superfcie de alface.

principalmente, tornar fontes de contaminao microbiana (BEER et al., 1992; ZOTTOLA; SASAHARA, 1994;
BEECH, 2004). Sob o aspecto microbiolgico, a adeso pode constituir-se de mi-

17

crorganismos alteradores e, ou, patognicos, que resultam em srios problemas


de higiene, de sade pblica ou de ordem econmica (CRIADO et al., 1994).

cap.01

Tabela 1. Aspectos desejveis e indesejveis da formao de biofilmes na indstria de alimentos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1. Microrganismos Envolvidos nos Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Microbianos
Diferentes microrganismos e superfcies participam do processo de adeso e
formao de biofilmes.
O envolvimento dos microrganismos no processo de adeso e formao de
biofilmes nas superfcies de equipamentos e utenslios para processamento de alimentos ocorre em vrios nveis de intensidade. A liberao desses microrganismos
poder trazer conseqncias indesejveis qualidade do alimento produzido, como
alterao deste e veiculao de patgenos.
Esses microrganismos podem ser originrios de diferentes fontes primrias de
contaminao, dentro da cadeia de processamento e comercializao dos alimentos,
incluindo-se o solo, a gua, as plantas, os utenslios, o trato intestinal de homens e animais, os manipuladores, a alimentao animal e o ar de ambientes de processamento.
Grande nmero de espcies de bactrias pode alterar alimentos. Dentre as mais
importantes, incluem-se aquelas dos gneros Acetobacter, Acinetobacter, Aeromonas,
Alcaligenes, Alteromonas, Bacillus, Brochotrix, Campylobacter, Citrobcater, Clostridium,
Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Flavobacterium, Lactobacillus,
Leuconostoc, Micrococcus, Moxarella, Pediococcus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella,
Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Vibrio e Yersinia.
Fungos filamentosos tambm alteram as propriedades dos alimentos, como as
espcies dos gneros Alternaria, Aspergillus, Botritys, Byssochlamis, Cephalosporium,

18

Colleotrichum, Fusarium, Geotricum, Helinthosporium, Monilia, Mucor, Penicillium,


Rhizopus, Sporotrichum, Thamnidium e Trichotecium, bem como as espcies de
leveduras dos gneros Brettanomyces, Candida, Debaromyces, Endomycopsis,
Hansenula, Kloeckera, Kluyveromices, Mycoderma, Rhodotorula, Saccharomyces,
Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, Torulopsis e Trichosporon.
Dentre as espcies bacterianas alteradoras, encontram-se Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas fragi, Micrococcus sp., Enterococcus faecium, Bacillus
sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus stearothermophilus e Desulfovibrio
desulfuricans (BEECH; GAYLARDE, 1989; FLINT et al.,1997; ZOTTOLA, 1997; ANDRADE et al., 1998a; ANDRADE et al., 1998b; AKUTSU et al., 1999; FIGUEIREDO et
al., 2000; FLINT et al., 2001; HJELM et al., 2002).
Exemplos tpicos de microrganismos alteradores, que produzem grandes quantidades de limosidades, so as espcies do gnero Pseudomonas que apresentam
as seguintes caractersticas: so bastonetes, Gram-negativos, em geral mveis, no
formadores de esporos, apresentam apenas um ou um grupo de flagelos em uma
ou em ambas as extremidades da clula; so capazes de fermentar grande nmero

alimentos; so proteolticos e lipolticos e sintetizam as vitaminas e os fatores de


crescimento necessrios ao seu desenvolvimento; apresentam tendncia de crescimento em aerobiose, rpido desenvolvimento; produzem substncias oxidadas e limosidades em superfcies de alimento, de equipamentos e utenslios para processamento; so tambm capazes de crescer em baixas temperaturas de armazenamento
e produzir substncias fluorescentes. A espcie P. fluorescens pode ser detectada
quando aderida, considerando-se que produz compostos que emitem fluorescncia
sob luz ultravioleta.
Entre as espcies bacterianas patognicas associadas formao de biofilmes,
incluem-se Listeria monocytogenes, Listeria innocua, Yersinia enterocolitica,
Salmonella Typhimurium, Escherichia coli 0157:H7, Staphylococcus aureus

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de carboidratos, produzindo uma variedade de produtos que afetam o sabor dos

Bacillus cereus (DOYLE, 1992; HOOD, 1996; PARIZZI, 1999; PARIZZI et al.,
2004).
Uma

microbio-

ta bem diversificada,
portanto, incluindo espcies Gram-positivas,
Gram-negativas, esporulantes ou no, bastonetes, cocos em cacho
(Figura 2), cocos em
cadeia, psicrotrficos,
mesfilos, termfilos e

19

termodricos, envolvida em processos de


adeso e formao de
biofilmes na indstria Figura 2 - Fotomicrografia de cocos em cacho.
de alimentos.

cap.01

Nos Estados Unidos, estima-se um gasto anual entre 5 bilhes e 22 bilhes de


dlares no tratamento das doenas de origem alimentar, considerando todas as formas de contaminao dos alimentos por esses microrganismos patognicos. Esses
valores variam de acordo com a metodologia utilizada para se proceder estimativa
que pode incluir despesas hospitalares, perdas de horas de trabalho, gastos com
a recuperao da doena e a estimativa de quanto as pessoas estariam dispostas
a pagar para no contrair a doena. De acordo com Center for Disease Control and
Prevention, o CDC, dos Estados Unidos, calculam-se 76 milhes de pessoas doentes
por causa de alimentos contaminados, com 325.000 hospitalizaes por ano e cerca
de 35.200 mortes (CDC, 2006). Somente com salmoneloses o gasto estimado de

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1 bilho de dlares anualmente. Cerca de 25 % dessas doenas esto associadas


a matria-prima, equipamentos e utenslios contaminados, sujeitos, portanto, formao de processos de adeso microbiana.
Mais de 200 doenas podem ser causadas pelos alimentos contaminados,
sendo os agentes etiolgicos: bactrias, fungos micotoxignicos, vrus, parasitas,
toxinas, metais pesados, prons e agentes qumicos, como resduos de fungicidas,
de inseticidas, de detergentes e de sanitizantes. Os sintomas variam de uma moderada gastroenterite a sndromes renais, hepticas e neurolgicas. Muitos dos patgenos de grande significado hoje, por exemplo Campylobacter jejuni, Escherichia
coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Cyclospora cayetanensis, no eram reconhecidos h 30 anos como causadores de doenas provocadas por alimentos.
A infeco por Campylobacter jejuni causa comum de doena veiculada por
alimentos nos Estados Unidos. Em 1996, 46 % dos casos confirmados reportados pelo CDC e pelo Food and Drug Administration, o FDA, foram causados por
espcies de Campylobacter, seguida, em prevalncia, por Salmonella (28 %),
Shigella (17 %) e infeco por Escherichia coli O157:H7 (5 %) .
A Organizao Pan-Americana de Sade, a OPAS, coordena, desde 1995, o Sistema Regional de Informao para a Vigilncia Epidemiolgica das Doenas de Origem Alimentar. Entre 1995 e 1999, 22 pases reportaram a esse rgo a ocorrncia de
aproximadamente 3.600 surtos, 114.000 casos e 210 mortes. O alimento envolvido foi
diagnosticado em 2.540 dos surtos, que correspondem a 75 % do total. Os alimentos
de origem animal tiveram maior participao, sendo responsabilizados em 1.457 surtos, o que representa 61,7 % do total. O agente causal foi identificado em 1.940 surtos,

20

com predomnio dos agentes bacterianos, que se envolveram em 51,4 % dos casos.
Os surtos causados por Salmonella spp. e Staphylococcus aureus foram os que mais
contriburam para a ocorrncia das doenas de origem bacteriana.
A ocorrncia de surtos, no Brasil, de notificao obrigatria desde 1999, conforme Portaria GM/MS n 1461, de 22/12/99. No entanto, h subnotificao que geralmente ocorre porque a doena pode se manifestar de forma branda, sem necessitar
de tratamento mdico, pelo fato de o consumidor no considerar importante o aparecimento de distrbios gastrointestinais espordicos e tambm desconhecer que pode
e deve denunciar, a fim de evitar ocorrncia de novos casos. A rotina sobrecarregada
dos servios de sade, sem espao para a notificao dos surtos de doenas de origem alimentar, tambm contribui para a subnotificao.
Nos dados disponibilizados pelo Sistema nico de Sade, o SUS, no perodo entre 1998 e 2001 a ocorrncia de infeces intestinais destacada como
o principal diagnstico, as quais so responsveis por 4,5 % a 4,8 % das causas
das internaes hospitalares (ANTUNES, 2000). Dentre outras doenas envolvidas,
encontram-se a clera, febre tifide, shigelose e amebase. Tais doenas repre-

perodo, sendo o grupo de causas com maior nmero de internaes, em comparao com outras doenas infecciosas, como tuberculose, malria, dengue ou
AIDS. Nesse perodo, o numero de internaes por doenas infecciosas intestinais
foi de aproximadamente 570.000, com valor total dessas hospitalizaes para o
pas, em 2001, de cerca de 108 milhes de reais, enquanto em 1998 era de 74 milhes de reais. Em comparao com o nmero de internaes por grandes grupos
de causas, classificadas pelo Cdigo Internacional de Doenas (CID 10/10 Reviso
da Classificao), as doenas infecciosas intestinais esto classificadas no 6 ou 7
lugar, considerando-se a populao como um todo (SCZ, 2002).
Em Minas Gerais, entre 1995 e 2000, dados da Fundao Ezequiel Dias (FUNED)
demonstraram que 12.820 pessoas foram intoxicadas e 17 morreram aps ingerirem

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

sentam cerca de 60 % do total de internaes por doenas intestinais naquele

alimentos contaminados por enterotoxina estafiloccica (Tabela 2).


Tabela 2. Surtos de intoxicao por enterotoxina estafiloccica ocorridos no Estado de Minas Gerais,
entre 1995 e 2000

21

Com o desenvolvimento da epidemiologia e a melhoria dos servios de vigilncia em doenas causadas por alimentos contaminados, os fatores especficos
que contribuem para a ocorrncia de surtos ficaram evidentes, incluindo-se prticas,
procedimentos e processos de fabricao deficientes.
Os fatores que contribuem para surtos de doenas de origem alimentar refletem perigos, e conseqentemente o conhecimento desses fatores ajuda a estabelecer pontos crticos de controle no processo. Assim, possvel propor medidas para
eliminar ou reduzir os perigos. A partir da possvel traar orientaes para avaliar
a probabilidade de ocorrncia de um risco e a indicao de onde a verificao do
monitoramento de um ponto crtico de controle necessria. Esses fatores devem
ser priorizados por legisladores, administradores de programas de qualidade, super-

cap.01

visores e inspetores em assuntos relacionados segurana dos alimentos.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Em pesquisa sobre as percepes, experincias e comportamento preventivo em doenas causadas por alimentos contaminados nos Estados Unidos
foram relacionados os principais fatores que levaram ocorrncia dessas doenas naquele pas. Cerca de 65 % dos alimentos foram adquiridos em restaurantes, 17 % em supermercados, 17 % consumidos em residncias e 1 %
adquiridos de indstrias. Os principais fatores que causaram os surtos foram o
consumo de sobras de alimentos ou aps a data de validade (27 %), o resfriamento inadequado (23 %), alimentos contaminados e de fonte insegura (12 %),
coco inadequada (10 %), m higienizao e contaminao cruzada (7 %) e
reaquecimento inadequado (1 %).
Os esporos bacterianos (Figura 3) esto amplamente dispersos no ambiente, solo, ar e
gua, de onde podero contaminar alimentos e superfcies e originar processos de adeso e
formao de biofilmes. Os principais gneros de bactrias que apresentam a capacidade de
formar esporos so: Bacillus, Clostridium, Sporolactobacillus, Sporossarcina, Oscillospira,
Alycliclobacillus e Desulfotomacullum, compreendendo espcies alteradoras e, ou,
patognicas. Os esporos tm grande importncia na indstria de alimentos, por
serem resistentes ao tratamento trmico, radiao, dessecao e aos agentes
qumicos. Alm disso, so refrteis e absorvem fracamente os corantes comuns,
mas podem ser observados empregando-se mtodos especiais de colorao. So
bastonetes ou cocos, s vezes apresentam-se sob a forma de filamentos, com dimetro entre 0,3 e 2 mm e comprimento variando de 2 mm a 10 mm, podendo atingir
30 mm. A maioria das espcies na sua forma vegetativa Gram-positiva e, em geral,
tem flagelos peritrquios.

22

Figura 3 - Morfologia do esporo bacteriano.

quando se observam as espcies bacterianas esporulantes. Dentre elas, encontram-se: i) Clostridium botulinum, que a bactria produtora da toxina mais letal
das espcies bacterianas, sendo responsvel por uma intoxicao neurotxica, de
letalidade elevada; ii) Clostridium perfringens, causador da intoxicao diarrica;
iii) Bacillus cereus, responsvel por sndromes emticas ou diarricas, dependendo da estirpe; iv) Clostridium tyrobutiricum, causador do estufamento tardio em
queijos; v) Alyciclobacillus acidoterrestris, alterador de suco de laranja; vi) Bacillus
sporothermodurans, resistente ao tratamento de Ultra Alta Temperatura, o UAT;
vii) Sporolactobacillus spp., alterador de alimentos cidos como o iogurte; viii)
Bacillus stearothermophilus, que apresenta alta resistncia ao calor; viii) Bacillus
coagulans, alterador de diversos alimentos; e ix) Desulfotomaculum nigrificans,
um anaerbio estrito, que utiliza nitrato, sulfitos e enxofre como aceptores de el-

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

A importncia do controle dos esporos para alimentos pode ser evidenciada

trons, reduzindo-os a cido sulfdrico, com formao de pigmentos negros em


diversos alimentos.
O controle de Bacillus sporothermodurans na indstria de alimentos , particularmente, importante no processamento do leite esterilizado pelo sistema UAT
(ZARCACHENKO; LEITO, 1999). Esta espcie bacteriana formadora de esporos
possui alta resistncia ao calor e capaz de resistir ao tratamento UAT (Tabela 3).
Foi detectada pela primeira vez em leite UAT, na Itlia e ustria, em 1985 (PETTERSSON et al. ,1996). So bactrias estritamente aerbias, no produzem cidos a partir
de acares como celobiose, frutose, galactose, glicose, lactose, manitol, manose,
rafinose, salicina e xilose e apresentam reao positiva nas provas de catalase e
oxidase e negativa no teste de Voges-Proskauer; no reduzem nitrato a nitrito e
no utilizam citrato como fonte de carbono. As estirpes estudadas hidrolisaram a

23

esculina, e a maioria delas hidrolisou fracamente a casena e no hidrolisou arbutina,


arginina, gelatina e uria, exceo de uma estirpe.
Tabela 3 - Caractersticas do Bacillus sporothermodurans

As clulas cultivadas em laboratrio apresentaram-se sob a forma de bastonetes alongados e filamentosos, superiores a 30 m de comprimento e 0,7 m de

cap.01

dimetro. So indefinidas quando submetidas colorao de Gram, apresentam-se

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

com aspecto granular semelhante a um cordo de prolas e motilidade por meio de


flagelos peritrquios (PETERSSON et al., 1996). No h evidncias de que esse microrganismo seja patognico, conforme estudos realizados. Essa espcie bacteriana
pode ser encontrada no apenas em leite UAT integral e desnatado, como tambm
em leite evaporado e leite reconstitudo (KLIJN et al.,1997; HAMMER et al., 1995).
De acordo com relatos da Associao Brasileira de Leite Longa Vida, a ABLV,
no Brasil, a partir de maio de 1997, alguns lotes de leite UAT apresentaram problemas quanto ao atendimento dos padres microbiolgicos exigidos pelo Regulamento Tcnico de Qualidade e Identidade quanto contagem de aerbios
mesfilos, detectados pelo Servio de Inspeo Federal, o SIF, do Ministrio da
Agricultura e Reforma Agrria, o MARA. De acordo com os resultados dos laudos,
os produtos desses lotes no apresentaram alteraes fsico-qumicas e, ou, sensoriais quando comparados com o leite UAT prprio para o consumo, apresentando produtos com acidez, pH, estabilidade de protena ao lcool, sabor e odor
normais. No entanto, contrariavam, do ponto de vista legal, as normas em vigor,
no que se refere contagem de aerbios mesfilos. Sckoken-Iturrino et al. (1996)
mostraram a ocorrncia de bactrias esporulantes (Figura 4) do gnero Bacillus
em amostras de leite UAT, no Brasil, relatando que 6,25% dos produtos estavam
com contagens acima de 102 UFC.mL-1, o que contraria o padro exigido pela legislao para o produto quanto contagem de microrganismos aerbios mesfilos,
que de at 1,0 x 102 UFC.mL-1 (Portaria SVS/MS, n 451/97).

24

As etapas da transformao de uma clula vegetativa em esporos so comuns a


todas as espcies que esporulam (Figura 4): Estgio 0 - Corresponde clula vegetativa. Estgio I - O material nuclear condensa-se, para formar um nico filamento axial de
cromatina. Estgio II - Forma-se um septo pela invaginao da membrana celular, e o
esporo desenvolve-se num dos plos da clula. Estgio III - O protoplasma do esporo
envolvido por duas membranas, formando o foresporo, que j se encontra livre na
clula. Estgio IV - Entre as membranas do foresporo, so formados a camada originadora da parede celular, a partir da membrana interna, e o crtex, a partir da membrana
externa. Estgio V - Formao da capa e incorporao de clcio. Estgio VI - O esporo
encontra-se maduro. Estgio VII - Ocorre sua liberao aps a lise da clula-me.
A estrutura dos esporos diferente em relao das clulas vegetativas (Figura 5), a qual constituda por camadas concntricas que se apresentam nas formas
ovais ou esfricas. Essa estrutura, quando observada do centro das camadas para o
exterior, : primeiro o protoplasma ou core, que contm DNA, RNA, enzimas e ribossomos, ou seja, o material gentico que deve ser protegido para originar uma

interna que origina a membrana celular e uma camada que forma a parede celular da
nova clula vegetativa. Na seqncia, encontram-se a membrana externa e o crtex,
formado de peptideoglicano, que confere resistncia ao esporo a tratamentos trmicos. A capa do esporo, que a camada mais externa, constituda por uma ou mais
camadas de protena, com alto contedo dos aminocidos metionina ou cistena com
ligaes dissulfdicas (S-S). Essas ligaes no so reduzidas pelos agentes oxidantes,
o que confere resistncia aos sanitizantes mais comuns usados na indstria de alimentos, incluindo cloro, iodo, cido peractico e compostos quaternrios de amnia.
Alguns esporos apresentam uma ltima camada, o exosprio, constituda por lipopolissacardeos. Quando o esporo se transforma em clula vegetativa, o crtex, a capa e
o exosprio so hidrolisados.

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nova clula vegetativa. Segundo, envolvendo o protoplasma, h uma membrana

25

cap.01

Figura 4 - Transformao de clula vegetativa em esporo.

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26

Figura 5 - Morfologia de clulas vegetativas bacterianas.

A transformao do esporo em clula vegetativa compreende as etapas de


ativao, germinao, crescimento ps-germinao e multiplicao (Figura 6). A ativao ocorre por tratamentos subletais, que no provocam alteraes importantes
no esporo, resistente a agentes qumicos e ao calor. Essa etapa pode ser iniciada
por exposio a tratamentos trmicos, alteraes de pH, substncias alcalinas ou
cidas e outros agentes qumicos. A germinao um processo degradativo que
torna os esporos sensveis ao tratamento trmico e aos agentes qumicos. Os esporos perdem clcio, cido dipicolnico e a refratibilidade; alm do mais, so capazes
de absorver corantes, e a sua densidade tica diminuda. A germinao requer
a presena de substncias qumicas; entre estas: aminocidos, como L-alanina e
L-cistina; ribosdeos, por exemplo inosina e adenosina; e acares, como glucose e
frutose, alm de lactato, bicarbonato e dipicolinato de clcio.

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Figura 6 - Transformao de esporo bacteriano em clula vegetativa.

No crescimento ps-germinao, os esporos intumescem em razo da entrada


de gua e nutrientes e, em seguida, alongam-se, originando uma nova clula vegetativa, quando, ento, ocorre a sntese de protenas, a de parede celular e a de enzimas
essenciais multiplicao. A sntese de DNA ocorre durante a fase de alongamento.
A ltima etapa do processo a multiplicao, que ocorre quando os microrganismos

27

aumentam em nmero, trazendo uma srie de conseqncias para os alimentos.


Segundo Anderson et al. (1995), os esporos de B. cereus aderem com facilidade
a diferentes superfcies, sendo essa capacidade de adeso devida a trs caractersticas: alta hidrofobicidade, baixa carga de superfcie e morfologia dos esporos, j que
possuem apndices, que tambm so responsveis pela adeso. A espcie Clostridium bifermentans possui um tipo de apndice que se projeta para o exterior, a partir
de um nico ponto no esporo. O corte transversal desse apndice revela que eles
so constitudos de trs camadas concntricas de subunidades de pequena densidade eletrnica, o que pode influenciar a adeso bacteriana (SAMSONOFF et al., 1970;
BROCK et al.,1994).
De acordo com Desrosier e Lara (1981), alguns esporos bacterianos apresentam
apndice chamado de pili. Estudos mostram que os esporos de pelo menos 16 estirpes
de B. cereus possuem, em mdia, oito pilus, que se encontram distribudos aleatoriamencap.01

te no esporo, auxiliando-o em sua adeso.

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O motivo pelo qual o esporo bacteriano apresenta forte hidrofobicidade no ainda


bem entendido. Sabe-se que a adeso desses esporos s superfcies da linha de processamento e aos equipamentos da indstria constitui problemas para a obteno de alimentos com qualidade. Ronner et al. (1990) realizaram estudos com esporos das espcies B.
cereus, B. licheniformis, B. polymyxa, B. subtilis e B. stearothermophilus, com a finalidade
de analisar o seu grau de hidrofobicidade. Eles constataram que o esporo de B. cereus foi
mais hidrofbico, com cerca de 45 % de adeso, enquanto o de B. licheniformis e o de
B. polymyxa apresentaram entre 10 % e 20 %. No entanto, o grau de adeso de esporos
de B. subtilis e B. stearothermophilus no ultrapassou 5 %. Observou-se, com base em
trabalhos desenvolvidos, que, em geral, os esporos mostraram maior capacidade de adeso tanto em superfcies hidrofbicas quanto em hidroflicas, quando comparados com
suas clulas vegetativas.
Dos esporos analisados, o de B. cereus o nico que no apresenta exosprio, e sua estrutura externa composta principalmente de protenas (52%), lipdios
(13%) e fosfolipdios (6%). Segundo (Ronner et al. (1990), o exosprio pode contribuir para a alta hidrofobicidade e o alto grau de adeso. Tambm, a pili pode estar
envolvida na sobreposio da fora de repulso eletrosttica, entre as superfcies do
esporo e do processamento de alimentos.
Esporos de B. cereus tm importncia na indstria de laticnios, pois, quando se
apresenta em nmeros iguais ou superiores de 106 UFC por mL ou g, podem causar doenas atravs dos alimentos, alm de produzirem proteases e fosfolipases extracelula-

28

res, resultando na coagulao doce e no sabor amargo do leite pasteurizado (COLLINS,


1981). Larsen e Jorgensen (1997), examinando cerca de 458 amostras de leite, coletadas em trs diferentes indstrias, observaram que 56% delas apresentavam B. cereus,
devendo-se ressaltar que, no vero, esse valor atingia 72 %, contra 28 % no inverno.
B. cereus psicrotrfico foi detectado em 29 de 115 amostras de leite cru e em 120 de
257 amostras de leite pasteurizado, tendo as clulas viveis sido encontradas dentro de
uma variao de 1,0 x 103 UFC.mL-1 a 3,0 x 105 UFC.mL-1. Giffel et al. (1997) avaliaram a
incidncia do microrganismo B. cereus em tanques de refrigerao de leite, observando que 40 % de 133 amostras estavam contaminadas com o microrganismo.

2. Superfcies Envolvidas em Processos de Adeso Microbiana


De acordo com muitos autores (LPEZ, 1970; STEVENS, 1990; CZECHOWSKI,
1990; HAYES, 1993; PALMER, 1998; VERGNAUD, 1998; RODRIGUEZ, 2002; RODOLFO
JR; NUNES, 2002; INSTITUTO DO PVC, 2004;), o material das superfcies comumente

carbonato, ao-carbono, madeira, fibra de vidro, poliuretano, PVC, mrmore, silicone,


granito, teflon e vidro, permite o crescimento microbiano, que pode originar processos
de adeso bacteriana e formao de biofilmes, segundo vrios autores (CONSTERTON
et al., 1978; COSTERTON et al., 1987; CONSTERTON et al., 1989; MARSHAL, 1992; SASAHARA; ZOTOLLA, 1993; ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; COSTERTON et al., 1995;
HOOD; ZOTOLLA, 1995; BOWER et al., 1996; HOOD, 1996; SAND, 1997; ZOTTOLA,
1997; HERALD; ZOTTOLA, 1998; STICLER, 1999; OTOOLE et al., 2000; LEJEUNE,
2003).
As caractersticas dessas superfcies de processamento so apresentadas na Tabela 4 e devem ser inertes, tanto no que se refere aos alimentos quanto ao que se concerne

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usado no processo de alimentos como ao inoxidvel, polietileno, polipropileno, poli-

a detergentes e sanitizantes sob condies normais de uso. Alm disso, seus componentes no devem ser txicos, no podem migrar nem ser absorvidos pelos alimentos.
As superfcies lisas, duras, contnuas sem fendas ou fissuras so as mais indicadas para
contato sem deformaes, como o abaulamento. As caractersticas das superfcies auxiliam a realizao de um procedimento de higienizao adequado. As caractersticas
macroscpicas e particularmente microscpicas das superfcies so determinantes para
maior ou menor adeso microbiana, com reflexos na contaminao dos alimentos com
microrganismos alteradores ou patognicos. Quanto mais lisa a superfcie, mais fcil a
higienizao. O ideal que nas superfcies no se formem poros nem ranhuras, e que
estas sejam resistentes s deformaes, como o abaulamento. As caractersticas das superfcies devem ser consideradas para a realizao de um procedimento de higienizao
adequado.

29

2.1. Ao Inoxidvel
Dentre os materiais disponveis, o ao inoxidvel, liga cuja composio inclui carbono, cromo e nquel, o mais utilizado (Figura 7). H diversos tipos de ao inoxidvel,
mas os que contm 18 % de cromo e 8 % de nquel so os mais usados. Nesse grupo,
esto as ligas da classe 300, por exemplo 304 e 316, que so resistentes corroso causada pela maioria dos alimentos, detergentes e sanitizantes, alm de serem facilmente
higienizadas e relativamente baratas. A resistncia do ao inoxidvel se deve pelcula
protetora de xido de cromo que se forma na presena de oxignio. Em situaes em
que h possibilidade de ocorrerem processos corrosivos mais intensos, como o caso
de salmouras, deve-se utilizar a classe 316, por conter mais nquel em sua composio
(cerca de 10 %) e, ainda, 2 % a -3 % de molibdnio. O tipo Hastelloy, que contm 56 %
de nquel, 16 % de cromo, 16 % de molibdnio, 5 % de ferro e 4 % de tungstnio, mais

cap.01

resistente corroso, mas sua utilizao limitada em razo do alto custo.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


30

Tabela 4 - Caractersticas de superfcies usadas no processamento de alimentos

O ao inoxidvel difere tambm no acabamento da superfcie, que pode variar


de acordo com o polimento empregado (HAYES, 1993; LE CLERCQ-PERLAT et al.,
1994; JULLIEN et al., 2002). O acabamento, ou o polimento, do ao inoxidvel
importante e se classifica em escala de 0, sem polimento, at 8, cuja superfcie
espelhada. Normalmente, na indstria de alimentos utilizado o ao inoxidvel com
polimento 4.

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Figura 7. Fotomicrografia de superfcie de ao inoxidvel, AISI 304 #4 por microscopia eletrnica de


varredura. a) presena de protuberncia e b) fissuras com dimetros variados.

Segundo Hayes (1993), os tipos de corroso em superfcies de ao inoxidvel so:


i) Pontual: qualquer leso na camada de xido de cromo determina a corroso. Os resduos alimentcios e inclusos nas partculas da superfcie podem produzir corroso por
excluso de oxignio. No caso dos alimentos, o problema mais grave, pois as bactrias
que crescem na matria orgnica podem produzir cidos que so responsveis pelo aumento da corroso. A corroso pontual tambm pode ser produzida por leses fsicas e
qualquer ferrugem, mancha ou zona rugosa, que, se no tratadas, podem levar facilmente a danos mais graves. Uma das principais causas de corroso o emprego incorreto
de solues de limpeza e de sanitizantes, especialmente o hipoclorito de sdio. s vezes,
essas solues so deixadas por muito tempo em contato com a superfcie, so aplicadas
em concentraes erradas ou preparadas com produtos inadequados.

31

ii) Corroso eletroltica: pode ser originada quando h umedecimento de dois metais
distintos, como o alumnio e o ferro, ou de dois aos inoxidveis de graus diferentes com
a mesma soluo. Assim, uma soluo de limpeza ou de sanitizao pode atuar como
um eletrlito e causar corroso quando em contato com dois metais diferentes que, por
exemplo, fazem parte da mesma pea do equipamento. Os eltrons passam do ferro para
o alumnio, permitindo a corroso do alumnio.
iii) Corroso intergranular: deve-se ao emprego de um ao inoxidvel rico em carbono.
Ocorre nos contornos dos gros dos metais e, freqentemente, propaga-se pelo interior
da pea, deixando poucos sinais visveis na superfcie. Pode acontecer em lugares prximos s soldas dos equipamentos. originada por precipitao de carbonetos de cromo
nos contornos dos gros, resultante da permanncia prolongada do ao a temperaturas
muito elevadas. Esse problema pode ser facilmente evitado utilizando-se aos inoxidveis com baixo contedo de carbono, como o tipo 304.

cap.01

iv) Corroso geral: deve-se ao emprego de um ao inoxidvel que no resiste s propriedades corrosivas do alimento processado. Pode ser evitada pelo uso de equipamento
fabricado com um ao de maior grau de resistncia.

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2.2. Polmeros
Os polmeros so amplamente utilizados na indstria de alimentos, em razo
de suas excelentes propriedades. So capazes de retardar, prevenir mudanas e
deteriorao no material de embalagem devido a influncias externas, como presena de oxignio, luz e microrganismos. Uma grande vantagem o seu menor
custo em relao a outros materiais usados para embalagem, por exemplo o vidro
(VERGNAUD, 1998).
As propriedades dos polmeros variam bastante, dependendo da matria-prima
utilizada, dos aditivos incorporados e do mtodo de fabricao. Basicamente, os usados
na indstria de alimentos so agrupados em duas categorias: termoplsticos e termoestveis. Os termoplsticos amolecem quando so aquecidos e endurecem quando
resfriados, processo que pode ser repetido vrias vezes sem mudanas qumicas apreciveis. Os tipos de termoplstico mais comumente encontrados em indstrias de alimentos so: polietileno, polipropileno, poli (cloreto de vinila) ou PVC e acrlico, entre
outros. Os termoestveis so capazes de endurecer na primeira vez que so aquecidos,
mas se forem reaquecidos pode ocorrer degradao qumica. Polister, resinas epxi e
poliuretanos so polmeros termoestveis usados na fabricao de equipamentos envolvidos no processamento de alimentos (HAYES, 1993; RODOLFO Jr. et al., 2002).
O polipropileno est entre os materiais mais populares em indstrias alimentcias, uma vez que tem sido usado em fabricao de tanques, tubulaes, acess-

32

rios e superfcies envolvidas no corte de alimentos (POMPERMAYER; GAYLARDE,


2000). Portanto, importante avaliar a possibilidade de contaminao cruzada de
alimentos e determinar o grau de adeso bacteriana e a formao de biofilme em
superfcies de polipropileno.
Algumas superfcies consideradas no convencionais tm sido usadas no processamento de alimentos. Dentre elas, destacam-se fibra de vidro, poliuretano, PVC,
silicone, mrmore e granito.
Os silicones so polmeros, quimicamente inertes, resistentes a cidos e alcalinos, radiao gama, decomposio pelo calor, gua ou a agentes oxidantes, alm
de serem bons isolantes eltricos. Resistentes ao calor e a intempries, os silicones
so apresentados nas formas fluida, de resina ou de elastmeros, ou seja, borrachas
sintticas, sempre com inmeras aplicaes. Servem, por exemplo, como agentes de
polimento, vedao e proteo e apresentam propriedades impermeabilizantes. Suportando temperaturas que podem variar de 65 C negativos a 400 C positivos, o silicone
usado em inmeros segmentos da indstria de alimentos sem perder suas caractersticas de permeabilidade, elasticidade e brilho (RODRIGUEZ, 1989; ABIQUIM, 2004).

pela sua ampla aplicao, destacando-se a grande flexibilidade, longevidade e compatibilidade com os meios de aplicao. O silicone, por ser inerte e atxico, no
traz malefcios para o meio ambiente, no contamina o solo, a gua e o ar, alm de
no alterar o sabor dos alimentos com os quais entra em contato (STEVENS, 1990,
ABIQUIM, 2004).
Revestimentos de correias transportadoras de alimentos, utenslios de cozinha,
mquinas automticas de servir bebidas, moldes de confeitaria, bandejas de gelo e
bicos de mamadeira so apenas algumas das inmeras peas feitas de elastmeros
de silicone para aplicaes de contato com alimentos (ABIQUIM, 2004).
O PVC (Figuras 8, 9 e 10) caracteriza-se por ser atxico, resistente maioria dos

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Superfcies de silicone possuem vrias caractersticas que so responsveis

reagentes qumicos, por exemplo agentes oxidantes; impermevel; estvel; e bom


isolante trmico, alm de possuir grande durabilidade e no propagar chamas. O PVC
pode ser rgido ou flexvel, opaco ou transparente, brilhante ou fosco, colorido ou no.
Esse material pode ser formulado com vrios tipos de aditivos, sendo o polmero mais
polivalente. Esses aditivos podem melhorar as caractersticas das superfcies de PVC,
como a resistncia ao calor ou ao frio, a choques ou luz, dentre outras. A adio de
lquidos orgnicos, denominados plastificantes, confere ao PVC grande flexibilidade
(STEVENS, 1990; RODOLFO Jr. et al., 2002; INSTITUTO DO PVC, 2004).
O PVC o nico material plstico que no 100 % derivado do petrleo, uma
vez que contm 57 % p/p de cloro, originrio do cloreto de sdio, e 43 % p/p de
eteno, de origem petrolfera. Dentre as superfcies de PVC envolvidas com alimen-

33

tos, destacam-se embalagens usadas para acondicionamento, garrafas para gua


mineral, construo de tanques, tubulaes, acessrios e revestimento de correias
transportadoras (HAYES, 1993; INSTITUTO DO PVC, 2004).

cap.01

Figura 8 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, com revestimento com tecido, por
microscopia eletrnica de varredura: a) poucas imperfeies e b) presena de bolhas de ar devido a defeitos
de fabricao.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Figure 9 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, dupla face rugosa por microscopia
eletrnica de varredura: a) e b) aspectos no uniformes da superfcie, c) ondulaes com dimetros
variados e d) depresses com dimetros diferentes.

34

Figure 10 - Fotomicrografia de superfcie de poli (cloreto de vinila), o PVC, com revestimento de tecido
grosso por microscopia eletrnica de varredura: a) presena de elevaes, b) presena de microfuro, c)
esgaramento do tecido (seta) e d) porosidade lateral.

polmeros com ampla variedade de propriedades, todas baseadas na reao de um diisocianato orgnico com componentes contendo grupos de hidrxidos, chamados de
poliis (STEVENS, 1990; ABIQUIM, 2004e). Dentre as caractersticas desse tipo de superfcie, destacam-se: elevada durabilidade, resistncia a cidos, oxidao, abraso e
radiao gama, mas no so muito resistentes a alcalinos (RODRIGUEZ, 1989). Slidos
ou expandidos, flexveis, semi-rgidos ou rgidos, os poliuretanos podem assumir a forma de artefatos moldados, revestimentos, elastmeros, espumas ou fibras (STEVENS,
1990). Dentre as aplicaes na indstria alimentcia, destacam-se o uso em revestimentos de correias transportadoras e como isolante trmico na cadeia do frio (ABIQUIM,
2004a).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Os poliuretanos (Figuras 11 e 12), tambm conhecidos como policarbamatos, so

Figura 11- Fotomicrografia da superfcie de poliuretano de dupla face rugosa por microscopia eletrnica de
varredura: a) presena de protuberncia e b) espao irregular com dimetro maior do que 3 m.
35

Figura 12 - Fotomicrografia de superfcie de poliuretano dupla face lisa por microscopia eletrnica de
varredura: a) presena de protuberncias e b) elevao (dimetro maior) e microfuros (dimetro menor).

As superfcies de granito (Figura 13) correspondem s rochas gneas e metamrficas


de granulometria grossa compostas principalmente de minerais flsicos na proporo de
50 % de quartzo, 30 % de feldespato e 20 % de mica (LPEZ, 1970). A dureza do granito
decorrente da presena e das propores relativas desses minerais. Esse tipo de superf-

cap.01

cie fisicamente difcil de ser explorado e beneficiado, entretanto possui alto brilho no po-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


36

limento e elevada durabilidade mecnica, alm do mais, apresenta resistncia ao calor e


custo relativamente baixo, podendo competir com o custo de superfcies sintticas. Uma
desvantagem a sensibilidade aos cidos, podendo levar perda do brilho e modificao
da colorao, mas dificilmente haver dissoluo superficial (FRASC, 2003).

Figure 13 - Fotomicrografia de superfcie de granito por microscopia eletrnica de varredura: a) presena de


ranhuras e fendas, b) rugosidades (vista lateral) e c) e d) ondulaes e depresses com dimetros variados.

Cientificamente, os mrmores so rochas metamrficas e recristalizadas de


granulometria grossa e composio base de carbonatos. Essas superfcies so
compostas, principalmente, por carbonato de clcio (CaCO3), tambm conhecido
como calcita, cujo contedo pode variar entre 90 % e 100 % de acordo com a pureza do material. J os mrmores dolomticos so compostos por cerca de 54 % de
carbonato de clcio e 46 % de carbonato de magnsio (MgCO3).
Juntamente com o carbonato de clcio pode haver tambm outros minerais
secundrios em maior ou menor quantidade, como o xido de silcio (SiO2), xido de ferro (Fe2O3), xido de mangans (MnO) e xido de alumnio (Al2O3), entre
outros, considerados impurezas. Essas vrias composies so responsveis pelas
diferentes condies de durabilidade e resistncia desse material, alm da grande
variedade de mrmores no mercado (LPEZ, 1970).

a qualidade dos mrmores, em termos de valor, a cor. De acordo com a colorao, os mrmores podem ser classificados em brancos e coloridos. Os brancos so
compostos unicamente de carbonato de clcio, j os coloridos apresentam cores
diferentes, como amarelo, verde, roxo, preto, que podem variar de acordo com os
minerais de sua composio (LPEZ, 1970).
As superfcies dos mrmores so consideradas menos compactas devido
sua dureza relativamente baixa. Por isso, so fceis de cortar e polir, sendo adequadas para processamentos industriais. Entretanto, possuem vulnerabilidade do
desgaste fsico e reaes qumicas, com grande sensibilidade a agentes cidos e
alcalinos, o que pode acarretar o surgimento de manchas e danos na superfcie
(FRASC, 2003).

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Do ponto de vista prtico, uma das principais caractersticas que determinam

Todas as superfcies onde se processam os alimentos so propcias formao


de biofilmes, que podem ocorrer at mesmo em locais onde as prticas de higiene
so corretamente aplicadas. Desse modo, a escolha de um agente antimicrobiano
deve ser cuidadosamente realizada, levando-se em conta os contaminantes microbianos potenciais e o tipo de superfcie (ROSSONI et al., 2000).

3. Mecanismos da Adeso Bacteriana


O entendimento dos mecanismos da adeso bacteriana s superfcies para
processamento de alimentos contribui para a tomada de medidas mais
adequadas ao seu controle.
As pesquisas sobre adeso bacteriana tiveram incio h algumas dcadas,

37

quando se constataram que microrganismos aderidos ou em biofilmes eram responsveis por processos de corroso em superfcies imersas em sistemas marinhos ou
aquticos (ZOBELL; ALLEN, 1935; ZOBELL ,1943; FLETCHER, 1980; CHARACKLIS;
COOKSEY, 1983; COSTERTON et al., 1987; FLETCHER, 1987).
Vrios mecanismos para adeso bacteriana em diferentes superfcies de contato
tm sido propostos (ZOTTOLA; SASAHARA, 1994; ZOTOLLA, 1997). De acordo com
a teoria descrita por Marshall et al. (1971), a adeso em superfcies slidas um processo que acontece em duas etapas. A primeira reversvel, pois o microrganismo
est fracamente aderido superfcie atravs de foras de van der Waals e atraes
eletrostticas, propiciando fcil remoo da clula bacteriana. J a segunda irreversvel, uma vez que o tempo de aderncia envolve a adeso fsica da clula superfcie,
por meio de material extracelular de natureza polissacardica ou protica produzido
pelo microrganismo, o que se denomina matriz de glicoclix. O glicoclix auxilia a forcap.01

mao do biofilme, sendo produzido somente aps a adeso superficial, fornecendo

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condies para adeso do peptideoglicano das bactrias Gram-positivas e da parte


externa da membrana externa das Gram-negativas.
Outra teoria sugere a existncia de cinco etapas, diferenciadas na seguinte
ordem: i) transporte de nutrientes e matria orgnica e inorgnica para a superfcie
slida; ii) formao de uma camada de nutrientes orgnicos e inorgnicos; iii)
adeso dos microrganismos superfcie e crescimento celular, iv) intensa atividade metablica no biofilme; e v) liberao de clulas para o meio (CHARACKLIS;
COOKSEY, 1983; ZOTTOLA, 1997).
Uma terceira teoria prope a diviso do processo de adeso em trs etapas, sendo a primeira a fixao da bactria, seguida da consolidao da bactria na superfcie
e, por ltimo, a colonizao da bactria (NOTERMANS et al., 1991).
A consolidao um estgio importante, pois os microrganismos produzem,
nessa fase, material extracelular que propicia a fixao das clulas na superfcie. Nesse ponto, as clulas fixadas no so removidas por rinsagem com gua
(SCHWACH; ZOTTOLA, 1984; STONE; ZOTOLLA, 1985; GMEZ-SUAREZ et al.,
2002), mas por ao mecnica ou qumica de detergentes e sanitizantes.
Durante o estgio de colonizao, muitas mudanas provavelmente ocorrem
entre a microcolnia e a superfcie; e um complexo polissacardico presente no
glicoclix pode se ligar a ons metlicos, alterando a natureza qumica e fsica do
biofilme. Nesse estgio, subprodutos metablicos, como cidos orgnicos, podem

38

ser encontrados na matriz e resultar em corroso local.


Vrios fatores podem influenciar a adeso de microrganismos s superfcies,
como as caractersticas do microrganismo; do material aderente e do meio que
envolve o microrganismo (TROLLER, 1993). A espcie, o meio de cultura, a idade
da cultura e a concentrao do microrganismo podem afetar o processo de adeso.
Quanto ao material aderente, tanto o tipo e a forma inica quanto o tamanho da partcula so importantes no processo de adeso. No que diz respeito ao meio, fatores
como pH, concentrao de sais orgnicos, compostos orgnicos, agitao, tempo e
temperatura de contato so importantes nesse processo (TROLLER, 1993).
A adeso bacteriana superfcie um processo complexo que se inicia com
a atrao de foras eletrostticas entre a clula e a superfcie (HOOD; ZOTTOLA,
1995). Na Figura 15 apresentado um esquema em que se prope representar a
adeso bacteriana. No mecanismo de adeso bacteriana, os seguintes passos ocorrem (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987):

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Figura 15 - Mecanismo terico da formao de biofilmes.


i) A grandes distncias de separao, acima de 50 nm, opera somente a fora atrativa de van der
Waals, sendo muito grande para a oposio de foras e o reconhecimento de componentes especficos de superfcie. A aproximao mediada por propriedades no-especficas da superfcie
da clula.
ii) Devido repulso eletrosttica, a uma distncia entre 10 nm e 20 nm ocorrem interaes
secundrias mnimas. possvel que a adeso nesse estgio seja reversvel, porm se altera com
o tempo para pouco reversvel ou essencialmente irreversvel, em razo do rearranjo da superfcie
da clula, levando a interaes especficas de curta distncia. Para isso, o filme de gua precisa
ser removido da interface bactria/superfcie. O maior papel da hidrofobicidade e componentes
de superfcie hidrofbica na adeso bacteriana provavelmente sejam o de remoo de gua nesse filme, o que auxilia a ocorrncia de interaes especficas de curta distncia.

39

iii) A uma distncia menor que 1,5 nm, com a barreira da energia potencial j superada, interaes especficas, iguais as que se podem originar de foras polares de curta distncia, podem
ocorrer, e essas interaes provavelmente levam a uma ligao essencialmente irreversvel.

A interao especfica microscpica, como a que existe entre componentes das superfcies, ocorrendo a uma distncia extremamente curta, que permite a
ocorrncia de ligaes inicas, de hidrognio e possivelmente ligaes qumicas.
A interao no-especfica definida como aquela que devido propriedade de
superfcie microscpica total, como as cargas ou energia livre de superfcie, pode
atuar em considerveis distncias da superfcie. proposto um valor calculado com
base na fora de van der Waals, em que uma longa distncia seria acima de 50 nm,
enquanto a curta distncia diz respeito a foras que atuam a distncias menores que

cap.01

1,5 nm (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

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4. Aspectos Termodinmicos do Processo de Adeso Bacteriana


Adeso microbiana em superfcies uma condio indispensvel na formao
de biofilmes. Como referido anteriormente, inicia-se com interaes de longo alcance, fracas, no-especficas entre clulas e superfcie. Essas ligaes so instveis,
podendo as bactrias ser removidas por meio de um fluido por estarem aderidas
a um estgio reversvel. Uma vez que as clulas se encontram muito prximas da
superfcie, podem-se formar interaes de curto alcance e especficas, sendo a bactria aderida superfcie (CHEN; ZHU, 2005). Esse processo principalmente governado por propriedades fsico-qumicas dos microrganismos, como tambm das
superfcies (OLIVEIRA et al., 2003). Estirpes bacterianas com diferentes propriedades
de superfcie celular mostraram diferentes cinticas de adeso e afinidades por superfcies (BAKKER et al., 2002; CHEN; ZHU, 2005). Propriedades fsico-qumicas de
superfcies de bactrias podem ser quimicamente modificadas para estimular ou impedir a adeso (WHITEKETTLE,1991; VAN DER MEI et al., 2001; CHEN; ZHU, 2005).
Assim, estruturas extracelulares, como lipopolissacardeos, flagelos e protenas de
membrana podem influenciar a adeso de bactrias superfcie (CAMMAROTA et
al., 1998; GMEZ-SUREZ et al., 2002; CHEN; ZHU, 2005).
Diferentes abordagens tm sido utilizadas para descrever e, simultaneamente, predizer a adeso bacteriana em superfcies. Em geral, a adeso pode ser ilustrada pelas
teorias DLVO (Derjaguin, Landau, Verwey e Overbeek), pela Teoria Termodinmica da
Adeso e pela Teoria DLVO Estendida.

4.1. Teoria Termodinmica da Adeso


40

Nesta abordagem, a variao da energia livre de superfcie interfacial de interao microrganismo e superfcie comparada antes e depois da adeso. A comparao expressa em termos de variao de energia livre de adeso (Equao 1):

GTOT= g sb- g sl- g bl

(1)

em que DGTOT a variao de energia livre de Gibbs, gsb a tenso superficial


entre superfcie e bactria, gsl a tenso superficial entre superfcie e lquido e, por fim,
gbl a tenso superficial entre bactria e lquido (VAN OSS, 1991, 1994).
Como todo sistema na natureza, a interao microrganismo e superfcie tambm procede em direo diminuio da variao de energia livre, e a adeso do
microrganismo ocorrer se a variao da energia for negativa (GTOT < 0), e a adeso ser termodinamicamente desfavorvel se positiva (GTOT > 0). O clculo das
tenses superficiais possvel por meio da medida do ngulo (Figura 16) de contato (q) das superfcie ou bactria com lquidos-padro com energia livre conhecida
(SHARMA; HANUMANTHA RAO, 2003).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

O ngulo de contato formado por uma gota de um lquido sobre uma superfcie slida (Figura 16) o ngulo entre um plano tangente a uma gota e a superfcie
onde o lquido se encontra depositado. Esse ngulo permite avaliar a molhabilidade dessa superfcie. Para realizao das medidas, deve-se utilizar um lquido
polar e dois apolares. Se o lquido for a gua, o ngulo formado ser relacionado
a hidrofobicidade da superfcie. Para Van Oss e Giese (1995), ngulos inferiores a
50 indicam superfcie hidroflica e ngulos superiores a 50, hidrofbica. Contudo,
para Vogler (1998), uma superfcie hidrofbica deve apresentar ngulo de contato
com a gua superior a 65.

Figura 16 - ngulo de contato (q) entre uma gota lquida e uma superfcie plana e horizontal ilustrando as
tenses superficiais da superfcie do slido, do lquido em equilbrio com o vapor e superfcie e lquido,
respectivamente.

A equao de Young-Good-Girifalco-Fowkes relaciona o ngulo de contato


formado pelo lquido sobre uma superfcie slida com os componentes da tenso
superficial do lquido e da superfcie (Equao 2):
(1+cosq) g l TOT= 2( gsLW glLW + gs+ gl- + gs- gl+)

(2)

41

Para lquidos apolares, a componente polar da tenso superficial nula e, portanto, a Equao 2 reduz-se Equao 3:

glTOT
gsLW =
(1+cosq)2
4

(3)

em que glTOT a tenso superficial total do lquido, glLW e gsLW so as tenses superficiais das foras de interao cido-base de Lewis, gl+ e gs+ e so as componentes
aceptoras de eltrons da componente cido-base da tenso superficial e gl- e gs- so as
componentes doadoras de eltrons da componente cido-base da tenso superficial,
considerando-se que so as tenses para os lquidos (l) e para a superfcie (s) analisados. As equaes permitem determinar os componentes da tenso superficial de
lquidos a 25 C. Na Tabela 5, so mostradas as componentes da tenso superficial de

cap.01

lquidos (VAN DER MEI et al., 1997).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Tabela 5 - Componentes da tenso de superficial de lquidos a 25 C

4.2. Teoria DLVO


A clssica teoria DLVO descrita inicialmente por Derjaguin e Landau em 1941 e
complementada por Verwey e Overbeek em 1948 parte da definio de que os microrganismos seriam partculas coloidais liofbicas. Todavia, no houve considerao
dos aspectos microbiolgicos. Essa teoria sustenta que a energia potencial total de
interao entre dois corpos resultante da ao combinada entre as foras atrativas
de Lifshitz-Van der Waals e as foras de dupla camada eltrica (Equao 4).

GTOT = GEL + GLW

(4)

em que GEL a variao da energia livre das foras da dupla camada eltrica
e G

LW

42

a variao da energia livre das foras da Lifshitz-Van der Waals (VAN OSS et

al., 1990).

4.3 - Teoria DLVO Estendida


A teoria DLVO considera apenas as foras de longo alcance. No entanto, quando uma partcula ou microrganismo esto muito prximos (2 nm - 5 nm) de uma
superfcie, foras de curto alcance passam a regular o processo. Tais foras denominadas no-DLVO so representadas pelas foras de repulso de Born, foras de
hidratao, interaes hidrofbicas e pontes polimricas.
Van Oss et al., em 1994, integraram os aspectos termodinmicos da adeso
teoria DLVO. Essa teoria conhecida como XDLVO ou DLVO estendida e considerou
as foras de curto alcance, principalmente as interaes hidrofbicas. A energia livre
das interaes totais numa superfcie (GTOT) resultante do somatrio das energias
livres das interaes de Lifshitz-Van der Waals (GLW), interaes cido-base de Lewis
(GAB) e foras eletrostticas de dupla camada eltrica (GEL) e interaes resultantes
dos movimentos Brownianos (GBR), conforme a Equao 5 e a Tabela 6:

GTOT= GLW+ GAB+ GEL+GBR

(5)

A intensidade das foras de Lifshitz-Van der Waals diretamente proporcional ao tamanho das partculas que se interagem e na razo inversa da distncia
superfcie. As foras de dupla-camada eltrica esto relacionadas carga eltrica

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Tabela 6 - Foras envolvidas na adeso microbiana s superfcies

superficial e aos movimentos Brownianos. A superfcie de um slido eletricamente


carregado em contato com uma soluo aquosa atrai ons de sinal contrrio do meio
e simultaneamente repele os de sinais iguais. Uma vez que a maioria das superfcies
adquire carga negativa em soluo, as foras da dupla camada eltrica apresentam,
geralmente, um carter repulsivo (OLIVEIRA, 2006). Dessa maneira a adeso somente ser irreversvel quando a variao da energia livre de Gibbs total for negativa
(GTOT<0) e a distncia entre a superfcie e o microrganismo for mnima possvel.
A contribuio das interaes consideradas pela teoria DLVO resulta em um perfil de energia potencial que muito dependente da fora inica do meio (Figura 17).
Assim, se a fora inica do meio baixa, o perfil de energia potencial de interao
entre os dois corpos de sinal igual apresenta um mximo de energia, que representa

43

uma barreira para a aproximao dos corpos, e um mnimo de energia, designado


mnimo primrio, que se localiza a uma distncia inferior a 2 nm da superfcie. Quando
se aumenta a fora inica do meio, a barreira de energia diminui, devido reduo
da energia da dupla camada eltrica. Assim, para valores intermdios da fora inica do meio, o mximo de energia diminui, e cria-se um mnimo secundrio. Este,
quando os microrganismos interatuantes so bactrias, situa-se a 5 - 20 nm da superfcie e pode ser tanto mais profundo quanto maiores forem as foras atrativas
de Van der Waals. Uma vez ultrapassado o mximo de energia e atingido o mnimo
primrio, a ligao entre os dois corpos interatuantes torna-se irreversvel. Para
valores elevados da fora inica do meio, a energia potencial de interao sempre negativa, e nesse caso todas as partculas podem atingir o mnimo primrio. A
existncia de dois mnimos de energia permite distinguir entre a adeso reversvel,
quando ocorre no mnimo secundrio, e irreversvel, quando acontece no mnimo

cap.01

primrio (CHAVES, 2004).

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Figura 17 - Grfico ilustrativo do processo de adeso: (GLW) energia livre de Lifshitz-van der Waals, (GAB)
energia livre cido-base de Lewis, (GEL) energia livre de dupla camada eltrica e GTOT energia livre total
em funo da distncia (nm).

5. Fatores Associados Adeso Microbiana e Formao de


Biofilmes
44

Embora os trabalhos, em sua maioria, tenham sido desenvolvidos fazendo-se


simulao laboratorial, no h dvidas de que os biofilmes se formam tambm em
condies de processamento. Por isso, a indstria de alimentos deve estar preparada
para controlar ou remover ocorrncias dessas formaes. Naturalmente, deve-se atuar de forma eminentemente preventiva, e, quanto a esse aspecto, os procedimentos
corretos de higienizao das superfcies que entram em contato com os alimentos
apresentam papel relevante. Na higienizao, os agentes qumicos detergentes tm a
funo de remover resduos orgnicos e minerais das superfcies, enquanto os sanitizantes fsicos ou qumicos inativam os patgenos e reduzem o nmero de alteradores
das superfcies para nmeros aceitveis, por exemplo, 2 UFC.cm-2 de aerbios mesfilos para superfcies de ao inoxidvel, conforme recomendao da American Public
Health Association, APHA, para que as superfcies sejam consideradas higienizadas.
A dinmica biolgica, qumica e fsica do desenvolvimento do biofilme, normalmente segue uma seqncia temporal ordenada, e o desenvolvimento do biofilme envolve as fases de adeso, crescimento celular, produo de polissacardeos e
maturao, usualmente seguida de liberao de parte do biofilme da superfcie.

a expresso de genes sobre propriedades fisiolgicas e a interao entre clulas


no biofilme (Tabela 7). O desenvolvimento rpido de ferramentas moleculares est
abrindo novas alternativas para que sejam estudados com detalhes a atividade fisiolgica e o estado de clulas individuais. Conseqentemente, os mecanismos regulatrios sero explorados para se entender o potencial morfolgico e fisiolgico de
uma espcie, podendo auxiliar o entendimento do que ocorre nas comunidades dos
biofilmes microbianos (OTOOLE, 1989a; OTOOLE, 1989b; ESCHER; CHARACLIS,
1990; VAN LOBSDRECHT et al., 1990; FUQUA et al., 1996; SAUER et al., 2002).
Tabela 7 - Fatores que podem influenciar a formao de biofilmes

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

da distribuio espacial destas em biofilmes, sendo o desafio para o futuro entender

45

cap.01

Nos ltimos anos, muito se tem discutido sobre a diversidade de espcies e

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O potencial de uma bactria para reagir s diferenciaes complexas, sempre


respondendo com adaptaes fisiolgicas, deve ser considerado na formao do
biofilme. Alm disso, o papel de fatores fsico-qumicos na regulao da estrutura
do biofilme deve ser analisado em associao com os fatores genotpicos. Nesse
sentido, estudos assim em combinao com a modelagem matemtica, que buscaro uma teoria unificada, de forma a explicar melhor o ciclo de desenvolvimento
do biofilme.
Alguns dos aspectos importantes que influenciam a adeso bacteriana e formao de biofilme so discutidos nos itens subseqentes.

5.1 Apndices Celulares


O mecanismo preciso de adeso da bactria superfcie ainda no bem entendido, mas sabe-se que, enquanto a bactria no faz um contato direto com a
superfcie, a adeso mediada por estruturas extracelulares capazes de sobrepor os
efeitos da repulso eletrosttica. Essas estruturas se referem a pili, fmbria, exopolissacardeos e protenas da parede celular (DENYER et al., 1993).
Os apndices de superfcie podem servir de ligao entre a clula e o substrato de adeso, anulando a repulso eletrosttica. Esses apndices podem variar
em tamanho e rigidez, chegando a ter vrias vezes a dimenso da clula. Muitos
componentes de superfcie da clula tm sido reconhecidos como sondas moleculares atuando estereoquimicamente com molculas de superfcie e so chamados
de adesinas (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

46

Os apndices contribuem para a hidrofobicidade, carga superficial e energia


livre de superfcie. Alm disso, muitas substncias podem estar transientemente
associadas com a superfcie da clula e afetar suas propriedades. Um bom exemplo
o composto ampiflico, conhecido como cido lipoteicico, essencialmente um
constituinte da membrana citoplasmtica de muitas bactrias Gram-positivas, que
migram atravs da parede celular para o meio circundante clula. Na superfcie da
clula, o cido lipoteicico pode atuar como uma molcula especfica, por exemplo
ligando Streptococcus pyogenes s clulas epiteliais e ao mesmo tempo mediando
a ligao da gua e do hidrocarbono na interface (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

5.1.1. Flagelo
Os flagelos so como hlices de um propulsor, apndices rgidos e inseridos
na base da clula, sendo responsveis pela motilidade dos microrganismos (Figura
18). Esses apndices so geralmente muito mais longos do que as clulas, muito
finos e somente visualizados, por anlise microscpica, quando so corados por
compostos especiais que fazem que os seus dimetros sejam aumentados.

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Figura 18 - Esquema de um flagelo bacteriano.

Os flagelos esto inseridos na membrana e parede celular por meio de uma estrutura denominada corpo basal, composto de dois anis em bactrias Gram-positivas
e quatro em bactrias Gram-negativas. H uma estrutura intermediria semelhante
a um cilindro tubular, em forma de gancho, como um filamento constitudo de subunidades de protena, a flagelina. As subunidades de flagelina, expostas no corpo
basal e na poro filamentosa dos flagelos, podem ser posicionadas para mediar a
adeso a superfcies, como as de equipamentos e utenslios usados para processar
alimentos. Os flagelos so utilizados na classificao taxonmica de bactrias e se
inserem de diversas formas nos microrganismos; so denominados flagelos peritrquios quando se distribuem em vrios pontos em torno da clula, lofotrquio e
anfilofotrquio se estiverem em grupos em uma das extremidades das clulas ou em
ambas, respectivamente, e monotrquios quando h apenas um flagelo.

47

cap.01

Pesquisas com espcies marinhas de Vibrio sugerem que durante a colonizao da superfcie o flagelo pode funcionar como sensor. Essas bactrias de ambientes marinhos so bacilos planctnicos de 2 mm de comprimento contendo um
nico flagelo polar. A adeso desse microrganismo, provocada em condies de
laboratrio, leva converso dessa clula a uma forma com mais de 30 mm de comprimento e muitos flagelos laterais. Essa alterao na morfologia da clula permite
uma eficiente colonizao da superfcie. O flagelo polar obtm energia a partir do
transporte de on sdio, enquanto o flagelo lateral utiliza o transporte de prtons. A
inibio da rotao do flagelo polar por agentes que bloqueiam os canais de sdio

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


48

resulta na produo de flagelo lateral, sugerindo que, quando as clulas com flagelo
polar se aproximam da superfcie, a rotao desse flagelo pode ser negativamente
afetada. A diminuio na rotao ou no fluxo do sdio um sinal para a produo do
flagelo lateral. Assim, o flagelo polar atua como sensor (DALTON; MARCH, 1998).

5.1.2. Fmbria e Pili


As fmbrias so estruturas semelhantes aos flagelos
(Figura 19), porm no envolvidas com a motilidade do microrganismo, sendo menores
e mais numerosas do que os
flagelos. Apresentam estrutura filamentosa, composta
de subunidades de protena,
denominada pilina. So encontradas em uma variedade de superfcies de clulas,
como de Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa e
Figura 19 - Esquema de um pili, flagelo e fimbria de clulas bacterianas.
Vibrio cholerae, entre outras.
O papel da fmbria na adeso
bacteriana por clulas patognicas tem sido bastante estudado. A interao entre a
bactria e o hospedeiro, ou uma superfcie inerte, depende da protena existente no
corpo ou na ponta da fmbria. A fmbria se liga a receptores especficos no hospedeiro e ativa os genes hospedeiro-clula, com a traduo da sinalizao, levando a
aumento na adeso ou invaso (AUSTIN et al.,1988; DALTON; MARCH, 1998).
Os pilus (Figura 19) so estruturas similares s fmbrias, sendo, em geral, mais
longas, e somente um ou poucos deles esto presentes nas superfcies dos microrganismos. Esses apndices podem ser visualizados por meio da microscopia
eletrnica, porque servem de receptor especfico de vrus e, quando recobertos por
esses microrganismos, podem ser facilmente observados. Tambm envolvidos em
processos de adeso microbiana (BROCK et al., 1994; DI MARTINO et al., 2003), os
pilus geralmente so constitudos por monmeros de uma nica protena, denominada pilina, que, quando reunidos, apresentam estrutura tubular de 3 a 25 nm de
espessura e 0,2 a 20 mm de comprimento.
Mutantes de E. coli que no apresentaram capacidade para produzir pili do
tipo I, ou flagelo, no formaram biofilmes em PVC, havendo poucas clulas aderidas
em pequenos grupos. Pode-se dizer, portanto, que a mobilidade importante para
sobrepor a fora de repulso entre a bactria e o substrato, e, uma vez atingida a
superfcie, o pili do tipo I requerido para estabilizar a adeso (STICKLER, 1999).

Com base em estudos, pode-se assegurar que o pili de Salmonela Enteritidis


tambm est envolvido no processo de iniciao de biofilme em ao inoxidvel e
teflon. Mutantes sem capacidade de produzir uma fmbria agregativa, chamada de
SEF 17, foram incapazes de formar biofilmes espessos tpicos de estirpes selvagens.
Assegura-se ainda que essa fmbria estabiliza o contato clula-clula durante a formao do biofilme (STICKLER, 1999).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Estudos com mutantes de P. aeruginosa que eram incapazes de formar biofilme em PVC mostraram que essas estirpes apresentavam defeito no pili do tipo IV ou
flagelo mediador da motilidade. Estirpes selvagens desse microrganismo formaram
uma monocamada de clulas em superfcie aps quatro horas. Entre cinco e oito
horas, as monocamadas tornaram-se confluentes, fazendo que toda a superfcie ficasse coberta. Os mutantes sem motilidade falharam em aderir ao PVC em um perodo de oito horas. Mutantes com defeito no pili do tipo IV formaram monocamadas
dispersas, porm falharam em adens-las. A retrao e extenso no pili do tipo IV
so consideradas as causas da migrao das clulas atravs da superfcie, que
chamada de twitching. No caso de P. aeruginosa, parece que a motilidade mediada pelo flagelo importante para a adeso e formao de monocamadas dispersas
de clulas (STICKLER, 1999).

5.1.3. Protenas da Superfcie


Celular
Componentes macromoleculares da superfcie da bactria parecem
interagir com os do filme condicionante (MARSHALL, 1992). Estudos
demonstraram que clulas de Vibrio
DW1, devido falta de nutrientes (estarvadas), quando aderidas passam
a metabolizar molculas orgnicas
como cidos graxos e protenas,
iniciando o crescimento e atingindo
o tamanho normal (Figura 20), quando, ento, comeam a se multiplicar.
Essas clulas aderem a uma posio
perpendicular. A clula-me permanece aderida, enquanto a clula-filha
liberada, tornando-se planctnica
(MARSHALL, 1992).
Figura 20 - Ciclos repetidos de adeso e reproduo
de Vibrio marinho DW1: (a) adeso de pequena clula
estarvada, (b) crescimento celular na superfcie do
substrato, (c) duplicao e (d) liberao.
cap.01

Outras bactrias aderem de forma a se colocarem no mesmo plano


da superfcie e se dividem formando

49

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

colnias ou as clulas-filha, que podem ser lentamente liberadas para o meio. Supe-se
que algumas bactrias sejam liberadas para o meio, devido a alteraes da superfcie da
clula ou das propriedades da superfcie (MARSHALL, 1992).
Espcies do gnero Streptococcus expressam um conjunto de componentes
de superfcie importantes para a adeso da clula no hospedeiro. Essa adeso pode
ter dois estgios: um inicialmente reversvel e o outro irreversvel. H evidncias de
que a fase reversvel envolve interaes hidrofbicas entre a clula hospedeira e o
cido lipoteicico da parede celular bacteriana. Observaes adicionais indicaram
que a protena M, uma adesina, de Streptococcus spp. requerida para a adeso
irreversvel. Esse modelo provavelmente anlogo ao que acontece quando a bactria coloniza superfcies inertes. Uma importante classe de adesina liga-se especificamente aos componentes da matriz extracelular, particularmente fibronectina (Fn),
o maior componente dessa matriz. Alguns trabalhos tm enfocado o papel da Fn em
adeso bacteriana e mostraram que Campylobacter jejuni expressa uma protena da
membrana externa (37 kDa) que se liga a Fn (DALTON; MARCH, 1998).
Staphylococcus aureus expressa duas protenas associadas com a parede celular que se ligam fibronectina, chamadas de fnbPA e fnbPB. Mutantes de S.
aureus que no possuam o gene fnbA ou fnbB no foram deficientes na adeso,
porm o duplo mutante para fnbA e fnbB foi completamente deficiente. Se um dos
dois tipos de genes fornecido por meio de plasmdeos, a adeso restaurada
(DALTON; MARCH, 1998).
Experimentos com mutantes de Pseudomonas fluorescens que apresentavam de-

50

ficincia na capacidade de adeso em superfcie mostraram que alguns desses mutantes


eram imveis, enquanto outros eram incapazes de produzir uma protena denominada
ClpP, normalmente encontrada na superfcie da clula. O crescimento em citrato, glutamato ou meio minimamente suplementado com ferro, embora no tenha restaurado
a motilidade, recuperou a capacidade da clula de iniciar a formao do biofilme. Fenmeno semelhante foi observado com mutantes ClpP. Props-se que Pseudomonas
fluorescens pode utilizar mltiplas estratgias para a iniciao da adeso e que essas
so dependentes de sinais do meio ambiente percebidos pelos microrganismos.

5.2. Estrutura e Condies Ambientais do Biofilme


A estrutura do biofilme pode variar de acordo com a localizao, a natureza
dos organismos constituintes e a disponibilidade de nutrientes, apresentando-se
em finas ou espessas camadas. Biofilmes de Pseudomonas aeruginosa, em que
o fluxo de nutrientes foi constante, colonizaram a superfcie de maneira a obter
uma forma semelhante de cogumelos, em que canais de gua interligavam as
microcolnias, como um primitivo sistema circulatrio, distribuindo nutrientes e
removendo resduos das microcolnias (STICKLER, 1999).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Uma questo importante como as clulas de Pseudomonas aeruginosa se


comunicam e coordenam sua sobrevivncia na construo do biofilme. Em bactrias Gram-negativas, a comunicao celular pode ser feita por meio de homosserina
lactonas aciladas (AHLs). Essas pequenas molculas sinalizantes so excretadas por
clulas e se acumulam em culturas em razo da densidade celular. As AHLs podem
interagir com os receptores na superfcie da clula bacteriana que controlam a expresso de genes, o que pode resultar no controle de densidade local de clulas. O
processo da comunicao entre as clulas e a coordenao da densidade celular
denomina-se quorum sensing. Experimentos com mutantes de P. aeruginosa, incapazes de produzir as AHLs, demonstraram que eles produzem uma fina camada de
clulas na superfcie do vidro, e a adio de AHL ao meio permitiu a restaurao da habilidade do mutante para produzir biofilmes do tipo selvagem. Observou-se tambm
que os mutantes em biofilmes no desenvolviam resistncia ao tensoativo biocida
dodecil sulfato de sdio, que era caracterstico do biofilme do tipo selvagem. Concluise que o acmulo de AHLs durante o desenvolvimento do biofilme responsvel pela
transformao de clulas individuais planctnicas em clulas ssseis. Essas substncias coordenam a formao de estruturas complexas de comunidades multicelulares
(STICKLER, 1999).
Determinadas protenas tm importante papel na adeso microbiana. Albuminas, fibrinognio e pepsina, por exemplo, inibem a adeso de espcies do gnero
Pseudomonas ao poliestireno, enquanto a casena favorece o processo de adeso.
De acordo com os estudos, a albumina demonstrou ser pouco favorvel adeso
de Listeria monocytogenes em slica (KUMAR; ANAND, 1998).
Denyer et al. (1993) sugeriram que, na maioria dos casos, a bactria aderida demonstra aumento na atividade metablica, porm somente quando em baixo nvel
de nutrientes. Outros estudos mostraram que o crescimento de Escherichia coli foi
melhorado depois da adsoro em superfcie, mas apenas quando a concentrao
de nutriente (glicose) foi menor que 25 mg.L-1. A adeso na superfcie pode oferecer
vantagem clula para efetuar a captura e, ou, entrada de nutrientes escassos no
meio. Outros autores tambm confirmaram um aumento na atividade metablica
para bactrias associadas superfcie em baixa concentrao de nutrientes ou at
mesmo em concentrao zero.

51

cap.01

O pH e a temperatura tm influncia no grau de adeso do microrganismo.


Pseudomonas fragi mostrou mxima adeso ao ao inoxidvel, em pH na faixa de
7 a 8, que so timos para o seu metabolismo. Outros estudos mostraram que Yersinia enterocoltica adere melhor ao ao inoxidvel a 21 C do que a 35 C ou 10 C,
e que a 35 C as clulas observadas no possuam flagelo, o que sugere que essa
estrutura auxilia o processo de adeso. Quanto ao pH, Yersinia enterocolitica parece
aderir melhor em pH entre 8,0 e 9,5 do que em pH 6,0, nas temperaturas de 10 C,
21 C e 35 C. Em pH 6,0, poucos flagelos foram observados, o que pode ter influenciado negativamente a adeso (HERALD; ZOTTOLA, 1988).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


52

Estudos realizados por Stone e Zottola (1985) indicaram que, na adeso em


ao inoxidvel em fluxo contnuo de leite, Pseudomonas fragi produziu fmbria em
30 minutos a 25 C e dentro de duas horas a 4 C. A adeso de Pseudomonas aeruginosa em ao inoxidvel foi maior em pH timo para o metabolismo da clula, e
presume-se que essa adeso tenha ocorrido em razo do transporte ativo de ctions
para a superfcie, aumentando sua carga superficial (ZOTTOLA, 1994).

5.3. Hidrofobicidade, Carga Eltrica e Rugosidade das Superfcies


Acredita-se que as interaes hidrofbicas tenham papel relevante na aderncia de organismos patognicos e no-patognicos a tecidos vivos e que mecanismos
similares podem ser responsveis pela adeso a substratos inanimados. Interaes
hidrofbicas so induzidas por molculas de gua situadas no meio de solutos no-polares (DENYER et al., 1993). As bactrias Gram-negativas e Gram-positivas apresentam
carga eltrica negativa em pH neutro. Embora os mecanismos no sejam completamente entendidos, esses fatores fsico-qumicos tm importante papel no processo de
adeso microbiana (HOOD; ZOTTOLA, 1995). Os microrganismos podem apresentar
variaes na hidrofobicidade, em razo do modo de crescimento bacteriano e das
condies de cultura. No quimiostato, por exemplo, quando a taxa de crescimento da
cultura aumenta, a hidrofobicidade diminui (KUMAR; ANAND, 1998).
Em relao carga de superfcie, pode-se dizer que tanto a bactria quanto o
substrato adquirem carga, que geralmente negativa, em virtude da adsoro de
ons ou de ionizao de grupos de superfcie, podendo, ento, atrair ons contrrios
que esto na fase aquosa circundante. Assim, quando a bactria aproxima da superfcie do substrato, ocorre o incio do desenvolvimento de interaes resultantes
da atmosfera inica, que circunda as duas superfcies. A intensidade dessa fora
depende do potencial das duas superfcies, da fora inica e constante dieltrica
do meio circundante e depende, ainda, da distncia entre a bactria e o substrato
(DENYER et al., 1993).
O estudo da adeso da bactria superfcie requer o conhecimento das caractersticas fsico-qumicas das duas superfcies - bactria e substrato - e da interao
entre elas. Em geral, ambas as superfcies possuem carga global negativa, e para
que ocorra a adeso necessrio que a barreira de repulso eletrosttica seja superada pela fora atrativa (DENYER et al., 1993).
Ligaes moleculares especficas operam somente a curtas distncias, envolvendo trs ligaes: inicas, de hidrognio e qumicas. As cargas de superfcie tm
influncia na adeso. Microrganismos, assim como algumas superfcies biolgicas
nas quais eles se aderem, freqentemente tm potencial zeta negativo sob condies fisiolgicas. As cargas negativas surgem principalmente de grupos fosfatos
e carboxlicos, podendo ser uniformemente distribudas com cargas positivas dos
grupos amino (BUSSCHER; WEERKAMP, 1987).

Segundo Characklis e Cooksey(1983), adsoro reversvel resulta principalmente de interao de foras a longas distncias, enquanto adeso irreversvel
geralmente considerada resultado de interaes mais definitivas. Essas ltimas interaes, na maioria das vezes, contam com o encurtamento da distncia entre as
foras fsicas de atrao e so otimizadas pela interao dos grupos componentes
da clula-receptora de ligao (DENYER et al., 1993).
A Portaria SVS/MS n 326, de 30 de julho de 1997, aprova o Regulamento
Tcnico sobre as Condies Higinico-Sanitrias e de Boas Prticas de Fabricao

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

O eventual resultado da interao entre essas foras determinado por princpios termodinmicos. O encurtamento da distncia entre o substrato e a bactria faz
que as foras adesivas comecem a predominar, o que favorecido pela presena de
apndices e polmeros extracelulares (DENYER et al., 1993)

para Estabelecimentos Produtores/Industrializadores de Alimentos, definindo as


condies tcnicas para a utilizao de materiais que compem equipamentos e
utenslios. De acordo com essa Portaria, todo o equipamento e o utenslio utilizado
nos locais de manipulao de alimentos que possam entrar em contato com o alimento devem ser confeccionados de material que: I) no libere substncias txicas,
odores e sabores; II) seja no absorvente e resistente corroso; e III) seja capaz de
resistir a repetidas operaes de limpeza e desinfeco.
As superfcies devem ser lisas e estarem isentas de rugosidade e frestas e
outras imperfeies que possam comprometer a higiene dos alimentos. No recomendvel o uso de madeira e de outros materiais que no possam ser limpos e desinfetados adequadamente, a menos que se tenha a certeza de que seu uso no ser
uma fonte de contaminao. Deve ser evitado o uso de diferentes materiais na mes-

53

ma superfcie, para inibir o aparecimento de corroso por contato (BRASIL,1997).


As caractersticas das superfcies auxiliam a realizao de um procedimento de
higienizao adequado (HAYES, 1993). Superfcies utilizadas em indstrias e que entram em contato com os alimentos apresentam diferentes microtopografias de superfcie (rugosidade), podendo apresentar fissuras ou microfissuras ou fendas com
tamanho suficiente para alojar microrganismos, principalmente bactrias (Figura 21).
A ocorrncia dessas imperfeies origina regies de difcil acesso que podem reduzir a eficincia de procedimentos de higienizao, favorecendo o crescimento microbiano e o desenvolvimento de microrganismos (BOWER et al., 1996). A rugosidade
dos materiais tambm influencia a formao do biofilme (TAYLOR; HOLAH, 1996),
mas parece ser menos importante em relao adeso inicial (BOULANGE-PETERMANN et al., 1998). Esse fato pode ser relacionado superfcie de contato entre
microrganismos e superfcies que processa o alimento. Em geral, quanto maior a
superfcie de contato, maior a probabilidade de formao de biofilme, uma vez que
maior a fora inicial de adeso. Contudo, nem sempre quanto maior a rugosicap.01

dade maior a adeso inicial. A influncia da rugosidade da superfcie no processo

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

de formao de biofilme relacionada s dificuldades durante a higienizao de


superfcies rugosas. Equipamentos processadores de alimentos so fontes potenciais de microrganismos patognicos (MIDELET; CARPENTIER, 2004). Haeghebaert
et al. (2002) mostraram que a contaminao de equipamentos contribuiu com 59 %
de surtos de doenas de origem alimentar investigadas na Frana, durante o ano
de 2001. Conseqentemente, importante melhorar o conhecimento dos fatores
envolvidos na transferncia de microrganismos de equipamentos para os alimentos,
especialmente durante o contato.

54

Figura 21 - Adeso microbiana: tamanho do microrganismo x rugosidade.

Alguns parmetros na anlise da rugosidade so analisados sendo os mais importantes: (i) Ra, a mdia aritmtica do valor absoluto das distncias da linha mdia
ao perfil R dentro da latitude da amostra. A unidade desse parmetro o micrmetro; (ii) Rq, o valor mdio da raiz quadrada dos desvios do perfil em relao linha
mdia, dentro da longitude da amostra. Esse parmetro apresenta um significado
estatstico, o desvio-padro das alturas do perfil, sendo considerado mais sensvel
que Ra; (iii) Rz o valor absoluto dos cinco picos mais altos mais o valor mdio
absoluto dos cinco vales mais profundos, dentro da latitude da amostra. Tambm
apresenta a unidade em micrmetros (OLIVEIRA, 2006).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

5.4. Formao de Exopolissacardeo


A matriz extracelular tem contedo
elevado de substncias polimricas extracelulares que variam de 50 % a 90 %. J a
terminologia para o material extracelular
associado com os agregados de clulas
ou biofilmes varia de acordo com a literatura, sendo referido como limosidade,
cpsula, glicoclix, substncia polimrica
extracelular e substncias cimentantes
extracelulares (Figura 22).
O ltimo estgio da adeso da clula superfcie, chamado de adeso irreversvel, envolve interaes especficas
e est associado produo de exopolissacardeos (Tabela 8). H cerca de 40
anos foi demonstrado o envolvimento de
polissacardeos cidos na adeso bacteriana (DENYER et al., 1993). Acares
como glucose, galactose, manose, frutose, ramnose, N-acetilglicosamina, cido
glucornico, cido galacturnico e cido
gulurnico so tpicos constituintes do
polissacardeo bacteriano (DENYER et al.,

55

1993).
De acordo com pesquisas, vrios
polissacardeos e fosfolipdeos acumulam-se mais tarde na fase estacionria,
quando a clula se encontra sob estresse fisiolgico. Pesquisadores tm
observado a produo de diferentes
polissacardeos durante o crescimento exponencial e a fase estacionria.
Pesquisadores induziram a inanio
de clulas em crescimento exponencial, observando que foi liberado um

Figura 22 - Estgios de formao de biofilmes observados


por microscopia eletrnica de varredura (Fonte: ZOLTAI et al,
1981; HERALD; ZOTTOLA, 1988).

polissacardeo viscoso e solvel, enquanto o mesmo polissacardeo no foi produzido por clulas que estavam em
(DENYER et al., 1993).

cap.01

crescimento. Verifica-se, portanto, que a inanio produz diferentes polmeros

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Tabela 8 - Informaes sobre substncias polimricas extracelulares participantes de processo


de adeso

Alguns pesquisadores observaram menor produo de polissacardeos por bactrias sob inanio do que em culturas em crescimento. Quando o meio de crescimento
rico, a bactria pode produzir polmeros taxa elevada, porm liberando-os como
limosidade e no os retendo como cpsula. Anticorpos produzidos em culturas lquidas
reagiram com a matriz do biofilme in situ, o que indica que substncia polimrica ex56

tracelular do biofilme contm alguns polmeros semelhantes aos produzidos no lquido


de cultura pelos organismos. Em um estudo foi mostrado que o mesmo microrganismo
produz mais substncias polimricas extracelulares no biofilme do que em suspenso
em cultura (DENYER et al., 1993).
As substncias polimricas extracelulares influenciam as propriedades fsicas
do biofilme, incluindo difusividade, condutividade trmica e propriedades reolgicas. Devido densidade de cargas e ao estado inico do exopolissacardeo, pode
se formar uma barreira difuso, fazendo-o agir como uma peneira molecular. Em
razo da natureza altamente hidratada e predominantemente polianinica do exopolissacardeo, tambm podem atuar como uma matriz trocadora de ons, contribuindo
para o aumento da concentrao local de substncias inicas, como metais pesados,
amnia e potssio, entre outros, que tm efeito oposto aos dos grupos aninicos. Isso
pode no ter efeito sobre nutrientes carregados, incluindo acares, contudo pode
servir como armadilha para nutrientes catinicos como aminas, especialmente sob
condies oligotrficas (COSTERTON, 1981). A penetrao de molculas carregadas,
como alguns biocidas, pode ser, em parte, reduzida por esse fenmeno.

dade do microrganismo a uma srie de antibiticos; contudo, Nichols et al. (1989)


sugerem que somente a adsoro e a diminuio da difuso causada pelo exopolissacardeo no podem, isoladamente, explicar a resistncia da bactria a antibiticos.
Tornam-se necessrios mais trabalhos para que se possa entender a diminuio
na sensibilidade aos antibiticos pelas clulas em biofilmes. Characklis et al. (1981)
reportaram que a condutividade trmica de um biofilme em cultura mista similar
da gua e, portanto, concluram que o biofilme fornece cerca de 27 vezes mais resistncia transferncia de calor do que o ao inoxidvel de igual espessura. Dessa
maneira, um biofilme bastante fino pode restringir a transferncia de calor atravs
de um tubo de ao inoxidvel (DENYER et al., 1993).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

Alguns polmeros componentes do biofilme podem reduzir muito a sensibili-

Assanta et al. (1998), ao investigarem a adeso de Aeromonas hydrophila em


sistema de distribuio de gua, observaram que o microrganismo aderiu facilmente em todos os tipos de superfcie avaliados, ou seja, ao inoxidvel, cobre e polibutileno, aps um tempo de exposio to curto quanto 1-4 horas, nas temperaturas
de 4 C e 20 C. O polibutileno, com energia de superfcie de 42,2 mJ.m-2, foi mais
colonizado do que o ao inoxidvel, com 65,7 mJ.m-2 de energia de ativao. Poucas clulas aderidas foram observadas em superfcie de cobre, apesar de sua baixa
energia de superfcie de 45,8 mJ.m-2. De acordo com estes autores, isso pode ser
devido a um efeito antimicrobiano do on cobre, afetando a habilidade de a bactria
aderir e multiplicar-se nessa superfcie.
O contato direto entre bactria e substrato pode ser estabelecido, em nvel mo-

57

lecular, por substncias polimricas extracelulares produzidas pelas bactrias. Em


virtude de essas substncias no estarem sujeitas ao mesmo tipo de repulso das
bactrias, podem-se estabelecer ligaes entre a bactria e a superfcie por vrias
combinaes de ligaes qumicas, como eletrosttica, co-valente e de hidrognio,
interaes dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, on-dipolo e interaes hidrofbicas;
conseqentemente, o mesmo tipo de bactria pode aderir em diferentes graus (MARSHALL, 1992).
A cpsula de muitas bactrias composta por polissacardeos, embora algumas espcies do gnero Bacillus possam formar cpsula de polipeptdio. A presena de cpsula pode aumentar a adeso microbiana e atuar como defesa contra
a fagocitose. Esse material pode tambm facilitar a adsoro de agentes txicos,
prevenindo, assim, sua penetrao no citoplasma (BOWER et al., 1996).
Aps o contato inicial com a superfcie, os microrganismos iniciam a producap.01

o de fibras finas, que podem ser vistas por microscopia eletrnica. Essas fibras

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tornam-se mais grossas com o passar do tempo, o que leva formao da matriz
do biofilme, e, dentro dessa matriz, outras substncias orgnicas, inorgnicas e material particulado podem existir juntamente com microrganismos. A produo de
exopolissacardeos aumentada com a adeso da bactria superfcie e, caso as
clulas do biofilme sejam reinoculadas no meio, como clulas planctnicas, haver
menor produo de exopolissacardeos (KUMAR; ANAND, 1998).
Segundo Costerton et al. (1978), o glicoclix integra a membrana externa de
Gram-negativas e do peptideoglicano de clulas Gram-positivas, sendo composto
de diversas fibras de polissacardeos ou protenas globulares; em seu estado hidratado, contm entre 98 % - 99 % de gua. Pseudomonas aeruginosa forma alginato
como maior constituinte do glicoclix e importante para o desenvolvimento de
biofilmes com uma s espcie. Os exopolissacardeos produzidos pelos microrganismos tm importante papel, que o de proteger a clula da desidratao, j que
pode reter gua em quantidade vrias vezes maior que sua massa e se desidrata
lentamente. Em Pseudomonas aeruginosa, a presena de cido urnico acetilado
no alginato bacteriano aumenta a capacidade de hidratao.

58

Figura 23 - Bactria aderida ao ao inoxidavel, mostrando a presena de exopolisacardeo. (Fonte:


ZOTTOLA, 1999)

As porcentagens de componentes orgnicos e inorgnicos no biofilme podem


ser determinadas pela combusto (Tabela 9). Os slidos volteis e fixos refletem a
frao orgnica e inorgnica, respectivamente. A frao voltil de uma populao
microbiana planctnica maior que 90 % e para biofilmes esse valor consideravelmente menor, uma vez que existe uma massa de constituintes inorgnicos aprisionados ou precipitados dentro da matriz do biofilme. Contudo, em experimentos
laboratoriais, em que predominam os componentes biticos, a frao voltil do biofilme pode chegar a 80 % do seu peso seco. A relao carbono/nitrognio cerca
de cinco vezes maior em alguns biofilmes do que em clulas microbianas em razo
provavelmente, da grande quantidade de polmeros extracelulares que, geralmente,
tm pequena quantidade de nitrognio (DENYER et al., 1993).

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

6. Composio dos Biofilmes Microbianos

Tabela 9 - Composio qumica do biofilme avaliada aps a combusto

A frao inorgnica maior em biofilmes que esto em ecossistemas aquticos

59

naturais, onde a argila, a areia e os sedimentos penetram na matriz, influenciando a


sua propriedade fsica (DENYER et al., 1993).
A presena do biofilme pode favorecer a corroso do metal, principalmente a
ocasionada pela aerao diferencial que as clulas sofrem em virtude da distribuio
irregular do biofilme ou, ainda, pela formao de stios de anaerobiose na base, devido respirao microbiana. Isso oferece condies favorveis para o crescimento
de bactrias sulfato-redutoras que usam o hidrognio, gerado em meio ambiente
anaerbio pela combinao de prtons e eltrons, que por sua vez aumentam a
corroso do metal. As bactrias sulfato-redutoras tambm produzem metablitos
corrosivos, como os sulfitos, que levam incorporao de produtos de corroso,

cap.01

como o sulfito de ferro dentro da matriz do biofilme (DENYER et al., 1993).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Referncias
ABIQUIM - ASSOCIAO BRASILEIRA DA INDSTRIA QUMICA. Atividades Setoriais: Silicones. Disponvel em: <http:www.abiquim.org.br/setorial/ silicones/asp>. Acesso em: 29 set. 2004a.
ABIQUIM - ASSOCIAO BRASILEIRA DA INDSTRIA QUMICA. Poliuretanos. Disponvel em: <http:
www.abiquim.org.br/canais.asp?id=13>. Acesso em: 29 set. 2004b.
AKUTSU, C. K. Adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans ao ao inoxidvel e sua resistncias a sanificantes qumicos em condies de uso simulado. Viosa, MG. UFV, 2001. 60 p. Dissertao
(Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viosa, Viosa.
ALLISON, D. G.; McBAIN, A. J.; GILBERT, P. Biofilms: problems of control. In: Community Structure
and Co-operation in Biofilms, Proceedings of the 59th. Simposium of the Society for General Microbiology, Exeter,UK. eds GILBERT, P., LAPPIN-SCOTT, M., WILSON, M. Cambridge, UK. p. 309-328.
University Press,2000.
ANDERSSON, A.; RONNER, U.; GRANUM, P. E. What problems does the food industry have with
the spore-forming pathogens Bacillus cereus and Clostridium perfringens? International Journal of
Food Microbiology, n.28, p.145-155, 1995.
ANDRADE, N. J., AJAO, D.B., ZOTTOLA, E.A. Growth and adherence on stainless steel by Enterococcus faecium cells. Journal of Food Protection, n.11, v.61, p.1454-1458, 1998a.
ANDRADE, N. J., BRIDEGMAN, T.A., ZOTTOLA, E.A. Bacteriocidal activity of sanitizers against Enterococcus faeciuum attached to atainless steel as determined by plate count and impedance methods.
Journal of Food Protection, v.61, p.833-838, 1998b.
ARCURI, E.F. Biofilme bacterianos na indstria de alimentos, Revista Leite e Derivados v.9, n.53,
2000.
ASSANTA, M.A., ROY, D., MONTPETIT, D. Adhesion of Aeromonas hydrophila to water distribution
system pipes after different contact times. Journal of Food Protection, v.61, n.10, p.1321-1329,
1998.

60

ANTUNES, M. A. Sistema multimdia de apoio deciso em procedimentos de higiene em unidades


de alimentao e nutrio. Editora UFV, Viosa, MG, 2003 ( Dissertao de Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos, UFV). 78p.
AUSTIN, J.W., BERGERSON, G. Development of bacterial biofilms in dairy processing lines. Journal of
Dairy Research, v.62, p.509-519, 1995.
AUSTIN, J.W., SANDERS, G., KAY, W.W., COLLINSON, S.K. Thin aggregative fimbriae enhance Salmonella enteritidis biofilm formation. FEMS Microbial Letters, n.162, p.295-301, 1998.
BAKKER. D.P., BUSSCHER, H.J., VAN DER MEI, H.C. Bacterial deposition in a parallel plate and a
stagnation point flow chamber: microbial adhesion mechanisms depend on the mass transport conditions. Microbiology, v. 148, p. 597-603, 2002.
BEECH, I. B. Corrosion of technical materials in the presence of biofilms current understanding and
state of the art methods of study. International Biodeterioration and Biodegradation. V. 53, p. 177183, 2004.
BEECH, I. B., GAYLARDE, C. C. Adhesion of Desulfovibrio desulfuricans and Pseudomonas fluorescens to mild steel surfaces. Journal of Applied Bacteriology, v. 67, p.201-207, 1989.
BEER, D., SRINIVASAM, R., STEWART, S. Direct measurement of chorine penetration into biofilm
during desinfection. Applied Environmental Microbiology, v. 60, p. 4339-4344, 1994.
BERESFORD, M. R., ANDREW, P. W., SHAMA, G. Listeria monocytogenes adheres to many materials
found in food-processing environments. Journal of Applied Microbiology, v. 90, p.1000-1005, 2001.
BOULANGE-PETERMANN, L. Processes of bioadhesion on stainless steel surfaces and cleanability: a
review with special reference to the food industry. Biofouling, v. 5, p.21-36, 1991.

BOWER, C.K., Mc GUIRE, J., DAESCHEL, M.A. The adhesion and detachment of bacteria and spores
on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology, v.7, p.152-157, 1996.
BROCK, T.D., MADIGAN, M.T., MARTINKO, J.M., PARKER, J. Biology of microorganisms. 7ed. New
Jersey: Prentice Hall, 1994. 909p.
BUSSCHER, H.J., WEERKAMP, A.H. Specific and non-specific interactions in bacterial adhesion to
solid substract. FEMS Microbiology, v.46, p.165-173, 1987.
CAMMAROTA, M. C., SANT ANNA, G. L. Metabolic blocking of exopolysaccharides synthesis: effects
on microbial adhesion and biofilm accumulation. Biotechnology. Letters, v. 20, p. 1-4, 1998.
CARPENTIER, B., CERF, O. Biofilms and their consequences with particular reference to hygiene in the
food industry. Journal Applied Bacteriology, v.75, p.499-511, 1993.
CDC CENTER FOR DISEASE CONTROL, USA http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/foodborneinfectionst.htm, Acesso em 28 de novembro de 2006.

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

BOULANGE-PETERMANN, L., RAULT, J. BELLON-FONTAINE, M. N. Adhesion of Streptococcus thermophillus to stainless s steel with different surface topography and roughness. Biofouling, v. 11, p.
201-216, 1998.

CHARACKLIS, W.G., COOKSEY, K.E. Biofilm and microbial fouling. Adv. Applied Microbiology, v.29,
p.93-137, 1983.
CHAVES, L.C.D. Estudo da Cintica de Formao de Biofilmes em Superfcies em Contacto com gua
Potvel. Minho, Braga: Universidade de Minho. 2004, 186p. Dissertao (Mestre em Tecnologia do
Ambiente). Universidade do Minho, 2004.
CHEN, G., ZHU, H. Bacterial adhesion to silica sand as related to Gibbs energy variations. Colloids and
Surfaces B: Biointerfaces, v. 44, p. 4148, 2005.
COLLINS, E.B. Heat resistant psychrotrophic microrganisms. Journal of Dairy Science, v.64, n.1,
p.157-160, 1981.
COSTERTON, J.W., CHENG, K.J., GEESEY, G.G., LADD, T.I., NICKEL, J.C., DASGUPTA, M., MARRIE,
T.J. Bacterial biofilms in nature and disease. Annual Rev. Microbiol., v.41, p.435-464, 1987.
COSTERTON, J.W., GEESEY, G.G., CHENG, K.J. How bacteria stick. Scientific American, v.238, p.8689, 1978.

61

COSTERTON, J.W., LAPPIN-SCOTT, H.M. Behavior of bacteria in biofilms. ASM News, v.55, n.12,
p.650-654, 1989.
CRIADO, M.T., SUREZ, B., FERREIRS, C.M. The importance of bacterial adhesion in the dairy industry. Food Technology, v.48, n.2, p.123-126, 1994.
CZECHOWSKI, M. H. Gasket and stainless steel surface sanitation: environmental parameters affecting bacterial attachment. Austr. Journal of Dairy Technology, p. 38-39, 1990.
DALTON, H.M., MARCH, P.E. Molecular genetics of bacterial attachment and biofouling. Current Opinion in Biotechnology, v.9, p.252-255, 1998.
DENYER, S. P., GORMAN, S. P., SUSSMAN, M. Microbial biofilms: formation and control. Londres:
Blackwell Scientific Publications, 1993. 333 p.
DESROSIER, J.P., LARA, J.C. Isolation and properties of pili from spores of Bacillus cereus. Journal of
Bacteriology, v.145, n.1, p.613-619, 1981.
DI MARTINO, P, CAFFERINI, N., JOLY, B., DARFEUILLE-MICHAUD, A. Klebsiella pneumoniae type 3
pili facilitate adherence and biofilm formation on abiotic surfaces. Research in Microbiology, v. 154,
p. 9-16, 2003.

cap.01

DOYLE, M.P. A new generation of foodborne pathogens. Dairy, Food and Environmental Sanitation,
v.12, n.8, p.490-493, 1992.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

ESCHER, A., CHARACKILIS, W. G. Modeling the initial events in biofilm accumulation. In: CHARACKLIS, W. G. and MARSHALL, K. C. Biofilms. New York, 1990. p. 445-486.
FAPEMIG/FUDAO DE AMPARO PESQUISA DO ESTADO DE MINAS GERAIS. Intoxicao alimentar. Minas faz cincia, n.11, Disponvel em <http:/revista.fapemig.br/11intoxicao.html>acesso
em:janeiro 2003
FIGUEIREDO, H. M.. Adeso bacteriana em modelo de circuito de linha de processamento de leite.
Imprensa Universitria, UFV, 2000. (Tese de doutorado em Cincia e Tecnologia de Alimentos, UFV).
80 p.
FLETCHER, M. Adherence of microorganisms to smooth surfaces. In: BEACHEY, E.H. (Ed.) Bacterial
adherence. New York: Chapman and Hall, 1980. p.78-97.
FLETCHER, M. How do bacteria attach to solid surfaces? Microbiology of the Science, v.4, p.133-136,
1987.
FLINT, S., PALMER, J., BLOEMEN, K., BROOKS, J., CRAWFORD, R. The growth of Bacillus stearothermophylus on stainless steel. Journal of Applied Microbiology, v. 90, p. 151-157, 2001.
FLINT, S.H., BREMER, P.J., BROOKS, J.D. Biofilms in dairy manufacturing plant - Description, current
concerns and methods of control. Biofouling, v.11, n.1, p.81-87, 1997.
FORSYTHE, S. J. Microbiologia da segurana alimentar. Traduo Maria Carolina Minardi Guimares
e Cristina Leonhardt. Consultoria, superviso e reviso tcnica: Eduardo Csar Tondo. Porto Alegre:
Artmed, 2002. p. 151-154.
FUQUA, C., WINNANS, S.C., GREENBERG, E.P. Census and consensus in bacterial ecosystems: the
LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional regulators. Annual Rev. Microbiol., n.50, p.727751. 1996.
FRASC, M. H..B. Mrmores e granitos: uso e conservao. Disponvel em: <http:/www.ipt.br/tecnologia/chat/?ARQ=110> acesso 05dez.2004
GOMEZ-SUAREZ, C., PASMA, J., VAN DER BORDEN, A. J., WINGENDER, J., FLEMMING, H. C., BUSSCHER, H. J., VAN DER MEI, H. C. Influence of extracellular polymeric substances on deposition and
redeposition of Pseudomonas aeruginosa to surfaces. Microbiology, v. 148, p.1161-1169, 2002.

62

HAEGHEBAERT, S., LE QUERREC, F., BOUVET, P., GALLAY, A., ESPI, E. VAILLANT, V. Les toxi-infections alimentaires collectives en France. Bulletin Epidmiologique Hebdomadaire, v. 50, p. 249-253,
2002.
HAMMER, P.; LEMBKE, F.; SUHEREN, G; HEESCHEN, A. Characterization of a heat resistant mesophilic Bacillus species affecting quality of UHT milk- a preliminary report. MILCHWISTSCHAFTLICHE,
V.47, P.303-311, 1995
HAYES, P. R. Microbiologa e higiene de los alimentos. Traduo Bernab Sanz Prez. Zaragoza :
Acribia, 1993. p.187-196.
HERALD, P. J., ZOTTOLA, E. A. Scanning electron microscopic examination of Yersinia enterocolitica
attached to stainless steel at selected temperatures an pH values. Journal of Food Protection, v. 51,
n. 6, p. 445-448, 1988.
HJELM, M., HILBERT, L. R., MOLLER, P., GRAM, L. Comparison of adhesion of the food spoilage bacterium Shewanella putrefaciens to stainless steel and silver surfaces. Journal of Applied Microbiology,
v. 92. p. 903-911, 2002.
HOLAH, J. T., THORPE, R. H. Cleanability in relation to bacterial retention on unused an abraded
domestic sink materials. Journal of Applied Bacteriology, v. 69, p. 599-608, 1990.
HOOD, S. K. Adherence of foodborne microrganisms to stainless steel. Ph.D Thesis. University of
Minnesota, St Paul, p.129, 1996.
HOOD, S., ZOTTOLA, E. A. Biofilms in food processing. Food Control, v. 6, p. 8-18, 1995.

KLIJN, N.;HERMAN, L.; LANGEVELD, L.; VAEREWIJCK, M.; WAGENDORP, A .A .; HUEMER, I.; WEERKAMP, A. H. Genotypical . characterization of Bacillus sporothermodurans strains surviving UHT
sterilization. International Dairy Journal, v.7,p.421-428, 1997
KUMAR, C. G., ANAND, S. K. Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology, v. 42, p. 9-27, 1998.
JULLIEN, C.; BNZECH, T.; CARPENTIER, B; LEBRET, V.; FAILLE, C. Identification of surface characteristics relevant to the hygienic status of stainless steel for the food industry. Journal of Food
Engineering, v.56, p.77-87, 2002.
LARSEN, H. D. e JORGENSEN, K. The occurrence of Bacillus cereus in danish pasteurized milk..
International Journal of Food Microbiology, v.42, p.9-27, 1998.
LE CLERCQ-PERLAT, M. N., LALANDE, M. Cleanability in relation to surface chemical composition and
surface finishing of some materials commonly used in food industries. Journal of Food Engineering,
v. 23, p. 501-517, 1994.

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

INSTITUTO DO PVC. O PVC. Disponvel em: < http://www.institutodopvc.org/ pvc.htm>. Acesso


em: 29 set. 2004.

LEJEUNE, P. Contamination of abiotic surfaces: what a colonizing bacterium sees and how to blur it.
Trends in Microbiology, v. 11, p. 179-184, 2003.
LEREBOUR, G. CUPFERMAN, S. BELLON-FONTAINE, M. N. Adhesion of Staphylococcus aureus and
Staphylococcus epidermidis to the Episkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. Journal of Applied Microbiology, v. 97, p. 7-16, 2004.
LPEZ, E. S. Piedras, granitos y marmoles. 7 ed. Barcelona:CEAC,1970. 200p.
MAFU, A.A., ROY, D., GOULET, J., MAGNY, P. Attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel,
glass, polypropylene, and rubber surfaces after short contact times. Journal of Food Protection, v.53,
n.9, p.742-746, 1990.
MARSHALL, K.C. Biofilms: an overview of bacterial adhesion, activity, and control at surfaces. American Society of Microbiology News, v.58, p.202-207, 1992.
MARSHALL, K.C., STOUT, R., MITCHELL, R.. Mechanism of initial events in the sorption of marine
bacteria to surfaces. Journal of General Microbiology, v.68, p.337-348, 1971.

63

MIDELET, G., CARPENTIER, B. Impact of cleaning and disinfection agents on biofilm structure and on
microbial transfer to a solid model food. Journal of Applied Microbiology, v. 97, p. 262-270, 2004.
MOSTELLER, T.M., BISHOP, J.R. Sanitizer efficacy against attached bacteria in a milk biofilm. Journal
of Food Protection, v.56, n.1, p.34-41, 1993.
NORTEMANS, S., DORMANS, J. A. M. A., MEAD, G. C. Contribuition of surface attachment to the establishment of microorganisms in food processing plants: a review. Biofouling, v. 5, p. 21-36, 1991.
OLIVEIRA, K. M. P. Adeso de Salmonella Enteritidis em diferentes superfcies de processamento
de alimentos. Londrina, P: UEL, 2006. 115p. Dissertao (Doutorado em Cincias de Alimentos) Universidade Estadual de Londrina, 2006.
OLIVEIRA, R., AZEREDO, J., TEIXEIRA, P. The importance of physicochemical properties in biofilm
formation and activity. Biofilms in wastewater treatment. 2003.
OTOOLE, G. Biofilm formation as microbial development. Annual Review. Microbiology, v. 56, p.
187-209, 2000.
OTOOLE, G.A., KOLTER, R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Molecular Microbiology, n.30, p.295-305, 1998a.

cap.01

OTOOLE, G.A., KOLTER, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS356


proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Molecular Microbiology,
n.28, p.449-461, 1998b.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

PALMER, J. Hygienic milk production and equipment cleaning. New Zeland: Fermoy: Moorepark
Research Centre, 1998. 47p.
PARIZZI, S. Q. F. Adeso bacteriana em diferentes superfcies avaliada pela microscopia de epifluorescncia e contagem em placas. Viosa, MG: UFV, 1999. 58p. Dissertao (Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de Viosa, 1999.
PARIZZI, S. Q. F.; ANDRADE, N. J.; SOARES, N.F.F.; SILVA, C.A..B. MONTEIRO, E.A.M. Bacterial adherence to different inert surfaces evaluated by epifluorescence microscopy and plate count method.
Brazilian Archives of Biology and Technology, v.47, n.1, p.77-83, 2004
PETTERSSON , B.; LEMBKE, F. HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, G. Bacillus sporothermodurans, a new specie producing highly heat-resistant endospore. J. Systematic Bacteriolgy, v.46,
n.3, p759-764,1996
POMPERMAYER, D. M. C., GAYLARDE, C., C. The influence of temperature on the adhesion of mixed
cultures of Staphylococcus aureus and Escherichia coli to polypropylene. Food Microbiology, v. 17,
p. 361-365, 2000.
RODOLFO Jr., A., NUNES, L. R., ORMANJI, W. Tecnologia do PVC. So Paulo: Proeditores/Braskem,
2002.400 p.
RODRIGUEZ, F. Principles of polymer systems. 3rd ed. New York: Hemisphere Publishing Corporation, 1989. p. 602-603.
RONNER, U., HUSMARK, U., HENRIKSSON, A. Adhesion of Bacillus spores in relation to hydrophobicity. Journal of Applied Bacteriology, v.69, p.550-556, 1990.
ROSSONI, E. M. M., GAYLARDE, C. C. Comparison of sodium hypochlorite and peracetic acid as
sanitising agents for stainless steel food processing surfaces using epifluorescence microscopy. International Journal of Food Microbiology, v. 61, p 81-85, 2000.
SAMSONOFF, W.A., HASHIMOTO, T., CONTI, S.F. Ultrastructural changes associated with germination and outgrowth of an appendage-bearing Clostridial spore. Journal of Bacteriology, v.101, n.3,
p.1038-1045, 1970.
SAND. W. Microbial mechanisms of deterioration of inorganic substrates a general mechanistic
overview. International Biodeterioration & Biodegradation v. 40, p. 183-190, 1997.

64

SASAHARA, K.C., ZOTTOLA, E.A. Biofilm formation by Listeria monocytogenes utilizes a primary colonizing microrganism in flowing systems. Journal Food Protection, v.56, n.12, p.1022-1028, 1993.
SHARMA, P.K., HANUMANTHA RAO, K. Adhesion of Paenibacillus polymyxa on
chalcopyrite and
pyrite: surface thermodynamics and extended DLVO theory. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,
v.29, p. 21-38, 2003.
SAUER, K. CAMPER, A.K.; ERLICH, G.D. COSTERTON, J.W.; DAVIES, D.G. Pseudomonas aeruginosa
displays multiple phenotypes during development as biofilm. Journal of Bacteriology, v.184, p11401153, 2002
SCHWACH, T.S., ZOTTOLA, E.A. Scanning electron microscopy study on some effects of sodium
hipoclorite on attachment of bacteria to stainless steel. Journal of Food Protection, v.47, n.10, p.756759, 1984.
SCKOKEN-ITURRINO, R.P.; NADER, F.; DIMENTEIN, A.R. Ocorrncia de bactrias esporuladas dos
gneros Bacillus e Clostridium em amostras de leite longa vida. Higiene Alimentar, v.102, n.42.p.2527, 1996
TE GIFFEL, M. C,; BEUNER, RR.; VAN DAM, W.F. SLAGHUIS, B.; ROUMBTS F.M. Sporicidal effect of
disinfectants on Bacillus cereus isolated from the milk processing environment. International Biodegradation; p.412-230, 1995
SNYDER, JR, O.P. Control of surface microorganisms and biofilms. Dairy, Food and Environmental
Sanitation, v.12, n.7, p.525-529, 1992.

STICKLER, D. Biofilms. Current Opinion in Biotechnology, v.2, p.270-275, 1999.


STONE, L. S., ZOTTOLA, E. A. Relationship between the growth phase of Pseudomonas fragi and
attachment to stainless steel. Journal of Food Science, v. 50, p. 951-956, 1985.
TAKAZAKI, M., SUDO, R. NISHIMURA, O., KIM, H.Y. Simultaneous removal of nitrogen and THM
precursors by developed submerged biofilm process for drinking water. Wat. Sei. Tech., v.26, n.9,
p.2021-2024, 1992.
TAYLOR, J. H., HOLAH, J. T. A comparative evaluation with respect to the bacterial cleanability of a
range of wall and floor surface materials used in the food industry. Journal Applied Bacteriology, v.
81, p. 262-266, 1996.
TROLLER, J.A. Sanitation in food processing. 2th edition, New York: Academic Press, 1993. p.5269.
VAN DER MEI, H.C., VAN DE BELT-GRITTER, B., DOYLE, R.J., BUSSCHER, H.J. Cell Surface Analysis
and Adhesion of Chemically Modified Streptococci. Journal of Colloid and Interface Science, n. 2,
v. 241, p. 327-332, 2001.

Adeso e Formao de Biofilmes Microbianos

STEVENS, M. P. Polymer Chemistry: an introduction. 2nd ed. Oxford: Oxford University Press, 1990.
p. 440-492.

VAN LOOSDRECHT, M. C. M., LYKLEMA, J., NORDE, W., ZEHNDER, A. J. B. Influences of interfaces on
microbial activity. Microbiology, v. 54, p.75-87, 1990.
VAN OSS, C.J.; GIESE, R.F.; COSTANZO, P.M. DLVO and non-DLVO interactions in hectorite. Clays
Clay Minerals, v. 38, p. 151-159, 1990.
VAN OSS, C. J. Interfacial forces in aqueous media. New York: Marcel Dekker, Inc., 1994.
VAN OSS, C.J. The forces involved in bioadhesion to flat surfaces and particles-their determination
and relatives roles. Biofouling, v. 4, p. 25-35, 1991.
VAN OSS, C. J., GIESE, R. F. The hidrophilicity and hidrophobicity of clay minerals. Clays and Clay
Minerals, v. 43, p. 474-477, 1995.
VERGNAUD,J.M. Problems encoutered for food safety with polymer packages: chemical exchange,
recycling. Advances in Colloid and Interface Science, v.78, n.3, p.267-297, 1998.

65

VOGLER, E. A. Structure and reactivity of water at biomaterial surfaces. Advances in colloid and
interface science, v. 74, p. 69-117, 1998.
WHITEKETTLE, W.K., Effects of surface-active chemicals on microbial adhesion. Journal of Industrial
Microbiology, v. 7, p.105-116, 1991.
ZACARCHENCO, O. B., LEITO, M.F.F. Avaliao e otimizao da metodologia para contagem de Bacillus sporothermodurans. Revista do Instituto de Laticnios Cndido Tostes, v.54, n.309,p134-150,
1999
ZOBELL, C.E. The effect of solid surfaces upon bacterial activity. Journal of Bacteriology, v.46, p.3956, 1943.
ZOBELL, C.E., ALLEN, E.C. Attachment of marine bacteria to submerged surfaces. Proc. Soc. Exp.
Biol. Med., v.30, p.1409-1411, 1935.
ZOLTAI, P.T., ZOTTOLA, E.A., MCKAY, L.L. Scanning electron microscopy of microbial attachment to
milk contact surfaces. Journal of Food Protection, v.44, n.3, p.204-208, 1981.
ZOTTOLA, E. A . Special techniques for studying microbial biofims in food system. In: Tortorello, M.
L. & Gendel, S. M. Food microbial analysis new technologies. IFT basic simposium series. Marcell
Dekker, INC. Cap. 16 p. 315-3346, 1997.

cap.01

ZOTTOLA, E. A., SASAHARA, K. C. Microbial biofilms in the food processing industry Should they
be a concern? International Journal of Food Microbiology, v. 23, p. 125-148, 1994.

o
a es
i
op Ad es
c
s a ilm
o
r
ic o d Biof
M ud e
t d
m
s
e
o
E
l
o
t u nicas s no a
p c da orm os
a
T sa F an
C
U da obi
e icr
M

02

1.

Introduo

2.

Microscopia ptica de Luz


2.1. Tipos de Microscopias de Luz e suas Aplicaes
2.2. Microscopia Eletrnica

3.

Aplicao da Microscopia no Estudo da Adeso e Formao de Biofilme


3.1. Microscopia de Fora Atmica
3.2. Uso da Microscopia de Fora Atmica na Avaliao de Adeso de Microrganismos e Anlise de Rugosidade de Superfcies
3.3. Adeso Bacteriana em Diferentes Superfcies Avaliada pela Microscopia
de Epifluorescncia.
3.4. Adeso Bacteriana e Formao de Biofilmes Observada pela Microscopia Eletrnica de Varredura
3.5. Avaliao de Superfcie de Ao Inoxidvel por MFA

4.

Concluso

5.

Referncias

Cludia Alencar Vanetti


Gino Ceotto
Eduardo Alves
Nlio Jos de Andrade

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1. Introduo
No nvel atual da pesquisa ps-genmica, o prximo desafio da pesquisa a
compreenso da interao das macromolculas em clulas vivas, embora, em pases em desenvolvimento, como o Brasil, muito estudo ainda tenha de ser feito sobre
nveis bsicos de conhecimento de organismos prprios das regies tropicais. Atualmente, com a comprovada mudana climtica que est ocorrendo em todo o globo,
os problemas tpicos de pases tropicais, antes restritos ao hemisfrio sul, devero
se estender parte do hemisfrio norte, atingindo pases ou parte de pases antes de
clima temperado. Portanto, onde predominavam invernos rigorosos, cujo clima controlava naturalmente a entrada de populao de patgenos tpicos do hemisfrio sul,
a partir de agora tero tambm de se preocupar com contaminantes dessas regies
de invernos amenos.
Em outros captulos deste livro, discorre-se sobre a contaminao microbiana
na indstria alimentar, com nfase na adeso de clulas, formao de biofilmes,
propagao de bactrias e seu controle, dentre outros. Neste captulo, faz-se uma
sntese sobre o uso da microscopia, tanto ptica de luz (= microscopia de luz) quanto eletrnica e de fora atmica, como mais uma ferramenta importante nos estudos
bsicos de contaminao bacteriana na indstria alimentcia e no diagnstico e na
avaliao de testes metablicos, qumicos, bioqumicos, biofsicos, fsicos e de controle. Sero feitos comentrios sobre algumas caractersticas exclusivas e importantes que diferenciam microscpios pticos de luz (microscpios de luz), microsc-

68

pios eletrnicos de varredura (MEV) e de transmisso (MET), microscpio ptico de


varredura a laser (Confocal), microscpio de fora atmica (MFA), sondas de raios-X
e a interao entre alguns deles, dando-se nfase aos possveis usos de cada um,
com a finalidade de ajudar aos estudantes e pesquisadores na deciso sobre qual(is)
o(s) aparelho(s) mais indicado(s) para o desenvolvimento de seu trabalho.
preciso sempre se ter em mente que a escolha do tipo de microscpio a
ser empregado est unicamente relacionada com o objetivo que se quer alcanar,
ou seja, todos os tipos de microscpios ou sondas so igualmente importantes,
e a sua escolha depende apenas das caractersticas deles e do apurado ajuste da
metodologia necessria para alcanar determinado fim. Em biologia, preciso saber
de antemo se o estudo apenas morfolgico ou diagnstico, se histolgico ou
celular ou de localizao de molculas bioqumicas ou minerais, ou de interao
entre molculas. Por exemplo, no funcional realizar uma pesquisa investigativa
de um rgo completo usando-se, de incio, um microscpio eletrnico de transmisso ou, ao contrrio, usar um microscpio de luz de campo claro ou uma lupa
com o objetivo de localizar exatamente certa macromolcula em determinada or-

um ordenamento natural do macro para o milimtrico e, da, para o micromtrico


e nanomtrico. Evidentemente que, se j se dispe de informaes a respeito de
determinado assunto, podem-se queimar etapas.
As siglas MEV, MET e MFA referem-se tanto ao microscpio quanto microscopia eletrnica de varredura, de transmisso e de fora atmica, conforme o contexto da frase.

2. Microscopia ptica de Luz


Com o advento dos microscpios no sculo XVII, o limite de resoluo do olho
humano, que de 0,1 milmetro, aproximadamente, foi estendido para 0,1 a 0,2
micrmetro, com o desenvolvimento de lentes de vidro usadas em microscpios de
luz convencional.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

ganela celular. Entretanto, os passos a serem dados devem, de preferncia, seguir

O microscpio ptico de luz, agora denominado microscpio de luz ou microscopia de luz, um sistema ptico capaz de fornecer uma imagem ampliada de
um objeto, permitindo a observao de detalhes invisveis a olho nu. constitudo
basicamente por dois conjuntos de lentes: o conjunto objetiva e o conjunto ocular.
A objetiva d uma imagem real ampliada e invertida do objeto; a ocular, por sua vez,
fornece uma imagem virtual que, atravs do cristalino, se projeta na retina do globo
ocular e interpretada pelo crebro.
Na microscopia de luz, o componente mais crtico a objetiva. nela que se

69

forma a imagem inicial, assim como ela que determina a resoluo do microscpio, sendo a principal responsvel pela capacidade de aumento do objeto.
A capacidade de aumento de uma lente de vidro depende da sua capacidade ou
limite de resoluo. O limite de resoluo (LR) de uma lente, ou de um microscpio,
por sua vez, medido como a capacidade da lente de resolver a menor distncia entre
dois pontos. Ele calculado pela frmula LR = k x /AN, portanto o limite de resoluo
diretamente proporcional ao comprimento de onda do espectro visvel usado (, que
varia da luz azul = 488 nm luz vermelha = 640 nm) multiplicado por um fator (k) de
0,61 e inversamente proporcional abertura numrica (AN). Conseqentemente, pela
frmula podemos concluir que, usando filtro para comprimento de onda azul e uma
objetiva com (AN) de 1,4, o microscpio estar apto a separar dois pontos com 0,5
micrmetro de distncia entre eles. No outro extremo, com a mesma objetiva usando
filtro de luz vermelha, a resoluo do aparelho cairia para 0,7 micrmetro, ou seja, o
microscpio no poderia resolver distncias menores que 0,7 micrmetro entre dois
cap.02

pontos, fornecendo como imagem final apenas um ponto.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

A AN de uma lente fornecida pelo fabricante, e ela se refere ao ngulo de captao dos feixes luminosos que passam atravs da lente condensadora, depois pela
lente objetiva. Ou seja, uma lente objetiva com capacidade de aumento de 100 x e
que trabalha imersa em leo possui maior AN do que uma lente de 10 x, porque trabalha mais prxima lente condensadora. Uma boa objetiva tambm varia com o tipo
de material do qual a lente fabricada e com os tipos de aberraes luminosas corrigidas, ou seja, lentes com correes para aberrao cromtica, aberrao esfrica,
como astigmatismo, curvatura do campo (HIBBS, 2004). A melhor lente de aumento
de 100 x a Plan-Apochromatic (Zeiss) usada em imerso em leo, que possui AN de
1,40. No lugar do leo, podem-se usar outros lquidos como meio contnuo de ligao
entre a amostra e a objetiva, como gua e glicerina. Entretanto, um bom leo aquele
que possui o ndice de refrao semelhante ao do vidro da lamnula, praticamente
no causando desvio por refrao entre a lamnula e a objetiva. Existem objetivas
apropriadas para o uso com gua como lquido de imerso da lente.
O nome das lentes objetivas varia com o fabricante. Geralmente, FLUAR significa lente de fluoreto que transmite luz visvel e luz ultravioleta (UV); PLAN ou PL significa lente de campo plano; e lente APO refere-se lente apocromtica, isto , com
correo para as aberraes das trs cores azul, verde e vermelho, dentre outros.
Para maiores detalhes sobre tipos de lentes e principais vantagens, consultar
os sites dos principais fabricantes de microscpios ( OLIMPUS, 2007a; ZEISS, 2007;
LEICA, 2007); sobre abertura numrica e resoluo (MICROSCOPYU, 2007abcf); origens do microscpio ( FIOCRUZ, 2007ab) e limitaes dessa microscopia ( WIKIPE-

70

DIA, 2007ab).

2.1. Tipos de Microscopias de Luz e suas Aplicaes


Nesta parte do captulo, pretende-se discorrer ligeiramente sobre as especificidades tcnicas de diferentes microscpios de luz que podero ser empregados no
estudo da adeso e formao do biofilme, considerando-se a amplitude de resoluo do microscpio de luz.
preciso frisar, entretanto, que um microscpio, por mais bem equipado que
esteja, no produzir informaes suficientemente boas para publicao se no estiver com o caminho luminoso muito bem ajustado. Para isso, principalmente antes
de registrar as imagens, imprescindvel que se proceda iluminao de Khler,
para cada aumento da objetiva a ser usada (HIBS, 2004): 1. Certificar-se de que a
lmpada do microscpio est focalizada na abertura frontal da condensadora. 2.
Focalizar um espcime. No mudar o foco durante o restante do procedimento. 3.
Fechar parcialmente o diafragma de campo. 4. Focalizar a imagem do diafragma de
campo, ajustando-se o boto de foco da condensadora. 5. Centralizar a imagem

condensadora. 6. Abrir o diafragma de campo at que as margens desapaream


do campo. Esse o limite para tal aumento. 7. Remover uma ocular e olhar dentro
do tubo do microscpio e abrir o diafragma de ris at que ele ocupe 3/4 do campo
da objetiva. Se fechar mais o diafragma de ris, o contraste aumenta, mas perde-se
resoluo, ou seja, a abertura numrica (AN) da lente no estar sendo usada em
sua completa capacidade. A posio 3/4 um equilbrio entre resoluo e contraste.
8. Controlar a intensidade de iluminao colocando-se um filtro ptico de densidade
neutra ou ajustando-se o controle de intensidade de voltagem da lmpada. No use
o diafragma de fase ou a condensadora de ris para ajustar a intensidade de luz.
Dentre os diferentes microscpios de luz, os mais usados nos estudos bacterianos so o de epifluorescncia e o confocal (ZOTTOLA et al.,1997). Para maiores
informaes, consultar Wikipedia (2007ab), Microscopyu (2007e).

2.1.1. Microscopia de Luz Comum ou de Campo Claro

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

do diafragma de campo dentro do campo de viso, usando os botes de ajuste na

O microscpio de luz comum, tambm denominado microscpio de campo


claro, encontrado praticamente em todos os laboratrios.
Dentre os microscpios, o mais fcil de usar, porm possui limitaes: 1. baixo poder de resoluo (restrita ao menor da luz visvel); 2. normalmente, a profundidade de campo que pode ser examinada pequena, com exceo das lupas; 3. s
trabalha com apoio (lmina e lamnula) transparente, como vidro, exceto a lupa; 4.
o material, para ser observado, precisa ser translcido luz, entretanto precisam ser
corados se forem hialinos, por exemplo clulas bacterianas. Apesar disso, inmeras

71

pesquisas em biofilmes microbianos foram realizadas utilizando esse instrumento e,


assim, reconhece-se que um instrumento til na investigao inicial e na preparao de materiais bacteriolgicos.
Geralmente, os microscpios de luz empregados em biologia permitem a observao de objetos transparentes aos raios de luz, com a exceo do microscpio
esterioscpico ou lupa. Podem ser equipados com diferentes fontes de luz, condensadores, objetivas, oculares e lentes auxiliares, desempenhando funes diferentes,
descritas nos tpicos subseqentes.

2.1.2. Microscopia de Campo Escuro


O microscpio de campo escuro baseia-se no princpio de que a luz dispersa
ao atingir a superfcie dos materiais que possuem diferentes ndices de refrao.
usado para aumentar o contraste de amostras no coloridas. Consiste num microscpio comum, cujo condensador substitudo por outro com um disco negro no

cap.02

centro e um anel hialino circundando o disco opaco. Assim, apenas os raios de luz

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

oblquos, que atravessam o anel da condensadora, iluminaro o objeto. Graas ao


efeito de Tyndall, os objetos aparecem brilhantes em conseqncia da disperso
da luz, enquanto o fundo permanece escuro. Ainda que o seu poder de resoluo
seja inferior ao do microscpio de campo claro, este microscpio permite detectar
estruturas menores, sem que, todavia, os seus detalhes sejam distinguidos claramente. O microscpio de campo escuro amplamente utilizado para a visualizao
e contagem de clulas bacterianas, em lminas de vidro. Entretanto, devido ao brilho intenso das partculas, este sistema no pode ser usado para medies. Para
maiores informaes, consultar Wikipedia (2007c).

2.1.3. Microscopia de Contraste de Fase


O microscpio de contraste de fase um microscpio ptico de luz dotado
de um sistema ptico especial que transforma diferenas de fase dos raios luminosos em diferenas de intensidade. Desse modo, o microscpio de contraste
de fase possibilita o estudo de materiais vivos e no coloridos porque acentua
pequenas diferenas de ndice de refrao e de espessura entre os vrios componentes da amostra.
Esse microscpio baseia-se no princpio de que a densidade de um corpo
determina a velocidade com que a luz o atravessa e, conseqentemente, diferentes densidades possuem distintos ndices de refrao. Quando uma partcula
transparente, cujo ndice de refrao prximo ao do meio em que est imersa,
atravessada por um raio luminoso, uma parte do raio atravessa sem se desviar,

72

enquanto outra parte se difrata, desviando-se, no atingindo a objetiva. No microscpio de contraste de fase, o raio mais lateral que passa atravs da objetiva
adiantado de l em relao luz central, pela introduo de uma placa anelar,
na objetiva e de um diafragma anelar no condensador. A placa anelar um disco
transparente com um sulco em forma de anel; ela ajustada de forma a coincidir
com a imagem direta do diafragma anelar do condensador. O efeito de fase decorre da interferncia entre a imagem geomtrica fornecida pela parte central da
objetiva e a imagem difratada, dada pelos raios laterais que so adiantados em 1/4
l. Essas diferenas, transformadas em diferenas de intensidade, so traduzidas
em imagens luminosas s quais a retina sensvel. As objetivas para contraste de
fase so marcadas com as letras Ph (phase).
Os microscpios equipados com contraste de fase so relativamente comuns
nos laboratrios. So muito usados no estudo de clulas vivas e transparentes, que
no podem ser coloridas. O efeito obtido semelhante ao da iluminao DIC (differential interference contrast) embora sem a sofisticao da 3D (item 2.1.4.). Devido
aos halos luminosos que formam em torno do espcime, no devem ser usados
em medies porque tornam o limite muito impreciso. Esse tipo de microscopia

Bacillus cereus e Bacillus stearothermophilus, espcies importantes comumente


encontradas em leite cru, podendo sobreviver pasteurizao, e capazes de aderir
s superfcies usadas para processamento de leite. Para maiores informaes, consultar (MICROSCOPYU, 2007b).

2.1.4. Microscopia de Imagem Nomarski ou DIC (differential interference


contrast)
A ptica Nomarski, ou imagem DIC, pode ser usada para observar clulas vivas,
no coloridas, e outros materiais biolgicos que sejam naturalmente muito pouco
contrastantes. uma ptica cara, embora muito usada em culturas de clulas animais, fungos e vegetais, dentre outros. O primeiro microscpio de ptica Nomarski
foi produzido comercialmente, em 1965, pela Zeiss.
medida que a luz atravessa a amostra, ela submetida a diferentes fases
pequenas, principalmente em funo de mudanas no ndice refrativo da amostra. A

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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foi usado, com sucesso, nos estudos de adeso de esporos de Bacillus subtilis,

imagem final muito interessante e informativa, porque a luz polarizada provoca um


sombreamento das estruturas, formando uma imagem aparentemente tridimensional. O efeito 3D do DIC no um 3D real, porque o efeito produzido mais pelos
diferentes ndices de refrao das estruturas do que pela forma e altura destas.
Para se proceder s anlises DIC, o aparelho precisa estar equipado com peas
adicionais especialmente projetadas para serem instaladas nas lentes objetivas e
na condensadora de um microscpio de luz de campo claro. So dois prismas de
Wollaston, ficando um situado logo abaixo da lente condensadora e o outro logo

73

aps a objetiva. O ajuste cuidadoso dos prismas que d maior ou menor efeito
de sombreamento ou 3D imagem. No se pode esquecer, entretanto, de que a
imagem DIC produzida em um microscpio de luz, portanto a resoluo da imagem permanece a mesma dos demais microscpios de luz, exceto o confocal. Isso
significa que o trabalho com clulas isoladas de dimenses bacterianas tem baixa
resoluo, mas nos estudos de biofilme produz resultados interessantes.
Atualmente, tem-se usado a iluminao Nomarski em conjunto com o Confocal
(veja 2.1.6.), o que tem gerado imagens muito ilustrativas porque delineia, no fundo,
em tons de cinza, o espcime, ajudando a localizar na clula ou em parte do tecido
o elemento ou a molcula fluorescente. Mais recentemente, com a popularizao
do uso do microscpio de fora atmica (MFA) (veja 2.3.) entre os biologistas, a iluminao Nomarski tambm tem sido empregada como complementao das imagens obtidas pelo MFA, com grandes ganhos de informao, inclusive em estudos
de clulas vivas (MADJ et al., 2006). Outro aspecto positivo do uso da iluminao

cap.02

Nomarski em conjunto com microscpios de fluorescncia que ele permite fazer

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

a localizao do stio que se pretende estudar antes de usar a luz UV que causa o
apagamento da fluorescncia, portanto reduz o branqueamento da amostra. Para
mais informaes, consultar Microscopyu (2007d).

2.1.5. Microscopia de Fluorescncia


Desde 1940, explora-se a fluorescncia, que a propriedade pela qual uma
molcula emite luz a determinado especfico quando irradiado com uma luz de
menor. H uma exceo: microscpio multifotnico em que uma luz de grande
capaz de excitar um fluorforo que emite curta.
O microscpio de fluorescncia permite fazer estudo dos constituintes celulares ou clulas que manifestem autofluorescncia ou fluorescncia secundria a eles
transmitida por corantes especiais chamados de fluorforos (HIBBS, 2004). Aqui,
preciso fazer uma distino entre fluorocromo e fluorforo. O fluorocromo, tambm
chamado de sonda fluorescente, uma molcula normalmente protica que exibe
fluorescncia; muitas vezes, um anticorpo que carrega o fluorforo. Assim, o fluorforo o elemento que fluoresce adicionado a uma protena que, isolada, no
capaz de emitir fluorescncia.
Para que ocorra a fluorescncia, necessrio usar um conjunto de filtros que
permitam passar apenas o comprimento de onda daquela luz emitida pelo fluorforo
excitado, o qual observado fluorescendo em um fundo escuro. Emprega-se, para
tanto, a luz ultravioleta (UV), de comprimento de onda inferior a 350 nm, de forma a
se obterem radiaes emitidas na faixa de 400 nm a 700 nm, isto , nas vrias cores

74

do espectro da luz visvel. As cores de fluorescncia emitidas, ento, dependem do


fluorforo usado ou, mais recentemente, dos genes do grupo de GFP (green fluorescence protein) hibridizado ao espcime. com recurso da fluorescncia que se
evidenciam, por exemplo, os antgenos associados a anticorpos marcados com fluorforos, ou fluorocromos, ou organelas em que se incorporou a protena produzida
pelo gene GFP (HIBBS, 2004).
Os microscpios de fluorescncia so semelhantes aos convencionais. A diferena est na fonte de iluminao e no conjunto de filtros. Entretanto, os melhores
resultados so obtidos com microscpios especialmente concebidos para esse fim,
nos quais as lentes de vidro so substitudas por lentes de quartzo ou de fluorite;
a fonte luminosa consiste de uma lmpada de vapor de mercrio que emite UV.
extremamente importante que, antes da ocular, seja inserido um filtro protetor para
impedir a chegada de radiaes ultravioletas aos olhos do observador, porque elas
so extremamente perigosas e causam leses crnea.
Na bacteriologia, comum usar marcadores fluorescentes nos estudos de
filmes bacterianos (YU; MCFETERS, 1994). Normalmente, para estudos com bac-

a contagem de clulas em placas de Petri e lmina de microscpio. Entretanto, o


uso de microscpios de epifluorescncia tem sido recomendado para estudos da
adeso de Listeria innocua e Staphylococcus aureus em cupons de ao inoxidvel,
polietileno e policarbonato; para a avaliao de contagem de placas, os resultados
tambm foram mais bem avaliados com o emprego de epifluorescncia (ANDRADE
et al., 1998a; PARIZZI, 1999). No entanto, com Enterococcus faecium em ao inoxidvel, a contagem em placas foi cerca de cinco vezes maior que na microscopia
de epifluorescncia, o que leva a crer que a contagem por microscopia subestima
o nmero de clulas de Enterococcus sobre a superfcie desses cupons, resultado
discordante de outros encontrados na literatura (HOOD, 1996; PORETTI, 1990); os
autores justificaram esses resultados conflitantes pelo uso de condies diferentes
de estudos, como meio de cultura e microrganismos e vigor de agitao em vrtex
(ANDRADE et al., 1998b).
Os microscpios acoplados a sistemas de anlise de imagens que facilitam a

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

trias tem-se preferido usar microscpio de fluorescncia invertido, porque facilita

contagem de clulas aderidas s superfcies tornam a microscopia de epifluorescncia uma tcnica extremamente til avaliao quantitativa dos processos de adeso
microbiana. Alm disso, a determinao da rea coberta pelo crescimento microbiano na superfcie, por meio de software associado microscopia de epifluorescncia,
uma evoluo na avaliao de processos adesivos (BLACKMAN; FRANK, 1996).
Vrios fontes sobre epifluorescncia esto disponveis ( MICROSCOPYU, 2007bd;
PROBES, 2007; BIOSTATUS, 2007; AMERSHAMBIOSCIENCES, 2007; HELIXRESEARCH, 2007; ICNPHAM, 2007; QBIOGENE, 2007; MOBITECH, 2007; INVITROGEN,
2007; CPG-BIOTECH, 2007).

75

2.1.6. Microscopia de Varredura a Laser ou Confocal (MVLC)


O microscpio de varredura a laser ou confocal um microscpio de fluorescncia bastante sofisticado.
A vantagem do confocal sobre o de fluorescncia-padro que ele permite: 1.
seccionar opticamente a amostra, captando imagens de clulas e tecidos internos
amostra; 2. reconstruir tridimensionalmente a imagem, localizando a marcao fluorescente subcelular; 3. alm disso, possui excelente resoluo, de aproximadamente 0,3 a 0,1 micrmetro; 4. usa s especficos, viabilizando marcaes mltiplas; 5.
possui sensibilidade muito alta, capaz de captar uma nica molcula fluorescente;
6. trabalha com imagens digitais, de fcil manipulao e obteno de imagens; e 7.
computadorizado, podendo ser inseridos mltiplos softwares.
O microscpio confocal combina o microscpio de fluorescncia com a an-

cap.02

lise eletrnica da imagem e lasers, proporcionando imagens em trs dimenses.

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Os cortes histolgicos mais finos, quando observados atravs de um microscpio


de fluorescncia comum, no permitem visualizar nitidamente toda a espessura do
corte. Na prtica, as lminas so observadas usando-se o artifcio de variar o plano
de focalizao atravs do boto micromtrico. Ao focalizar um plano ideal da clula
ou do tecido, os demais ficam desfocalizados. Esse mtodo tem o inconveniente de
sobrepor as imagens desfocalizadas de outros planos imagem ntida da amostra.
O confocal soluciona esse inconveniente.
O confocal, uma vez que permite o seccionamento tico da amostra, elimina
da imagem a fluorescncia das demais sees no focalizadas, eliminando a fluorescncia fora de foco. Com isso, alcana-se uma nitidez de imagem muito superior
do microscpio de fluorescncia comum.
Os primeiros confocais foram produzidos comercialmente nos anos de 1980
pelas Zeiss, Leica e BioRad. Existe mais de um tipo de confocal, segundo Hibbs
(2004): o Laser scanning confocal microscope, a que se refere este captulo, varre
um ponto finamente focalizado atravs do objeto para criar uma imagem, usando pinhole (abertura) para eliminar focos indesejveis de luz; o Nipkow disk confocal microscope, que usa um disco especial Nipkow para varrer vrias centenas de pinholes
atravs da imagem; esses pinholes removem a luz de foco e permitem, ao mesmo
tempo, que se faam varreduras muito rpidas do objeto - usado para observao
de objetos em rpido movimento, como bactrias em meio lquido, movimento Browniano de partculas, fluxo sanguneo in situ, dentre outros; o Slit scanning confocal
microscope, que usa uma fenda, em vez de pinhole, para remover a luz fora de foco.

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Tambm, capaz de varrer rapidamente e pode ser observado diretamente com o


olho nu. Ainda indisponvel no mercado, o Multiphoton microscope varre pulsos de
laser de vermelho distante (longo ), atravs da amostra para gerar fluorescncia
a partir de corantes, que so excitados normalmente por s muito menores (geralmente UV). A luz fora do foco removida pelo fato de que a intensidade do laser j
suficiente para a excitao multifotnica do fluorforo, apenas no plano focal; o
SNOM ou Scanning near field optical microscope, usado para detectar fluorescncia e imagem topogrfica, ao mesmo tempo (OH et al., 2006). Ele segue o mesmo
desenho do MFA (item 2.4.). Entretanto, na ponta do cantilever existe um tip recoberto de alumnio com um furo na ponta, onde termina uma fibra tica que reduz o
dimetro da fibra para 10-100 nm. O feixe de luz emitido atravs desse orifcio varre
a amostra. A separao entre a fibra e o espcime controlada pela parte MFA do
sistema operando com deflexo do feixe de laser. O controle entre amostra e tip da
fibra tica feito atravs de foras de van der Waals.
No MVLC, a iluminao realizada por um delgado feixe de raios laser, que
varre o corte, iluminando, ponto por ponto, apenas em determinado plano da clula

nesse plano de varredura, sem que os componentes celulares situados noutros planos contribuam para a formao da imagem. No somente a imagem muito mais
ntida, como tambm a clula pode ser cortada opticamente em vrios planos,
dependendo do aumento da objetiva usada. Cada plano da amostra varrido e armazenado independentemente; em seguida, atravs de programas do computador,
faz-se a remontagem dos planos, criando-se uma imagem 3D. De certa forma, ao
eliminar planos indesejveis do espcime, acima e abaixo do stio de marcao, o
confocal permite um aumento na resoluo da imagem, porque os elimina opticamente. Essas marcaes de fundo podem ser causadas por elementos autofluorescentes ou por resduos livres de fluorforos no lquido de montagem, dando
imagem uma aparncia borrada, confundindo a interpretao.
A autofluorescncia provocada por vrias molculas, como resduos de aminocidos aromticos, aldedos, nucleotdeos de piridina reduzida, flavinas e resduos de flavinas, protoporfirina de zinco, quitina, clorofila, lipofuscina (grnulos de

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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ou fatia ptica. A imagem formada apenas pelas estruturas que se encontram

pigmentos encontrados em clulas maduras), clulas apoptticas ou mortas (clulas


mortas apresentam autofluorescncia), dentre outros. Entretanto, a autofluorescncia pode ser usada a favor da imagem porque ela, algumas vezes, delineia a clula
ou organela, assim como fornece indicao do estado de integridade celular, importante no estudo de viabilidade. Tudo vai depender do objetivo final do estudo.
Entretanto, preciso ter-se em mente, durante o planejamento da metodologia,
que raramente a autofluorescncia criada pela fixao do material benfica ao
trabalho. O simples ato de fixar uma clula ou tecido pode resultar em altos nveis
de autofluorescncia devido apenas presena de aldedos que formam ligaes

77

cruzadas com protenas. No caso de necessidade absoluta de fixao do material,


prefervel que se use paraformaldedo ou formaldedo em vez de glutaraldedo. O
melhor fixativo, provavelmente, seria a acetona ou o etanol. Para reduzir o efeito dos
aldedos, sugere-se lavar a amostra com uma soluo de boroidrito de sdio.
Geralmente, as clulas so submetidas a um elemento fluorescente (YU;
McFETERS, 1994), e a luz emitida captada por um sistema de vdeo, digitalizada
em computador e fica acessvel num monitor. Essas imagens dos cortes pticos
podem ser armazenadas e utilizadas posteriormente para reconstituio da imagem
tridimensional, ou para clculos biomtricos, como rea e volumes. A preparao
da amostra para ser observada no confocal mais simples do que para fluorescncia, porque o microscpio de fluorescncia que usa UV emite o feixe luminoso em
todos os comprimentos de onda da luz branca, alm de UV; as amostras precisam
ser cortadas em seces muito finas, de um a trs micrmetros de espessura, enquanto para anlise com confocal podem atingir 200 micrmetros de espessura,
cap.02

graas aos feixes de laser.

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O equipamento de MVLC mais encontrado provido de lasers de argnio de


baixo poder e refrigerado a ar. Esses lasers podem emitir uma variedade de comprimentos de onda, sendo os mais importantes aqueles de 488 nm e 514 nm; o primeiro corresponde ao mximo de excitao da fluorescena, e o segundo estimula
emisses da rhodamina e do Texas Red. Existem lasers capazes de emitir na regio
do ultravioleta, porm so mais caros e mais complicados de usar devido aos danos
que podem causar aos olhos do observador. Os sistemas de laser tm iluminao de
alta-intensidade, conferindo ao sistema boa sensibilidade e melhorando a resoluo
de fluorescncia.
Atualmente, encontram-se disponveis no mercado alguns modelos de confocal capazes de captar imagens de objetos em movimento. Entretanto, o nmero de
pixels varridos para o registro da imagem pelo computador est em funo da velocidade de excitao, ou seja, quanto maior a velocidade de varredura do laser para
acompanhar o objeto em movimento, menor a resoluo da imagem. , tambm,
o que ocorre com os microscpios multifotnicos, que no sero discutidos neste
livro. Assim, ao se pretender adquirir um aparelho, esse fator deve ser cuidadosamente levado em conta na seleo do modelo de microscpio.
Stanley e colaboradores (2006) realizaram um excelente trabalho sobre placas
de conexina Cx32, marcada com fluorescena (FITC), e Cx43, com rhodamina (TRITC) no tendo de eqinos, localizadas nas membranas citoplasmticas de clulas
adjacentes, formando canais intercelulares fortemente unidos. O trabalho foi possvel de ser realizado graas eliminao de marcaes de fundo, tpicas de fluores-

78

cncia obtida por marcaes com fluorocromos, resultando numa imagem clara,
acurada e passvel de repetio. No trabalho, os autores usaram um software que
permitia quantificar rapidamente, antes que ocorresse a fadiga (veja em 2.1.6.1) do
fluorocromo, e separar a fluorescncia verde de fluorescncia vermelha. As conexinas so subunidades glicoproticas transmembranrias, que fazem ligao entre
clulas, por onde transitam metablitos, ons e pequenas molculas e tambm esto
presentes em bactrias.

2.1.6.1. Solues Antifadiga e Fluorocromos


Preparaes antifadiga esto disponveis no mercado. Essas solues so usadas para aumentar a vida til, ou seja, a durao do tempo de fluorescncia, dos
fluorforos. Os primeiros fluorforos, FITC, TRITC e Texas Red, dentre outros, fluoresciam por um perodo muito curto de exposio a UV. Atualmente, embora ainda
sejam usados nas formulaes convencionais, eles foram melhorados, aumentando
a vida til e introduzindo algumas caractersticas diferentes. Mais recentemente,
passou-se a desenvolver grande nmero de fluorforos novos e de outras origens.

cluindo p-fenilenediamina (PPD); n-propyl gallate (NPG); 1,4-diazobicyclo [2,2,2]-octano


e cido ascrbico (vit.C). Usar 2 mg.mL-1 de tampo PBS e fazer previamente um teste
porque pode ser txico s clulas. H solues antifadiga preparadas comercialmente,
como Vectashield, Slowfade, Fluoro Guard e Moliwal.
Dentre os corantes fluorescentes esto o FITC (isotiocianato de fluorescena),
TMR (tetramethyl-rhodamina), TRITC (forma reativa do TMR), Texas Red, grupo
dos Alexa Fluor dyes e grupo dos Cyanine dyes. As sondas para cidos nuclicos
incluem DAPI, SYTO, SYTOX, propidium iodide, acridine orange, YOYO, TOTO e
ethidium bromide (marca DNA e RNA duplos do citoplasma). So marcadores de
DNA que usam UV, o DAPI e Hoechst 33258, SYTO, SYTOX, acridine orange. So
marcadores apenas de clulas mortas: propidium iodide, ethidium bromide, acridine homodimer, cyanine dimer, cyanine monomer, SYTOX, YOYO e APOPTRAC.
Os indicadores fluorescentes de ons mudam o espectro da resposta em funo de ligaes especficas, medindo, assim, a concentrao e o fluxo subcelular

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

As solues antifadiga podem ser preparadas a partir de vrias substncias in-

de ons. A mudana pode ser aumentando ou diminuindo a intensidade de brilho


ou no de emisso. So muito teis nos estudos de nvel de contaminao de
organismos vivos. Existem indicadores para ons de: Ca2+, Mg2+, Zn2+; Na+, K+ ;
Cl-, Bi-, I-, tiocianato; Cu+, Ni2+, Co2+, Fe2+ Al3+, Ga3+, Cd2+, Hg2+, Pb2+; Cs+, fosfatos
inorgnicos, cianido, selnio, tiis, sulfetos; nitrito (NO2-); Eu3+, Tb3+ (latandeos);
pH, (potencial de membrana). Os indicadores de Ca2+, com luz UV, so Indo1,
Fura2, Fluo3, Fura Red, BTC, Quin-1. Os indicadores Ca2+, luz visvel: Calcium Green,
Calcium Orange, Cal Crimson, Fluo3, Fluo4, Fura Red, Fluo3+Furo Red, Mag-Fluo4,
Mag-Indo1, Magnesium Green, Rhod2, X-Rhod1, Oregon Green 488 BAPTA, Cal-

79

cena. So indicadores de pH o FDA, CFDA, BCECF, SNARF, SNAFL, HPTS, Oregon


green, LysoSensor e LysoTracker. So indicadores de de membrana: DiI e DIO
- para quaisquer membranas; Oxonal - para membranas despolarizadas; outros que
marcam membranas de organelas esto descritos a seguir. Outros ons: Na+: SBF1;
K+: PBF1; CL-: derivados de 6-methoxy quinolimium como SPQ; Mg+: variantes do
quelante BAPTA e NO: DAF-2 diacetato.
Os Pontos Qunticos so nanocristais condutores prontamente excitveis pela
luz azul (488 nm) e emitem fluorescncia em banda de emisso estreita de verde
at vermelho, dependendo da composio e tamanho da partcula (geralmente 10
nm). Podem ser feitos de vrios materiais: europium oxyde (Eu2O3) ou ncleo de
cadmium-selenium (CdSe) coberto com zinco-enxofre (ZnS). O ncleo do cristal
semicondutor coberto com um polmero inerte ao qual so adsorvidas diferentes
molculas biolgicas. A vantagem que reduzem muito o problema de fadiga ou

cap.02

branqueamento da fluorescncia e possuem alta penetrao na clula viva por en-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

docitose, devido ao seu reduzido tamanho, e so usados, tambm, em imunomarcao. Entretanto, so potencialmente txicos, por isso so bons para trabalhar com
clulas mortas, fixadas, e so deficientes para estudar movimento molecular intracelular. Para maiores informaes sobre confocal, princpios, filtros, espelhos, aberturas, fluorforos e agentes antifadiga, pode-se consultar Microscopyu (2007). Para
informaes complementares, sobre marcadores ou provas fluorescente pesquisar
em Probes (2007), Amershambioscience (2007), Helixresearch(2007), Icnpharm
(2007) e Kpl(2007). Para Informaoes adicionais sobre protenas fluorescentes consultar Qbiogene (2007), Mobitech (2007), Invitrogen (2007) e Cpg-biotech (2007).

2.1.7. Outros Tipos de Microscopia de Luz


Os microscpios descritos a seguir so, na verdade, microscpios normais
descritos anteriormente que mudam de nome em funo da localizao da fonte de
luz e, ou, da objetiva. Essas diferentes denominaes fazem confuso entre pesquisadores que possuem menor convivncia com esses aparelhos.
Com base na posio da fonte de luz em relao s lentes objetivas, um microscpio pode ser de luz transmitida ou de epiiluminao. No de luz transmitida, a
fonte de luz fica situada na base do microscpio, antes da condensadora, atravessa
a condensadora, o espcime, a objetiva e chega ocular. Na epifluorescncia, a
fonte de luz fica situada na parte superior ou lateral do microscpio e o feixe luminoso atravessa a objetiva, e o espcime reflete em um espelho dicrico, retorna pela

80

objetiva e atinge a ocular.


Com relao posio dos componentes, um microscpio de luz transmitida
pode ser tambm invertido, ou seja, as lentes objetivas ficam abaixo do espcime e
a condensadora fica acima, conseqentemente a fonte de luz fica na parte superior
ou lateral do aparelho. O microscpio invertido muito prtico porque permite o estudo de culturas de clulas vivas em placas de Petri e no impede o exame de material em lminas de microscpio, embora haja a necessidade de vir-las ao contrrio,
de forma que a lamnula fique voltada para baixo, em direo s objetivas. Para isso,
as lamnulas devem ser bem fixadas com esmalte. Portanto, um microscpio pode
ser de luz transmitida e, ao mesmo tempo, ser invertido.
Com relao ao poder de resoluo, existem as lupas que podem ser manuais,
aumentando em zoom at 8x ou montadas em um aparelho contendo uma (mono)
ou duas oculares (binocular) que permitem um aumento adicional de 5x. As binoculares geralmente so chamadas de esterioscpicas. Atualmente, existem lupas
que trabalham tanto com luz incidente quanto transmitida, possuindo duas fontes

densadora. So timas para exames macros, de localizao, porque observam tanto


a superfcie de objetos no transparentes e, ao mesmo tempo, se o material for
translcido, fornece alguma viso do interior de tecidos, em luz transmitida.
Com o rpido desenvolvimento dos aparelhos ajudado pela informtica, vrios
softwares esto sendo constantemente jogados no mercado. Um deles pretende
transformar imagens de campo claro em imagens 3D, baseando-se tanto no ndice
refrativo do espcime, que obtido pela iluminao ou contraste DIC, quanto pela
mudana de amplitude da onda de luz, pelo microscpio de contraste de fase, ou
seja, pelos dois sistemas, concomitantemente (ALLMAN et al., 2006), eliminando os
halos normalmente formados no contraste de fase.
Atualmente, tm sido mais e mais desenvolvidas hibridaes entre tipos diferentes de microscpios, por exemplo o sistema de varredura de eltrons do MEV
foi usado de forma semelhante no movimento fsico do cantilever do MFA (item 2.4.)

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

de luz, uma acima da objetiva e outra abaixo do espcime. No possuem lente con-

provocado pela interao da carga eltrica do espcime e o campo eltrico gerado


na extremidade do tip. Igualmente, o confocal utiliza-se de um sistema de varredura
(semelhante ao MEV); entretanto, usando um feixe de laser em vez de eltrons. J
existe um misto de varredura e MET, chamado de Microscpio Eletrnico de Transmisso por Varredura, e vrias outras configuraes.
O limite de resoluo /2 dos microscpios ticos foi ultrapassado. medida
que caminhamos para o nanomtrico, verificamos que so encontradas foras diminutas tanto na fsica quanto na biologia. Essas foras determinam uma srie de

81

eventos como estabilidade coloidal, adeso celular, motilidade celular, estabilidade


de ligaes especficas e mudanas conformacionais de protenas (FLORIN et al.,
1998). Da mesma forma, elas permitem manipular as clulas, o que fundamental
na biologia e na biotecnologia, em testes de imunofenotipia de superfcie para diagnose, efeito da morfologia na diferenciao celular, na deteco de bactrias em
alimentos, movimento Browniano (PRALLE et al.,1998) e movimento de vesculas
secretoras em clulas vivas (ABU-HAMDAH et al., 2006).
Abu-Hamdah e colaboradores (2006) desenvolveram, em 1997, um microscpio ptico apropriado para fazer esse tipo de medio em amostras biolgicas, o
Microscpio de Fora Fotnica (MFF) que, segundo eles, um microscpio ptico
com resoluo nanomtrica. Ele faz varredura tridimensional de um feixe de laser e
baseia-se no princpio das tesouras pticas. Existem outras tcnicas de manipulao
fsica de clulas, como foras acsticas e modificao celular, alm da tesoura ptica
cap.02

e do MFF. Todos eles se baseiam nos princpios de foras eltricas de eletroforese,

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

que atuam em uma partcula fixa, ou de dieletroforese, que atuam na induo de


carga. Ambas as foras podem calcular a fora de adeso e a fora necessria para
o arraste de uma partcula (VOLDMAN, 2006). Para maiores informaes, consultar
Pubmedcentral(2007), Biophysj (2007) e Microscopyu (2007).

2.2. Microscopia Eletrnica


Nos primeiros decnios do sculo passado, em busca de informaes mais
detalhadas de amostras biolgicas, o homem comeou a pesquisar uma forma de
suplantar os limites da resoluo do microscpio de luz. A Figura 1 ilustra os pontos
em comuns dos microscpios de luz e do MET e do MEV.

82

Figura 1 - Esquema dos microscpios ptico, eletrnico de transmisso e varredura, seus componentes e o
processo de formao de imagens.

Meek (1976) fez um relato dos passos histricos da fsica at a construo comercial do primeiro MET. Bastante resumidamente aqui, e a ttulo de curiosidade,
ele informa em seu livro que pouco antes da metade do sculo 19 descobriu-se
que a eletricidade de alta-voltagem, quando era direcionada para dentro de tubos
de vidro cheios de gs baixa presso, produzia descargas eltricas; em 1850,
descobriu-se como selar eletrodos de metal dentro de tubos de vidro emendados
com alto vcuo. Cerca de 10 anos depois, descobriu-se que o que se chamava

cuo. Esses raios catdicos eram carregados negativamente e eram defletidos por
campos eletrostticos e magnticos. Em torno de 1899, foram produzidas as primeiras lentes magnticas, que na verdade so campos magnticos axialmente
simtricos formados dentro do tubo de descarga, o que permitiu o controle do
direcionamento dos feixes, assim como a concentrao e a disperso dos eltrons, ou seja, aumento e reduo do dimetro do feixe de eltrons. Em 1897,
Braun j havia descoberto as telas fluorescentes quando excitadas por feixes de
eltrons. Thomson, citado por Meek (1976), mostrou que os raios catdicos eram
corpsculos carregados negativamente com uma massa de aproximadamente um
milsimo da massa de um tomo de hidrognio. Esse corpsculo foi depois chamado de eltron. Em 1926, descobriu-se que o campo magntico poderia desviar
um feixe de eltron da mesma forma que as lentes de vidro ou quartzo desviam
a luz visvel. Assim, os fundamentos para a ptica eletrnica foram estabelecidos.
Rapidamente, todas essas informaes culminaram nos primeiros estudos sobre o

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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de raios catdicos possuam movimento retilneo quando eram emitidos no v-

microscpio eletrnico, em torno de 1933, por Ruska e colegas, na Alemanha. Em


1945, logo aps a Segunda Grande Guerra, foi colocado no mercado o primeiro
MET comercial, marca Siemmens, modelo M-100. Para esse microscpio, Ruska
e colaboradores acompanharam eletronicamente o mesmo desenho do microscpio de luz transmitida. A partir do MET, foram necessrios poucos anos, cerca
de 10 anos, para surgir o primeiro microscpio eletrnico de varredura (MEV).
A ambos os aparelhos, MET e MEV, pode-se acoplar um sistema de microan-

83

lise de raios X (Energy-Dispersive X-Ray Microanalysis (EDS), que permite estudar a


composio qumica da amostra, com vantagens sobre a qumica analtica, porque
os elementos podem ser mapeados in situ, o que permite identificar a posio em
que esses se encontram na amostra (MUSSETTI; FAVALI, 2003).
Para que possa ser explorado em toda a potencialidade, com mxima resoluo, um microscpio eletrnico precisa ser instalado em local adequado, com umidade e temperatura controladas, alm de estar bem isolado de campos magnticos
e de vibraes produzidas pela proximidade de ar-condicionado, bombas de vcuo,
elevadores, estabilizadores de voltagem; deve-se tambm evitar proximidade com
ruas de trnsito pesado (MEEK, 1976; MULLER et al., 2006). Para maiores informaes, consultar Scholar Google (2007).
Os diferentes tipos de eltrons produzidos aps a incidncia de um feixe de

cap.02

amostras sobre um espcime esto esquematizados na Figura 2.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Figura 2. Esquema da interao eltron/amostra gerando diferentes sinais e rea/volume da amostra


envolvida na emisso de eltrons secundrios, retroespalhados e raios X da amostra irradiada pelos eltrons
primrios.
84

2.2.1. Microscopia Eletrnica de Transmisso


O microscpio eletrnico de transmisso (MET) tem uma nica vantagem sobre o microscpio ptico de luz: maior capacidade de resoluo, ou seja, ele capaz
de formar imagens claras e ntidas de objetos at mil vezes menores, isto , a sua
resoluo da ordem de 1-2 nm, ou seja, 1.000 x melhor que a do microscpio de
luz. Os princpios bsicos sobre o MET podem ser encontrados no livro de autoria
de Meek (1976). O espcime tem de ser suficientemente fino para permitir a passagem de 50-90% dos eltrons (MEEK, 1976); o feixe o atravessa em maior ou menor
intensidade, dependendo do grau de eletrodensidade da regio. As partes mais eletrodensas desviam os eltrons, que no atingem a tela, formando uma sombra na
tela fluorescente, enquanto as partes menos eletrodensas so atravessadas pelo feixe, que vo excitar as molculas da tela. O resultado a formao de uma imagem
em claro/escuro, semelhante s de fotografias em preto/branco.
O funcionamento do MET, resumidamente, consiste no descrito a seguir: a fonte de eltrons do aparelho um filamento metlico de tungstnio incandescente que
aquecido emite eltrons que so atrados para a primeira abertura onde passam por

pela lente condensadora e incide sobre a amostra a ser examinada. Ao atravessar


a amostra, os eltrons so desviados uns mais do que os outros. O feixe de eltrons, com os desvios introduzidos pela amostra, ampliado pela lente objetiva. At
aqui, idntico ao que ocorre no microscpio de luz transmitida. Parte desse feixe
, por sua vez, dispersado por outros campos magnticos que agem como lentes
projetivas. Como a nossa viso no sensvel aos eltrons, a imagem projetada
sobre um cran fluorescente. O registro da imagem feito em filmes fotogrficos
ou digitalizados por cmaras CCD. No estudo da adeso e formao dos biofilmes, o
MET tem permitido visualizar detalhes morfolgicos das bactrias como a presena
de parede, membrana, cromatina, fimbrias, flagelos e a estrutura e composio do
biofilme. Na Figura 2 est esquematizado o funcionamento do MET.

a) Mtodo de Emblocamento de Amostras Biolgicas e o Porqu de Faz-lo


O interior da coluna do MET fica sob alto vcuo, exigindo que as amostras

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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uma primeira seleo, formando o feixe inicial de eltrons. Esse feixe condensado

sejam pr-fixadas em fixadores aldedicos, por exemplo glutaraldedo, formaldedo,


paraformaldedo, isolados ou em combinao preparados em tampes; e ps-fixadas em tetrxido de smio ou KMnO3 e, ento, desidratadas em sries crescentes
etanlicas ou acetnicas para evitar que a gua interna seja sugada violentamente
pelo vcuo, destruindo a amostra. Como as paredes e as membranas biolgicas
so extremamente seletivas, molculas grandes tm dificuldade de atravess-las.
Por isso, muito importante que as dimenses do espcime sejam bastante reduzidas
para bloquinhos de aproximadamente 1 mm x 1 mm x 1 mm ou 1 mm x 1 mm x 3 mm.
No entanto, o feixe de eltrons tem baixo poder de penetrao e as amostras preci-

85

sam ser extremamente delgadas, no mximo 100 nm de espessura. Para que sejam
seccionadas sem causar modificaes ultra-estruturais, os espcimes precisam ser
embebidos em resina (por exemplo Spurr, Epon, Araldite, Lowicryl e Unicryl dentre outras). As resinas so escolhidas de acordo com a finalidade do estudo e da
qualidade ou facilidade de impregnao do tecido (BUSCHMANN et al., 2002). Em
seguida, as amostras so emblocadas em molde de silicone ou cpsulas de BEEM
ou gelatina e polimerizados de acordo com o fabricante. Depois, os bloquinhos sero seccionados em seces semifinas - para observao prvia em microscpio de
luz - e, ou, ultrafinas, de 60-100 nm de espessura, com navalha de diamante ou de
vidro, na qual colocado gua para que, medida que os bloquinhos vo sendo
seccionados, as seces flutuem na superfcie. Como a essa espessura as seces
so transparentes na lupa do ultramicrtomo, necessrio que uma fonte de luz
incida sobre elas. Somente os cortes que refletirem prateado ou dourado-claro
que podero ser usados para observao no MET. Os cortes, ento, so estendidos

cap.02

com vapor de xilol ou clorofrmio e, depois, recolhidos em telinhas (grid) de 3 mm

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de dimetro, de 50-300 mesh ou de um nico furo. Uma pelcula de plstico Formvar


0,3%, extremamente fina (20 nm), utilizada como lmina de microscpio e reveste
a telinha, que pode ser de cobre, nquel ou ouro, dependendo dos reagentes a que
ser submetida. Sobre essas telinhas com formvar podem ser examinados materiais
em suspenso como fraes celulares, molculas, vrus e bactrias ou cortes histolgicos de 50-100 nm de espessura.
O MET trouxe contribuies importantes para o conhecimento humano, ao
mostrar detalhes jamais visualizados na rea biolgica. Sem dvida, um equipamento que abrange amplo campo de estudos, como imunolgicos, citolgicos, enzimolgicos e biofsicos, tanto na rea animal, vegetal e de microrganismos quanto
na rea morfolgica da nanotecnologia (RASKAS, 2003).
Por no trabalhar com ondas do espectro visvel, no possvel obter imagens
coloridas. As imagens coloridas que so mostradas em revistas e peridicos so
resultantes de manipulao artificial da imagem em preto e branco em programas
especficos para computador. Portanto, tratamentos com colorantes usados na microscopia de luz como azul-de-algodo, safranina, toluidina, rodamina e outros no
possuem nenhum efeito colorante, embora alguns como o violeta e o vermelho de
rutnio e o Alcian blue sejam usados em algumas tcnicas por possurem elementos na sua composio que so eletrondensos (HAYAT,1975). No entanto, como os
cortes so extremamente finos, a difrao do feixe de eltrons sobre a amostra no
contrastada insuficiente para a obteno de imagens ntidas. Por isso, na MET so
rotineiramente usados contrastantes eletrodensos como acetato de uranila, citrato

86

de chumbo, hidrxido de chumbo, tartarato de chumbo, acetato de chumbo, cido fosfotungstico, permanganato de potssio, tetrxido de smio (que tambm
um forte fixador usado rotineiramente em ps-fixao), colide de torium e outros
(HAYAT,1975). Esses contrastantes, por possurem maior ou menor afinidade com
lipdeos, polissacardeos, glicoprotenas, lipoprotenas, protenas, enzimas e outras
protenas, fazem que, na biologia, sejam intensivamente usados nos estudos de
detalhes morfolgicos e fisiolgicos de organelas inteiras, como membrana plasmtica, ncleo, nuclolo, cromossomos, cloroplasto, mitocndria, centro celular e
plasmodesma, at ento conhecidas por meio de coloraes especficas, em microscopia de luz. Tambm permitem o estudo tanto morfolgico quanto fisiolgico
de uma srie de outros componentes, como retculo endoplasmtico, aparelho de
Golgi, presena de lisossomos, colides, multivesculas, cromatina, cromossomo,
ribossomos, microtbulos, microfilamentos, filamentos intermedirios, lisossomo,
peroxissoma, complexo juncional, junes comunicantes, glicoclix e caractersticas internas e externas de microrganismos, como a presena de parede celular, flagelos e fmbrias. Alem disso, em conjunto com a imunomarcao, permite verificar
a presena de ons como clcio, ferro e enxofre, dentre outros.

Nas dcadas de 1970-1980, por meio de tcnicas de imunomarcao ou de uso


de sondas especficas, iniciaram-se os estudos sobre a localizao exata de molculas proticas e epitopos, acares, ferritina, protenas, cido nuclico, pectina, celulose, hemicelulose e outros, abrindo, inclusive, um campo vasto para a enzimologia
(HAYAT, 1989; van NOORDEN; FREDERIKS, 1992). Nos estudos de imunomarcao,
os antgenos usados (primeiro ou segundo anticorpo, dependendo da tcnica) so
marcados com uma sonda eletrodensa, opaca ao feixe de eltrons, como esferas
de ouro coloidal de 1 m a 20 m de dimetro ou cido fosfotungstico (PTA), ferricianeto, DAB (3,4,3,4-tetraaminobifenilidrocloreto), cobre-glicina e outros (WANG,
1986; HAYAT, 1989; LEWIS; KNIGHT, 1992).
Na imunomarcao com dois anticorpos, a telinha posta com a seo ultrafina voltada para uma gota do primeiro anticorpo no marcado. Depois de lavada
em tampo, transferida para o segundo anticorpo, marcado com a sonda, que foi
produzido contra o animal no qual foi produzido o primeiro anticorpo. Apenas as

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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b) Mtodo de Imunomarcao

molculas de antgeno que ficaram expostas na superfcie seccionada iro reagir


com o primeiro anticorpo; as que estiverem imersas na resina, no reagem porque
esto com os stios de reao bloqueados. Alguns tipos de resina (Lowicryl, Unicryl,
Epon) so levemente hidroflicas, permitindo que o antgeno reaja com molculas
expostas na superfcie e aquelas ligeiramente imersas na resina.
Na imunomarcao com apenas um anticorpo, esse precisa estar marcado
com a sonda eletrodensa. Nesse caso, a marcao menor porque a relao ser
de um anticorpo marcado para um antgeno.

87

Alguns cuidados so muito importantes na imunomarcao, como: no delineamento do trabalho necessrio constar, sempre, todos os tipos de testemunha
positivas e negativas para amostra e antissoros. Deve-se, tambm, suavizar a fase
de pr-fixao e, se a quantidade de antgeno esperado de encontrar na amostra
for muito baixa, evitar o uso do tetrxido de smio que um potente bloqueador
de stios. Todos os bloqueadores de marcao de fundo como soro normal, BSA,
Tween 20 e outros precisam ser usados para neutralizar os aldedos, cargas livres
e outros. Quando se usa ouro como marcador, as seces podem ser osmicadas
e contrastadas com acetato de uranila e citrato de chumbo depois de terminado o
processo de imunomarcao. Para maiores detalhes, consultar Hayat (1989).

c) Mtodos para Observao em 3-D


Como foi dito anteriormente, o MET apresenta limitaes impostas pela necessidade do alto vcuo na coluna e pelo baixo poder de penetrao do feixe de
cap.02

eltrons. Assim, alm de limitar o estudo aos espcimes mortos, bem fixados e

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

emblocados em resina, o exame deles s pode ser realizado em seces ultrafinas


(50-80 nm de espessura de preferncia), o que dificulta a visualizao da organizao tridimensional das estruturas. Contudo, certo nvel de informao 3D pode ser
obtido pela montagem de fotografias de seces seriadas superpostas, uma a uma,
ou de tcnicas especiais como moldagem por congelamento (freeze-etching) e a
criofratura (freeze fracture) (PARSON, 1970), que so bastante trabalhosas, como
descrito a seguir.
Os mtodos de criofratura e criomoldagem foram tentados pela primeira vez
em 1950, por Hall (PARSON, 1970). Esses mtodos permitem o estudo ultra-estrutural
tridimensional com a resoluo permitida pelo MET, ou seja, 0,1-0,2 nm. So mtodos
mais trabalhosos que, atravs do congelamento rpido do espcime, permitem que se
trabalhe com material hidratado, ainda vivo antes do congelamento, disponibilizando
informaes morfolgicas mais reais, em especial as membranas, porque no sofrem
efeito estressante de reagentes fortes. Resumidamente, o espcime congelado e,
em seguida, uma pequena poro da sua superfcie transferida para o vcuo, onde
o gelo sofre sublimao, deixando as estruturas no volteis como projees na superfcie. Faz-se, ento, uma rplica ou molde da superfcie exposta, primeiro com uma
liga carbono-paldio que depois reforada com carbono pulverizado em ngulo. A
rplica ou molde ainda presa ao espcime desidratado posta a flutuar em gua para
que o espcime se desprenda da rplica que flutua. A rplica, ento, montada em
telinha e examinada no MET, fornecendo imagem em 3D ( PARSON, 1970).

88

O exame de espcimes preparados por criofratura e criomoldagem no permite um direcionamento prestabelecido do sentido da fratura, porque ela ocorre
ao acaso, embora a tendncia seja de clulas fraturarem ao longo da superfcie
das membranas internas ou externas. Entretanto, algumas vezes a fratura pode
ocorrer em planos tangenciais da amostra, deixando exposto em 3D nanomtrico,
no sentido Z da amostra, as organelas internas, alm dos detalhes morfolgicos
das membranas, como poros, e tambm detalhes de paredes celulares, ribossomos, cloroplastos, mitocndrias, vesculas, retculo endoplasmtico e Aparelho
de Golgi. Smarda e colaboradores (2001), realizaram um estudo detalhado das
camadas S das paredes celulares de cianobactrias usando o mtodo de criofratura e criomoldagem e demonstraram que cada camada S formada por feixes
bidimensionais, monomoleculares cristalinos de unidades idnticas de protena ou
macromolculas de glicoprotenas arranjadas em uma de quatro possibilidades de
tipos 2D de ltice: oblquo, triangular, quadrado ou hexagonal.
Em 2006, foram apresentados dois mtodos de manipulao de imagem que
reproduzem a forma 3D obtidas de cortes ultrafinos observados no MET, sem usar a

pios de luz, e baseia-se no uso da imagem obtida pela refrao de eltrons no MET
(ALLMAN et al., 2006), enquanto Fiala e Harris (2006) afirmaram que, atravs do
programa gratuito disponvel na internet (http://synapses.bu.edu/tools/), possvel
obter imagem 3D com a remontagem de imagens de cortes seriados. O mesmo
sistema pode ser usado para imagens feitas em confocal.

d) Mtodo de leaf-dip
Outro mtodo para observao no MET, chamado de leaf-dip (HAYAT, 1972),
um mtodo rpido e consiste da contrastao negativa do material disposto sobre uma telinha recoberta com formvar 0,3%. Muito usado na diagnose de vrus,
tambm til no estudo de bactrias. D indicao sobre a disposio dos ltices
proticos da parede, presena de flagelo e morfologia. Sobre uma telinha de cobre
recoberta com formvar 0,3%, adiciona-se uma gota de uma suspenso bacteriana
contendo 1x109 clulas por mL, e sobre essa gota adiciona-se uma gota de acetato

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

metodologia da criofratura. Um deles foi descrito na seo sobre outros microsc-

de uranila 5% ou de cido fosfotungstico em K ou Na (KPTA ou NaPTA). Deixa-se


reagir por aproximadamente 20 segundos, e seca-se cuidadosamente com papel-filtro.
Depois de seca, a telinha pode ser observada no MET. chamada de contrastao
negativa porque, contornando a bactria, forma-se uma faixa eletrodensa, enquanto
a bactria permanece clara. Sobre tcnicas de uso do MET e de preparao de espcimes biolgicos para observao no MET, consultar, tambm, Hayat (1970, 1972,
1975, 1989), Parson (1970), Souza (1998).
89

2.2.2. Microscopia Eletrnica de Varredura


A capacidade que o microscpio eletrnico de varredura (MEV) possui de formar imagem tridimensional em uma escala muito ampla de aumento , talvez, a sua
caracterstica mais interessante na pesquisa biolgica, especialmente na sistemtica, ecologia, estudos evolucionrios, morfologia e interpretao (HEYWOOD, 1971;
ZOLTAI et al., 1981; GLAUGHER, 1990).
Em meados do sculo passado, entre 1963-65 foram desenvolvidos comercialmente os primeiros MEVs. A introduo desse microscpio causou uma segunda revoluo no estudo do mundo microscpico, em virtude de suas caractersticas como
a alta profundidade de campo de trabalho, que confere o aspecto tridimensional s
imagens; ampla gama de aumento (10 X 1.000.000 X); alta resoluo que alguns
aparelhos atingem, cerca de 2-3 nm, sendo o mais comum entre 20 e 30 nm; a rpida
digitalizao do sistema de captao de imagens, aliada s relativas facilidades de

cap.02

operao e preparao da amostra, tornou este aparelho extremamente popular.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Ao contrrio do MET, em que o feixe de eltrons atravessa o espcime, no


MEV, os eltrons primrios so usados na varredura da superfcie das amostras metalizadas. Eles refletem ou atravessam o espcime, gerando vrios tipos de emisses
eletrnicas (HEYWOOD, 1971; POSTEK et al., 1980) como eltrons secundrios, retroespalhados, catodoluminescncia, raios X, cada um capturado por receptadores
especficos e transformados em imagem num monitor. Na Figura 2, encontra-se o
diagrama esquemtico de funcionamento do MEV. Os eltrons secundrios refletidos sobre a superfcie da amostra, que so os mais usados, so emitidos em diferentes ngulos, dependendo da topografia do material. Esses eltrons de diferentes
ngulos so captados por um receptador de eltrons secundrios, decodificados e
transformados computacionalmente em imagem, em um monitor.
Deve-se considerar tambm que, apesar de tcnicas microscpicas terem levado a uma grande quantidade de informaes sobre os processos de adeso microbiana e formao de biofilme, elas apresentam alguns problemas que devem ser
considerados. Dentre eles a interpretao das imagens que produzem, dependendo
dos procedimentos utilizados. Os exopolissacardeos, por exemplo, que geralmente
envolvem as comunidades microbianas, podem secar, aparecendo cordes finos
que podem ser interpretados como estruturas fibrosas que prendem os microrganismos a si mesmos (WIMPENY et al., 2000). A tcnica a ser escolhida depende
do aspecto da interao do biofilme ou da sua formao que se deseja analisar, da
a importncia de se conhecer previamente o material com o qual se trabalha, em

90

nveis macro e de microscopia de luz.


A resoluo de uma imagem depende de vrios fatores: da voltagem de acelerao; da morfologia, da topografia e da densidade do material; da estabilidade e do isolamento do aparelho de campos magnticos externos, do movimento
do ar e das vibraes fsicas; do tipo de captao de eltrons usados (se eltrons
secundrios, eltrons retroespalhados, raios X, catodo-luminescncia); de lentes
magnticas, dimetro da abertura usada; tilt ou inclinao da mesa dos espcimes,
dimetro do feixe de eltrons; velocidade da varredura; balano entre brilho e contraste, distncia entre pistola de feixe e superfcie da amostra, dentre outros. Todos
esses fatores precisam estar em perfeito equilbrio, de acordo com cada espcime.
Outro fator muito importante a ser considerado a densidade de eltrons presentes
no espcime, porque o nmero de eltrons secundrios emitidos se eleva com o
aumento do nmero atmico do material (POSTEK, 1980). Da a necessidade de se
cobrir os

materiais no-eletrocondutivos com camada nanomtrica de metal, de

no mximo 20 nm (ouro, paldio, alumnio ou ligas) para torn-los condutivos sem


que se percam detalhes topogrficos. Quando se fala em examinar uma superfcie

trito superfcie externa de um rgo. Os diferentes tecidos internos ou o interior


de clulas de um tecido, desde que sejam expostos por seccionamento ou fratura
durante a preparao, aps a fixao, podem tambm ser estudados. Portanto, as
clulas bacterianas podero ser observadas tanto na superfcie externa de uma folha
ou de cupons de qualquer constituio, por exemplo, quanto no interior dos diferentes tecidos que compem a folha, bastando apenas seccion-la.
As amostras biolgicas, alm de no serem condutoras de eltrons, so mais
difceis de trabalhar devido sua constituio macia, isto , o feixe de eltrons pode
causar danos e deslocamentos de partes do material provocando descargas visveis
como faixas claras nas imagens. Para amostras sensveis, como o caso da maioria
das amostras biolgicas, as voltagens usadas so de 1-20 KV, mas para materiais
rgidos, como os examinados em cincias de materiais, pode-se chegar a 40 KV.
A resoluo da imagem ser tanto melhor quanto maior for a voltagem e menor a
distncia entre a ponta inferior da coluna do instrumento e a superfcie da amostra.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

topogrfica de um material, no significa que o estudo obrigatoriamente ficar res-

Atualmente, encontram-se no mercado aparelhos que trabalham a baixo vcuo, com presso varivel (PV) dentro da cmara, o que permite examinar amostras parcialmente hidratadas e emissoras de gases sob vcuo. Entretanto, esse
tipo de varredura produz imagens de qualidade inferior s emitidas por eltrons
secundrios (metalizadas ou condutoras), embora seja uma tcnica eficiente para
diagnose rpida (TOTH et al., 2003). Alguns modelos mais modernos de microscpios podem ser equipados com um acessrio que resfria a cmara para permitir

91

a observao de materiais hidratados e congelados. Nesse caso, so observados


sem cobertura metlica, baixa presso dentro da cmara, no baixo vcuo, para
que no ocorra sublimao do gelo. Tambm, a imagem obtida por essa tcnica
de qualidade inferior obtida pelos eltrons secundrios, mas preservam a estrutura de materiais muito delicados.
possvel observar amostras j includas em resina, que foram preparadas
inicialmente para cortes ultrafinos para observao no MET, portanto com superfcie
uniformemente plana, pela tcnica de backscattered ou eltrons retroespalhados,
embora a resoluo da imagem tambm no seja to boa quanto obtida de eltrons secundrios (PIERRE et al., 2005). Nesse caso, a imagem formada devida
diferena do nmero atmico entre a resina e o espcime e no topografia (POSTEK et al., 1980), e a imagem produzida visivelmente plana. O eltron captado o
emitido abaixo da superfcie da amostra, portanto, de preferncia, deve-se recobrir

cap.02

o material com fina camada de carbono em vez de metal.

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a) Preparao de Amostra Biolgica para Observao a Alta Voltagem ou


Alto Vcuo
Na preparao prvia de uma amostra biolgica mida para observao no
MEV, sob alta voltagem, preciso fazer a pr-fixao da amostra em aldedo (glutaraldedo ou paraformaldedo + glutaraldedo) e ps-fixao em tetrxido de smio
(dispensvel), depois a desidratao em srie crescente de etanol ou acetona (ver
item 2.2.1.). Ainda no etanol ou acetona 100%, o material transferido para o aparelho de secagem no ponto crtico, onde o lcool ou a acetona so trocados por CO2
lquido, gradativamente, temperatura de 5-8 C, para manter o CO2 ainda em estado lquido. A temperatura da cmara , ento, elevada lentamente at 40 C, quando
a presso da cmara atinge entre 60-70 bar, devido expanso do gs de CO2. Nessa
presso e temperatura, o CO2 lquido se transforma em gs sem alterar a morfologia
do material. Depois, ento, o material fixado em suportes (stubs) com fita adesiva
de dupla face comum ou de carbono condutiva ou colada com colide de carbono
ou prata que tambm so condutivos. Em seguida, levado para um metalizador,
onde ser pulverizado com tomos de metal condutivo, sendo os melhores o ouro e
a liga de ouro-paldio. necessrio que a cobertura seja fina o suficiente para formar
um filme uniforme e condutivo, mas sem que provoque a perda de detalhes nanomtricos da topografia por entupimento das depresses. Para variaes da metodologia, consultar Heywood (1971), Postek et al. (1980), Glaugher, (1990).
Outra tcnica interessante de preparar material muito frgil e que se desprende

92

facilmente sob vcuo o usado por Tiedt e colaboradores (1987). Em vez de fixarem a amostra em solues de glutaraldedo e tetrxido de smio, esses autores
fixaram-na em vapor de tetrxido de smio, sem passar pela soluo de glutaraldedo, usando uma capela de exausto durante o manuseio, tendo-se em vista que
o tetrxido altamente perigoso inalao e ao contato. Nesse caso, a amostra
colocada dentro de uma placa de Petri, e, na face inferior da tampa da placa, adicionam-se umas gotas de tetrxido de smio 2%; depois, cuidadosamente a placa
novamente tampada e vedada com parafilme. O conjunto deve ser incubado por
tempos variveis, de 2 horas a 24-48 horas, conforme o material. Depois, a amostra
retirada da placa, e continua-se o processo de desidratao, secagem no ponto
crtico e metalizao.
Tambm ao MEV pode ser acoplada, com vantagens adicionais, uma sonda
de raios X, o que vai unir a alta resoluo dos eltrons secundrios microanlise
para examinar, por exemplo, a constituio e localizao de ons e mudanas nas
concentraes inicas durante a apoptose celular , dentre outros (ver item 2.3). Para
maiores informaes, consultar Analitic (2007) e Wikipedia (2007d).

O Microanalisador ou Sonda de Raios X no , exatamente, um microscpio


eletrnico. Ele um acessrio dos MET e MEV (TERACHI; KAWANA, 2006.) que
permite realizar anlise qumica das espcies atmicas que compem, normalmente, as amostras. O MET ou MEV, estando equipado com detector de raios X (sonda
acessria), capaz de localizar minerais, como clcio, ferro, enxofre e outros, dentro
de clulas ou tecidos (LEWIS; KNIGHT, 1992).
A anlise feita normalmente durante o exame normal do material ao microscpio. Durante a emisso do feixe eletrnico sobre a amostra, o feixe de eltrons colide com um espcime slido, interage com a matria, emitindo, tambm, radiao
eletromagntica produzida pelo deslocamento orbital do eltron pelo feixe. Sempre
que um feixe de eltrons interage com tomos, os eltrons incidentes deslocam
os eltrons desses tomos, gerando eltrons secundrios. A diferena de energia
emitida em forma de raios X, cujas caractersticas de comprimento de onda ou

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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b) Acessrios: Sonda ou Microanalisador de Raio-X

energia esto em funo do elemento que o emite.


Medindo-se com um espectrmetro tanto o comprimento de onda quanto a
energia de cada raios X emitidos, pode-se, assim, fazer uma anlise qualitativa e
quantitativa dos tomos que compem o espcime, mas no possvel formar uma
imagem gerada pelos raios X emitidos. A figura obtida em forma de grfico. A
comparao dos raios X produzidos pelas amostras com os raios X de elementos-padro
permite identificar os elementos que emitiram os raios detectados. Os mais leves so mais
dificilmente detectados, sendo a identificao mais segura a partir do sdio. Alm disso, a

93

rea da amostra que gera raios X de tamanho vrias vezes ao do dimetro do feixe incidente e, portanto resulta em menor resoluo.
O MET, assim como o MEV, ao ser equipado com esse acessrio, devido
alta resoluo que eles alcanam, permite fazer anlises localizadas de raios X, nas
amostras, o que antes era impossvel. Anteriormente, s eram feitas anlises de
composio atmica em amostras de tamanho macro.
Os raios X acoplados ao MET ou MEV so muito teis nos estudos sobre
poluentes, como chuvas cidas, pesticidas, bactrias que vivem e sobrevivem em
locais de condies extremas de sobrevivncia, dentre outros ( NEWBURY et al.,
1986; BOZZOLA; RUSSEL, 1999). Para maiores informaes, consultar Scholar.

cap.02

Google (2007).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.2.3. Microscopia de Raios X


As imagens obtidas nos primeiros microscpios de raios X baseavam-se em
tcnica grfica de sombreamento e no possuam alta definio. Essa tcnica devida atenuao diferencial dos raios X pelos componentes da amostra. Enquanto a
atenuao era efetiva para amostras com forte capacidade de absoro, o contraste
de amostras de fraca absoro era muito fraco.
Segundo Brownlow e colaboradores (2006), em 1930 surgiu o primeiro microscpio de raios X de projeo pontual; a resoluo era muito limitada em funo da
fonte de raios X. Em 1950, foram introduzidas melhorias e usadas lentes magnticas
para reduzir o feixe de eltrons produzindo feixes de raios X menores. Grande parte
dos microscpios de raios X distribudos nos centros de pesquisa est baseada no
projeto desenvolvido, em 1978, por Horn e Waltinger. Nele, o equipamento de raios
X fica acoplado a um MEV (NEWBURY et al., 1986), de forma que, usando o processo de feixe eletrnico e as lentes magnticas do MEV, tambm fosse produzido
um feixe fino de raios X; mas a baixa densidade da fonte de eltrons resultou em
baixas intensidades de raios X e isso, combinado com filmes de baixa capacidade
de deteco, exigia que fossem usados perodos de exposio muito longos.
A capacidade de floculao de minerais de biodegradao microbiana considerada um dos processos bsicos na descontaminao do solo e da gua, de acordo com Thieme e colaboradores (2003). Eles usaram MET de raios X para estudos
tomogrficos em 3D, in situ, de bactrias agregadoras de partculas de solo, usando

94

como fonte de raios X a radiao sincrotrnica. O resultado obtido por eles foi imagem tridimensional e de alta resoluo.
Brownlow e colaboradores (2006) desenvolveram um microscpio de raios X
com imagem de contraste de fase acoplado a um MEV, que eles denominaram X-ray
ultraMicroscope (XuM), que atua por flexo ou refrao dos raios X, medida que
eles interagem com a amostra. Alm de fornecer um mecanismo para fazer imagem
de materiais de baixa densidade, o contraste de fase sensvel a caractersticas de
freqncia espacial alta, definindo melhor os limites de ligaes, rachaduras e espaos vazios, como bolhas. Para isso, foram feitos estudos, em que avanos na fonte de
raios X, tecnologia de detector e softwares, possibilitaram ultrapassar muitas das limitaes anteriores da tcnica, que tinham resoluo mxima de 100 nm, passando a
obter resoluo de 50 nm. Ainda segundo esses autores, os raios X tpicos se baseiam
no contraste de absoro, mas possvel formar imagem com adaptaes precisas
feitas na origem dos raios, obtendo-se tanto informaes de contraste de fase quanto de absoro. Para conseguir alta resoluo, eles tiveram que fazer adaptaes no
MEV, assim como modificaes no sistema de captao de imagem (cmaras CCD).

biofilmes e na manuteno da estabilidade destes. Em microbiologia de alimentos,


a tcnica ainda pouco utilizada, talvez porque no seja bastante conhecida. De
acordo com Browlow e colaboradores (2006), o XuM permite realizar estudos de
eletromigrao, delaminao e localizao de defeitos em semicondutores e amostras microeletrnicas, compsitos polimricos, defeitos em diamantes e outros minerais, estudo da estrutura interna da madeira, papel e outros tipos de embalagens,
exame de ampla gama de amostras biolgicas e a localizao de poeira csmica
capturada em aerogel. Os mtodos de tomografia e estreo ajudam muito quando
se interpreta a estrutura 3D da amostra.
Para mais informaes sobre microscopia eletrnica de raios X, consultar o
site que contm, entre outros, sugestes de livros sobre o assunto, com nfase em
biologia (GOOGLE SCHOLAR, 2007).

2.2.4. Microscopia de Fora Atmica

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Essa tcnica tem sido til para estudar a influncia de minerais na formao de

H muito vinha sendo um desafio conciliar a alta resoluo da microscopia


eletrnica com a capacidade de obter imagens em meio aquoso, prpria dos microscpios pticos. No entanto, no incio da dcada de 1980, com a inveno do microscpio de tunelamento (BINNIG et al., 1982), tornou-se possvel observar, medir e
manipular tomos ou molculas, estimulando inmeros laboratrios a desenvolver
experimentos controlados em escala nanomtrica. A inveno desencadeou o surgimento de grande variedade de tcnicas microscpicas de varredura por sonda,
dentre as quais se destaca, alm da prpria microscopia de tunelamento, a microscopia de fora atmica. O MFA um equipamento utilizado para obter imagens de

95

superfcies de materiais diversos em escala submicromtrica, e seu funcionamento


se baseia na medida de foras atrativas ou repulsivas entre a amostra e uma sonda
(ponteira ou ponta) que a percorre (BINNIG et al., 1986).

2.2.5. Princpio de Funcionamento dos MFA


Os MFA sondam a superfcie da amostra por meio de uma ponteira muito fina,
cuja curvatura da extremidade inferior pode ser descrita aproximadamente como
uma semi-esfera com raio variando entre 5 e 50 nm e comprimento entre 2 e 4 m.
As ponteiras so montadas nas extremidades livres de alavancas (cantileveres) com
85 a 320 m de comprimento e mdulo elstico entre 0,02 e 17 N.m-1.
O sistema composto basicamente por uma sonda (ponteira com extremidade
inferior muito fina) fixada na extremidade de uma haste flexvel (cantilever); um sistema piezoeltrico de varredura para movimentar a amostra ou a ponta; um sistema

cap.02

de deteco do movimento da haste; um sistema de realimentao para controlar

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

a distncia entre a ponta e a superfcie da amostra. H duas maneiras de percorrer


a amostra em observao. Tanto se pode mover a amostra e manter fixa a ponteira
quanto, alternativamente, mover a ponteira sobre a amostra fixa.
As foras de interao entre a ponta e a amostra causam deflexo no cantilever, enquanto a ponteira percorre a amostra ou quando a amostra se desloca
sob a ponteira. Em geral, os MFA so capazes de medir deflexes do cantilever
(dc) de at 0,01 nm. Para isso, a maioria dos MFA dispe de um dispositivo ptico
de fcil manuseio, capaz de alcanar uma resoluo comparvel de um interfermetro (ALEXANDER et al., 1989). O dispositivo ptico formado por um laser,
um espelho (parte superior do cantilever) e um sensor de posicionamento vertical (fotodetector). O feixe de laser, aps refletir na parte espelhada do cantilever,
incide no fotodetector. Os sinais provenientes do fotodetector, que monitora o
posicionamento vertical da ponta e do sistema de controle do piezeltrico, so
armazenados e processados por um microcomputador, permitindo-lhe gerar um
mapa topogrfico da superfcie em estudo.
O MFA funciona medindo foras atrativas ou repulsivas entre a ponteira e a
amostra. No modo repulsivo, tambm chamado de modo de contato, a ponta toca
suavemente a superfcie da amostra, medindo foras de repulso. Esse modo de
operao fornece informao topogrfica com definio horizontal inferior a 0,1 nm
e definio vertical menor do que 0,01 nm. Uma variao do modo de contato que
produz imagens a partir de deflexes laterais (tores) do cantilever recebe a denominao microscopia de fora lateral.

96

Outra fora geralmente presente durante a operao do MFA, ao ar, no modo


de contato, a fora de capilaridade. Superfcies expostas ao ar ambiente geralmente se acham cobertas por uma fina camada de gua. Ao entrar em contato com a
superfcie, a sonda envolvida pela gua, e forma-se um menisco entre a ponta e a
superfcie, responsvel por uma fora atrativa intensa (~10-8 N) que os mantm em
contato. A fora de capilaridade resulta da separao entre a ponta e a amostra.
Operando no modo de contato, o MFA pode gerar imagens da superfcie de
duas formas distintas.
No primeiro caso, modo de alturaconstante, a variao espacial da deflexo do
cantilever pode ser usada diretamente para gerar o conjunto de dados topogrficos,
porque a altura do scanner predeterminada e mantida constante durante todo o
processo de varredura. O modo de alturaconstante freqentemente usado para
capturar imagens em escala atmica de superfcies absolutamente planas (Figura 3).
Esse modo de operao essencial para o registro em tempo real de imagens de
superfcies dinmicas, quando alta velocidade de varredura imprescindvel.

varredura de 100 nm.s-1. No destaque, a transformada de Fourier da imagem (Fonte: CEOTTO et al., 1999).

No outro caso, modo de fora-constante, a deflexo do cantilever usada como


entrada de um circuito de retroalimentao que move o scanner para cima e para

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Figura 3. Resoluo da rede atmica de uma superfcie de mica imersa em gua, obtida com velocidade de

baixo, acompanhando a topografia da superfcie da amostra, mantendo a deflexo


do cantilever constante (fora constante). Nesse caso, a imagem gerada a partir do
movimento do scanner. Como a deflexo mantida constante, a fora total aplicada
amostra tambm o . No modo de fora-constante, a velocidade de explorao
limitada pelo tempo de resposta do circuito de retroalimentao, mas a fora total
exercida na amostra pela ponteira bem controlada. Na Figura 4 so apresentadas
imagens do fungo Colletotrichum graminicola, obtida no modo de fora-constante.
97

Figura 4. Imagem de fungos Colletotrichum graminicola em superfcie de vidro (Fonte: CEOTTO et al., 1998).

No modo atrativo, ou modo de no-contato, o MFA mantm a ponta e a amostra separadas por uma distncia previamente ajustada (10 - 20 nm), enquanto monitora deflexes decorrentes de interaes de longo alcance, como foras de van der
Waals, eltricas e magnticas, dentre outras. Uma das vantagens desse modo de
operao repousa no fato de a ponta no tocar a amostra. Entretanto, a resoluo
cap.02

normalmente pobre, sendo raramente usado em materiais biolgicos.

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98

O modo de contato intermitente similar ao modo de no-contato, exceto


pelo fato de que o cantilever oscila de tal maneira que, ao final de seu curso (~100
nm), a ponteira toca a amostra. Algumas amostras so mais bem exploradas atravs
do emprego desse modo de contato, que tem se consolidado como uma tcnica
importante de MFA por superar algumas das limitaes dos modos de contato e
de no-contato. Comparado ao modo de contato, o modo de contato-intermitente
elimina os danos provenientes das foras laterais (frico ou arrasto) entre a ponta
e a amostra. No entanto, para que a ponteira possa penetrar e sair da camada de
gua, a fora vertical deve ser grande o bastante para superar a fora de capilaridade
(~10-8 N), que tende a manter a ponteira aderida amostra, podendo danificar e,
ou, deformar superfcies macias ou materiais elsticos. Em relao ao modo de
no-contato, o modo de contato-intermitente tem-se mostrado mais eficaz para
varrer amostras que apresentem grande variao de topografia.
A utilizao do MFA permite observar materiais ao ar, em vcuo e em meio
lquido. Um dos aspectos mais atrativos do MFA est exatamente na capacidade de
obteno de imagens de estruturas em solues aquosas. Apesar de a maioria dos
experimentos ainda serem realizados ao ar, os estudos em lquidos apresentam a
vantagem de eliminar o menisco sem a necessidade da utilizao de sistemas de vcuo, possibilitando reduzir de 10 a 100 vezes a fora aplicada pela ponta superfcie
(WEINSENHORN et al., 1989).
Entre as aplicaes do MFA, destaca-se seu potencial de uso para o estudo
de materiais biolgicos (BUSTAMANTE et al., 1994; GUNNING et al., 1996; TESCHKE; DOUGLAS, 1997; HANSMA, 1998; CABALLIDO-LOPEZ; ERRINGTON, 2003;
OHAGAN et al., 2004; BERDYYEVA et al, 2005; BURTON; BHUSAHAN, 2006; JENA,
2006; PUECH et al., 2006; SIMON; DURRIEU, 2006; VENKATARAMAN, 2006). Uma
vez que a maioria desses materiais desnaturada quando no mantida em solues isotnicas e que organismos vivos dependem do fornecimento de diversos
nutrientes em forma de solutos, fica evidente a importncia do desenvolvimento
de mecanismos de observao de processos em sistemas imersos em meios lquidos. Nesse campo, o MFA apresenta grandes vantagens em relao a outros
mtodos de microscopia.
No caso particular de observaes de estruturas microbianas, por exemplo, a
microscopia ptica convencional apresenta limitaes, pois, alm de exigir o uso de
substratos transparentes, a resoluo fica limitada a aproximadamente metade do
comprimento de onda da luz, ou seja, entre 200 e 400 nm. J em microscopia eletrnica, ainda que o limite de resoluo do microscpio ptico tenha sido superado,
as amostras necessitam de preparao especial, que envolve fixao qumica, desidratao e emprego de contrastes ou revestimentos, o que leva visualizao de
estruturas artificiais. Ao se observarem clulas ou esporos aderidos em superfcies,
por meio de MFA, no h necessidade de luz nem de preparo prvio da amostra e,
ainda, podem-se usar substratos opacos, bastando que a superfcie em exame seja

2.2.6. Curvas de Fora


O MFA tambm permite a construo de curvas de fora em funo da distncia entre a ponta e a superfcie da amostra (CEOTTO et al., 2001). Essas medidas so
essenciais para definir foras verticais que devem ser aplicadas a uma superfcie,
para a captao de imagens.
O MFA, alm de mapear as superfcies em estudo com uma resoluo espacial
de poucos nanmetros, possibilita, a partir das imagens geradas, escolher onde
medir as referidas foras. Se um cantilever de baixa constante elstica for usado
por exemplo, com kc = 0,03 N/m, a resoluo da fora na direo perpendicular
superfcie ser:
F = kc dc = (0,03 Nm-1) (0,1 10-10 m) = 3 10-13 N

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


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plana. Entretanto, cuidados especiais devem ser tomados no preparo de materiais


biolgicos, a fim de evitar que materiais viscosos, como meios de cultivo base de
gar, mascarem a imagem e inviabilizem a ponteira.

A representao grfica da fora aplicada ponteira do MFA, enquanto a amostra aproximada e afastada, constitui a chamada curva de fora. As curvas de fora
so complexas e especficas para diferentes sistemas em estudo. Em princpio, tal
grfico expressa a fora requerida para atingir certa profundidade de deformao, o
que possibilita a determinao de parmetros viscoelsticos de materiais. Assim, se
examinam plaquetas, bactrias e clulas, ou se estudam propriedades micromecnicas de ossos e de outros materiais.
99

3. Aplicao da Microscopia no Estudo da Adeso e Formao de


Biofilmes
3.1. Microscopia de Fora Atmica
H cerca de 60 anos, a microscopia ptica foi usada pelo pesquisador Zobbel,
para demonstrar o papel da adeso bacteriana na formao de depsitos e corroso
de superfcies slidas submersas no mar. Esse pesquisador mostrou a capacidade
de microrganismos aderirem a lminas de vidro que foram coradas e observadas
no microscpio ptico. A estrutura complexa do biofilme j foi revelada por essa
tcnica e, com base nas caractersticas morfolgicas, uma variedade de bactrias foi
descrita, indicando alta diversidade de espcies nos processos de adeso microbiana e formao de biofilmes (WIMPENY, 2000).
Hoje se v que a microscopia pode ser empregada no estudo do processo
de formao do biofilme em diversos tipos de materiais utilizados na indstria de
cap.02

alimentos. As tcnicas se aplicam para o estudo de diferentes fases, desde a adeso,

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passando pelo incio da formao de camadas bacterianas (agregao), estabelecimento da arquitetura do biofilme, liberao de clulas para a colonizao de outros stios, estabelecimento de formas irreversveis do biofilme (com a presena de
agentes cimentantes, como o clcio) at o estudo do papel de fmbrias e exopolissacardeos na arquitetura do biofilme. A microscopia pode tambm ser utilizada para
o estudo dos efeitos de cada superfcie experimental e de agentes sanitizantes sobre
o biofilme. Entretanto, para cada estudo sempre haver uma tcnica de microscopia
mais adequada. Como exemplo, as microscopias de luz, com exceo da MFA, s
se aplicam ao estudo da formao de biofilme em cupons transparentes, enquanto
a MFA e a MEV so usadas no estudo das superfcies e arquitetura dos biofilmes.
J a MET e a tambm a MEV so aplicveis ao estudo de exoplissacardeos e elementos qumicos envolvidos na formao do biofilme. A MET, alm do j mencionado, permite o estudo da estrutura interna do biofilme e da influncia de fmbrias,
flagelos e glicoprotenas em sua formao. As caractersticas de algumas tcnicas
de microscopia so detalhadas na Tabela 1. Constata-se que o microscpio ptico
e o microscpio de fora atmica so rpidos e fceis para uso, com nenhuma ou
pouca preparao da amostra, no sendo necessrio o uso de vcuo. Alm disso,
esses microscpios tm campos de observao amplos, ainda que somente o MFA
tenha elevada capacidade de ampliao e resoluo. Os MEV e MFA mapeiam as
superfcies e tm uma profundidade de campo ampla, mas somente a microscopia
de fora atmica funciona com um mnimo de preparao da amostra.
Quadro 1 - Caractersticas de algumas tcnicas microscpicas para avaliar microtopografia
de superfcies

100

levado a uma grande quantidade de informaes sobre processos de adeso microbiana e formao de biofilme, permanecem alguns problemas que devem ser
levados em considerao, dentre eles a interpretao das imagens produzidas,
dependendo dos procedimentos utilizados. Por exemplo, o exopolissacardeo que
geralmente cerca e envolve as comunidades microbianas pode secar, formando
cordes finos, os quais podem ser interpretados como estruturas fibrosas que unem
os microrganismos (WIMPENY, 2000).
A microscopia ptica convencional o mtodo mais simples de usar, porm
possui limitaes: i) a ampliao e a resoluo no so to boas quanto as de outros
instrumentos mais modernos disponveis; ii) a profundidade de campo que pode ser
visualizada mnima; iii) deve ser utilizado um substrato transparente, como o vidro;
e iv) as clulas aderidas devem ser coradas. Apesar disso, inmeras pesquisas com
biofilmes microbianos foram realizadas, utilizando esse instrumento e, assim, reconhecido que o microscpio de luz um instrumento til para estudar os biofilmes.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

Deve-se considerar tambm que, apesar de as tcnicas microscpicas terem

Outras formas de microscopia de luz, como a de epifluorescncia e a confocal, so


os mtodos preferidos para serem utilizados nessas pesquisas (ZOTTOLA, 1997).
Aps essas consideraes, sero mostrados subseqentemente exemplos da
utilizao das diversas microscopias e esclarecidas para quais finalidades cada uma
se aplica melhor.

3.2. Uso da Microscopia de Fora Atmica na Avaliao de Adeso de


Microrganismos e Anlise de Rugosidade de Superfcies

101

3.2.1. Avaliao de Adeso de Microrganismos


Um breve ensaio do uso MFA para observar materiais biolgicos foi desenvolvido, usando-se esporos de Bacillus cereus e clulas vegetativas de Bacillus subtilis
e Listeria innocua (Tabela 2).

cap.02

As estruturas desses microrganismos foram examinadas quando estes se encontravam aderidos em cupons de mica, silcio e vidro. As observaes foram feitas
temperatura ambiente, sendo as imagens obtidas de acordo com trs diferentes
protocolos de preparao das amostras: i) os cupons de mica foram clivados imediatamente antes de receber a suspenso bacteriana, com o objetivo de obter superfcies limpas e hidroflicas, e os cupons de silcio foram mergulhados em soluo
de cido fluordrico por cerca de 1 minuto, para que as superfcies se tornassem
hidrofbicas e, em seguida, lavadas em gua Milli-Q. Logo aps, os cupons foram
impregnados por gotejamento com suspenses de esporos de B. cereus ( 109 esporos.mL-1); ii) os cupons esterilizados de vidro e de silcio foram simultaneamente
colocados, por aproximadamente 18 horas, em frascos contendo 100 mL de meio

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de cultivo inoculados com B. subtilis, sendo depois lavados com gua bidestilada
para remoo de clulas planctnicas e secos por aproximadamente 48 horas,
temperatura ambiente e em ambiente assptico; e iii) cupons de vidro foram imersos em suspenses de clulas de L. innocua e, aps 12 e 18 horas de contato, foram
removidos e lavados com gua bidestilada, de forma a manter somente as clulas
ssseis. Os cupons foram observados imediatamente aps a secagem.
Quadro 2 Sntese do estudo que avaliou a adeso bacteriana em superfcies, por microscopia
de fora atmica (MFA)

102

As imagens das estruturas microbianas confirmaram o potencial do MFA para


visualizar e estudar materiais biolgicos, evidenciando-se sua indicao para investigar mecanismos de adeso de esporos e formao de biofilmes microbianos.

contato, ao ar, com as clulas em forma de bastonete aderidas a cupom de vidro,


possivelmente em plena diviso celular.

Figura 5. Imagens de Listeria innocua obtidas no modo de contato, ao ar. Vista de topo (a) com
representao em funo da altura e (b) com iluminao lateral (Fonte: CEOTTO, 2001).

Nas Figuras 6, 7, 8 e 9 so apresentadas as imagens de clulas de B. subtilis


aderidas a cupons de vidro e de silcio, tambm obtidas no modo de contato ao ar.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

Na Figura 5 so apresentadas as imagens de L. innocua obtidas no modo de

a)

103

b)

cap.02

Figura 6. Imagens de clulas de Bacillus subtilis aderidas em cupons de (a) silcio e (b) vidro, obtidas no
modo de contato, ao ar (Fonte: CEOTTO, 2001).

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a)

b)

Figura 7. Imagens de clulas de Bacillus subtilis aderidas em cupom de vidro, obtidas no modo de contato,
ao ar (a). Em (b), detalhe da regio de contato entre clulas (Fonte: CEOTTO, 2001).

a)

104

b)

Figura 8. Imagens de aglomerados de clulas Bacillus subtilis aderidas em cupons de vidro, ao ar, obtidas
no modo de contato (a) e no contato (b) (Fonte: CEOTTO, 2001).

b)

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

a)

Figura 9. Imagens de aglomerado de clulas de Bacillus subtilis aderidas cupons de silcio, ao ar, obtidas
no modo de contato (a). Em (b), detalhes da superfcie rugosa e da regio de contato entre clulas (Fonte:
CEOTTO, 2001).

As Figuras 10 e 11 exibem imagens de esporos de B. cereus, em cupons de


mica e de silcio.

105

Figura 10. Imagens de esporos de Bacillus cereus em cupons de mica, obtidas no modo de contato, ao ar
(Fonte: CEOTTO, 2001).

cap.02

Figura 11. Imagens de esporos de Bacillus cereus em cupons de silcio tratado com soluo de cido
fluordrico, obtidas no modo de contato, ao ar (Fonte: CEOTTO, 2001).

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Na Figura 12a so mostrados detalhes da superfcie de uma amostra preparada


para ser visualizada por MEV. Na Figura 12b, observa-se a superfcie de um esporo
de B. cereus no estado natural, condio apropriada para visualizao por MFA. As
imagens revelam diferenas marcantes entre a amostra sem preparao prvia e a
que foi recoberta por uma camada de aproximadamente 15 nm de ouro.

106

Figura 12. Imagens de superfcies de esporos de Bacillus cereus obtidas no modo de contato, ao ar: (a)
coberto por uma fina camada de ~15 nm de ouro e (b) in natura.

3.2.2. Topografias de Poli-nilon Polietileno e Poli(cloreto de vinilideno)


Irradiadas com 60cobalto
Avaliadas pela MFA, as superfcies mostraram diferenas em suas microtopografias com o aumento do grau de irradiao (Figuras 13,14 e 15), auxiliando, assim,
a interpretao da adeso bacteriana (SILVA, 2006). Embora, visualmente, possam
constatar fendas identificadas pela tonalidade de cor MFA permite a determinao
da rugosidade das superfcies a partir dos valores de Ra, RZ e Rq ( Quadro 3 ), o que
torna mais precisa a avaliao dos resultados.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos
107

cap.02

Figura 13 - Microtopografia de poli-nilon observada por microscopia de fora atmica, depois de irradiado
com 60cobalto.

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108

Figura 14 -. Microtopografia de polietileno de baixa densidade observada por microscopia de fora atmica,
depois de irradiado, com 60cobalto.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos
109

cap.02

Figura 15 - Microtopografia de poli(cloreto de vinilideno) observada por microscopia de fora atmica,


depois de irradiado, com 60cobalto.

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Quadro 3 Rugosidade mdia (Ra), mdia da raiz quadrada das rugosidades (Rq) e mdia dos
pontos mais irregulares (Rz) das amostras de nylon-poli, PEBD e PVDC, obtidos por microscopia de fora atmica, aps a irradiao com 60cobalto

Os resultados do Quadro 3 evidenciam diferenas nas microtopografias das


110

superfcies irradiadas. Quando so analisados os valores de Ra e Rq, verifica-se


que a superfcie que apresenta maiores mdias de rugosidade a PVDC, com valores variando entre 9,123 nm e 22,959 nm para Ra e entre 12,027 nm e 29,391nm
para Rq, correspondendo a um acrscimo de 152 % e 144 % na rugosidade, respectivamente. Para o poli-nilon, os valores variaram de 8,238 nm a 12,573 nm
para Ra e de 10,493 nm a 15,961 para Rq, perfazendo um acrscimo porcentual
de 52 % nos dois parmetros de avaliao da rugosidade. Dentre os polmeros
analisados, o PEBD apresentou menor variao para Ra e Rq, respectivamente de
8,913 nm a 12,208 nm e de 11,513 nm a 15,561, com uma diferena porcentual de
36 % e 35 % na rugosidade.
Com relao s mdias dos picos mais altos e mais baixos (Rz) das superfcies, pode-se destacar que o poli-nilon apresentou maior variao porcentual,
113 %, com valores de variao entre 80,632 nm e 171,94 nm, sendo seguido pelo
PVDC, que apresentou valores variando de 117,97 nm a 233,33 nm. Para o PEBD,
os valores variaram de 104,35,nm a 122,87 nm, com porcentual de alterao de 53
% na rugosidade do polmero.

ras diferentes dos polmeros.

3.3. Adeso Bacteriana em Diferentes Superfcies Avaliada pela Microscopia


de Epifluorescncia
As fotomicrografias da Figura 16 mostram a adeso de S.aureus e de L. innocua em ao inoxidvel AISI 304, n 4. Usando as fotomicrografias, pode-se determinar o nmero de microrganismos aderidos superfcie. Para o S. aureus so
enumeradas 31 unidades microbianas (isoladas ou em agrupamento) em uma rea
de 2160 m2. Assim, em uma rea de 1 cm2, tem-se a adeso de 7,8 x104 CDM/cm2,
configurando-se um proceso de adeso. Da mesma forma, observam-se 16 unidades de L. innocua aderidas a uma rea de 2160 m2 do ao inoxidvel, sginificando
uma adeso de 3,9 x104 CDM/cm2.

Figura 16 - Adeso de Staphylococcus aureus e de Listeria innocua em ao inoxidvel AISI 304, n 4, aps
12 h, a 37 oC.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

Provavelmente, a alterao na rugosidade pela irradiao se deveu s estrutu-

111

Na Figura17, observa-se um biofilme de P. fluorescens em polietileno aps 12


h de adeso.

cap.02

Figura 17 - Biofilme de Pseudomonas fluorescens, em polietileno, aps 24 h a 30 C.

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A fotomicrografia da Figura 19 mostra a adeso de esporos de Bacillus cereus


em polietileno, onde se pode observar a morfologia oval e, ou, esferica dos esporos.

Figura 19 - Adeso de esporos de Bacillus cereus em polietileno, aps 12 h a 30 C.

As fotomicrografias da Figura 20 mostram a adeso de Pseudomonas fluorescens a diversas superfcies e tempos de contato.

112

Figura 20 - Adeso de Pseudomonas fluorescens em diversas superfcies e tempos de contato: a- ao


inoxidvel(6 h); b- PVC revestimento fino (10 h); c- PVC revestimento grosso (8 h); d- granito (2 h); emrmore (8 h); f- poliuretano dupla face (6 h).

As fotomicrografias mostram a adeso de Escherichia coli O157:H7 em superfcies de folhas de alface.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

3.4. Adeso Bacteriana e Formao de Biofilmes Observada pela


Microscopia Eletrnica de Varredura

113

cap.02

Figura 21 - Adeso de Escherichia coli O157:H7 superfcies de alface, avaliada por microscopia de fora
atmica.

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3.5. Avaliao de Superfcie de Ao Inoxidvel por MFA

Figura 22 - Fotomicrografia de superfcie de ao inoxidvel AISI 304 n4, por microscopia de fora atmica.

4. Concluso
H cerca de 60 anos, a microscopia foi usada pelo pesquisador Zobbel para
demonstrar o papel da adeso bacteriana na formao de depsitos e corroso de
superfcies slidas submersas no mar. Esse pesquisador mostrou a capacidade de
microrganismos de aderirem lminas de vidro, que foram posteriormente coradas
e observadas ao microscpio. A estrutura complexa do biofilme foi revelada por
essa tcnica. Com base nas caractersticas morfolgicas, concluiu-se que grande
diversidade de espcies contribua para os processos de adeso microbiana e for-

114

mao de biofilmes naquelas superfcies.


Hoje se v que a microscopia pode ser empregada no estudo das vrias fases
do processo de formao do biofilme, em diferentes tipos de cupons ou substratos
utilizados experimentalmente em microbiologia de alimentos. As tcnicas se aplicam
aos estudos de adeso, incio da formao de camadas bacterianas (agregao), estabelecimento da arquitetura do biofilme, liberao de clulas para a colonizao de
outros stios, estabelecimento de formas irreversveis de biofilme com a presena
de agentes cimentantes, como o clcio, at o estudo do papel de fmbrias e exopolissacardeos na arquitetura do biofilme. A microscopia pode tambm ser usada no
estudo dos efeitos de cada superfcie experimental e de agentes sanitizantes sobre
o biofilme.
Para cada desafio, entretanto, sempre haver uma tcnica de microscopia mais
adequada. Como exemplo, as microscopias de luz de campo claro, quando acopladas com contraste de fase e de iluminao DIC, se aplicam ao estudo da formao
de biofilme em cupons transparentes, com ou sem colorao; com fonte de luz adequada e filtros especiais, a microscopia de luz se aplica observao de bactrias

to; na contagem de clulas bacterianas geralmente usado o microscpio de campo


escuro, enquanto o microscpio de fora atmica (MFA) e o microscpio eletrnico
de varredura (MEV) so utilizados nos estudos de superfcies e arquitetura dos biofilmes e de bactrias. No entanto, a microscopia eletrnica de transmisso (MET) e
a microscopia eletrnica de varredura (MEV) so muito empregadas no estudo de
exopolissacardeos e elementos qumicos envolvidos na formao do biofilme. A
MET, alm do mencionado, permite o estudo da estrutura interna, da composio e
papel fisiolgico do biofilme em relao clula bacteriana e superfcie do substrato, bem como ajudar a desvendar a influncia de fmbrias, flagelos e glicoprotenas
na formao do biofilme. Em termos de preparao da amostra, tanto o microscpio
de luz (com exceo do de fluorescncia e do confocal) quanto o MFA so rpidos
e fceis de usar, com nenhuma ou pouca preparao das amostras; os eletrnicos
normalmente so usados sob alto vcuo, da a necessidade de um processo mais
longo de preparao dos espcimes biolgicos. Entretanto, com relao ao tamanho da amostra, os microscpios de luz permitem vasto campo de observao,

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

autofluorescentes ou fluorescncia de clulas bacterianas marcadas, cito-esquele-

ao contrrio do MFA, que no entanto, possui elevada capacidade de resoluo. Os


MEV e MFA mapeiam as superfcies e tm profundidade de campo ampla; embora
ambos possam usar espcimes praticamente sem nenhuma preparao anterior, o
MFA, todavia, trabalha apenas espcimes de dimenses micromtricas. As sondas
de raios X e os microscpios de raios X no fornecem informao sobre a morfologia do material, mas informam a constituio inica dele.

cap.02

115

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Referncias
ABU-HAMDAH, R.; CHO, W.J.; HRBER, J.K.H.; JENA, B. P. Secretory vesicles in live cells are not
free-floting but tethred to filamenous structures: A study using photonic force microscopy. Ultramicroscopy, 106:670-673, 2006.
ALEXANDER, S.; HELLEMANS, L.; MARTI, O.; SCHNEIR, J.; ELINGS, V.; HANSMA, P.K.; LONGMIRE,
M.; GURLEY, J. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical-lever.
Journal of Applied Physics, v. 65, n. 1, p. 164-167, jan 1 1989.
AMERSHAMBIOSCIENCES. http://www4.amershambiosciences.com/. 2007
ANALYTIC. http://www.sem.com/analytic/sem.htm .2007.
ANDRADE, N. J.; BRIDGEMAN, T. A. ; AJAO, D. B.,. ZOTTOLA, E. A. Growth and adherence on stainless steel by Enterococcus faecium. Journal of Food Protection, v.61, -1454-1456, 1998(a).
ANDRADE, N.J., BRIDGEMAN, T.A., ZOTTOLA, E.A. Bacteriocidal activity of sanitizers against Enterococcus faeciuum attached to stainless steel as determined by plate count and impedance methods.
Journal Food Protection, v.61, p.833-838, 1998(b).
BERDYYEVA, T.; WOODWORTH, C.D.; SOKOLOV, I. Visualization of cytoskeletal elements by tne
atomic force microscope. Ultramicroscopy, 189-198, 2005.
BINNIG, G.; QUATE, C. F; GERBER, C. Atomic force microscope. Physical Reviews Letters. 56: 930933, 1986
BINNIG, G.; ROHRER, H.; GERBER, C.; WEIBEL, E. Tunneling through a controllable vacuum gap.
Applied Physics Letters, 40: 178-180, 1982.
BIOPHYSJ. http://www.biophysj.org/cgi/reprint/85/4/2705.pdf. 2007
BIOSTATUS. http://www.biostatus.co.uk/. 2007
BLACKMAN I., FRANK, I.F. Growth of Listeria monocytogenes as a biofilm on various food processing
surfaces. Journal Food Protection, v.59, p.827-831, 1996.

116

BOZZOLA, J.J. E RUSSELL, L.D. Electron Microscopy: Principles and techniques for biologists.
1999
BROWNLOW, L.; MAYO, S.; MILLER, P. SHEFFIELD-PARKER, J. Towards 50-nanometre resolution
with an SEM-hosted X-ray microscope. Microscopy and Analsis, 20(2);13-15, 2006.
BURTON, Z.; BHUSAHAN, B. Surface characterization and adhesion and friction properties of hydrophobic leaf surfaces. Ultramicroscopy 106: 709-719, 2006
BUSCHMANN, H. POTTER, U. Beeching, J. Ultrastruture of cassava roots studied by TEM and SEM.
Microscopy and Analysis, 52: 17-19, 2002.
BUSTAMENTE, C.; ERIE, D.A. KELLER, D. Biochemical and structural applications of scanning force
microscopy. Current Opinion in Structural Biology, 4:750-760, 1994
CABALLIDO-LOPEZ, R., ERRINGTON, J. A dynamic bacterial cytoskeleton. Trends in Cell Biology
13(11):577-583, 2003
CEOTTO FILHO, G. Medidas de perfil da permissividade eltrica em interfaces slido-lquido, usando microscopia de fora atmica. Universidade Estadual de Campinas, Campinas, So Paulo, Brasil.
(Tese de doutorado). 119p.2001
CEOTTO, G.; ANDRADE, N.J.; TESCHKE, O. Uso de microscopia de fora atmica (AFM) na observao de clulas e esporos bacterianos, aderidos a superfcies. Anais do V Congresso Latino Americano de Microbiologia e Higiene de Alimentos, guas de Lindia, SP, nov 1998.
CEOTTO, G.; DE SOUZA, E.F.; DOUGLAS, R.A.; TESCHKE, O. Efeitos do tempo de relaxao da dupla
camada na resoluo das imagens obtidas por microscopia de fora atmica. Anais do XXII Encontro
Nacional de Fsica da Matria Condensada, Caxambu, MG, p. 403, mai 1999.

CPG-BIOTECH. http://www.cpg-biotech.com. 2007


FIOCRUZ http://www.invivo.fiocruz.br/celula /historia_05.htm, 2007b
FORIN, E.L.; PRALLE, A.; STELZER, E.H.K.; HRBER, J.K.H. Photonic force microscope calibration by
thermal noise analysis. Applied Physics A, 66:S75-S78, 1998.
GLAUGHER, D. (ED.). Scanning Electron Microscopy in Taxonomy and Functional Morphology - The
Systematic Associoation Special Volume No.41. Oxford. Clarendon Press. 1990. 315p.
GUNNING, P.A., KIRBY, A.R., PARKER, M. L., GUNNING, A..P., MORRIS, V.J. Comparative imaging of
Pseudomonas putida bacterial biofilms by scanning electron microscopy and both DC contact and AC
non-contact atomic force microscopy. Journal of Applied Bacteriology, 81 276-282. 1996
HALL, C. E. A low temperature replica method for electron microscopy. Journal of Applied. Physics,
21: 61, 1950
HANSMA, P.K.; ELINGS, V. B.; MARTI, O.; BRACKER. C. E. Scanning tunneling microscopy and atomic force microscopy: application to biology and technology. Science, 242: 209-216, 1988.
HAYAT, M. A. Basic Electron Microscopy Techniques. NY, Cincinnati, Chicago, Millbrae, Dallas. Van
Nostrand Reinhold. 1972. 119 p.

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

CEOTTO, G.; DE SOUZA, E.F.; TESCHKE, O. Ionic surfactant films imaged by atomic force microscopy. Journal of Molecular Catalysis A Chemical, v. 167, n. 1-2, p. 225-233, fev 2001.

HAYAT, M. A. Colloidal Gold- Principles, methods, and applications. v.1. San Diego, NY, Berkeley,
Boston, London, Sydney, Tokyo, Toronto, Academic Press. 1989. 536p.
HAYAT, M. A. Positive Staining for Electron Microscopy, NY, Cincinnati, Toronto, London, Melbourne, Van Nostrand Reinhold, 1975. 361p.
HAYAT, M. A. Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications. V.1. NY,
Cincinnati, Chicago, Millbrae, Dallas. Van Nostrand Reinhold. 1970. 410p.
HELIXRESEARCH. http://www.helixresearch. com/. 2007
HEYWOOD, V. H. (ed.). Scanning Electron Microscopy - Systematic and Evolutionary Applications.
London, NY,. Systematic Association and Academic Press. 1971. 331p.

117

HIBBS, A. R. Confocal Microscopy for Biologists. Melbourne. Springer. 2004, 467p.


HOOD, S. Adherence of food-borne microorganisms to stainless steel. Ph.D Thesis. University of
Minnesota. St Paul. 1996.
ICNPHARM http://www.icnpharm.com.2007
IFR.http://www.ifr.ac.uk/spm/publications.html . 2007
IFR http://www.ifr.ac.uk/spm/gallery.lasso. 2007b
INVITROGEN. http://www.invitrogen.com/. 2007;
JENA, B.P.. Cell secretion machinery: studies using the AFM. Ultramicroscopy 106: 663-669, 2006
KPL. www.kpl.com/.2007
LEICA. http://www.leica.com. 2007
LEWIS, P. R. , KNIGHT, D. P., Cytochemical Staining Methods for Electron Microscopy. vol 14. (ed:
Glauert, A. M. Pratical Methods in Electron Microscopy. Amsterdan, Londres, NY, Tquio. Elsevier.
1992. 321p.

cap.02

MADL, J.; RHODE, S.; STANGL, H; STOCKINGER, H.; HINTERDORFER, P.; SCHTZ, G.J.; KADA, G.
A combined optical and atomic force microscope for live cell investigations. Ultramicroscopy, 8-9:
645-651,2006

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

MEEK, G.A. Pratical Electron Microscopy for Biologists, 2ed. London, NY, Sydney, Toronto, Jon
Wiley et Sons, 1976. 528p.
MICROSCOPYU. http://www.microscopyu.com/articles/ confocal/index.html .2007e
MICROSCOPYU.http://www. microscopyu.com/articles/fluorescence/index.html. 2007d
MICROSCOPYU.http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fluorescenceintro.html .2007c
MICROSCOPYU.http://www.microscopyu.com/articles/formulas/formulasna.html 2007a
Microscopyu.http://www.microscopyu.com/articles/phasecontrast/phasehome.html. 2007b
MICROSCOPYU.http://www.microscopyu.com/articles/stereomicroscopy/index.html 2007 f
Mobitech. http://www.mobitech.de/.2007
Muller, D.A.; Kirkland, E.J.; Thomas, M.G.; Grazul, J.L.; Fitting, L.; Weyland, M. Room design for highperfomance electron microscopy. Ultramicroscopy, 106: 1033-1040, 2006.
MUSETTI, R., FAVALI, M.A. Cytochemical localization of calcium and X-ray microanalysis of Catharanthus roseus L. infected with phytoplasmas. Micron, 34:387-393, 2003
NEWBURY, D.E.; ECHLIN, P.; JOY, D.C.; FIORI, C.E.; GOLDSTEIN, J.I. Advanced Scanning Electron
Microscopy and X-Ray Microanalysis, 1986
OHAGAN, B.M.G.; DOYLE, P.; ALLEN. J.M.; SUTTON, K.; MCKERR, G. The effects of atomic force
microscopy upon nominated living cells. Ultramicroscopy, 102:1-5, 2004
OLIMPUS. http://www.olympus.com.2007
PARIZZI, S.Q.F.; Adeso bacteriana em diferentes superfcies avaliada pela microscopia de epifluorescncia e contagem de placas. Editora Universidade Federal de Viosa. Viosa, Minas Gerais,
Brasil, 1999. 58p. (Dissertao de Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos).
PARSON, D. F. Some Biological Techniques in Electron Microscopy. NY, London. Academic Press.
1970. 186p.

118

PIERRI, J.J.; MAESTRELLI, S.C.; PALLONE, E. M. J. A.; TOMASI, R. Disperso de nanopartculas de


ZrO2 visando a produo de nanocompsitos de ZrO2 em matriz de Al2O3. Cermica, 51(317):janmar, 2005 (http://www.scielo.br/scielo .php?script=sci_arttex&pid=S0366-69132005000100003).
PORETTI, M. Quality control of water as raw material in food industry. Food Control, v.1. n3, p.79-83,
1990.
POSTEK, M.T.; HOWARD, K.S.; JOHSON, A. H.; McMichael, K.L. Scanning Electron Microscopy - A
Students handbook. Ladd Research Industries, 1980; 305p.
PRALLE, A.; FLORIN, E. L., STELZER, E. H. K.; HRBER, J. K. H. Local viscosity probed bu photonic
force microscopy. Applied. Physics A 66:S71-S73, 1998.
PROBES. http://www.probes.com. 2007
PUBMEDCENTRAL.http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=1303494 . 2007
PUECH, P. H.; POOLE, K.; KNEBEL, D.; MULLER, D. J. A new technical approach to quantify cell-cell
adhesion forces by AFM. Ultramicroscopy,106: 637-644, 2006
QBIOGENE. http://www.qbiogene.com/. 2007
RASKA, I. Oldies but goldies: searching for Christmas trees within the nucleolar architecture. Trends
in Cell Biology, 13:517-525, 2003
SCHOLAR.GOOGLE.http://scholar.google.com/scholar?q=X+ray,+electronic+microscopy&hl=ptBR&lr=&start=20&sa=N . 2007

SIMON,A. E DURRIEU, M. C. Strategies and results of atomic force microscopy in the study of cellular
adhesion. Micron, 37:1-13, 2006
SMARDA, J.; SMAJS, D.; KOMRSKA, J.; KRZYZANEK, V. S-layers on cell walls of cyanobacteria.
Micron, 33:257-277, 2002.
SOUZA, W. de (ed.) Tcnicas Bsicas de Microscopia Eletrnica Aplicadas s Cincias Biolgicas. Rio
de Janeiro. Sociedade Brasileira de Microscopia. 1998. 179p.
STANLEY, R.L.; FLECK, R.; PATTERSON-KANE, J. C.; GOODSHIP, A.E.; RALPHS, J.R. Confocal microscopy and image analysis of connexin plaques in equine tendon. Microscopy and Analysis, 20
(2): 5-6, 2006
TECNHNION.http://www.technion.ac.il/~eshimoni/Research.htm.2007
TERAUCHI, M.; KAWANA, M. Soft-X-ray emission spectroscopy based on TEM - Toward a total electronic struture analysis. Ultramicroscopy, 106: 1069-1075, 2006.
TESCHKE, O.;DOUGLAS, R. A. Viscous drag effect on imaging of linearized plasmid deoxyribonucleic
acid in liquid medium with atomic force microscopy. Applied Physics Letters, 70;1977-1979, 1997
THIEME, J.; SCHNEIDER, G. E KNCHEL, C. X-ray tomography of a microhabitat of bacteria and other
soil colloids with sub-100nm resolution. Micron, 34: 339-334, 2003

Tcnicas em Microscopia usadas no Estudo da Adeso e da


Formao de Biofilmes Microbianos

SILVA, C. A. S. Avaliao da adeso bacteriana em polmeros empregados na indstria de alimentos irradiados com 60cobalto. Viosa, MG. 2006. p. 56. Tese (doutorado em Cincia e Tecnologia de
Alimentos). Universidade Federal de Viosa.

TIEDT, L R.; JOOSTE, W. J.; HAMILTON-ATTWELL, V. L. Techniques preserving aerial fungus structures for scanning electron microscopy. Trans. Br. Mycol. Soc., 88(3): 420-421, 1987
TOTH, M.; THIEL, B.L.; DONALD, A.M. Interpretation of secondary electron images obtained using a
low vacuum SEM. Ultramicroscopy, 94:71-87, 2003.
VAN NOORDEN, C. J. F. , FREDERIKS, W. M. A Enzyme Histochemistry - A laboratory manual of
current methods. Royal Microscopy Society, Microscopy Handbooks, vol.26. Oxford Science Publications. 1989. 116p.
VENKATARAMAN,S.; ALLISON, D.P.; QI, H.; MORREL-FALVEY, J.L.; KALLEWAARD, N.L.; CROWE
JR., J.E.; DOKTYCZ, M.J. Automated image analysis of atomic force microscopy images of rotavirus
partiles. Ultramicroscopy, 106:829-837, 2006.

119

VOLDMAN, J. Electrical forces for microscale cell manipulation. Annu. Ver. of Biomedi. Eng. 8: 425454, 2006
WANG, T.L. (ed.) Immunology in Plant Science.Society foi Experimental Biology - Seminar Serie,
v.29. Cambridge, London, NY, New Rochelle, Melbourne, Sydney. Cambridge University Press. 1986.
228p.
WEISENHORN, A.L. HANSMA, P.K.; ALBRECHT, T.R.; QUATE, C.F. Forces in atomic force microscopy in air and water. Applied Physics Letters, 54(26): 2651-2653, 1989
WIKIPEDIA . http://en.WIKIPEDIA.org/wiki/Optical _microscope. 2007 b
WIKIPEDIA http://en.WIKIPEDIA.org/wiki/Dark _field_microscopy. 2007 c
WIKIPEDIA.http://en.WIKIPEDIA.org/wiki/Electron_microscope#Electron_microscope_manu
facturers.2007d
WIKIPEDIA.http://en.WIKIPEDIA.org/wiki/Light_microscope#Limitations_of_light_microscopes.2007a
WIMPENY J.; MANZ W.; SZEWZYK U. Heterogeneity In Biofilms. FEMS Microbiology Reviews, v.24
p-661-671, 2000.

cap.02

YU, F. P., MCFETERS, G. A.. Rapid in situ assesment of physiological activities in bacterial biofilms
using fluorescent probes. Journal of Microbiological Methods , 20:1-10, 1994.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


120

ZEISS. http://www.zeiss.com; www.nikkon.com.(2007)


ZOLTAI, P. T.; ZOTTOLA, E. A; MCKAY, L. L. Scanning electron microscopy of microbial attachment
to milk contact surface. Journal of Food Protection, 44:204-208. 1981.
ZOTTOLA, E.A. Special techniques for studying microbial biofilms in systems. In: Tortorello, M.L.,
Grendel, S.M. (Eds.) Food microbiologist analysis: new technologies. Baltimore: IFT basic symposium, 1997

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03

1.

Introduo

2.

Consideraes Sobre o Sistema Cleaning In Place (CIP)

3.

Sistema Modelo de Circulao de Leite para Estudos de Adeso Bacteriana


3.1. Adeso de Enterococcus faecium em Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Agentes
Qumicos
3.2. Adeso de Clulas Vegetativas e de Esporos Bacterianos em Ao Inoxidvel
3.3. Adeso de Bacillus cereus em Ao Inoxidvel: Efeito do Fluxo e do Tempo de
Adeso
3.4. Adeso de Esporos Bacillus sporothermodurans em Ao Inoxidvel e sua Resistncia a Agentes Qumicos

4.

Sistema Modelo para Avaliao de Adeso Bacteriana e Eficincia Bactericida


da Radiao Ultravioleta em Polietileno de Baixa Densidade
4.1. Adeso de Escherichia coli e Staphylococcus aureus em Polietileno e sua Resistncia Radiao Ultravioleta
4.2. Adeso de Bacillus stearothermophilus ao Polietileno e Sua Resistncia Radiao Ultravioleta

5.

Concluso

6.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Hamilton Mendes Figueiredo
Cleusa Kyiomi Akutsu
Cristiane Mello Albuquerque
Cleuber Antnio de S Silva
Maria Aparecida Antunes

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Os testes em uso simulado,


quando bem elaborados, refletem as condies reais
do processamento da indstria de alimentos.

1. Introduo
Os testes em uso simulado preconizam a transferncia das condies de processamento na indstria de alimentos para o laboratrio. Para isso, muitas vezes,
necessrio desenvolver metodologias e equipamentos para simular as diversas
condies dos procedimentos de higienizao e dos usos dos sanitizantes. Esses
testes so mais trabalhosos e exigem criatividade, e todas as condies devem ser
muito bem definidas.
H mais de um sculo, o descobridor do bacilo da tuberculose, Robert Koch,
desenvolveu o primeiro mtodo de teste para avaliar a eficincia de desinfetantes.
Ele impregnou fio de seda com Bacillus anthracis e o mergulhou em soluo de desinfetante por vrios tempos. Observou-se que os esporos eram protegidos contra a
ao do desinfetante pela protena do meio utilizado que permaneceu no fio mesmo
aps a lavagem, resultando em efeito bacteriosttico no meio do subcultivo. A partir
de ento, vrios estudos foram desenvolvidos at o estabelecimento dos mtodos
atualmente utilizados (CREMIEUX; FLEUTETTE, 1991).
Em 1982, Scheusner inoculou Staphylococcus aureus e esporos de Bacillus subtilis
em bandejas de fibra de vidro contendo resduos de carne, leite e cereais. Aps a adeso,

122

as bandejas foram submetidas sanitizao pelos mtodos spray, imerso e enxagagem.


Em seguida, foram imersas em soluo neutralizante, sendo os microrganismos
recuperados por swab e enumerados em meios de cultura apropriados. Segundo esse
autor, o teste reproduziu as condies reais de higienizao e avaliou a resistncia do
microrganismo ao do sanitizante e a eficincia do processo de higienizao.
Em 1985, Stone e Zottola desenvolveram um modelo em sistema Cleaning In
Place (CIP) constitudo de tubulao de ao inoxidvel com 3,5 m, para a circulao
de 15 L de leite desnatado inoculado com Pseudomonas fragi. O modelo foi acoplado
a uma bomba de presso positiva e a um tanque de equilbrio. Verificou-se que o
sistema- modelo foi adequado ao estudo da adeso do microrganismo-teste.
Em 1995, Contin e colaboradores simularam as condies de sanitizao e limpeza
de tubulaes, elaborando um modelo em sistema CIP, por onde circularam 15 L de
leite desnatado. Em cupons de prova de ao inoxidvel, foram aderidos esporos de
Bacillus stearothermophilus, sob um tratamento trmico de 62,8 C por 30 min, com
leite pasteurizado contendo 3 % de gordura ou leite adicionado de 1,25 % de suspenso, com 4,0 x 107 esporos por mililitro. Os processos de higienizao avaliados neste

+ NaOH 1 % + enxge + HNO3 1 % + enxge; 4) pr-lavagem + NaOH 1 % +


enxge + HNO3 1 % + enxge + NaClO a 100 mg.L-1 de cloro residual total, pH 10,
preparados a partir de hipoclorito de sdio comercial 10 % de CRT. Para avaliao da
eficincia dos procedimentos, os cupons foram submetidos s tcnicas do swab e
da rinsagem. Constataram-se diferenas no log10 da contagem de esporos entre os
tratamentos-controle, pr-lavagem e lavagem alcalina tanto pela tcnica de rinsagem quanto pela de swab dos cupons. O valor recomendado pela American Public
Health Association (APHA) de 2 UFC.cm-2 de rea de equipamento, para que uma
superfcie seja considerada higienizada, foi obtido aps a lavagem cida, quando
avaliada por rinsagem. Este mesmo valor foi alcanado depois da lavagem alcalina,
quando avaliada pelo swab.
O teste em uso simulado, quando adequadamente elaborado, apresenta resultados que refletem as condies reais, incluindo procedimento de higienizao,
sujidades, carga microbiana, tempo de contato, dureza da gua, tipo de superfcie,
tipo de aplicao, temperatura, pH e contaminao por manipuladores. O sanitizante
aplicado em uma parte do equipamento ou da superfcie, e os microrganismos so

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

estudo foram: 1) pr-lavagem; 2) pr-lavagem + NaOH 1 % + enxge; 3) pr-lavagem

recuperados e contados por um dos mtodos de avaliao: swab, placa de contato


e rinsagem, entre outros.

2. Consideraes Sobre o Sistema Cleaning In Place (CIP)


Nas indstrias de alimentos, o processo de higienizao compreende as etapas
de limpeza e sanitizao, que so complementares (ANDRADE; MACDO, 1996;

123

ROCHA et al., 1999). Limpeza um procedimento que inclui pr-lavagem com gua,
para remoo das sujidades, seguida do uso de agentes qumicos, como detergentes alcalinos e, ou, cidos para remoo de resduos orgnicos e minerais das superfcies; e do enxge antes da etapa da sanitizao, que realizada com o uso de
calor ou de agentes qumicos (GIESE, 1991; ANDRADE; MACDO, 1996).
Dentre os mtodos de higienizao, encontra-se o sistema CIP bastante utilizado em indstria de alimentos (TIMPERLEY, 1981; SHARP, 1985; GIESE, 1991).
Trata-se de um sistema automtico e permanente que no requer a desmontagem
de equipamentos e tubulaes para a higienizao (ANDRADE; MACDO, 1996).
constitudo basicamente por uma bomba central, tanques para solues qumicas
e um conjunto de tubos para distribuio das solues para os diversos locais da
fbrica, podendo ainda estar acoplado a um tanque para gua de rinsagem e a um

cap.03

computador, que controla todo o processo de higienizao (TROLLER, 1993).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Esse processo possibilita o controle eficiente do fluxo, da temperatura e do


tempo de contato das solues circuladas, permitindo menor tempo de higienizao
e reduo do gasto de gua, o que torna o processo mais econmico. Em limpeza
de tubulaes, a taxa de escoamento do fluido, que confere uma ao mecnica
associada a outros fatores que so otimizados pela limpeza CIP, como ao qumica
e trmica e tempo de contato (ANDRADE; MACDO, 1996), importante para se
obter um processo de higienizao eficiente. Para uma higienizao adequada, a
Federao Internacional de Laticnios (FIL) determinou uma velocidade mnima de
1,5 m.s-1 para os agentes de limpeza e sanitizantes (FLOH, 1993).
Em qualquer sistema de escoamento de fluido, forma-se uma pelcula de separao,
ou camada-limite, entre o fluido e a superfcie, ou seja, o fluido difundido pela superfcie
numa camada fina (FOUST et al., 1982). H dois tipos de escoamento: o laminar e o
turbulento (FELLOWS, 1994). O escoamento laminar caracteriza-se pelo movimento
das partculas do fluido em camadas ou lminas, segundo trajetrias retas e paralelas.
No escoamento turbulento, as partculas se movimentam de forma desordenada. O
escoamento do fluido caracterizado por um grupo adimensional, denominado nmero
de Reynolds, que, quando superior a 4.000, indica fluxo turbulento.
O nmero de Reynolds calculado segundo a Equao 1 (FELLOWS, 1994;
FOUST et al., 1982):

124

Re = r v D
m
em que:

(Equao 1)

Re = nmero de Reynolds
r = massa es pecfica do fluido (kg.m-3)
v = velocidade do escoamento (m.s-1)
D = dimetro da tubulao (m)
m = viscosidade do fluido (kg. m.s-1).

A turbulncia inicia-se num ncleo central e cresce nas dimenses radiais


proporo que a velocidade mdia aumentada. Em razo disso, h maior tenso
na parede do tubo e reduo da camada-limite, o que resulta em elevao na taxa
de transferncia do fluido at a superfcie (FOUST et al., 1982).
Partculas aderidas tubulao podem ser removidas pela fora de atrito exercida pelo contato entre a camada do fluido e a superfcie. A magnitude dessa fora
depende do tipo de escoamento (McCABE et al., 1993), uma vez que um fluxo turbulento exercer maior fora de atrito que um escoamento laminar.

forme a Equao 2.
V = v x p d2
4
em que:

(Equao 2)

V = vazo do escoamento (m3.s-1);


d = dimetro da tubulao (m); e
v = velocidade (m.s-1).
O ponto mais importante quanto higienizao a vazo de escoamento, isto
, o fluxo. Conforme mencionado, a Federao Internacional de Laticnios determinou que fosse mantida uma velocidade mnima de 1,5 m.s-1 das solues de limpeza
e sanitizao (FLOH, 1993), para se conseguir adequada higienizao.
Em um procedimento tpico de higienizao CIP para a indstria de laticnios,
exigem-se: i) pr-enxgue com gua temperatura de 38 C a 46 C, durante 40
seg para remoo de resduos pouco aderidos superfcie; ii) limpeza com soluo alcalina na concentrao de 0,5 % a 1 % de alcalinidade custica (OH-) por 15

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

A velocidade do fluido em tubo cilndrico est relacionada com a vazo, con-

min, temperatura de 80 C, para deslocamento de resduos orgnicos, lipdios e


protenas; iii) enxge a frio por 20 seg, at a remoo do alcalino; iv) lavagem com
soluo cida, na concentrao de 0,5 % de acidez (H+), temperatura de 70 C, pH
1,5 a 2,0, por 10 min, para remoo de resduos de natureza inorgnica, como sais
minerais; v) enxge com gua morna at a remoo do cido; vi) aplicao dos
agentes sanitizantes, utilizados conforme Tabela 1; e vii) avaliao do procedimento
de higienizao por anlises microbiolgicas ou tcnica do ATP-bioluminescncia.

125

Entre os agentes alcalinos mais empregados nas formulaes de solues


de limpeza esto os alcalinos fortes, como hidrxido de sdio, em combinao
com um agente complexante, por exemplo o EDTA. Como agente cido, usa-se,
geralmente, o cido ntrico. Dentre os agentes sanitizantes, so utilizados cido peractico, compostos clorados e tambm calor, como gua quente e vapor (TROLLER,1993; PASSOS, 1992).

cap.03

Tabela 1 - Alguns sanitizantes que podem ser usados no procedimento de higienizao


Cleaning In Place (CIP)

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

3. Sistema-Modelo de Circulao de Leite para Estudos de


Adeso Bacteriana
Com o objetivo de entender melhor os fatores envolvidos na adeso bacteriana nos equipamentos para processamento de alimentos, desenvolveu-se um
sistema-modelo de linha de circulao de leite em ao inoxidvel AISI 304, acabamento n 4, acoplado com cupons de prova (MELO,1997; FIGUEIREDO, 2000;
AKUTSU, 2001).
O modelo composto por uma tubulao de 1,9 cm de dimetro interno e
comprimento total de 5,8 m, por onde circulam o leite e o sanitizante; e por um
tanque de 25 L, utilizado como reservatrio do produto e das solues sanitizantes.
O reservatrio acoplado a uma bomba centrfuga de HP, para impulsionar as solues de higienizao pelo sistema (Figura 1). Em pontos especficos da tubulao,
foram instalados cupons de prova com formatos de curva 90 , em t e cilndricos.
As reas superficiais internas dos cupons de prova so de 108 cm2 para cupons em
formato t, de 85 cm2 para os cilndricos e de 53 cm2 para aqueles em formato de
curva de 90 . Nesse sistema-modelo foram realizados vrios experimentos, alguns
deles mostrados na Tabela 2.

126

Figura 1 - Modelo de linha de circulao de leite: 1) cupom de prova curva de 90 , 2) cupom de prova
cilndrico, 3) cupom de prova t, 4) controle de potncia, 5) tanque com capacidade para 25 L; 6) bomba
centrfuga e 7) controle de vazo.

3.1. Adeso de Enterococcus faecium a Ao Inoxidvel e sua Resistncia a


Agentes Qumicos
A pesquisa realizada por Mello (1997), utilizando-se o sistema-modelo, teve como
objetivo avaliar a eficincia de sanitizantes qumicos sobre Enterococcus faecium
(Tabela 3). Esse microrganismo foi isolado de leite cru e apresenta caracterstica de
psicrotrfico acidificante, alm de resistncia pasteurizao lenta do leite.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Tabela 2. Estudos sobre adeso microbiana usando-se o modelo de circulao de leite

Tabela 3 - Sntese de pesquisa que avaliou a eficincia de sanitizantes qumicos sobre


Enterococcus faecium

cap.03

127

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O psicrotrfico acidificante estudado foi caracterizado como Gram-positivo, cocos em cadeia, diplococos ou isolados, com crescimento e formao de halo amarelo quando inoculado em gar prpura de bromocresol e incubado a 7 C durante
10 dias ou a 28 C por 48 h.
A etapa de adeso consistiu em adicionar o E. faecium, desenvolvido em
suspenso no meio Lactobacilos MRS, no interior dos cupons de prova previamente
higienizados, secos em estufa a 110 C, fechados por rolhas de borracha nas
extremidades e esterilizados a 121 C por 15 min. Ao retirarem as rolhas de uma
das extremidades, um volume de 46 mL da suspenso bacteriana foi adicionado
ao cupom cilndrico, 30 mL em cupons de formato de curva e 61 mL ao cupom em
formato de t. Aps repouso por 12 horas, a 28 C, no interior dos cupons, a soluo
bacteriana foi descartada e o cupom, submetido secagem a 28 C, por 30 min. Com
os cupons de prova colocados nos locais preestabelecidos no sistema-modelo, as
solues sanitizantes foram circuladas por 10 min, vazo estimada de 137 L.min-1
(d = 0,0254 m; v = 1,5 m.s-1) nos cupons de prova. Aps esse processo, os cupons
de prova foram removidos e o procedimento de sanitizao, avaliado.
Os microrganismos aderidos foram recuperados pela tcnica da rinsagem.
Para os cupons no-submetidos sanitizao, utilizou-se a soluo-tampo fosfato
de Butterfield e para aqueles sanitizados, uma soluo neutralizante, constituda de
1 g de tioglicolato de sdio, 15 g de lecitina, 20 g de Tween 80, 6 g de tiossulfato
de sdio e 2,5 g de bissulfito de sdio por litro, esterilizada a 121 C por 15 min. Em

128

seguida, procedeu-se inoculao de alquotas de diluies decimais apropriadas,


em duplicata, pela tcnica de profundidade em gar-padro (PCA), sendo as placas
incubadas a 28 C por 48 h. As colnias foram contadas e multiplicadas pelo volume
da soluo de rinsagem para a estimativa da populao microbiana. Os resultados
foram divididos pela rea superficial interna dos cupons de prova e expressos em
nmeros de E. faecium por cm2.
O procedimento de sanitizao foi avaliado determinando-se o nmero de
redues decimais na populao do E. faecium, obtido pela diferena entre o log10
dos microrganismos aderidos aos cupons de prova antes e depois da sanitizao. Os
sanitizantes que atingiram cinco ou mais redues decimais na populao de clulas
aderidas foram considerados eficientes. Para as comparaes de interesse entre os
sanitizantes, foi realizado contraste das mdias do nmero de redues decimais
para cada tipo de cupom de prova, em nvel de 5 % de probabilidade (P<0,05).
As comparaes de interesse entre os sanitizantes (Tabela 4) foram estabelecidas
com o objetivo de responder a algumas questes de ordem prtica que surgem na
rotina diria de uma indstria de laticnios.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Tabela 4 - Comparaes de interesse entre os sanitizantes avaliados

129

Constatou-se que a eficincia dos sanitizantes variou de acordo com o cupom


de prova utilizado (Tabela 5). As diferenas de resultados entre os cupons de prova
podem estar relacionadas a efeitos hidrodinmicos e difusionais que ocorreram
durante o processo de sanitizao. A ao mecnica atribuda ao efeito do
cisalhamento do fluido sobre a parede do tubo, em virtude do escoamento da
soluo. O escoamento foi classificado como turbulento, com nmero de Reynolds
estimado em 42.000. A turbulncia nos cilindros menor com relao a tubos,
como aqueles em curva e em t. Assim, o cisalhamento pelo fluido sobre a parede
dos cupons de prova cilndricos foi menor, podendo ter causado remoo pouco
relevante do microrganismo-teste pelo efeito mecnico.
A ao qumica dos sanitizantes, de modo geral, influenciada pela turbulncia.
A difuso do sanitizante at a superfcie da tubulao ocorre numa fina camada-limite,
cuja espessura reduzida com o aumento na turbulncia do escoamento (McCAB
et al., 1993). Isso resulta em incremento da taxa de transferncia do sanitizante at
a superfcie do tubo, o que levou maior remoo dos microrganismos nos cupons
cap.03

de prova em curva e em t.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


130

Ao comparar a eficincia da gua e a dos diferentes sanitizantes, observou-se


diferena significativa (P<0,05) em todos os cupons de prova. A ao da gua sobre
o microrganismo ocorreu em virtude da fora de atrito do escoamento do fluido
sobre a superfcie dos cupons de prova, removendo microrganismos, mas atingindo
as menores redues decimais que foram de 0,52 nos cupons cilndricos, de 3,03 na
curva e de 3,08 no t.
Notou-se maior eficincia de dicloroisocianurato de sdio, devido quantidade
de cido hipocloroso (HClO) liberado durante o processo de sanitizao. Essa soluo
liberou 8,9 mg.L-1 de HClO, enquanto o hipoclorito de sdio, 7,3 mg.L-1.
Ao comparar o grupo de sanitizantes cujo mecanismo de ao por oxidao
com aqueles que apresentam outro tipo de mecanismo, observou-se que no houve
diferena significativa (P0,05) em nenhum dos tipos de cupons de prova, o que
demonstra um mesmo nvel de eficincia entre os grupos de sanitizantes avaliados.
Tabela 5 - Resumo do teste F para as comparaes de interesse entre sanitizantes, nos cupons
de prova cilndrico, curva e t

Verificou-se, por meio de contraste entre as mdias de redues decimais, que


os sanitizantes amnia quaternria e cido peractico no apresentaram diferena significativa (P0,05) entre eles, nos cupons de prova cilndricos, em curva e em t. Esses
compostos, nas condies simuladas no experimento, tm a mesma eficincia bactericida.
A fim de relacionar eficincia versus custo, compararam-se as mdias de redues decimais (RD) entre um produto de baixo custo, o hipoclorito, e outro de
alto custo, o cido peractico. Verificou-se diferena significativa (P<0,05) entre os
sanitizantes somente nos cupons de prova em t. Numa avaliao com base nas
redues decimais nesse cupom, o cido peractico atingiu 7,95 RD e o hipoclorito
de sdio, 3,61RD. Nos cupons de prova cilndricos e em curva, no se constatou
diferena significativa (P0,05) entre os produtos.
Nota-se, com base na Figura 2, que nenhuma das seis solues sanitizantes
circuladas no sistema-modelo apresentou eficincia sobre o E. faecium em cupons
de prova cilndricos, considerando-se valores iguais ou acima de 5 RD. Esse valor
foi aplicado neste experimento para definir se a soluo sanitizante eficiente, pois,
nesse caso, as solues sanitizantes agiram sobre clulas ssseis e planctnicas
presentes nas superfcies de ao inoxidvel.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Dicloroisocianurato de sdio e iodforo submetidos ao teste de uso simulado


apresentaram diferena significativa (P<0,05) apenas nos cupons de prova em curva. Nos cupons de prova cilndrico e em t, esses sanitizantes exibiram o mesmo
nvel de eficincia bactericida.

131

Figura 2 - Mdias dos nmeros de redues decimais (RD) obtidos na populao de Enterococcus faecium,
no teste de uso simulado nos diversos sanitizantes.

cap.03

So = gua; S1 = 100 mg.L-1 de cloro residual total, a partir de hipoclorito de sdio, pH 8,6; S2 = 1 % de quaternrio
de amnio em pH 10,5; S3 = 300 mg.L-1 de cido peractico, pH 2,6; S4 = 100 mg.L-1 de gluconato de clorohexidina,
pH 7,2; S5 = 150 mg.L-1 de CRT preparada a partir de dicloroisocianurato de sdio, pH 8,7; e S6 = 12,5 mg.L-1 de IRL
preparada a partir de iodforo em pH 1,9.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

De acordo com os valores das RD, as solues clorohexidina e iodforo foram ineficientes contra as clulas de E. faecium nos cupons de prova em curva. J as de clorohexidina, hipoclorito de sdio e iodforo no apresentaram eficincia nos cupons de prova
em t.
Considerando que os sistemas CIP no so constitudos apenas por tubulaes
de formato cilndrico, de curva ou de t, estimou-se o tempo necessrio para garantir
a sanitizao eficiente, ou seja, o tempo de contato necessrio para reduzir em cinco
ciclos log10 a populao de E.faecium (Figura 3). Os resultados deste experimento
mostraram que os cupons de prova que apresentaram os maiores tempos de
contato para atingir essas redues foram os cilndricos. Assim, esses cupons
devem ser considerados como um dos pontos crticos no processo de sanitizao
de tubulaes em sistema CIP, apresentando os seguintes tempos de contato: 96,5
min para a gua, 51 min para a clorhexidina, 39,4 min para o hipoclorito de sdio,
39,4 min para o dicloroisocianurato de sdio, 34,2 min para o iodforo, 19,8 min
para a amnia quaternria e 16,4 min para o cido peractico.

132

Figura 3 - Tempo necessrio para obter 5 RD populao de E. faecium no teste em uso simulado, dos
diversos sanitizantes.
So = gua; S1 = 100 mg.L-1 de cloro residual total, a partir de hipoclorito de sdio pH 8,6; S2 = 1 % de
quaternrio de amnio em pH 10,5; S3 =300 mg.L-1 de cido peractico, pH 2,6; S4 = 100 mg.L-1 de gluconato
de clorohexidina, pH 7,2; S5 = 150 mg.L-1 de CRT preparada a partir de dicloroisocianurato de sdio, pH 8,7; e
S6 = 12,5 mg.L-1 de IRL preparada a partir de iodforo em pH 1,9.

As tubulaes cilndricas so um dos pontos crticos de controle para a sanitizao


em sistema CIP, nas indstrias de laticnios. Em sistemas de vazo de 137 L.min-1,
preconiza-se a utilizao dos sanitizantes nos tempos mnimos de 16,4 min no cido
peractico e 19,8 min na amnia quaternria, para obter 5 RD e eficiente sanitizao
em menor tempo.

Usando o modelo de circulao de leite mostrado na Figura 1, Figueiredo


(2000) estudou a adeso de bactrias deterioradoras e quantificou a contaminao
resultante, a fim de conhecer os microrganismos que apresentavam maior capacidade
de adeso e avaliar melhor os fatores (Tabelas 6 e 7 ) que levaram a uma grande
contaminao do leite processado.
Tabela 6 - Fatores avaliados na adeso bacteriana no modelo de circulao de leite

Tabela 7 - Sntese da pesquisa que avaliou a adeso de clulas vegetativas e esporos


bacterianos em superfcie de ao inoxidvel (Fonte: Figueiredo, 2000)

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

3.2 - Adeso de Clulas Vegetativas e Esporos Bacterianos a Superfcie de


Ao Inoxidvel

133

Na seleo dos microrganismos, consideraram-se os seguintes aspectos: P.


aeruginosa uma espcie Gram-negativa contaminante habitual do leite cru, podendo
recontamin-lo aps o tratamento trmico; B.cereus causador da coagulao doce
em leite UAT e do sabor amargo em creme de leite; e o isolado do leite E. faecium
psicrotrfico acidificante.
A anlise estatstica do experimento baseou-se no nmero de redues decicap.03

mais ocorridas na populao de microrganismos antes da circulao do leite (RDA)

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

e aps a circulao do leite (RDB). Considera-se que a adeso ser maior para a
bactria que apresentar a menor RD. Nas comparaes de interesse, foi aplicado o
teste de Tukey a de 5 % de probabilidade (P<0,05). Os demais experimentos foram
analisados por estatstica descritiva.
Para determinao de RDA, foi feito o seguinte clculo: RDA =log N0 - log N1,
em que N0= nmero total de bactrias (planctnicas e ssseis) dentro do cupom,
aps 12 h de incubao; e N1 = nmero de bactrias ssseis dentro do cupom, aps
12 h de incubao.
O nmero de bactrias planctnicas (P1) foi determinado pelo plaqueamento
de uma alquota de 1 mL de leite do interior dos cupons de prova, sendo o resultado
multiplicado pela quantidade total do leite contido dentro do cupom de onde se retirou
a alquota.
O nmero de clulas ssseis (N1) foi obtido com a rinsagem dos cupons em
curva, cilndricos e em t, pelo plaqueamento de uma alquota de 1 mL de soluo
de citrato de sdio 2 % utilizada na rinsagem dos cupons de prova. Esse nmero foi
multiplicado pela quantidade total da soluo de rinsagem utilizada no cupom.
Para obter N2, a rinsagem foi realizada nos cupons em curva, cilndricos e em
t acoplados ao sistema-modelo e, depois da circulao do leite, na velocidade desejada. Portanto, pela soma de P1 e N1, obteve-se N0.
Para determinao de RDB, fez-se o seguinte clculo: RDB = log N1 log N2,

134

em que N2 = nmero de bactrias que permaneceram aderidas aos cupons, aps a


circulao do leite.
Como meio de cultivo para B. cereus e E. faecium, foi utilizado caldo Lactobacilos
MRS (Man, Rugosa e Sharpe) e para P. aeruginosa, caldo nutriente. Os microrganismos
foram cultivados, armazenados sob congelamento e posteriormente ativados nos
mesmos meios de cultura antes da utilizao. Aps a ativao, foram inoculados
em 400 mL de leite, de modo a obter uma contagem de aproximadamente 1,0 x 106
UFC.mL-1.
Para permitir a adeso, o leite inoculado foi utilizado para encher os cupons de
prova em ao inoxidvel previamente esterilizados. No cupom em cotovelo, gastaram-se 27 mL de leite; no cupom em t, 57 mL; e no cupom cilndrico, 49 mL,
respectivamente. Os cupons foram incubados a 18 C em todos os experimentos,
com exceo do experimento que avaliou o efeito da temperatura de refrigerao.
O tempo de incubao foi de 12 h, exceto no experimento que avaliou o efeito do
tempo de incubao. Aps esse perodo, foram retiradas amostras do leite do interior dos cupons para o plaqueamento, sendo o restante descartado.

adicionou-se leite esterilizado no interior dos cupons, que ali permaneceu por 2
min, sendo, aps esse tempo, descartado. Um cupom de prova de cada tipo foi
rinsado com soluo de citrato de sdio 2 %, sendo agitados manualmente por
15 min; em seguida, alquotas das solues de rinsagem foram inoculadas
em meio de cultura e incubadas em condies apropriadas. Cupons que no
tiveram contato com microrganismos foram esterilizados e, subseqentemente,
acoplados no equipamento juntamente com os outros trs cupons de prova com
os microrganismos aderidos. Ao reservatrio do equipamento foram adicionados
10 L de leite esterilizado a 15 C, circulando por 10 min a 1 m.s-1, com exceo do
experimento que avaliou a velocidade das solues na adeso bacteriana.
A seguir so apresentados os principais resultados do experimento de importncia
relacionada ao procedimento de higienizao em indstria de alimentos.

3.2.1 Influncia da Espcie Bacteriana no Crescimento e na Adeso ao Ao Inoxidvel


A) Crescimento e Adeso a 18 C de Incubao

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Para eliminao de clulas planctnicas e de esporos aderidos reversivelmente,

De acordo com os dados apresentados na Tabela 8, entre as bactrias avaliadas,


E. faecium foi a que apresentou a maior capacidade de multiplicao a 18 C em
leite, com aumento de dois ciclos logartmicos na contagem em placas aps 12
h. A contagem de P. aeruginosa apresentou incremento de 0,9 ciclo logartmico,
enquanto a de B. cereus (esporos e clulas vegetativas) teve aumento de 0,4 ciclo
logartmico.
135

Tabela 8 - Contagens microbianas (UFC.mL-1) no leite imediatamente aps a inoculao e com


12 h de incubao a 18 C

Pesquisa de Andrade e colaboradores (1998) mostrou que E. faecium apresenta


velocidade especfica de crescimento () em caldo MRS a 30 C de 1,68 h-1. Observase pelos resultados que, em caso de abuso de temperatura por perodo prolongado,
os microrganismos que tm alta velocidade especfica de crescimento apresentaro
maior multiplicao celular, o que pode resultar em grande nmero de clulas
aderidas aos equipamentos.
Quanto adeso com 12 h, observou-se que existe diferena com relao ao

cap.03

microrganismo. A maior porcentagem de adeso ocorreu nos esporos de B. cereus,

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

que apresentou menor reduo decimal (Tabela 9) de acordo com o teste de Tukey
(P<0,05). Os microrganismos estudados foram classificados em ordem crescente
de reduo decimal.
Tabela 9 - Redues decimais e porcentagem de adeso dos diversos microrganismos na
superfcie dos cupons de prova com 12 h (RDA) de incubao a 18 C

importante, portanto, que o leite seja processado o mais rpido possvel, a fim
de evitar que ocorra a esporulao durante a estocagem, antes do tratamento trmico,
o que poderia comprometer a eficincia desse tratamento. Os esporos podem aderir
superfcie de equipamentos e resistir ao processo de higienizao, posteriormente
germinar e comprometer a qualidade do leite.
Observa-se, pela Figura 4, a classificao dos microrganismos quanto porcentagem de adeso em ao inoxidvel aps 12 h a 18 C. Constatou-se a seguinte ordem decrescente de capacidade de adeso: esporos de B.cereus (24,6 %); P. aeruginosa (5,83
%); B. cereus, nas formas vegetativa e esporulada (2,21 %); e E. faecium (0,57 %).

136

Verificou-se alto porcentual de adeso obtido com os esporos que alcanaram


24,6 %, cerca de 11 vezes maior que a adeso de clulas vegetativas e esporos (2,21
%). Isso explicado pelo fato de alguns esporos apresentarem caractersticas de hidrofobicidade, o que favorece a sua adeso s superfcies. Essa intensa adeso, aliada
maior resistncia ao calor, pode causar problemas nas linhas de circulao do leite,
pois os esporos podem resistir ao tratamento trmico e, conseqentemente, aderir
aos equipamentos. Com o tempo, esses esporos podem germinar e dar origem ao
biofilme, que servir como fonte constante de contaminao dos produtos aps o
processamento trmico.
H grandes diferenas na capacidade de adeso de diferentes esporos, o que
pode ser devido s suas caractersticas fsico-qumicas e morfolgicas. Os esporos
de B. cereus possuem apndices na sua superfcie, e essas estruturas podem ajudar a
sobrepor as foras de repulso eletrosttica entre o esporo e a superfcie (RONNER et
al.,1990). Problemas no sistema de refrigerao de tanques de recepo de leite podem
elevar a temperatura, o que resultar em maior crescimento de microrganismos, alm
de possibilitarem a esporulao. Isso permitir maior adeso de bactrias s paredes
dos tanques, dificultando a higienizao.

B) Permanncia e Adeso de Microrganismos Aps a Circulao do Leite


Observou-se, pela anlise de varincia (Tabela 10) dos resultados obtidos aps
a circulao de leite no circuito de processamento, que no houve diferenas sig-

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Figura 4 - Porcentagem de adeso mdia de bactrias, antes da circulao do leite no modelo, calculada em
relao ao nmero total de bactrias dentro dos cupons com 12 h, em ao inoxidvel, a 18 C. A) esporos
de B. cereus; B) Pseudomonas aeruginosa; C) Bacillus cereus, incluindo esporos mais clulas vegetativas; e
D) Enterococcus faecium.

nificativas (p>0,05) na adeso quando os diferentes microrganismos foram comparados; no entanto, constatou-se diferena quanto remoo das clulas nos vrios
tipos de cupons.
Tabela 10 - Resumo da anlise de varincia do nmero de redues decimais na populao de
diferentes microrganismos, em vrios cupons de prova, aps o uso do modelo de circulao de
leite, com velocidade de 1m.s-1, por 10 min a 15 C

137

A interao microrganismos versus cupom no foi significativa. Nesse tipo


de interao, pode-se verificar se existe a possibilidade de determinada bactria
permanecer aderida, em maior porcentagem, em certo tipo de cupom, ao mesmo
tempo que outra espcie avaliada apresenta maior porcentagem de adeso em um

cap.03

segundo tipo de cupom.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O teste de Tukey (Tabela 11) mostrou que h diferena (P<0,05) na remoo de


bactrias entre os cupons nas formas de t e cilndrica. No foi observada diferena
significativa (P>0,05) na remoo de bactrias em cupons cilndricos e curvas de 90
e nos cupons nas formas de t e de cotovelo.
Tabela 11 - Mdias de redues decimais de populao de microrganismos nos diferentes
cupons de prova, aps o uso do modelo de circulao do leite a 1m.s-1 por 10 min a 15 C

Observou-se que 5,36 % das clulas de P. aeruginosa permaneceram aderidas


aps a circulao do leite no modelo de circuito (Figura 5). Esse porcentual calculado com base no nmero de clulas aderidas antes da circulao do leite no circuito
representa 1,7 x 104 UFC.cm-2 de superfcie. Esse nmero de microrganismos ainda
elevado o suficiente para causar problemas de deteriorao do leite, uma vez que
as proteases e lpases produzidas por espcies de Pseudomonas so extremamente
resistentes aos tratamentos trmicos do leite.

138

Figura 5 - Porcentagem de clulas que permaneceram aderidas aos cupons de ao inoxidvel,


independentemente do tipo de cupom, em tubulao de linha de processamento, aps a circulao de leite
a 1 m.s-1 por 10 min, a 15 C: A) Enterococcus faecium, B) Pseudomonas aeruginosa, C) esporos e clulas
vegetativas de Bacillus cereus e D) esporos de Bacillus cereus.

Observou-se tambm, pelos resultados, que de cada 200 clulas de E. faecium


aproximadamente uma (0,57 %) est aderida, e que, de cada 100 clulas aderidas,
cerca de cinco (5,51 %) no so removidas pelo fluxo de leite a 1 m.s-1. Foram enumerados, antes da circulao do leite, 6,5 x 105 UFC.cm-2 para E. faecium, tendo esse
nmero reduzido para 3,3 x 104 UFC.cm-2 aps a circulao.

do equipamento e resistem ao fluxo e ao das solues de limpeza. Aps um perodo


de processamento de 6 a 8 h, pode-se atingir um considervel nmero de bactrias
aderidas. As clulas que iniciaram o processo de adeso logo no incio do processamento
certamente apresentaro maior resistncia ao processo de higienizao. Ocorrer, ainda,
a liberao de clulas viveis para o alimento, a partir de possveis biofilmes formados.
Adeso de esporos e clulas vegetativas de B. cereus antes da circulao do
leite de 2,21 % foi verificada, devendo-se ressaltar que, das clulas aderidas, 2,3 %
no foram removidas pelo fluxo de leite. Deve-se estar atento a alimentos com alta
contagem de esporos de B. cereus, j que tm elevada capacidade de adeso, com
24,6 %, ainda que somente 4,1 % dos esporos aderidos resistiram ao fluxo de leite.
Podem ser observadas diferentes porcentagens de adeso obtidas nos
variados tipos de cupons (Figura 6). Enquanto no cupom tipo t somente 3,0 % das
clulas no foram removidas pelo fluxo do leite, no cupom cilndrico 6,0 % das bactrias
permaneceram aderidas. No cupom em curva de 90, a adeso foi de 3,6 %, o que no
representa diferena significativa (P0,05) quando comparado com os demais cupons.
Constatou-se diferena significativa (P<0,05) entre os cupons tipo t e cilndricos. Segundo

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Deve-se preocupar, principalmente, com as bactrias que se fixam na superfcie

Mello (1997), a turbulncia em tubos cilndricos menor que a de tubos com formatos
contornados, como em curva de 90 e tipo t. Por essa razo, o cisalhamento pelo
fluido sobre as paredes dos cupons de prova cilndricos menor, podendo causar
menor remoo de microrganismos.

139

Figura 6 - Porcentagem de clulas que permanecem aderidas, independentemente do tipo de bactria,


obtida em diferentes tipos de cupons aps a circulao do leite a 1 m.s-1, durante 10 min, a 15 C.

3.2.2 - Efeito da Temperatura de Refrigerao

cap.03

Observa-se, na Tabela 12, que as incubaes a 5 C e 10 C no resultaram em alterao considervel no nmero de P. aeruginosa, decorrido o perodo de 12 h de incubao.
A 18 C, o crescimento foi de 0,9 ciclo logartmico, como constatado anteriormente.

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Tabela 12 - Contagem de Pseudomonas aeruginosa (UFC.mL-1) no momento da inoculao do


leite e com 12 h de incubao, em diversas temperaturas. Mdias de trs repeties

Quanto adeso bacteriana, observou-se (Figura 7) que, medida que a temperatura aumenta, as porcentagens de P. aeruginosa aderidas tambm aumentam.
Dessa maneira, a adeso a 18 C foi de 5,83 %, o que equivale a 3,2 x 105 UFC.cm-2.
A 10 C, verificou-se 1,95 % de adeso, representando 2,0 x 104 UFC.cm-2, e, a 5 C,
constatou-se 1,36 %, equivalente a 9,0 x 103 UFC.cm-2.
A menor proporo de clulas aderidas em temperaturas mais baixas ocorreu,
provavelmente, em virtude de a velocidade de multiplicao das bactrias ser menor nessas temperaturas. Tambm, a produo de exopolissacardeos pode ter sua
velocidade afetada negativamente pelo abaixamento da temperatura, alm do fato
de a mudana de viscosidade do leite poder dificultar a difuso da bactria at a
parede de cupom de prova. A alterao da viscosidade da gordura a 5 C pode fazer
que seja estabelecida uma camada gordurosa na parede dos cupons, dificultando a
aproximao de novas bactrias.

140

Figura 7 - Porcentagem de adeso de Pseudomonas aeruginosa em cupons de ao inoxidvel aps 12 h de


incubao do leite, nas temperaturas de 5 C, 10 C e 18 C.

Os resultados desta pesquisa diferem dos encontrados por Stone e Zottola


(1985), que no detectaram diferena, na proporo de clulas aderidas, ao estudar
a adeso de Pseudomonas fragi, suspensa em leite desnatado, em ao inoxidvel,
nas temperaturas de 4 C e 25 C. Esses autores observaram que a produo de
exopolissacardeos em P. fragi, a 25 C, ocorreu em 30 min. Na temperatura de 4 C,
esses polissacardeos foram observados em 2 h, demonstrando menor velocidade
de produo de exopolissacardeos em temperaturas mais baixas.

No experimento de Figueiredo (2000), P. aeruginosa a 5 C no apresentou


multiplicao, mas ocorreu o processo de adeso ao ao inoxidvel, o que sugere
atividade metablica para produo de exopolmeros.
Pode-se observar, ainda, a porcentagem de bactrias que permaneceram aderidas
aps a circulao do leite pelo sistema-modelo. A 18 C, das clulas aderidas com 12 h
de incubao, 5,36 % no foram removidas aps a circulao do leite a 1m.s-1 (Figura
8). J a 10 C e 5 C os valores foram de 6,95 % e 8,54 %, respectivamente. Verificou-se
tendncia de aumentar o porcentual de bactrias que permaneceram aderidas aps a
circulao do leite, medida que a temperatura diminua.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Diversos relatos de pesquisas mostram a influncia da temperatura sobre


a capacidade de adeso dos microrganismos s superfcies para processamento
de alimentos. Por exemplo, Hood e Zottola (1995) observaram que Yersinia
enterocolitica adere melhor em ao inoxidvel a 21 C do que a 35 C e 10 C. As
clulas crescidas a 35 C no apresentavam flagelo, o que influenciou negativamente
sua capacidade de aderir. possvel que a temperatura tenha importante papel na
formao de estruturas que ajudam o processo de adeso e que temperaturas
prximas do ideal para o crescimento celular permitem maior quantidade de
clulas aderidas. Stone e Zottola (1985) encontraram menor proporo de clulas
aderidas a 3 C, em comparao com a proporo de adeso celular a 20 C.
Segundo Mafu (1990), aps 1 hora, clulas de L. monocytogenes so capazes de
aderir ao ao inoxidvel, com polissacardeos visveis ao microscpio eletrnico,
tanto a 4 C quanto a 20 C.

141

Figura 8 - Porcentagem de Pseudomonas aeruginosa que permaneceram aderidas a cupons de ao


inoxidvel aps a circulao do leite a 1 m.s-1, nas temperaturas de 5 C, 10 C e 18 C.

Constata-se que, aps a passagem do leite a uma velocidade de 1 m.s-1 nos cupons
de prova previamente incubados a 18 C, a adeso do microrganismo correspondeu
a 1,7 x 104 UFC.cm-2. Essa concentrao foi de 1,4 x 103 e 7,7 x 103 UFC.cm-2 quando a

cap.03

incubao para adeso bacteriana ocorreu a 10 C e 5 C, respectivamente.

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142

3.2.3 - Efeito da Velocidade de Circulao do Leite


Verificou-se, pelos resultados deste trabalho, que a velocidade de circulao do
leite afetou o nmero de clulas bacterianas aderidas. velocidade de 0,5 m.s-1, 10,7
% das clulas permaneceram aderidas aos cupons de prova. Isso significou que a
contagem de 3,2 x 105 UFC.cm-2 foi reduzida para 3,5 x 104 UFC.cm-2. Na velocidade
de 1 m.s-1, a porcentagem de bactrias que resistiram ao fluxo foi de 5,36 %, o que
fez que o nmero de bactrias aderidas mudasse de 3,2x105 UFC.cm-2 para 1,7x104
UFC.cm-2. velocidade de 1,5 m.s-1, 4,9 % das bactrias permaneceram aderidas,
ocorrendo diminuio do nmero de bactrias aderidas de 2,7x105 UFC.cm-2 para
1,3 x 104 UFC.cm-2. Portanto, pode-se observar que, medida que o fluxo do leite
aumenta, mais bactrias so removidas dos cupons.

Figura 9 - Porcentagem de clulas de Pseudomonas aeruginosa que permaneceram aderidas a cupons de


ao inoxidvel, independentemente do tipo de cupom, aps a circulao do leite por 10 min a 15 C, em
diferentes velocidades.

Observa-se, pela Figura 9, que se a velocidade de circulao do leite for baixa


(0,5 m.s-1) haver maior nmero de clulas aderidas nas tubulaes, podendo intensificar problemas de formao de biofilmes. Tal fato poder trazer algumas conseqncias: i) se a baixa velocidade ocorrer antes do processamento trmico do produto,
o nmero de clulas aderidas s tubulaes provavelmente aumentar, ou seja, elas
multiplicaro e liberaro quantidade cada vez maior de bactrias para o leite, o que
compromete a qualidade do leite pasteurizado, considerando-se que a morte de bactrias pelo calor acontece de forma logartmica; ii) se a contaminao ocorrer aps
o processamento trmico do produto, haver contaminao ps-processamento do
leite. Geralmente, no incio do perodo de produo essa contaminao pequena;
porm, no fim do perodo de processamento, substancialmente maior.
Outra questo a considerar a velocidade de bombeamento, ou seja, se demasiadamente alta e a tubulao estiver contaminada, haver, inicialmente, elevada
contaminao do leite, em virtude da transferncia de bactrias aderidas para o fluido.

fortemente aderidas no sero removidas, e o fluxo ir dificultar a adeso de novas.


As velocidades utilizadas no experimento resultaram em fluxos caracterizados
como turbulentos, com nmero de Reynolds de 4.700, 9.400 e 14.100, nas velocidades
de 0,5 m.s-1, 1,0 m.s-1 e 1,5 m.s-1, respectivamente. No entanto, os resultados
mostram, no que se refere adeso bacteriana, no haver diferena relevante entre
as velocidades de 1,0 m.s-1 e 1,5 m.s-1.
A velocidade das solues de higienizao de 1,5 m.s-1 , freqentemente,
utilizada. Quando realizado em baixa velocidade, esse procedimento pode se tornar
deficiente. Erros dessa natureza permitem que nmeros elevados de bactrias
permaneam aderidos superfcie
Observou-se certa tendncia de permanecer maior nmero de bactrias ssseis
no cupom cilndrico, independentemente da velocidade de bombeamento do leite
(Tabela 13). Porm, deve-se ressaltar que, medida que o fluxo do leite aumenta, o
nmero de clulas aderidas diminui. A menor adeso foi no cupom tipo t, em todas
as velocidades de bombeamento utilizadas.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Porm, com o passar do tempo essa contaminao ir diminuir, pois apenas as clulas

Tabela 13 - Porcentagem de Pseudomonas aeruginosa que permaneceram aderidas aos diferentes tipos de cupons de ao inoxidvel submetidos s velocidades de 0,5 m.s-1, 1,0 m.s-1 e
1,5 m.s-1, durante 10 min, em modelo de linha de processamento de leite, utilizando como fluido
o leite integral a 15 C

143

3.2.4 - Influncia da Concentrao de Bactrias na Adeso


A) Crescimento e Adeso aps 12 h a 18 C
Verificou-se que o crescimento bacteriano com 12 h de contato, independente
da concentrao, foi inferior a um ciclo (Tabela 14).

cap.03

A concentrao de clulas com 12 h de incubao influenciou o nmero de


clulas de P. aeruginosa aderidas aos cupons de ao inoxidvel. A Figura10 mostra
que em concentraes maiores de clulas ocorre maior proporo de clulas
aderidas. Aps 12 h de incubao, o nmero inicial foi de 7,3x106 UFC. mL-1. Desses
microrganismos, 5,83 % aderiram superfcie. No entanto, a partir dos nmeros
iniciais 9,2 x 105 UFC.mL-1 e 1,7x105 UFC.mL-1, aderiram ao ao inoxidvel 2,62 % e
2,26 %, respectivamente.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


144

Esses valores reforam a necessidade de obter alimentos com baixo nvel de


contaminao microbiana antes do processamento. Isso implica menor nmero de
bactrias aderidas superfcie e, portanto, menor contaminao do alimento que ir
entrar em contato com aquela superfcie.
Tabela 14 - Contagem de Pseudomonas aeruginosa (UFC.mL-1) no momento da inoculao do
leite e com 12 h de incubao a 18 C. Mdia de trs repeties

Figura 10 - Influncia da concentrao inicial de bactrias do leite sobre a porcentagem de clulas aderidas
aos cupons de prova, com12 h de incubao a 18 C. Mda de trs repeties.

B) Permanncia da Adeso Microbiana aps a Circulao do Leite


Quanto aos resultados da adeso, obtidos aps a circulao do leite no
modelo (Figura 11), verificou-se que a proporo de clulas que permanecem
aderidas aos cupons de prova, calculada com base no nmero de clulas aderidas
antes da circulao do leite no circuito de processamento, foi bastante prxima,
independentemente da concentrao inicial de clulas no leite. As porcentagens de
adeso celular aps a simulao foram de 5,36 %, 4,92 % e 5,83 %, nas concentraes
de 7,3 x 106 UFC.mL-1, 9,2 x 105 UFC.mL-1 e 1,7 x 105 UFC.mL-1, respectivamente.
provvel que as bactrias aderidas com maior tenacidade superfcie de
ao inoxidvel do modelo tenham sido aquelas que produzem maior quantidade de
exopolissacardeos. Segundo Kumar e Anand (1998), as substncias associadas ao
biofilme podem limitar a difuso de sanitizantes e provocar alteraes fisiolgicas
nos microrganismos e induzir a produo de enzimas que degradam os sanitizantes.
Portanto, ainda que a contaminao da superfcie seja relativamente baixa, como 1,2

grau de eficincia dos sanitizantes no controle dessas bactrias.

Figura 11 - Porcentagem de bactrias que permaneceram aderidas aos cupons de prova, aps a circulao
de leite a 1 m.s-1, em temperatura de 15 C, no simulador de linha de circulao de leite. Mdia de trs
repeties.

3.2.5 - Influncia do tempo de incubao do leite inoculado com Pseudomonas aeruginosa


sobre o processo de adeso

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

x 102 UFC.cm-2, difcil prever, aps o perodo de produo de exopolissacardeos, o

A) Crescimento Microbiano e Adeso aps a Incubao a 18 C


Observou-se no leite incubado por um perodo de 12 h que houve alterao no
nmero de clulas de 0,89 ciclo logartmico (Tabela 15). Em relao ao leite incubado por 24 h, nota-se a alterao de 0,87 ciclo logartmico.
145

Tabela 15 - Contagem de Pseudomonas aeruginosa (UFC.mL-1) no momento da inoculao do


leite e com os perodos de incubao de 12, 24 e 48 h, a 18 C

possvel que a mudana da bactria de um meio que continha caldo nutriente


para o leite, juntamente com a alterao de temperatura de incubao de 35 C para
18 C, tenha contribudo para o aumento da fase lag, resultando em multiplicao
celular semelhante nos tempos de 12 e 24 h. No leite incubado por 48 h, verificouse alterao de 1,82 ciclo logartmico. Quanto ao perodo de 48 h de incubao, P.
aeruginosa apresentou maior capacidade de se multiplicar devido adaptao da

cap.03

bactria s condies do meio.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


146

No que se refere adeso bacteriana, antes da circulao do leite no modelo,


observa-se, pela Figura 12, que h tendncia de mais clulas ficarem aderidas
medida que o tempo de incubao aumenta. Assim, verifica-se uma porcentagem
de adeso de 48,7 %, quando a incubao foi por 48 h e com adeso de 5,5 x 107
UFC.cm-2, o que caracteriza uma formao de biofilme. Para 24 h, essa porcentagem
foi de 7,65, sendo esse valor correspondente a 9,1x 105 UFC.cm-2, enquanto para 12
h, foi de 5,83 % de adeso correspondente a 3,2x105 UFC.cm-2.
Observou-se, portanto, aumento no nmero de clulas aderidas com o incremento do tempo de contato. Tal fato tem implicaes na higienizao dos equipamentos, uma vez que um alimento mantido armazenado por 48 h, em condies de abuso
de temperatura, permitiria a multiplicao de bactrias. H tempo suficiente para as
bactrias aderirem s paredes, consolidarem a adeso e originarem o biofilme.

Figura 12 - Influncia do tempo de incubao do leite inoculado com 106 UFC.mL-1 sobre a porcentagem de
clulas aderidas aos cupons de prova a 18 C.

B) Permanncia da Adeso Microbiana aps a Circulao do Leite


Conclui-se pelos resultados obtidos na adeso bacteriana, aps a circulao do
leite pelo modelo (Figura 1), que a maior parte das clulas anteriormente aderidas no
resiste ao fluxo de 1 m.s-1, sendo retiradas das paredes do cupons de prova.
Para 48 h de incubao, a adeso de P. aeruginosa de 48,7 % antes da circulao do leite reduziu-se para 2,91 % aps a circulao do leite a 1 m.s-1, restando 1,6
x 106 UFC.cm-2 aderidas aos cupons de prova (Figura 13).
No tempo de 24 h de incubao, houve adeso de 7,65 % antes da circulao
do leite no modelo, e 5,6 % das clulas anteriormente aderidas resistiram ao fluxo
do leite, o que correspondeu a 5,1 x 104 UFC.cm-2.
Quando a incubao foi de 12 h, a porcentagem de adeso de 5,83 % antes da
circulao do leite no modelo manteve-se bem prxima aps a circulao do leite a
1 m.s-1, com 5,36 % de adeso, o que correspondeu a 1,7 x 104 UFC.cm-2.

aps a incubao a 18 C.

3.3 - Adeso de esporos de Bacillus cereus em Ao Inoxidvel: Efeito do


Fluxo e do Tempo de Adeso
Usando o modelo de circulao de leite (Figura 1), Cabral e colaboradores avaliaram a adeso de esporos de Bacillus cereus (Tabela 16).

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Figura 13 - Porcentagem de bactrias que resistiram ao fluxo de 1 m.s-1 de leite em modelo de linha de leite,

Tabela 16 - Sntese do experimento que avaliou o efeito da velocidade de circulao do alimentos e do tempo de adeso de Bacillus cereus em ao inoxidvel

147

Suspenso dos Microrganismos


As suspenses de esporos de Bacillus cereus foram obtidas por meio da seguinte tcnica: i) Aps trs repicagens consecutivas em gar nutriente, solidificado
na posio inclinada em tubo de ensaio de 15 mm x 160 mm e incubaes de 24 h
a 32 C, das culturas de Bacillus cereus, foram obtidas suspenses de clulas vegetativas pela adio de soluo-tampo de fosfato e agitao manual; ii) Em seguida,
volumes de 1 mL dessas suspenses foram inoculados nas superfcies de 50 mL de
meio de esporulao - gar nutriente adicionado de sulfato de mangans e amido
- contidos em frascos de Roux. A incubao prolongou-se at a obteno de cerca
de 90 % a 95 % de esporulao constatada por observao por microscopia de contraste de fase; iii) ao fim da incubao, foram adicionados 20 mL de gua destilada

cap.03

esterilizada sobre a superfcie do meio de cultura dos frascos de Roux e prolas de

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

vidro esterilizadas. Os frascos foram agitados manualmente e os sobrenadantes, coletados em tubos de centrfuga; e iv) a centrifugao foi efetuada a 2.500 g durante
15 min, a 4 C. Os sedimentos de esporos foram ressuspensos em gua destilada esterilizada e novamente centrifugados, e o processo foi repetido por cinco vezes. Ao
final, os esporos foram suspensos em gua destilada esterilizada e mantidos a 4 C.
As suspenses de esporos foram padronizadas para conter em torno de 109 esporos
por mL e serem usadas no processo de adeso dos esporos no simulador da linha de
processamento de leite. A adeso dos esporos aos cupons ocorreu a 8 C e 18 C.

Processo de Adeso dos Esporos


Depois da ressuspenso dos esporos em 500 mL de gua esterilizada, a suspenso foi adicionada no interior dos cupons de prova previamente esterilizados.
Para isso, as rolhas das extremidades de cada cupom de prova foram retiradas, a
suspenso de esporos adicionada no interior dos cupons e as rolhas recolocadas.
A suspenso permaneceu em repouso, no interior dos cupons, por cerca de 12 h, a
8 C e 18 C , sendo em seguida descartada. Em seguida, os cupons de prova foram
submetidos secagem a 25 C, por 30 min e, logo aps, novamente enchidos com
gua esterilizada, a qual permaneceu dentro dos cupons por 1 min, sendo essa gua
depois descartada. Objetivou-se, nesse ltimo processo, eliminar esporos planctnicos, ou seja, os que no estavam aderidos superfcie. Foi utilizada gua esterilizada
para garantir que nenhum esporo da suspenso germinasse.

Procedimento para Simulao


148

Com os cupons de prova colocados nos locais preestabelecidos no sistema-modelo,


o tanque do simulador foi enchido com 20 L de gua esterilizada, sendo circulados por
10 min. Aps, os cupons de prova foram removidos, realizando-se, ento, a contagem de
esporos que foram retirados da superfcie pela gua e a contagem dos que permaneceram
aderidos aos cupons.

Avaliao da Capacidade de Adeso


Os microrganismos aderidos aos cupons de prova foram recuperados pela
tcnica de rinsagem, sob agitao, durante 15 min. Para isso, foi utilizada uma soluo-tampo fosfato de Butterfield (ICSMF,1978) nos cupons submetidos ao teste.
O volume de soluo utilizado foi equivalente a 80 % do volume empregado para
adeso da suspenso do esporo.
Em seguida, foi feito o plaqueamento utilizando-se a tcnica de profundidade
em gar-padro (PCA). As placas foram incubadas a 37 C, por 48 h. As colnias,
aps contadas, foram multiplicadas pelo volume da soluo de rinsagem, para a
estimativa da populao microbiana. Os resultados foram divididos pela rea superficial interna dos cupons de prova e expressos em UFC.cm-2.

Para limpeza da superfcie dos cupons de prova, utilizou-se soluo de NaOH


1 % de alcalinidade custica (OH-), durante 30 min, com posteriores enxge e escovao em gua corrente at a reao negativa com fenolftalena 1 %. Depois de
secos em estufa temperatura de 110 C, os cupons eram fechados com rolhas nas
extremidades e esterilizados a 121 C, por 15 min.
A limpeza do equipamento foi feita da seguinte maneira: i) pr-enxge com gua
temperatura ambiente por 5 min; ii) limpeza com hidrxido de sdio 1 % e 80 C por
20 min; iii) enxge at a remoo do hidrxido de sdio, o que foi constatado por meio
de reao com fenolftalena como indicador; iv) lavagem cida com cido ntrico 0,5 %
de acidez (H+), 70 C durante 10 min; v) enxge at a remoo do cido ntrico, constatada pela reao com metilorange como indicador; vi) sanitizao com soluo de 100
mg.L-1 de CRL, em pH 8,0, temperatura de 20-25 C, preparada a partir de hipoclorito
de sdio; vii) enxge at a remoo do cloro, constatada por reao com soluo de
N,N-dietil-p-phenylenne diamine (DPD) como indicador.
Constatam-se, pelas Tabelas 17 e 18, as influncias das velocidades e dos
tempos diferentes no processo de adeso dos esporos de B. cereus na superfcie
de ao inoxidvel. So essas as porcentagens de adeso dos esporos nos cupons,
antes do procedimento de circulao no simulador, com 12 h: 7,11; 7,54; e 22,08;
com 24 h: 8,44; 33,73; e 21,99, respectivamente. J aps a circulao no sistema
simulador foram essas as porcentagens de esporos que continuaram aderidos, na
temperatura de 8 C e tempo de 12 h: 21,37; 30,33; e 16,88, respectivamente, nas
velocidades de 0,5 m.s-1, 1,0 m.s-1 e 1,5 m.s-1. No tempo de 24 h, so esses os valores
de porcentagem de adeso encontrados: 40,21; 41,90; e 30,27, respectivamente, nas
mesmas velocidades. Esses valores de adeso so elevados. Verificou-se, portanto,
a tendncia de maior adeso medida que o tempo aumentou de 12 h para 24 h. Em
relao ao fluxo, constatou-se que as diferenas na adeso dos esporos ocorreram
particularmente entre 0,5 m.s-1 e 1,5 m.s-1, e a maior adeso aconteceu quando o
fluxo foi menor.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Limpeza e Esterilizao dos Cupons de Prova e do Modelo de Circulao do Leite

149

cap.03

Tabela 17 - Porcentagem de adeso (UFC.cm-2) de Bacillus cereus em cupons de testes antes


e depois da circulao de gua num simulador de linha de circulao de leite, aps tempo de
contato de 12 h em velocidades de 0,5 m.s-1, 1,0 m.s-1 e 1,5 m.s-1

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Tabela 18 - Porcentagem de adeso (UFC.cm-2) de Bacillus cereus em cupons de testes antes


e depois da circulao de gua num simulador de linha de circulao de leite, aps o tempo
de contato de 24 h em velocidades de 0,5 m.s-1 , 1,0 m.s-1 e 1,5 m.s-1

Observa-se, pelos resultados, que a higienizao de equipamentos deve ocorrer logo aps o uso na indstria de alimentos. Alm disso, fundamental que a
velocidade das solues detergentes e sanitizantes seja bem estabelecida, de modo
a se ter uma higienizao eficiente. As velocidades das solues de higienizao
devem ser mais elevadas do que as de processamento de alimentos e, geralmente,
acima de 1,5 m.s-1.

3.4 - Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans a Ao Inoxidvel e


sua Resistncia a Sanitizantes Qumicos
Utilizando modelo de circulao de leite (Figura 1), Akutsu (2001) avaliou a
adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans CCT6247 em cupons de ao
150

inoxidvel e sua resistncia a sanitizantes qumicos, em condies de uso simulado (Tabelas 19 e 20).
Seis cupons de prova, sendo dois em formato de curva de 90, dois cilndricos
e dois em t, foram inoculados com uma suspenso em tampo-fosfato de 0,31 M
em pH 7,0 +/- 0,1, contendo cerca de 105 esporos.mL-1 de B. sporothermodurans
por 12 h a 30 C.
Simulou-se um processo de sanitizao CIP, circulando-se 15 L das solues
sanitizantes temperatura entre 20-25 C, pelo tempo de 15 min, a uma velocidade
de 1,5 m.s-1 nos cupons de prova, obtida a partir de uma vazo estimada de 25,7
L por minuto e considerando o dimetro do tubo de 1,9 cm. A gua esterilizada foi
usada para avaliar a remoo mecnica dos esporos aderidos.
As solues sanitizantes avaliadas pelo teste em uso simulado foram preparadas a partir de produtos comerciais concentrados. As concentraes das solues
utilizadas de cada sanitizante so apresentadas na Tabela 21.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Tabela 19 - Sntese do experimento que avaliou a adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans CCT6247 em cupons de ao inoxidvel e sua resistncia a sanitizantes qumicos, em
condies de uso simulado (Fonte: AKUTSU, 2001)

151

Observou-se que os esporos de B. sporothermodurans apresentaram capacidade de adeso aos cupons de prova; porm, no houve diferena significativa (P
0,05) entre eles (Tabela 22). Os logs10 do nmero de esporos aderidos por cm2 aos
cupons no formato de cotovelo 90, cilndricos e t foram, respectivamente, de 4,01;
3,88; e 4,03 (Tabela 23); e as porcentagens de adeso foram de 3,93 no cupom em

cap.03

formato de curva de 90, 2,55 no cilndrico e 4,46 no t (Tabela 23).

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Tabela 20 - Comparaes de interesse entre sanitizantes por cupom de prova

152

Tabela 21 - Concentrao e pH de produtos comerciais e solues sanitizantes

Tabela 23 - Porcentagem e log10 do nmero de esporos de Bacillus sporothermodurans (UFC.cm-2)


aderidos a ao inoxidvel, AISI 304 n 4, aps 12 h de contato, a 30 C

Neste estudo, o nmero de clulas aderidas de B. sporothermodurans no

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Tabela 22 - Resumo da anlise de varincia do log10 do nmero de esporos.cm-2 de Bacillus


sporothermodurans aderidos nos diferentes cupons de prova do modelo de linha de circulao
de leite, aps 12 h de incubao a 30 C

constituiu um biofilme, j que, de acordo com Zottola (1997), para isso seria necessria uma adeso entre 106 e 107 UFC.cm-2. No entanto, nessas condies a superfcie
encontra-se em situao inadequada para o uso, pois a APHA (American Public Health Association) sugeriu o mximo de 2 UFC.cm-2 para superfcies adequadamente
higienizadas (Evancho et al., 2001). Portanto, a presena desses esporos aderidos s
superfcies em quantidade superior sugerida pode implicar possvel contaminao
de alimentos.

153

H diferena significativa (P<0,05) na eficincia dos sanitizantes qumicos sobre


os esporos de B. sporothermodurans aderidos; porm, no se constatou influncia
dos tipos de cupom: t, curva de 90 e cilndrico (Tabelas 24 e 25).

cap.03

Tabela 24 - Resumo da anlise de varincia do nmero de redues decimais de Bacillus sporothermodurans pela ao dos sanitizantes, nos diferentes cupons de prova do modelo de linha de
circulao de leite, aps circulao a 1,5 m.s-1 por 15 min, temperatura ambiente (20-25 C)

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154

Tabela 25 - Resumo do teste F das comparaes de interesse entre sanitizantes

S1: gua; S2: hipoclorito de sdio a 100 mg.L-1 de CRT, pH 9,45; S3: hipoclorito de sdio a
100 mg.L-1 de CRT, pH 8,0; S4: hipoclorito de sdio a 100 mg.L-1 de CRT, pH 7,0; S5: cloramina orgnica a 100 mg.L-1 de CRT, pH 7,18; S6: cloramina orgnica a 60 mg.L-1 de CRT, pH
7,18; S7: cido peractico a 60 mg.L-1, pH 3,4; S8 e cido peractico a 30 mg.L-1, pH 3,7.

Ao comparar a eficincia da gua, por ao mecnica, e a dos diferentes sanitizantes, por ao qumica, notou-se efeito significativo (P<0,05) (Tabela 25). A remoo
dos esporos, nesse caso, ocorreu devido fora de atrito da gua sobre a superfcie
dos cupons de prova, ou seja, apenas da ao mecnica gerada pelo escoamento do
fluido pela superfcie, que se classificou em turbulento, com o nmero de Reynolds
estimado em 32.000 (r= 997 kg/m3; v=1,5 m/s; d= 0,01905 m e m= 0,0009 kg/m.s).
Neste experimento, verificou-se que a circulao da gua, a uma velocidade
de 1,5 m.s-1 por 15 min, reduziu em mdia 0,74 RD da populao dos esporos de B.
sporothermodurans aderidos aos cupons (Quadro 7), ou seja, 6,98 x 103 UFC.cm-2, o
que significa que 74,79 % de esporos foram removidos da superfcie.
Tabela 26 - Redues decimais (RD) na populao de esporos de Bacillus sporothermodurans
devido ao dos sanitizantes circulados por 15 min a 1,5 m.s-1, temperatura ambiente (2025 C), no modelo de linha de circulao de leite

entre o hipoclorito de sdio, contendo 100 mg.L-1 de cloro residual total (CRT) sem
correo de pH (pH 9,45), e os demais sanitizantes. Ressalta-se, nesse caso, que a
ao qumica dos sanitizantes foi influenciada pelo escoamento do fluido. Quando
o escoamento turbulento, a transferncia do sanitizantes at a superfcie maior,
resultando em remoo mais eficiente dos microrganismos aderidos.
As diferenas de eficincia obtidas entre as solues de hipoclorito de sdio
a 100 mg.L-1 de CRT em pH 9,45; 8,0; e 7,0 e as de cloramina orgnica a 100 e 60
mg.L-1 de CRT podem ser explicadas pela concentrao de cido hipocloroso (HClO)
nelas presente, que o agente antimicrobiano.
Reordenando os termos da equao de Henderson-Hasselbalch, possvel determinar a concentrao de cido hipocloroso nas solues cloradas, da
seguinte maneira:
mg.L-1 de HClO = mg.L-1 de cloro residual livre
1 + 10 pH - 7,5
A soluo de hipoclorito de sdio contendo 100 mg.L-1 de CRT e pH 9,45 (sem

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Formao de Biofilmes Bacterianos

Quanto aos sanitizantes qumicos, verificou-se efeito significativo (P< 0,05)

correo de pH) apresentou menor concentrao de cido hipocloroso (Tabela 27),


o que explica sua menor ao sobre os esporos aderidos nos cupons de prova. Com
a correo do pH desta soluo clorada para pH 8,0 e 7,0, obteve-se maior liberao
de cido hipocloroso. Assim, ao reduzir o pH houve maior concentrao de cido hipocloroso e menor de on hipoclorito, aumentando a eficincia do sanitizante
(DYCHDALA, 1991; GIESE, 1991).
155

Tabela 27 - Efeito da concentrao de cido hipocloroso (HClO) das solues sanitizantes na


ao esporicida sobre Bacillus sporothermodurans

Quando o pH da soluo de hipoclorito de sdio, contendo 100 mg.L-1 de CRT,


foi corrigido com cido ntrico de 9,45 para 8,0 e 7,0, as concentraes de cido
hipocloroso aumentaram de 1,68 mg.L-1 para 24,08 mg.L-1e 75,59 mg.L-1, respectivamente, e os tempos para se conseguir 1 RD (nesse caso, assumido como valor D) na
populao de esporos correspondentes a essa variao foram de 9,55 min para 5,75

cap.03

min e 5,28 min (Tabela 27).

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Observou-se, portanto, melhor eficincia quando o pH dessa soluo diminudo, o que tambm foi constatado por Andrade e Serrano (1993). Esses pesquisadores, utilizando uma soluo de hipoclorito de sdio a uma concentrao de
105 mg.L-1 em pH 9,0; 8,0; e 7,0, a 30 C, em teste de suspenso, sobre esporos de
Bacillus subtilis ATCC 19659, observaram reduo no valor de D quando a concentrao de cido hipocloroso foi aumentada. Essa soluo, em pH 9,0, apresentou
concentrao de 3,22 mg.L-1 de cido hipocloroso, e a diminuio do pH para valores de 8,0 e 7,0 fez que essa concentrao fosse aumentada para 25,24 mg.L-1 e
79,55 mg.L-1, respectivamente. Os valores de D obtidos foram de 5,77; 0,94; e 0,25
min, respectivamente.
Os resultados dos experimentos com B. sporothermodurans e B. subtilis, anteriormente mencionados, levam s seguintes consideraes: i) os esporos de B.
sporothermodurans so mais resistentes que os de B. subtilis ao cido hipocloroso;
ou ii) a maior resistncia est associada ao fato de os primeiros estarem aderidos
superfcie de ao inoxidvel, o que parece ser mais provvel.
No foi constatada diferena significativa (P>0,05) entre as solues de hipoclorito de sdio corrigidas para pH 8,0 e 7,0 e as solues de cloramina orgnica 100
mg.L-1, e 60 mg.L-1 CRT (Tabela 26), apesar da diferena na concentrao do cido
hipocloroso (27).
Por meio da equao que relaciona o log10 dos valores de D em virtude da

156

concentrao de cido hipocloroso (Figura 14), foi possvel determinar o valor de Z


(344,8 mg.L-1), que a variao na concentrao de HClO, em mg.L-1 de cloro residual livre (CRL), necessria para reduzir em 90 % o valor de D, em minutos.
Foi possvel, assim, determinar a Equao 11, que inter-relacionam o valor de
D, em minutos, e a concentrao de HClO.
D= Dr x 10 Cr- C / 344,8

(Equao 11)

Em que:
D = valor de D, em minutos;
Dr = valor de D de referncia, em minutos;
Cr = concentrao de cido hipocloroso de referncia, em mg.L-1 de CRL; e
C = concentrao de cido hipocloroso, em mg.L-1 de CRL.

Considerando, por exemplo, o valor de Dr como de 6,37 min e Cr igual a 40


mg.L-1, tem a seguinte equao:
D= 6,37 x 10 40-C/344,8
Essa equao vlida para as concentraes de cido hipocloroso entre 1,68 e

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Figura 14 - Valor de D (min) em funo da concentrao de cido hipocloroso.

75,59 mg.L-1 (Tabela 27), que foi a faixa estudada neste experimento. Assim, para se
obter 3 RD a partir de uma concentrao de 50 mg.L-1 de HClO, expressa em CRL, o
tempo de contato dever ser de 17,8 min.
Observou-se que no houve diferena significativa (P>0,05) entre as solues
de cido peractico e as demais solues, com exceo do hipoclorito de sdio a
100 mg.L-1, pH 9,45 (Tabelas 27 e 28).

157

Pelos resultados obtidos, nenhum dos sanitizantes atingiu 3 RD, que o valor
sugerido em testes de suspenso para a aprovao desses produtos contra esporos
nas condies de uso (GIFFEL et al., 1995). Deve-se ressaltar que no h valor definido para aprovao de sanitizantes agindo sobre microrganismos aderidos, sejam
clulas vegetativas, sejam esporos. No entanto, assim como as clulas vegetativas
aderidas, os esporos aderidos so mais resistentes ao dos sanitizantes, necessitando de concentraes e tempos de contato maiores para serem eficientes (MOSTELLER; BISHOP, 1993; GIFFEL et al., 1995).
Constata-se, pela Tabela 28, que para se obter 3 RD o tempo de contato dos sanitizantes contra os esporos aderidos variou entre 15,83 e 28,71 min, o qual se encontra

cap.03

dentro de uma faixa considerada adequada para o procedimento de higienizao.

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Tabela 28 - Valores de RD de esporos de Bacillus sporothermodurans para sanitizantes


circulados a 1,5 m.s-1 por 15 min, temperatura ambiente (20-25 C), no modelo de linha de
circulao de leite

4. Sistema-Modelo para Avaliao de Adeso Bacteriana e


Eficincia Bactericida da Radiao Ultravioleta em Polietileno
de Baixa Densidade
A procura por materiais e sistemas mais eficientes para o envase de alimentos
coincide com o aumento de pesquisas sobre materiais plsticos adequados ao contato com os produtos alimentcios. Podem ser citados como materiais plsticos mais
comumente empregados pela indstria de alimentos o polipropileno, o policarbonato, o poli(cloreto de vinila), o poliestireno e o polietileno de alta e baixa densidades.

158

Este ltimo utilizado na indstria de laticnios para o envase de leite fluido.


O polietileno um polmero termoplstico formado pela aglomerao de unidades monomricas derivadas do petrleo, denominadas etileno (Figura 15). O polietileno de baixa densidade (PEBD) apresenta ponto de fuso em torno de 115 C, densidade na faixa de 0,91 a 0,94, e ndice de refrao de 1,51 a 1,52, com alta resistncia
a substncias cidas e alcalinas, sendo um slido com 50 % a 60 % de cristalinidade
(BILLMEYER,1984; MANO,1991).
O impedimento espacial provocado pelas ramificaes dificulta um empilhamento das cadeias polimricas. Por essa razo, as foras intermoleculares que
mantm as cadeias polimricas unidas tendem a ser mais fracas, tornando o polietileno bastante flexvel. Como aplicaes tpicas, pode-se citar o uso na fabricao
de filmes plsticos e laminados para embalagens de produtos alimentcios lquidos
e slidos, filmes termoencolhveis, filmes laminados e plastificados para produtos
farmacuticos e hospitalares, filmes para embalagens industriais e agrcolas, utenslios domsticos, brinquedos, sacos para lixo, revestimento de fios e cabos, tubos e
mangueiras (MANO,1991).

Na dcada de 1970, foi introduzida a embalagem de PEBD para leite fluido


(ALVES; GARCIA, 1997). Devido no-resistncia dessas embalagens esterilizao pelo calor, mtodos foram desenvolvidos para o controle da microbiota desses
materiais sensveis ao calor (TOLEDO, 1975; FLCKIGER, 1995).
A radiao UV tem sido usada para reduo na microbiota de superfcies de
materiais utilizados na embalagem de alimentos, seja em processos asspticos ou
no (HUANG, TOLEDO, 1982; YOUSEF; MARTH, 1988; BANWART,1989). No entanto, o uso dessa radiao se estende a outras indstrias, como a farmacutica e a
qumica (BACHMANN, 1975).
A reduo na microbiota de materiais para embalagem empregados em processo contnuo nas linhas de envase um fator importante para manuteno das
caractersticas microbiolgicas do produto, aumentando, assim, sua vida de prateleira (BACHMANN, 1975; YOUSEF; MARTH, 1988; FLCKIGER, 1995). Estudos tm
documentado a efetividade da radiao ultravioleta na morte de microrganismos
contaminantes de uma variedade de materiais de superfcie (ROWAN et al., 1999; SIZER; BALASUBRAMANIAN, 1999). Em testes efetuados com esporos de B. subtilis e
B. stearothermophilus, observaram-se entre trs e quatro redues decimais, sendo
o experimento conduzido nas seguintes condies: densidade do microrganismo de
1,4 x 104 UFC.cm-2, 10,5 cm de distncia da fonte de radiao, dose de 30.000 W.cm-2
e tempo de irradiao de 1 segundo (FLCKIGER, 1995).

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Figura 15 - Estrutura qumica e espacial do polietileno de baixa densidade.

159

O emprego de calor para a esterilizao de alguns tipos de embalagem torna o


processo caro. No entanto, alguns materiais no resistem ao tratamento com aquecimento, como o caso das embalagens de polietileno empregadas no envase de
leite, entre outros produtos.

cap.03

Para fornecer subsdios, a fim de um melhor uso da radiao UV pela indstria


de laticnios, particularmente no envase de lquidos, foram desenvolvidos dois tra-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

balhos, em que se avaliou a eficincia da radiao UV no controle de microrganismos aderidos superfcie do polietileno de baixa densidade.
As condies da indstria foram simuladas por um modelo que reproduz as
caractersticas e condies do sistema radiao UV da mquina de empacotamento
de leite fluido.
O modelo foi construdo com chapa galvanizada, apresentando as seguintes dimenses: 10 x 25 x 50 cm (Figura 16). Em seu interior, tem-se uma lmpada ultravioleta com comprimento de onda de 254 nm, 15 W de potncia, ligada rede eltrica (127
V) por meio de um reator de 20 W e um starter. A lmpada est situada a 2 cm acima
da canaleta por onde corre o suporte, contendo a embalagem a ser irradiada.

160

Figura 16 - Modelo para exposio das embalagens radiao UV; A) aspecto geral e B) componentes do
sistema.

Tabela 29 - Sntese do experimento realizado por Silva (2000), que avaliou a adeso de microrganismos ao polietileno de baixa densidade e a resistncia desses microrganismos radiao
ultravioleta

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Usando o modelo descrito anteriormente (Figura 16), Silva (2000) avaliou a


adeso de microrganismos ao polietileno de baixa densidade e a resistncia desses
microrganismos radiao ultravioleta, conforme Tabela 29.

161

cap.03

4.1 - Adeso de Escherichia coli e Staphylococcus aureus a Polietileno e suas


Resistncias Radiao Ultravioleta

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A) Adeso Superfcie
Aps a ativao das culturas de Escherichia coli K12 e Staphylococcus aureus ATCC
25923 em caldo BHI (Brain Heart Infusion), diluio do inculo em tampo-fosfato, 0,31 M
e pH de 7,0 0,1, foram obtidas as suspenses nas concentraes de 104 UFC.mL-1, 105
UFC.mL-1 e 106 UFC.mL-1.
As superfcies internas de 72 embalagens de polietileno de baixa densidade
foram previamente sanitizadas com lcool 70 GL e expostas radiao ultravioleta
com comprimento de onda de 254 nm, por 1 min. A essas embalagens, adicionaram-se 1.000 mL da suspenso bacteriana. Em seguida adio das suspenses,
as embalagens foram seladas termicamente na seladora TecnoB, modelo S300, e
incubadas em estufas tipo BOD, modelo 50A14, s temperaturas de 8 C e 18 C por
12 h, para permitir a adeso bacteriana.
Aps 12 h de incubao nas temperaturas de 8 C e 18 C, as embalagens
passaram pelos seguintes procedimentos: i) o tampo empregado na inoculao da
embalagem foi escoado, e a essa embalagem adicionaram-se 1.000 mL de tampofosfato esterilizado, pH 7,0 0,1, sendo a embalagem deixada em repouso por 1
min, para retirada das clulas planctnicas; ii) escoado o tampo, a embalagem foi
rinsada, empregando-se a agitao manual vigorosa durante 90 seg, com 100 mL de
tampo-fosfato esterilizado, para retirada das clulas ssseis. Aps a rinsagem, os
tampes contendo as clulas ssseis foram diludos conforme necessrio, sendo
as alquotas dessas diluies plaqueadas, em profundidade, em PCA; iii) as placas
de Petri, aps solidificao, foram invertidas e incubadas temperatura de 35 C

162

por 24 h, para determinao do nmero de clulas aderidas embalagem. Os


resultados foram expressos em UFC.cm-2.
Observa-se, pelas Tabelas 30 e 31, que S. aureus e E. coli apresentaram capacidade de aderir ao polietileno de baixa densidade em diferentes temperaturas de adeso e a partir de diferentes nmeros iniciais de clulas. Dependendo do nmero inicial
de microrganismos na suspenso, a porcentagem de adeso para S. aureus variou de
0,009 % a 0,106 % a 8 C e de 0,036 % a 0,107 % a 18 C. Em E. coli, a porcentagem
de adeso variou de 0,001 % a 0,006 % a 8 C e de 0,002 % a 0,028 %, a 18 C.
Os nmeros de clulas aderidas por cm2 no caracterizam um processo de formao de biofilme, j que para isso os valores deveriam estar entre 106 e 107 UFC.cm-2.
Os baixos valores encontrados no experimento com S. aureus e E. coli, quando comparados com os resultados anteriormente mencionados em ao inoxidvel, podem ser
explicados pelas caractersticas diferentes das superfcies de adeso e pelas diferenas
entre clulas vegetativas e esporos bacterianos. A adeso de esporos facilitada pela
sua alta hidrofobicidade, alm da interao que ocorre entre os constituintes qumicos
da capa dos esporos com as superfcies.

Tabela 31 - Porcentuais e UFC.cm-2 de Escherichia coli K12 aderidos, a 8 C e 18 C, em polietileno de baixa densidade, em razo do logaritmo do nmero inicial (UFC.mL-1) na suspenso

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Tabela 30 - Porcentuais e UFC.cm -2 de Staphylococcus aureus ATCC 25923 aderidos a 8 C e


18 C, em polietileno de baixa densidade, em razo do logaritmo do nmero inicial (UFC.mL-1)
na suspenso

Nas Figuras 17 e 18 mostrado o logaritmo de clulas aderidas, em razo do


logaritmo do nmero inicial de clulas de S. aureus e E. coli, respectivamente, s
temperaturas de 8 C e 18 C.
163

cap.03

Figura 17 - Efeito das temperaturas de 8 C e 18 C no nmero de clulas aderidas de Staphylococus aureus


ATCC 25923, em funo do logaritmo do nmero inicial de clulas. Mdia de trs repeties.

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Figura 18 - Efeito das temperaturas de 8 C e 18 C no nmero de clulas aderidas de Escherichia coli K12
em funo do logaritmo do nmero inicial de clulas. Mdia de trs repeties.

Os resultados demonstram que o aumento na temperatura de 8 C para 18 C foi


responsvel por maior adeso bacteriana ao polietileno, uma vez que a temperatura
fundamental para o desenvolvimento dos microrganismos. Em temperaturas extremas, baixas ou altas, ocorre inativao de enzimas e outras estruturas funcionais
da clula, como as membranas (MOAT; FOSTER, 1995). A 18 C, os microrganismos
se encontram mais prximos da faixa de temperatura tima para crescimento, j
que ambos so mesoflicos, ocorrendo, assim, aumento no crescimento microbiano
e uma produo de exopolissacardeos provavelmente maior, elevando, portanto, o

164

nmero de clulas aderidas.


Ao comparar os valores de adeso dos microrganismos empregados neste experimento, observou-se maior tendncia de adeso das clulas de S. aureus. A 8 C,
a adeso de S. aureus nas concentraes iniciais de 105 UFC.mL-1, 106 UFC.mL-1 e 106
UFC.mL-1 foi de, respectivamente, 2,8; 9,0; e 106 vezes maior que a adeso das clulas
de E. coli. J temperatura de 18 C os valores encontrados foram, respectivamente,
de 5,4; 18,0; e 3,8.

B) Ao da Radiao Ultravioleta nas Clulas Aderidas


Aps a adeso dos microrganismos na embalagem de polietileno, o tampo
de inoculao foi retirado. Em seguida, adicionaram-se 1.000 mL de tampo-fosfato
esterilizado, pH 7,0 0,1, embalagem, ficando esta em repouso durante 1 min,
para retirada das clulas planctnicas. Decorrido o tempo, o tampo foi escoado, e
as superfcies internas da embalagem foram submetidas radiao UV por aproximadamente dois segundos, empregando-se o modelo j descrito. Antes do incio

emisso da luz. Aps esse intervalo de tempo, a parte interna das embalagens foi
submetida exposio radiao UV. Foram adicionados 100 mL de tampo-fosfato
esterilizado, 0,31 M, em pH 7,0 0,1, s embalagens irradiadas e agitou-se vigorosamente durante 90 seg, para recuperao das clulas que resistiram ao tempo de
exposio radiao ultravioleta.
Aps a rinsagem, os tampes foram diludos conforme necessrio, sendo essas diluies plaqueadas em profundidade, em PCA, e incubadas a 35 C por 24 h,
sendo os resultados expressos em UFC.cm-2.
A eficincia da radiao UV foi determinada por meio de Redues Decimais
(RD), empregando-se a seguinte frmula: RD=log n0 - Log n1, em que: n0 = nmero
de UFC aderidas ao polietileno por cm2 antes do uso da radiao ultravioleta; e n1 =
nmero de UFC aderidas ao polietileno por cm2 aps o uso da radiao ultravioleta.
A intensidade da radiao ultravioleta, expressa em W.cm-2, emitida pela
lmpada, foi determinada a cada 50 h, at completar o total de 1.500 h de uso. A
eficincia bactericida da lmpada foi determinada em trs diferentes tempos: inicial

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


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do experimento, a lmpada permaneceu ligada por 30 min, para estabilizao da

(T70); aps 800 h de uso (T800); e com 1.500 h de uso (T1500), empregando-se os
procedimentos descritos anteriormente. Foi determinada tambm a contaminao
inicial de aerbios mesfilos nas embalagens, empregando-se a tcnica de Nmero
Mais Provvel (NMP), com trs sries de cinco tubos, com o uso de volumes de
10 mL, 1 mL e 0,1 mL, conforme metodologia descrita por Greenberg et al. (1992).
Foram analisadas, ao acaso, amostras de polietileno de baixa densidade provenien-

165

tes de trs bobinas, antes e depois da exposio radiao UV. De cada bobina
foram analisados 3.780 cm2, referentes rea de seis embalagens com 630 cm2 e
capacidade para 1.000 mL. Dessas embalagens, trs no foram expostas radiao
UV, e outras trs o foram, em condies de envase de leite em um laticnios. Para
a retirada das clulas presentes na superfcie interna, adicionaram-se 100 mL de
tampo-fosfato esterilizado e pH igual a 7,0 0,1. A rinsagem foi efetuada por meio
de agitao manual vigorosa por 90 seg. Aps a rinsagem, procedeu-se diluio
dessa soluo e posterior distribuio em trs sries de cinco tubos (18 x 150 mm)
de ensaio, com capacidade para 15 mL, contendo 10 mL de caldo BHI; a primeira
srie de tubos apresentava concentrao dupla do meio de cultura e as demais sries, concentrao simples. Foram utilizados volumes de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL da
soluo de rinsagem das embalagens. As sries de tubos foram levadas incubao
em estufa a 35 C, por 24 h.
De posse da combinao formada pelo nmero de tubos positivos em cada
cap.03

diluio e com o auxlio de tabela apropriada, determinaram-se os valores de

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NMP.100 mL-1, correspondentes aos 630 cm2 da superfcie interna da embalagem,


com 95 % de probabilidade. Na Tabela 32 so mostrados os nmeros de redues
decimais na populao dos microrganismos, bem como os respectivos valores de
intensidades de radiao estimadas, para S. aureus e E. coli expostos radiao
UV por 2 segundos. Durante o experimento, o tempo de uso da lmpada UV foi de
cerca de 20 h, quando a intensidade diminuiu de 216 para 175 W.cm-2 . Assim, para
estimar a variao da intensidade da radiao UV, mostrada na Tabela 32, utilizou-se
a equao de regresso polinomial, conforme Figura 19.
Tabela 32 - Logaritmo do nmero de Staphylococcus aureus e de Escherichia coli, valores de
redues decimais (RD) aps 2 segundos de contato e intensidade de radiao UV

166

Observou-se que a radiao UV reduz o nmero de clulas aderidas superfcie do polietileno de baixa densidade. Em E. coli, as redues decimais mdias
variaram de 0,52 a 1,37. No caso de S. aureus, os valores situaram-se entre 0,85
e 1,73. Constatou-se que h diferena na ao da radiao UV em diferentes concentraes iniciais de clulas aderidas ao polietileno de baixa densidade e entre os
microrganismos estudados.

Nota-se que, no experimento com S. aureus, ocorreu reduo na intensidade da radiao UV de 216 para 179 W.cm2 e em E. coli a diminuio foi de 203
para 175 W.cm-2. No entanto, no houve grandes variaes na intensidade nem
no nmero de RD, nas repeties, quando se avaliou o efeito dos nmeros iniciais.
Por exemplo, a diferena mxima na intensidade (7 W.cm-2) foi constatada em S.
aureus quando os logaritmos do nmero inicial eram de 4,5; 4,6; e 4,7. J em E. coli

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Figura 19 - Diminuio da intensidade de radiao UV nas primeiras 70 h de uso da lmpada germicida.

no houve diferena na intensidade quando os logaritmos do nmero inicial eram


de 7,2; 7,8; e 7,6.
Pressupondo que as variaes de 216 a 179 W.cm2 e de 203 a 175 W.cm2
no sejam expressivas, observou-se tendncia de aumento no nmero de redues
decimais quando o nmero inicial de bactrias na suspenso de adeso ao polietileno foi aumentado.

167

Com o aumento do logaritmo do nmero inicial de clulas, observou-se tambm aumento no nmero de clulas aderidas, o que parece ter influenciado a ao
da radiao UV. Por exemplo, em nmeros menores de adeso os microrganismos
podem apresentar melhor distribuio na superfcie, alojando-se em fendas ou locais de difcil acesso radiao, em virtude da sua topografia, reduzindo, assim,
sua eficincia. Como a superfcie, provavelmente, apresenta capacidade limitada de
proteo s bactrias, a ao da radiao UV ser mais eficiente proporcionalmente
quando a superfcie apresentar maior nmero de bactrias aderidas.
Para facilitar as comparaes sobre a resistncia dos microrganismos, j que
os logaritmos dos nmeros iniciais eram diferentes no experimento, foram empregadas as equaes de regresso linear de S. aureus e E. coli (Figuras 20 e 21),

cap.03

obtendo-se, dessa forma, os valores apresentados na Tabela 33.

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168

Figura 20 - Regresso linear de redues decimais em funo do logaritmo de nmero inicial de


Staphylococus aureus ATCC 25 933, aps 2 segundos de exposio radiao UV.

Figura 21 - Regresso linear de redues decimais em funo do logaritmo de nmero inicial de Escherichia
coli K12 , aps 2 segundos de exposio radiao UV.

Tabela 33 - Redues decimais estimadas do nmero de clulas de Staphylococcus aureus ATCC


25923 e Escherichia coli K12 aps a exposio radiao ultravioleta de 216 a 175 W.cm-2,
durante 2 segundos, em razo do nmero inicial de clulas aderidas ao polietileno de baixa
densidade, obtidas a partir das respectivas regresses lineares

igual a 5, o valor de RD foi de 0,46; para um logaritmo da concentrao igual a 6,8, de


1,09. Para clulas de S. aureus, os valores de RD obtidos nas mesmas concentraes
iniciais foram, respectivamente, de 1,02 e 1,70. Esses resultados mostram que as clulas de E. coli, aderidas ao polietileno, apresentam maior capacidade de sobreviver
exposio radiao UV, quando comparadas com as de S. aureus.
Embora a radiao ultravioleta apresente atividade bactericida nos microrganismos aderidos superfcie do polietileno, as redues obtidas encontram-se abaixo
dos valores de trs ciclos logartmicos recomendados em literatura para sanitizantes
qumicos e fsicos na inativao de clulas aderidas (MOSTELLER; BISHOP, 1993).
No entanto, no h dvida de que a radiao UV um tratamento auxiliar til no
controle da contaminao microbiolgica de embalagens de polietileno.
A comparao dos resultados obtidos com a literatura dificultada porque
vrios fatores podem interferir na ao bactericida da radiao UV. Dentre eles,
incluem-se o tempo de exposio, a intensidade de radiao empregada, a distncia da fonte irradiadora superfcie, a morfologia microbiana, a capacidade de
adeso do microrganismo, o estado fsico das clulas e o tipo de superfcie onde

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Pode-se observar que, em E. coli, quando o logaritmo da concentrao inicial foi

se encontra o microrganismo.
Neste experimento, a resistncia das clulas vegetativas est associada adeso superfcie. Por exemplo, uma pesquisa mostrou a reduo de 6,3 ciclos logartmicos para clulas em suspenso de Salmonella Typhimurium, empregando-se a
intensidade de 620 W.cm-2 em um intervalo de tempo de 15 seg (KUO et al., 1997).
Nessa mesma intensidade, quando o experimento foi conduzido com as clulas no

169

estado sssil, previamente aderidas em casca de ovo, obteve-se reduo de trs ciclos logartmicos para 1 min de exposio das clulas radiao UV. Em outro experimento, foram obtidos cinco ciclos logartmicos de reduo do nmero de clulas
de E. coli em suspenso, utilizando-se 300.000 W.cm-2 por 2,5 seg (BACHMANN,
1975). Isso ocorre em virtude da maior suscetibilidade das clulas em suspenso
ao da radiao UV. No caso de clulas aderidas superfcie, os valores de redues so menores, pois as clulas apresentam-se fixadas superfcie por meio de
exopolissacardeos, dificultando, assim, a ao da radiao UV devido ao seu baixo
poder de penetrao.
Deve se considerar, ainda, a topografia da superfcie onde as clulas se encontram aderidas, pois a radiao UV tem pequeno poder de penetrao, sendo sua
ao restrita superfcie. Desse modo, casca de ovo, superfcie de carnes e carcaas de aves, polietileno e ao inoxidvel apresentam diferentes tipos de superfcies,
com as mais variadas irregularidades, que podem proteger as clulas do contato

cap.03

direto com a radiao UV, diminuindo, assim, sua ao bactericida.

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C) Reduo na Intensidade da Radiao UV versus a Eficincia Bactericida


Figura 22 ilustra a reduo na intensidade da radiao UV com o tempo de uso da
lmpada fluorescente germicida comercial de 15 W. Observa-se, nessa figura, decrscimo acentuado na intensidade da radiao UV nas primeiras 100 h e perda de 39,5 % da
intensidade emitida pela lmpada na faixa de comprimento de onda entre 240 e 260 nm.
Essa queda brusca nas 100 primeiras horas de uso tambm foi relatada por Flckiger
(1995), ao analisar uma lmpada germicida BBC disponvel no mercado.

Figura 22 - Reduo da intensidade radiao UV com o tempo de uso.

Na Tabela 34, observam-se as redues decimais obtidas aps exposio por 2


segundos radiao UV de clulas de S. aureus e E. coli, em trs tempos diferentes
de uso da lmpada.

170

Tabela 34 - Influncia da diminuio da intensidade da radiao UV na eficincia bactericida


sobre clulas de Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Escherichia coli K12 aderidas intencionalmente a polietileno de baixa densidade

Aps 1.500 h de uso, o nmero de redues decimais em clulas de E. coli


aderidas superfcie do polietileno foi de 0,94 para 0,36. Em S. aureus, o nmero
reduziu de 1,04 para 0,58. Isso representa uma efetividade 2,6 vezes menor na inativao de clulas de E. coli e de 1,8 vez em clulas de S. aureus, aps decorridas
1.500 h de uso. Assim, como esperado, a vida til da lmpada germicida dependente da reduo na intensidade com o tempo de uso. Alm disso, constatou-se que
as clulas de E. coli so mais resistentes radiao UV do que S. aureus. Flckiger
(1995) sugeriu vida til de 1.200 h a 1.500 h para lmpadas UV comerciais.

intensidade de radiao UV em S. aureus e E. coli, respectivamente.

Figura 23 - Relao entre o logaritmo do tempo para 1 RD e a intensidade de radiao UV em clulas de


Staphylococcus ATCC 25923.

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As Figuras 23 e 24 mostram a relao entre o logaritmo dos valores de RD e a

171

Figura 24 - Relao entre o logaritmo do tempo para 1 RD e a intensidade de radiao UV em clulas de


Escherichia coli k12.

D) Avaliao da Radiao Ultravioleta em Condies de Uso


Na Tabela 35 so apresentados os valores de logaritmo do NMP/embalagem
(630 cm2) de microrganismos mesfilos nas embalagens de polietileno antes e de-

cap.03

pois da irradiao com ultravioleta.

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Tabela 35 - Logaritmos dos nmeros de microrganismos mesfilos nas embalagens de polietileno, antes e depois da exposio radiao UV, em condies de uso, determinados pela
tcnica de Nmero Mais Provvel (NMP)

Os resultados mostram a existncia de determinada contaminao microbiolgica inicial nas embalagens. Neste experimento, o valor mdio de contaminao
encontrado nas embalagens antes da exposio radiao UV foi de 0,16 NMP.cm-2,
estando acima do valor recomendado, que de 0,10 NMP.cm-2. No entanto, aps
a irradiao das superfcies internas das embalagens por aproximadamente 2 seg,
observou-se a sobrevivncia de 0,014 NMP.cm-2, o que significa reduo decimal de
1,06, isto , cerca de 90 % das clulas contaminantes no sobreviveram ao da
radiao UV.
No envase do leite, o risco de contaminao igual soma dos riscos de cada
etapa do processo, sendo, assim, indispensvel o controle rigoroso dessas etapas
(FLCKIGER, 1995). A efetividade na reduo do nmero inicial de bactrias anterior
embalagem do alimento um ponto importante no prolongamento da sua vida de
prateleira (HUANG; TOLEDO, 1982), bem como na preservao das caractersticas

172

sensoriais e higinico-sanitrias do produto.

E) Topografia da Superfcie de Polietileno de Baixa Densidade


Empregou-se microscpio de fora atmica (MFA) com a tcnica taping mode.
Nessa tcnica, uma ponta, com raio de curvatura entre 5 e 10 nm, conectada a um
oscilador piezoeltrico, sendo forada a vibrar perto de sua freqncia de ressonncia, tocando a superfcie da amostra cerca de 500 vezes por ponto de medida. As
medidas de alteraes na freqncia de vibrao, quando a altura da amostra varia,
so traduzidas por software, produzindo a imagem da amostra. Essa tcnica permite obter alta resoluo espacial, e, uma vez que a ponta no fica todo tempo em
contato com a amostra, o risco de deformao da amostra pela ponta minimizado
(STRAUSSER; HEATON, 1994).
Ao visualizar a superfcie do polietileno por microscopia de fora atmica (MFA),
observaram-se dois diferentes tipos de superfcie, um relativamente liso e outro com
pontos refringentes. Nas Figuras 26 e 27 so mostradas a topografia da superfcie de
polietileno de baixa densidade, observada pela microscopia de fora atmica (MFA).

analisada.

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O tipo de superfcie apresentada na Figura 27 representa cerca de 50 % da rea total

Figura 26 - Fotomicrografia da superfcie de polietileno representativa das regies relativamente lisas,


obtida pela microscopia de fora atmica.

173

cap.03

Figura 27 - Fotomicrografia da superfcie de polietileno mostrando fendas e elevaes, obtida pela


microscopia de fora atmica.

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A presena de rugosidades e contornos no material da embalagem origina


sombras que reduzem a efetividade da radiao UV, uma vez que o efeito bactericida
ocorre somente na direo do feixe de luz (HUANG; TOLEDO, 1982).
Observa-se, na Figura 26, que a rugosidade mdia encontrada de 50 nm, podendo ser considerada uma superfcie relativamente plana. J na superfcie mostrada na Figura 27 notam-se imperfeies com 5 m de dimetro e 0,2 m de profundidade. Considerando que as clulas de S. aureus e E. coli apresentam as dimenses
0,5-1,5 m de dimetro e 1,1-1,5 x 2,0-6,0 m, respectivamente, as imperfeies da
superfcie podem proteger esses microrganismos do contato direto com a radiao
UV, reduzindo sua eficincia.
Por meio da topografia do polietileno por MFA, pode-se mostrar irregularidades na superfcie que possibilitam o alojamento de bactrias, facilitando o processo
de adeso, alm de dificultar o processo de inativao microbiana de clulas aderidas, por meio do uso da radiao UV. Essas irregularidades podem impedir a ao
da radiao UV por meio de proteo desses microrganismos em fendas e pela
presena de elevaes, que podem impedir o contato direto do microrganismo com
a radiao UV.

4.2 - Adeso de Bacillus sporothermodurans ao Polietileno e sua Resistncia


Radiao Ultravioleta
Usando o mesmo modelo mostrado na Figura17, Cabral e colaboradores avaliaram a ao da radiao ultravioleta sobre esporos de Bacillus sporothermodurans
174

(Tabela 36). Os esporos desses microrganismos aderiram superfcie de polietileno


de baixa densidade em valores que variam entre 2,10 e 6,10 %, quando as embalagens foram enchidas com as suspenses contendo 105 esporos.mL-1. Esse fato
importante, considerando-se que esse esporo resistente ao tratamento trmico
de UHT e que na embalagem usada para esse produto h uma camada interna de
polietileno de baixa densidade.

Adeso dos Esporos Superfcie


Aps serem obtidas as suspenses concentradas de esporos de Bacillus
sporothermodurans a partir de clulas vegetativas, prepararam-se 1.000 mL de
suspenses contendo 105 esporos.mL-1, em gua destilada esterilizada, conseguindo-se, desse modo, a suspenso de inoculao. A seguir, os microrganismos aderiram superfcie de polietileno, usando-se sacos de polietileno com
volume de 1.000 mL. s embalagens foram adicionados 1.000 mL da suspenso,
e estas foram seladas e incubadas.

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Tabela 36 - Sntese de experimento realizado por Cabral e colaboradores (2001) que avaliaram
a eficincia da radiao UV sobre esporos bacterianos

175

Aps o tempo de incubao, as embalagens passaram pelos seguintes procedimentos: i) o tampo empregado na inoculao da embalagem foi escoado; ii) embalagem foram adicionados 1.000 mL de gua destilada esterilizada, sendo a embalagem
deixada em repouso por 1 min para a remoo dos esporos que no se aderiram
superfcie do polietileno; iii) depois do escoamento do tampo, a embalagem foi rinsada
e agitada vigorosamente, durante 90 segundos, para a retirada dos esporos aderidas
superfcie do polietileno com 100 mL de tampo fosfato (0,31 M, pH 7,0 +/- 0,1, esterilizado a 121 C por 30 min) iv) aps a rinsagem, as solues-tampo foram diludas
conforme necessrio e plaqueados empregando-se o meio Agar BHI, incubados a 37 C
cap.03

por 48 h para a determinao do nmero de esporos aderidos embalagem.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Ao Esporicida da Radiao Ultravioleta


Aps o procedimento de adeso, a superfcie externa de uma parte das embalagens foi submetida radiao ultravioleta. Para isso foram necessrios alguns
procedimentos: i) retirou-se o tampo de inoculao, acrescentando-se 1.000 mL
de soluo-tampo fosfato esterilizada, ficando em repouso por 1 min para a retirada dos esporos no-aderidos; ii) escoaram-se o tampo e as superfcies internas
da embalagem submetidas radiao UV por 2 segundos; iii) s embalagens irradiadas foram adicionados 100 mL de tampo-fosfato esterilizado, passando por
agitao vigorosa durante 90 segundos, para a remoo dos esporos aderidos; iv)
aps a rinsagem, os tampes-fosfato foram diludos conforme necessrio, sendo
essas diluies plaqueadas em BHI, incubados a 37 C por 48 h, para a determinao
do nmero de esporos que resistiram ao tratamento com radiao ultravioleta; e
v) determinou-se a eficincia da radiao UV por meio do nmero de Redues
Decimais (RD) na populao de esporos na superfcie de polietileno, antes e depois
do uso da UV, em que: RD = log do nmero de esporos aderidos ao polietileno por
cm2 antes do uso da UV - log do nmero de esporos aderidos ao polietileno por cm2
aps o uso da UV.
Os esporos de Bacillus sporothermodurans aderiram superfcie de polietileno
de baixa densidade (PEBD) em valores que variaram de 2,10 % a 6,10 %, quando
suspenses com 105 esporos.mL-1 foram adicionadas s embalagens. Constatou-se,
pelos resultados observados na Tabela 38, a ao da radiao ultravioleta a 102W.
cm-2 sobre os esporos de B. sporothermodurans aderidos a polietileno de baixa densidade, normalmente utilizados em embalagem de leite. Como esperado, verificou-se

176

uma tendncia do aumento da eficincia, quanto ao nmero de redues decimais,


da radiao ultravioleta sobre esporos quando se aumenta o tempo de exposio da
embalagem ao sanitizante fsico.
Quando comparadas as clulas vegetativas aderidas a polietileno de baixa densidade, os esporos de B. sporothermodurans apresentam resistncia consideravelmente maior radiao ultravioleta.
Os esporos de B. sporothermodurans aderidos a polietileno de baixa densidade
apresentam, ainda, maior resistncia radiao quando comparados com esporos de
B. sporothermodurans suspensos em meio de cultura. Essa maior resistncia provavelmente se deva ao fato de que a superfcie do plstico bastante irregular, como
pode ser observado na Figura 28, e os esporos aderidos a essa superfcie podem ficar
protegidos da radiao ultravioleta por essas irregularidades.
Ao contrrio do esperado, os valores de D, que correspondem ao tempo de
exposio da embalagem radiao ultravioleta necessrio para que ocorra 1RD no
nmero inicial de esporos aderidos ao polietileno de baixa densidade, nos tempos
de 2, 10, 20 e 25 seg de exposio radiao ultravioleta, foram diferentes (Tabela

exposio, os esporos que sobrevivem so os mais resistentes. Sabe-se que numa


populao de esporos a resistncia no homognea, contendo alguns mais e outros
menos resistentes. Assim, se o tempo de exposio da embalagem radiao ultravioleta for aumentado, a eficincia sanitizante ser proporcionalmente menor.
Tabela 37 - Ao esporicida de 102 mW.cm-2, a 254 nm, de radiao ultravioleta aps tempos
de contato diferentes sobre esporos de Bacillus sporothermodurans aderidos em polietileno de
baixa densidade, apos contato de 12 h a 18 C, com inculo inicial de 105 esporos.mL-1

Tabela 38 - Ao esporicida de 102 mW.cm-2, a 254 nm, de radiao ultravioleta durante 25


segundos sobre esporos de Bacillus sporothermodurans aderidos a polietileno de baixa densidade, apos contato de 12 h a 18 C, com inculo inicial de 104 esporos.mL-1

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

37 e Figura 28). Uma explicao possvel que medida que aumenta o tempo de

177

cap.03

Figura 28 - Redues Decimais (RD) na populao de Bacillus sporothemodurans em razo do tempo de


exposio radiao ultravioleta.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Na Figura 29 mostrada a equao de regresso linear dos valores de D obtidos de acordo com o tempo de exposio radiao ultravioleta. Por exemplo, se
o tempo de exposio dessa radiao nas condies do experimento for de 8 seg,
estima-se que o valor D ser de 7,9 seg.

Figura 29 - Valor D para a populao de Bacillus sporothemodurans em funo da exposio radiao


ultravioleta.

5. Concluso
178

O desenvolvimento de sistemas, que simulem no laboratrio as condies reais


do processamento de alimentos, quando bem elaborados, pode oferecer subsdios
para uma avaliao dos fatores que afetam a adeso bacteriana, como as etapas do
procedimento de higienizao; tipos de detergentes e sanitizantes; concentrao,
pH, temperatura e fluxo das solues de higienizao; espcies microbianas e superfcies, dentre outros.

AKUTSU, C. K. Adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans ao ao inoxidvel e suas resistncias a sanificantes qumicos em condies de uso simulado. Viosa, MG. UFV, 2001. 60 p.
Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos). Universidade Federal de Viosa.
ALVES, R. M.V. e GARCIA, E.E.C. Embalagem para leite fluido: desempenhode filmes flexveis. Indstria de Laticnios, p.66-68, 1997
ANDRADE, N. J.; MACDO, J. A. B. Higienizao na indstria de Alimentos. Livraria Varela, So
Paulo, 182p. 1996.
APHA. 1992. Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 16th ed, ed. Richardson,
G. H. Am. Pub. Health Assoc. Washington, D.C.
BACH, J. P.; KROLL, R. G. The differential fluorescence of bacteria stained with acridine orange and
the effects of heat. Journal of Applied Bacteriology, 71, 51-58, 1991.
BACHMANN, R. Sterilization by intense ultraviolet radiation. Brown Boveri Review, 5, 206-209,
1975.
BANWART, G.J. Control of microorganisms by destruction. Basic food microbiology, 2th ed., Chapman & Hall, London, 1989, 748p.
CREMIEUX, A. , FLEURETTE, J. Methods of testing desinfectants. In: Block, S.S. (Ed.). Desinfection,
sterilization and preservation. 4.ed. Pennsylvania: Lea e Febiger, 1991. cap. 57, p. 1009-1027.
DYCHDALA, G. R. Chlorine and chlorine compounds. In: BLOCK , S.S. (Ed). Disinfectiion, sterilization
and preservation, 4th ed. Pennsylvnia, USA, Lea and Febiger, 1991, p1009-1027,

Testes em Uso Simulado para Avaliao de Processos de Adeso e


Formao de Biofilmes Bacterianos

Referncias

EVANCHO, G.M.; SVEUM, W.H.; MOBERG, L.J.; FRANK, J. F. Microbiological Monitoring of the
Foods Processing Environment. In: DOWNES, F.P.; ITO, K. ed. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th. Chapter. 3, p. 25-35, 2001
FLOH, R. Automatic recirculation cleaning in the 90s . Dairy, Food Environmental Sanitation. 13,
216, 1993
FLCKIGER, E. Alternative methods to avoid recontamination during aseptic filling and packaging.
Bulletin of the IDF 300, p.52-56, 1995.

179

GIESE, J. H. Sanitation: the key to food safety and public health. Food Technology, .45, 74-80, 1991.
GIFFEL, M.C.; BEUMER, R.R.; VAN DAM, W.F.; SLAGHUIS, B. A ; ROMBOUTS, F.M. Sporicidal effect
of disinfectants on Bacillus cereus isolated from the milk processing environment, International Biodeterioration and Biodegradation. p.421-430, 1995
GREENBERG, A.E., CLESCERI, L.S., EATON, A.D. Ed. Standard Methods For Examination of Water
and Wastewater- APHA, 18th ed. Baltimore, 1992.
FIGUEIREDO, H. M. Adeso bacteriana em modelo de circuito de processamento de leite., Viosa,
MG,2000.76p Tese ( Doutorado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Federal de
Viosa
HOOD, S., ZOTTOLA, E. A. Biofilms in food processing. Food Control, 6, 8-18, 1995.
HUANG, Y.-W., TOLEDO, R. Effect of high doses of high and low intensity UV irradiation on surface
microbiological counts and storage-life of fish. . Journal of Food Science, 47, 1667-1669, 1982.
KUMAR, C. G.; ANAND, S. K. Significance of microbial biofilms in food industry: a review. International Journal of Food Microbiology, 34,179-186,1997
KUO, F. L.; CAREY, J.B. ; RICKE, S. C. UV irradiation of shell eggs: effect ofpopulations of aerobes,
moulds and inoculated Salmonella typhimurium.Journal of Food Protection, 60, .639-643, 1997.

cap.03

McCABE, W. L.; SMITH, J.C.; HARRIOT, P. Unit operations of chemical engineering. 5th ed. New
York : McGrae-Hill, 1130p, 1993

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

MAFU, A.A., ROY, D., GOULET, J., MAGNY, P. Attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel, glass, polypropylene, and rubber surfaces after short contact times. Journal of Food Protection,
53,742-746, 1990.
MANO, E.B. Polmeros como materiais de engenharia, 1 ed, Edgard Blcher So Paulo, 1991,
356p.
MELLO, C. A. Avaliao da eficincia de sanificantes qumicos em condies de uso simulado sobre
psicrotrficos acidificantes. Viosa, UFV, Minas Gerais, 1977, 62p. Dissertao ( Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos). Universidade Federal de Viosa.
MOAT, A.G.; FOSTER, J.W. Microbial Fisiology. 3a ed. New York, Willwy- Liss, 1995, 580p
MOSTELLER, T.M., BISHOP, J.R. Sanitizer efficacy against attached bacteria in a milk biofilm. Journal
of Food Protection, 56, 34-41, 1993.
PASSOS, M.H.C.R. Estudo da disperso de depsitos incrustantes obtidos em pasteurizadores de
leite por detergentes cidos e alcalinos: influncia do pH, tempo e temperatura de reao. Campinas, Unicamp, 1992. 136p. Dissertao (Mestrado em Tecnologia de Alimentos) Universidade
Estadual de Campinas. UFV
RONNER, U.; HUSMARK, U.; HENRIKSSON,A. Adhesion of Bacillus spores in relation to hydrophobicity. Journal Applied Bacteriology, 69, 550-556, 1990
ROWAN, N. J., MacGREGOR, S. J., ANDERSON, J.G., FOURACRE, R. A., McILVANEY e FARISH, O.
Pulsed-light inactivation of food-related microorganisms. Applied and Environmental Microbiology,
65, 1312-1315, 1999.
SILVA, C. A. S. Avaliao da radiao ultravioleta no controle de microrganismos aderidos em
filmes de polietileno de baixa densidade. Editora UFV, Viosa, 2000. Dissertao (Mestrado em
Cincia e Tecnologia de Alimentos, UFV). Universidade Federal de Viosa.
SIZER, C. E & BALASUBRAMANIAM, V. M. New intervention processes for minimally processed juices. Food Technology, 53, 64-67, 1999.
STONE, L. S.; ZOTTOLA, E. A. Scanning electron microscopy of stainless steel finishes used in food
processing equipment. Food Technology, 39:100 and 112-114, 1985.

180

STRAUSSER, Y. E.; HEATON, M. G. Scanning probe microscopy Technology and recent innovations. American Laboratory, May, 1994.
TOLEDO, R. T.. Chemical sterilants for aseptic packaging. Food Technology, p.102112., 1975.
YOUSEF, A.E., MARTH,E. H. lnactivation of Listeria monocytogenes by ultraviolet energy. Journal of
Food Science, 53, 571-573, 1988.
ZOTTOLA, E.A Microbial attachment and biofilms formation: a new problem for the food industry ?
Food Technology,48, 107-114, 1994.
ZOTTOLA, E. A . Special techniques for studying microbial biofims in food system. In: Tortorello, M.
L. & Gendel, S. M. Food microbial analysis new technologies. IFT basic simposium series. Marcell
Dekker, INC. Cap. 16 p. 315-3346, 1997

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04

1.

Introduo

2.

Fundamentos Bsicos de Higienizao


2.1. Superfcies Usadas no Processamento de Alimentos
2.2. Qualidade da Matria-Prima e da gua
2.3. Caractersticas dos Principais Resduos
2.4. Agentes Detergentes e Formulaes
2.5. O Passo a Passo do Procedimento de Higienizao
2.6. Sanitizantes

3.

Avaliao da Eficincia do Procedimento de Higienizao


3.1. Teste do Swab
3.2. Mtodo de Rinsagem
3.3.Placa de Contato
3.4. Sedimentao de Microrganismos do Ar em Meio Slido
3.5. Mtodo da Seringa com gar
3.6. Mtodo da Esponja
3.7. Impresso de Microrganismos do Ar em Meio Slido
3.8. Tcnica do ATP - Bioluminescncia

4.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Cludia Lcia de Oliveira Pinto
Marclia Santos Rosado

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Os conhecimentos sobre os fundamentos da limpeza e sanitizao das superfcies


contribuem para obteno de alimentos seguros ao consumo.

1. Introduo
O advento da globalizao tem acarretado grandes e rpidas mudanas econmicas, sociais e polticas, ampliando oportunidades de negcios, mas provocando uma competitividade acirrada. As indstrias de alimentos que se incluem nesse
contexto tm processado uma quantidade de alimentos cada vez maior, na tentativa
de suprir o mercado crescente, buscando sempre o incremento de produtividade.
Isso pode gerar diferentes problemas, a exemplo de perdas ps-processamento ou
diminuio da vida de prateleira se os mtodos de higienizao empregados no
forem eficazes ou, ento, forem negligenciados.
A higienizao na indstria de alimentos se insere dentro das Boas Prticas de
Fabricao (BPF) e dos programas de qualidade como o de Anlise de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC), visando obteno de alimentos seguros, particularmente sob os aspectos relacionados s contaminaes com agentes qumicos,
fsicos e microbiolgicos, alm de contribuir para a manuteno das caractersticas
sensoriais e nutritivas desses alimentos. Dentro desse contexto, os profissionais
responsveis pela higienizao nos estabelecimentos produtores/industrializadores
de alimentos devem atuar de forma eminentemente preventiva na busca da melhor
qualidade dos alimentos processados, evitando problemas de ordem econmica ou
de sade pblica. Para isso, deve-se perseguir constantemente o desenvolvimento

182

educacional do pessoal envolvido atravs de programas de treinamento continuado,


motivando-os e conscientizando-os da importncia da realizao de forma correta
dos procedimentos de higienizao.
A implantao de programas de higienizao mais rigorosos tem sido uma
necessidade na indstria de alimentos. Isso se deve a fatores como o desenvolvimento de novos produtos, as novas tecnologias no processamento de alimentos,
as exigncias comerciais de novos mercados, consumidores mais exigentes e os
relatos de doenas veiculadas por alimentos, particularmente quelas de origem
bacteriana. Todos os processadores de alimentos tm responsabilidade direta sobre
a segurana e qualidade de seus produtos. Assim, fundamental que os responsveis pela higienizao tenham em mente dois aspectos relevantes para o sucesso
de um procedimento adequado: a) como fazer e b) como avaliar o procedimento de
higienizao proposto.
A indstria deve enfatizar o como fazer os procedimentos de higienizao,
enfocando as etapas de pr-lavagem, usos de detergentes, enxge e sanitizao.
Devem ser fornecidas informaes que incluem concentrao, pH, tempo e temperatura de contato das solues detergentes e sanitizantes. O como avaliar se

ginicas previamente estabelecidas, normalmente associadas com quantidade de


microrganismos aps a realizao do procedimento de higienizao, foram atendidas. Por exemplo, a avaliao do procedimento de higienizao de equipamentos e
utenslios, que entram em contato direto com os alimentos, dos manipuladores que
processam os alimentos, do ar dos ambientes de processamento, uma preocupao constante das indstrias, que necessitam de resultados rpidos para garantir a
qualidade dos produtos processados e a segurana aos consumidores. Os resultados dessa avaliao so imediatamente repassados aos controladores de processos
para que possam aplicar uma ao corretiva, se necessrio.
Nas indstrias de alimentos, a multiplicao e a sobrevivncia de microrganismos devem ser controladas nas matrias-primas, nas superfcies de equipamentos
e utenslios, nos ambientes de processamento, em manipuladores, em embalagens,
na distribuio e no produto final. O monitoramento correto dos procedimentos de

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

fundamenta em anlises microbiolgicas, ou no, para definir se as condies hi-

higienizao permite um controle microbiolgico eficiente, e, alm disso, registros


comprovam se um processo ou manipulao em um ponto crtico de controle est
em conformidade com o limite crtico estabelecido no plano APPCC.
Este captulo tem o objetivo de oferecer subsdios para que os procedimentos
de higiene auxiliem a produo de alimentos com a qualidade microbiolgica recomendada, especificada ou, ainda, exigida pela legislao vigente.

2. Fundamentos Bsicos da Higienizao


Prticas higinicas eficientes so necessrias em todas as etapas da cadeia

183

produtiva dos alimentos. Nas indstrias de alimentos, a higienizao inclui as etapas


de limpeza e sanitizao das superfcies de alimentos, ambientes de processamento,
equipamentos, utenslios, manipuladores e ar de ambientes de processamento.
A limpeza tem como objetivo principal a remoo de resduos orgnicos e minerais aderidos s superfcies, constitudos principalmente por carboidratos, protenas, gorduras e sais minerais. A sanitizao tem como objetivo eliminar microrganismos patognicos e reduzir o nmero de microrganismos alteradores para nveis
considerados seguros.
necessrio que o profissional responsvel pela higienizao nas indstrias de
alimentos tenha slida base de conhecimentos em diversos aspectos. importante
saber sobre as caractersticas, utilizao e cuidados com superfcies mais comuns
em indstrias de alimentos, como o ao carbono, ao inoxidvel, policarbonato,
polietileno, plstico, cermica, tinta, vidro, loua, alumnio, concreto e borracha.
Tambm so necessrias informaes sobre a qualidade da gua, a solubilidade,

cap.04

a facilidade de remoo pela ao de gua ou detergentes alcalinos ou cidos e

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

o efeito do tratamento trmico nos diversos resduos presentes nas superfcies,


como carboidratos, gordura, protenas e sais minerais. importante conhecer: i) as
funes dos agentes de limpeza, como alcalinos, cidos, fosfatos, complexantes e
tensoativos; ii) as reaes fsicas e, ou, qumicas entre os resduos e os detergentes durante o procedimento de higienizao, como saponificao, emulsificao,
molhagem, penetrao, suspenso, enxaguagem, abrandamento, solubilizao de
minerais, solubilidade, corrosividade, segurana e economia; iii) as formulaes de
detergentes; iv) os mtodos para avaliao qumica dos detergentes; e v) a biodegradabilidade dos detergentes e seus impactos ao ambiente.
Tambm, so importantes as informaes disponveis sobre sanitizantes fsicos, como calor e radiao ultravioleta e sobre sanitizantes qumicos que incluem
compostos clorados, compostos quaternrios de amnio, compostos iodados e
clorhexidina. Ainda, com relao aos sanitizantes necessrio conhecer suas funes, suas concentraes de uso, seus modos de ao, como e onde podero ser
empregados e forma correta de prepar-los.
A descrio correta do passo-a-passo dos mtodos de higienizao manual ou
mecnica com enfoque na pr-lavagem, aplicao do detergente, enxge, sanitizao fundamental na obteno de alimentos seguros e de qualidade.

2.1. Superfcies Usadas no Processamento de Alimentos


As superfcies comumente usadas para processamento de alimentos, como
ao inoxidvel, polietileno, polipropileno, policarbonato, ao-carbono, madeira, te184

flon e vidro, permitem o crescimento microbiano, podendo originar processos de


adeso bacteriana e formao de biofilmes. Um processo de adeso ocorre quando
a contagem de microrganismos na superfcie atinge valores entre 104 UFC.cm-2 e 105
UFC.cm-2. Contagens acima desses valores j caracterizam o desenvolvimento de
biofilmes, se ocorre a produo de exopolissacardeos pelos microrganismos.
As caractersticas principais das superfcies usadas na indstria de alimentos
esto descritas na Tabela 1.

2.2. Qualidade da Matria-Prima e da gua


A produo de alimentos com qualidade, sem dvida, inicia-se com as condies higinico-sanitrias da matria-prima. Tais condies se relacionam: i) aos
aspectos fsicos, como a ausncia de corpos estranhos, pedras, insetos; ii) aos aspectos qumicos, como ausncia de resduos de inseticidas, de fertilizantes e dos
prprios agentes de limpeza e sanitizao; e iii) aos aspectos microbiolgicos, como
os nveis adequados de bactrias patognicas ou alteradoras, fungos filamentosos
e leveduras. Matrias-primas que no atendem s especificaes para o processamento no devem ser aceitas pela indstria de alimentos. Se as matrias-primas

no podem ser processadas.


Tabela 1 - Caractersticas dos principais tipos de superfcies usadas na indstria de alimentos

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

contm contaminantes que no podem ser reduzidos em nveis aceitveis tambm

185

Por exemplo, frutas e vegetais so cultivados em solos e carreiam aproximadamente 109 UFC.g-1 de microrganismos aps colheita. Dentre esses microrganismos mais comuns na matria-prima esto bactrias, fungos filamentosos e
leveduras. As bactrias mais freqentes so Pseudomonas spp, Erwinia herbicola
e Enterobacter agglomerans, bactrias do cido ltico como Leuconostoc mesenteroides, Lactobacillus spp., as patognicas como as do gnero Salmonella e
Clostridium, alm da estirpe E. coli O157: H7. O gnero Pseudomonas geralmente
responsvel por 50 a 90% da populao microbiana de vegetais. Entretanto, outros microrganismos podem se desenvolver durante o transporte, processamento
e armazenamento.

cap.04

A gua para uso na indstria de alimentos deve ser considerada como matria-prima e atender aos padres fsicos, qumicos e microbiolgicos estabelecidos na legislao
brasileira de acordo com a Portaria n 518, do Ministrio da Sade, de 25 maro de 2004. A
gua aceita como potvel quando se encontra dentro de certos requerimentos de
qualidade. J foram detectados cerca de 2.000 contaminantes diferentes na gua.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


186

Aproximadamente, 700 deles foram encontrados em gua potvel. Isso demonstra a


dificuldade em determinar quais as anlises devem ser efetuadas para se definir a qualidade da gua. Por isso, as entidades e organismos nacionais, como os Ministrios
da Sade e Ministrio da Agricultura, Agncia Nacional da gua, ou internacionais,
entendem que, na impossibilidade de analisar todos esses possveis contaminantes,
a qualidade da gua seja avaliada por determinado nmero de anlises de grupos
representativos da qualidade, com a finalidade de ser monitorada. As metodologias
analticas para determinao dos parmetros fsicos, qumicos, microbiolgicos e
de radioatividade devem atender s especificaes de entidades nacionais e, ou,
internacionais. So amplamente aceitas as metodologias publicadas na edio mais
recente do Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, de autoria das instituies American Public Health Association (APHA), American Water
Works Association (AWWA) e Water Environment Federation (WEF), ou as metodologias publicadas pela International Standartization Organization (ISO). Algumas
legislaes vigentes no Brasil sobre uso da gua so mostradas na Tabela 2.

Tabela 2 - Algumas legislaes importantes para uso da gua na indstria de alimentos

A legislao atual prev a anlise cerca de 90 parmetros, que sem dvida


um nmero elevado. As anlises propostas fundamentam-se em cinco grupos
principais (Tabela 3).
Tabela 3 - Grupos de anlises propostos para avaliar a qualidade da gua

O grupo de anlises que indicam possibilidades de formao de incrustaes e


corroso representado pelos sais minerais e gases presentes. Esse grupo apresenta

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

grande importncia em processos de adeso microbiana e formao de biofilmes. Os


locais onde ocorre corroso e, ou, depsitos minerais so apropriados ao desenvolvimento de microrganismos. Esses eventos alteram a microtopografia das superfcies
que processam alimentos, facilitando a deposio de matria orgnica, nutrientes e
microrganismos. As incrustaes desses minerais muitas vezes so denominadas no
dia-a-dia da indstria de pedras. Assim, ocorrem, por exemplo, as formaes minerais conhecidas como pedras de leite e pedras de cerveja. No caso de laticnios, essas
incrustaes so constitudas de minerais da gua, principalmente aqueles responsveis pela dureza, como clcio e magnsio, minerais dos detergentes e sanitizantes,
como sdio, fsforo e cloretos, resduos de protenas, gordura, aucares e sais minerais de leite. Alm disso, nessas incrustaes podem se agregar microrganismos
de origens diversas, como aqueles presentes no ar, na gua, nos manipuladores e
no prprio alimento. Esses microrganismos, encontrando condies favorveis para
seu desenvolvimento, atingem nmeros elevados e, ao se liberarem, contaminam os
alimentos processados nessas superfcies incrustadas.
A reao entre compostos de detergentes e os ons clcio e magnsio presentes na gua dura d origem a precipitados insolveis, que, para serem eliminados,
requerem o uso de detergentes cidos em maior freqncia e concentrao, elevando os custos de produo. Alm disso, h significativa reduo na eficincia de
limpeza de superfcies e equipamentos, em funo do decrscimo no poder de ao
que os detergentes apresentam quando combinados com gua dura. Dessa forma,
recomenda-se a incluso de abrandadores na composio dos detergentes.
A dureza da gua, expressa em mg.L-1 de CaCO3, pode variar de 10 a 200
mg.L-1 em gua doce, podendo alcanar at 2.500 mg.L-1 em guas salgadas. Esses sais podem ser removidos das guas brutas por abrandamento, desmineralizao ou evaporao.

187

A gua amplamente utilizada em indstrias de alimentos como veculo para


aquecimento e resfriamento, limpeza e sanitizao de equipamentos, alm do seu
uso como ingrediente ou como veculo para incorporar ingredientes. Assim, as caractersticas fsicas, qumicas e microbiolgicas da gua interferem diretamente na
qualidade sanitria dos alimentos produzidos, assim como na vida til dos equipamentos, utenslios e superfcies industriais.

cap.04

O controle da qualidade da gua industrial deve ser realizado sistematicamente,


visando atender aos padres e recomendaes existentes. Assim, auxilia a garantia
da qualidade sensorial e microbiolgica dos alimentos produzidos, na segurana nos
processos industriais, na maior eficincia das solues de limpeza e sanitizao e na
reduo de problemas operacionais devido formao de depsitos, incrustaes e
corroso em superfcies e metais. Alm disso, contribui para a reduo dos custos de
produo em razo da maior vida til de equipamentos e utenslios.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.3. Caractersticas dos Principais Resduos


As etapas de um procedimento de higienizao que normalmente so propostas para o controle higinico de superfcies de equipamentos e utenslios, para
o asseio pessoal de manipuladores e para o ar de ambientes de processamento,
levam em considerao as caractersticas de solubilidade dos resduos de alimentos
em gua ou detergentes alcalinos e cidos (Tabela 4). Constata-se, portanto, que a
gua, associada ao mecnica, capaz de remover com alguma facilidade resduos de carboidratos e sais minerais monovalentes desde que no tenham recebido
ao do calor. No entanto, verifica-se a necessidade do uso de agentes alcalinos
ou de tensoativos para a remoo de gordura e de cidos para a remoo de sais
minerais divalentes, como o clcio e magnsio. Os alcalinos tambm so os agentes
responsveis pela remoo de resduos de protena. Deve-se salientar que a ao do
calor torna a remoo dos resduos mais difcil.
Tabela 4 - Solubilidade e ao do calor sobre os principais resduos de alimentos

188

2.4. Agentes Detergentes e Formulaes


A limpeza das superfcies obtida pelo uso de determinados agentes qumicos
ou por formulaes destes que apresentam ao especfica sobre os resduos dos
alimentos. As solues de limpeza podem ser aplicadas: i) manualmente; ii) pela imerso de partes desmontveis de equipamentos e tubulaes, como vlvulas conexes
e, ainda, para o interior de tachos de tanques; iii) por meio de mquinas lava jato
tipo tnel; iv) por meio de equipamento spray com alta ou baixa presso; v) por
nebulizao ou atomizao; vi) pelo uso de espuma; vii) pelo uso de gel; e viii) ou por
circulao (Cleaning In Place - CIP). Deve-se ressaltar que em indstrias de produtos
em p normalmente se utiliza a limpeza a seco. Nesse caso, os resduos so removidos por meio de aspiradores, e a sanitizao pode ser efetuada pelo uso de tecidos
ligeiramente umedecidos com a soluo sanitizante.
Os principais grupos de agentes detergentes so representados pelos agentes
alcalinos, os cidos, os fosfatos, os agentes complexantes e os tensoativos. As caractersticas e funes principais dos detergentes encontram-se nas Tabelas 5, 6 e 7.

Tabela 6 - Valores relativos de ao de alcalinos e fosfatos

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Tabela 5 - Funes dos principais agentes de limpeza usados em formulaes de detergentes

189

cap.04

Tabela 7 - Valores relativos da ao de cidos, complexantes e tensoativos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.4.1 Alcalinos
Dentre os alcalinos, incluem-se o hidrxido de sdio, o carbonato de sdio, o
metassilicato de sdio, o ortossiliciato de sdio e o sesquissilicato de sdio. Todos
esses agentes apresentam como caracterstica principal a liberao de ons hidroxila
(OH-) que promovem a saponificao dos cidos graxos constituintes da gordura e a
solubilizao dos resduos de protena. No entanto, existe diferena na quantidade de
alcalinidade liberada em soluo aquosa. O hidrxido de sdio o agente alcalino que
libera 100 % de alcalinidade custica que responsvel pela sua ao de detergncia
e por isso usado amplamente na limpeza pelo mtodo de limpeza no lugar, mais conhecido como CIP (Cleaning In Place). Esse mtodo de higienizao permite o uso de
agentes ou formulaes que liberam alta alcalinidade custica, temperaturas e tempo
de contato das solues de limpeza mais elevadas e tempo de contato maior. Assim,
para limpeza de um pasteurizador de leite, pode-se usar uma soluo de hidrxido de
sdio contendo 1 % de alcalinidade custica, que origina um pH 13, temperatura de
80 C, durante 30 min, circulada a uma velocidade de 1,5 m.s-1. Nesses trocadores de
calor podem ocorrer grossas pelculas de gordura e protenas que devem ser controladas por solues de alta alcalinidade. O hidrxido de sdio comercializado nas formas de escama, perolados ou lquido e origina solues que devem ser manipuladas
com cuidado, por serem perigosas aos manipuladores.
O carbonato de sdio participa de formulaes de mdia alcalinidade, pois libera
em soluo aquosa apenas 50 % de alcalinidade custica (reaes a seguir). Em concentrao de 1 % esse agente alcalino origina um pH de cerca de 11. Isso significa que

190

na mesma concentrao de 1 % a soluo de carbonato de sdio tem 100 vezes menos


alcalinidade custica do que o hidrxido de sdio. Assim, pode-se usar o carbonato de
sdio para formulaes usadas na limpeza manual de equipamentos e utenslios.

Os outros alcalinos que participam de formulaes so o metassilicato de sdio, cuja principal caracterstica atenuar a corrosividade das formulaes das quais
participa, o ortossilicato de sdio e o sesquissilicato de sdio, que no apresentam
a caracterstica mencionada.

Tabela 8 - Caractersticas de substncias alcalinas comumente usadas no procedimento de


limpeza na indstria de alimentos

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

A Tabela 8 mostra as principais caractersticas desse grupo de agentes de limpeza.

Os ons hidroxilas responsveis pela alcalinidade custica e liberados pelos


agentes alcalinos participam efetivamente para a reao de saponificao, que transforma os cidos graxos insolveis na gua em sabo que , por sua vez, solvel em
gua. A saponificao consiste em reagir o cido graxo com uma soluo alcalina
sob aquecimento (Figura 1).

191

Figura 1 - Reao de saponificao.

Tambm, os ons hidroxilas pelo aumento do pH da soluo auxiliam a remoo


de resduos proticos. Sabe-se que no ponto isoeltrico as protenas apresentam carga eltrica livre igual a zero, e nesse caso os resduos proticos esto insolveis em
gua. Para solubiliz-los, no procedimento de higienizao dispe-se de duas alternativas: diminuio do pH, em que os resduos proticos esto carregados positivamente; ou aumento do pH, em que esses resduos apresentam carga eltrica negativa.
Quando se observa a curva de solubilidade de protena em funo do pH (Figura
2), constata-se a maior eficincia das solues alcalinas. Por exemplo, uma soluo
alcalina preparada com 1 % de hidrxido de sdio, que corresponde tambm a 1 %
de alcalinidade custica, expressa em NaOH, promover repulso eletrosttica entre
cap.04

os resduos proticos que se apresentam carregados negativamente. Devido a essa

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

repulso, esses resduos se mantm suspensos em soluo aquosa e so removidos


da superfcie pela etapa de enxaguagem no procedimento de higienizao.

Figura 2 - Efeito do pH na solubilidade de resduos proticos.

2.4.2. cidos
Os cidos inorgnicos ou orgnicos tm efetiva participao no controle de
sais minerais na superfcie de equipamentos e utenslios. Dentre os cidos inor192

gnicos, encontram-se o ntrico e o fosfrico. Esses cidos so corrosivos, por


isso, geralmente participam de formulaes com inibidores de corroso, como
bases nitrogenadas heterocclicas e ariltiourias. Os inibidores aderem superfcie, protegendo-a da ao corrosiva. Esses cidos normalmente so usados numa
concentrao de 0,5 % de acidez total, expressa em HCl, que originam pH em
torno de 2,0, e na limpeza CIP deve-se usar uma temperatura em torno de 70 C,
para otimizar a detergncia do cido sobre os minerais. J os cidos orgnicos
so representados pelos cidos ltico, actico, hidroxiactico, tartrico, levulnico
e glucnico, dentre outros.
Os cidos orgnicos so menos corrosivos do que os inorgnicos, porm
mais caros. Os cidos muitas vezes so formulados com tensoativos para diminuir
a tenso superficial da soluo e melhorar o contato entre o resduo mineral e o
detergente, pois as solues cidas no molham bem as superfcies.
Esses agentes de limpeza, por exemplo o cido ntrico, transformam o carbonato de clcio e o de magnsio, que so insolveis em gua, em nitrato de clcio

qumicas permitem o controle desses minerais pelo procedimento de higienizao, conforme as reaes qumicas a seguir.

2.4.3. Fosfatos
De maneira geral, utilizam-se o ortofosfato de sdio, representado pelo fosfato
trissdico, e os polifosfatos de sdio, representados pelo hexametafosfato, tetrafosfa-

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

e de magnsio, respectivamente, que so solveis na gua. Essas transformaes

to, tripolifosfato e pelo pirofosfato em suas formas sdicas (Figura 3). Esses produtos
ou formulaes deles podem ser adquiridos de empresas especializadas, sob diversos nomes comerciais. Como informao, pode-se afirmar que o fosfato trissdico
atua por precipitao dos sais de clcio e de magnsio, responsveis pela dureza da
gua, o que no conveniente, pois haver depsitos nas superfcies que processam
os alimentos. Os polifosfatos, em contrapartida, atuam sobre a dureza por formao
de quelatos com os sais, no ocorrendo, portanto, a deposio. A capacidade de
quelao varivel em funo do polmero. Por exemplo, 1 g de hexametafosfato de
sdio capaz de formar complexos solveis com cerca de 74 mg de dureza. Outros
polifosfatos, como o tripolifosfato de sdio e o tetrafosfato de sdio, complexam,
respectivamente, 36 e 57 mg de dureza por grama do seqestrante.

193

cap.04

Figura 3 - Exemplos de polifosfatos: a) hexametafosfato de sdio, b) tripolifosfato de sdio e c) pirofosfato


tetrassdico.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


194

Mesmo quando a gua classificada como mole, podem ocorrer processos


de incrustaes em superfcies de troca de calor. Por isso, sugere-se que os detergentes utilizados no procedimento de higienizao sejam formulados com agentes
complexantes, como os polifostafos.

2.4.4. Seqestrantes
Os agentes seqestrantes so representados pelas formas sdicas do EDTA
(etilenodiamino tetracetato de sdio), do NTA (nitriloacetato de sdio) e pelo gluconato de sdio (Figura 4). Os agentes tm como funo semelhante quela dos
polifosfatos: o controle de depsitos minerais nas superfcies por complexao,
atuando sobre clcio, magnsio, ferro e mangans, dentre outros. No entanto, so
muito mais eficientes nessa funo (Tabela 9), alm de serem mais estveis em
temperaturas elevadas. Porm, so de custo elevado e, geralmente, usados para
solucionar problemas especficos. Cada grama do EDTA-Na seqestra 201 mg de
dureza. A mesma quantidade do gluconato de sdio complexa 325 mg de dureza.
Deve-se salientar que os cidos orgnicos, como o glucnico e o ctrico, tambm
apresentam a capacidade de complexar minerais.

Figura 4 - Agentes seqestrantes orgnicos: a) etileno diamino tetracetato de sdio e b) gluconato de sdio.

Tabela 9 - Caractersticas de substncias quelantes e seqestrantes comumente usadas no


procedimento de limpeza na indstria de alimentos

de leite em p, em que h possibilidade de formao de grossas pelculas de gordura


e protena contendo minerais e microrganismos, recomenda-se uma formulao de
detergente alcalino com 95 % de hidrxido de sdio adicionado de 5 % de EDTA-Na.

2.4.5. Agentes Tensoativos


Os agentes tensoativos tambm so conhecidos como umidecedores, emulsificantes, detergentes sintticos e agentes de molhagem, entre outros. A estrutura
qumica de um tensoativo se caracteriza por apresentar uma parte hidroflica, ou seja,
polar e outra hidrofbica, isto , apolar (Figura 5). Essa caracterstica permite que esses agentes diminuam a tenso superficial em interfaces lquido-lqudo, lquido-gs
e slido-lquido. Tal fato muito importante para o procedimento de higienizao,
que para ser eficiente exige a ocorrncia de contato entre os agentes de limpeza e

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Por exemplo, na indstria de processamento de leite condensado e fabricao

os resduos a serem removidos. Observe o seguinte: a gua, ao contrrio do que parece, no molha bem a superfcie, pois apresenta alta tenso superficial, equivalente
a 72 mJ.m-2. Essa tenso deve ser diminuda a valores de 36 mJ.m-2 para otimizar
o contato entre o detergente e o resduo a ser removido. Por isso, numa superfcie
onde se encontram resduos de gordura a gua apresenta-se na forma de gotculas,
pois a atrao entre as molculas da gua maior do que aquela entre as molculas
de gua e as de gordura. Essa diminuio da tenso superficial da gua conseguida
com o uso de tensoativos.

195

Figura 5 - Estrutura qumica de um tensoativo: dodecilbenzeno sulfonato de sdio.

Assim, os agentes tensoativos, por serem emulsificantes, permitem a disperso de dois lquidos no miscveis e, por serem agentes de molhagem, melhor
penetrao de lquidos em resduos slidos. Os sabes e alguns compostos orgnicos melhoram o poder de penetrao das solues aquosas em fissuras, ranhuras e poros capilares das pelculas de gordura depositadas nos equipamentos
e interpem-se entre a superfcie slida e os resduos. Essas substncias aderem
s superfcies das pelculas dos resduos slidos ou lquidos, favorecendo, dessa
maneira, a formao de emulso e disperso das partculas. De maneira geral, os
tensoativos so: i) solveis em gua fria; ii) ativos em concentraes muito baixas,

cap.04

podendo nveis de 0,1 % diminuir a tenso superficial da gua em torno de 50 %;

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

iii) indiferentes dureza da gua, exceo dos sabes; iv) no formam precipitados; v) atuam em diferentes pH; vi) em alguns casos, so bactericidas; e vii) no
so corrosivos das superfcies.
A parte apolar do tensoativo na interface lquido-gs, por exemplo, quando em
soluo aquosa fica direcionada para o ar e a parte polar para a gua. Isso provoca a
formao de espuma pelos detergentes (Figura 6a). A ocorrncia de espuma pode ser
desejvel no procedimento de higienizao de superfcies externas de equipamentos,
silos, paredes e tetos, dentre outros. Nesse caso, a espuma permite melhor contato do detergente com os resduos a serem removidos e facilita a observao visual
da rea higienizada. No entanto, o excesso de formao de espuma no desejvel
para a higienizao pelo processo CIP, devido a dificuldades operacionais. A remoo
da espuma em excesso prejudica a etapa de enxaguagem dos resduos durante higienizao. Deve-se ressaltar que a quantidade de espuma formada no indicativa
da eficincia na reduo da tenso superficial. Cabe s empresas que formulam os
detergentes a escolha adequada das substncias mais indicadas, em razo do uso na
indstria de alimentos. Alm disso, deve-se mencionar que a ocorrncia de espumas,
quando os resduos de detergentes no so adequadamente tratados pela indstria,
torna-se um problema srio de poluio ambiental.

a)

196

b)

Figura 6 - Interao gua e tensoativos.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

A molcula do tensoativo forma micela no interior da soluo aquosa (Figura


6b). Nesse caso, as partes hidrofbicas se direcionam para o interior da micela, e
as partes polares interagem com a gua. a formao de micela que permite a
remoo dos resduos de gordura pelo processo de emulsificao realizado pelos
tensoativos: a parte hidrofbica dessas substncias interage com a gordura e cidos
graxos, insolveis em gua e a hidroflica com as molculas de gua, formando as
micelas, que so solveis em gua. As micelas envolvem o resduo e o suspende
em soluo aquosa. A concentrao de tensoativo em que se inicia a formao de
micelas denomina-se Concentrao Crtica de Micela (CCM). Na CCM, a tenso
interfacial est em nvel mnimo (Figura 7), e a eficincia de limpeza est otimizada.
Aumento na concentrao de tensoativo em soluo alm do CCM no causar diminuio da tenso superficial. No entanto, excesso de tensoativo necessrio para
manter a CCM, desde que o tensoativo reage com o resduo a ser removido.

Figura 7 - Tenso superficial em funo da concentrao de tensoativo.


197

Assim, manter concentrao suficiente de molculas de tensoativo para a formao de micelas importante para se obter uma boa limpeza. Essa concentrao
varia de acordo com o tipo de tensoativo. Por exemplo, a concentrao de alquil
sulfonatos, como o dodecilbenzeno sulfonato de sdio, deve situar-se entre 0,1 % e
0,2 %. Esse tensoativo tem um CCM de aproximadamente 0,03 %.
H uma classificao dos agentes tensoativos baseada na sua ionizao em
soluo aquosa. Os tensoativos aninicos liberam uma carga eltrica negativa em
gua e so representados pelos sabes obtidos pela saponificao de cidos graxos
com cadeia de 12 a 18 tomos de carbono ou por compostos sintticos geralmente
de origem petroqumica, como o caso do dodecilbenzeno sulfonato de sdio.

cap.04

O sabo no usado para a higienizao de superfcies de equipamentos e


utenslios por originar odores indesejveis e, principalmente, por ser inativado pelos
sais presentes na gua, particularmente os de clcio e magnsio, responsveis pela
dureza da gua. Com o objetivo de solucionar esse problema, a indstria qumica
desenvolveu substncias que no so afetadas pela gua dura, como o dodecil-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


198

benzeno sulfonato de sdio, j mencionado. No entanto, necessrio e obrigatrio


pela legislao vigente que a indstria de alimentos utilize compostos sintticos que
sejam biodegradveis. Nesse caso, devem apresentar somente cadeia carbnica
linear, de modo a permitir a ao microbiana para sua degradao.
Os tensoativos aninicos geralmente formam bastante espuma o que pode
ser indesejvel em formulaes de detergentes usados em limpeza CIP. No entanto
essa caracterstica desejvel em procedimentos de higienizao de superfcies externas de equipamentos, tanques e silos de armazenamento.
Os primeiros tensoativos aninicos comerciais surgiram por volta de 1930,
destacando-se o grupo denominado alquil sulfato de sdio, sintetizados pela sulfonatao de lcoois de cadeia longa (Figura 8 ).

Figura 8 - Sntese de um alquil sulfato de sdio.

Posteriormente, o grupo denominado alquil benzeno sulfonatos de sdio foi


desenvolvido, tendo como frmula geral: R-SO3 Na . Deve-se observar que o grupo
alquil (R) d as caractersticas de biodegradabilidade do tensoativo. Um tetrapropileno que apresenta carbonos tercirios e quaternrios no ser degradado completamente pelos microrganismos. Por isso, o uso de grupos alquil de cadeia linear na
sntese desses tensoativos, com carbonos primrios e secundrios, a alternativa
vivel, j que sero tensoativos biodegradveis.
Os tensoativos aninicos incluem os alquil aril sulfonatos, como o dodecilbenzeno sulfonato de sdio, os lcoois sulfatados de cadeia longa, as olefinas sulfonatados e teres sulfatados (Figura 9).

Figura 9 - Exemplos de tensoativos aninicos: a) dodecilbenzeno sulfonato de sdio, b) lauril sulfato de


sdio e c) lauril etoxilato sulfato de sdio.

Os agentes tensoativos catinicos so aqueles que liberam carga eltrica positiva em soluo aquosa. So representados pelos compostos quaternrios de amnia, tambm conhecidos como quats, cuja funo bactericida mais importante
do que a ao como detergente.
Os agentes no inicos usualmente resultam da condensao do xido de etileno ou do xido de propileno com lcoois de cadeia longa ou alquil fenis (Figura10).

Figura 10 - Exemplos de tensoativos no inicos: a) frmula geral de um tensoativo no-inico, b) lauril


lcool etoxilato e c) nonil fenol etoxilato.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

No liberam carga eltrica em soluo aquosa. No entanto, apresentam uma poro


polar e outra apolar em sua molcula qumica, que lhes conferem as caractersticas
de agentes tensoativos. Algumas substncias tensoativas desse grupo no formam
muito espuma, embora sejam muito eficientes na diminuio da tenso superficial
da gua e assim participam de formulaes para serem usadas em procedimentos
de higienizao pelo mtodo CIP.

Os tensoativos anfteros liberam carga eltrica negativa ou positiva, dependendo do pH da soluo aquosa (Figura 11). Esses agentes apresentam aplicao
limitada na formulao de detergentes usados na indstria de alimentos. No entanto, so bastante utilizados na preparao de shampoos.

Figura 11 - Tensoativos anfteros: a) frmula geral e b) dodecil diaminoetilglicina.

199

H mais de uma centena de agentes tensoativos que podem ser classificados


nas cinco categorias mencionadas na Tabela 10.

cap.04

Tabela 10 - Grupos qumicos e caractersticas de agentes tensoativos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.4.6. Enzimas
Em algumas situaes, com o objetivo de aumentar a eficincia do procedimento de higienizao, sugere-se a adio de enzimas proteolticas e lipases s solues
de tensoativos. Na indstria de carnes, por exemplo, a utilizao dessas enzimas seria
vivel, pois pelculas de protenas e gordura podem se depositar sobre superfcies de
processamento. Os detergentes contendo as enzimas hidrolisam as gorduras e protenas, facilitando sua remoo posterior. O uso das enzimas no requer gua quente, que,
ao contrrio, pode inativ-las. Alm disso, normalmente as enzimas atuam melhor em
meio neutro ou ligeiramente alcalino. Assim, a eficincia das enzimas em formulaes
de detergentes de alcalinidade custica muito elevada deve ser bem avaliada.

2.4.7. Formulaes de Detergentes


Um detergente apropriado ao uso no procedimento de higienizao na indstria
de alimentos deve ser eficiente nas condies de uso, no corroer ou danificar equipamentos, no afetar as caractersticas sensoriais dos alimentos, ser facilmente rinsados
das superfcies e seguro aos manipuladores.
Espera-se que um detergente ideal apresente as caractersticas de: i) saponificao; ii) emulsificao; iii) molhagem; iv) penetrao; v) diminuio da tenso superficial; v) solubilizao de protena; vi) manuteno dos resduos em suspenso; vii)
controle de minerais; viii) no ser corrosivo e ix) ser de baixo custo.
Considerando que no h uma nica substncia que apresente todas essas caractersticas desejveis, a indstria de alimentos utiliza-se de formulaes que sejam

200

adequadas ao procedimento de higienizao a ser seguido. Como exemplo, algumas


formulaes sero mencionadas a seguir. No entanto, deve-se salientar que a melhor
orientao para a indstria de alimentos a aquisio de detergentes formulados
por empresas especializadas, idneas e de nome reconhecido no mercado. Essas
empresas geralmente oferecem produtos que apresentam bons resultados quando
as recomendaes tcnicas de uso so seguidas corretamente. A formulao preparada pelas prprias empresas somente vivel se nelas existir uma capacidade
tecnolgica instalada, com profissionais capazes de desenvolver, preparar e controlar
a qualidade dessas formulaes.

B - Formulaes tpicas de detergentes para uso na indstria de alimentos, com relao


formao de espumas

C - Exemplo de formulao de detergente para limpeza CIP (Cleaning In Place)

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

A - Exemplo de formulaes de detergente em funo da dureza da gua

201

cap.04

D - Exemplo de formulao de detergente para higienizao manual

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

E - Exemplo de formulao de detergente para higienizao de tubulaes de ao inoxidvel

F - Exemplo de formulao de detergente para remoo de incrustaes minerais

G - Exemplo de formulao de detergente para higienizao de tanques de armazenamento de leite

202

H - Exemplo de formulao de detergentes para higienizao de garrafas de vidro por mtodo CIP

2.5. O Passo a Passo do Procedimento de Higienizao


A descrio correta do passo a passo dos mtodos de higienizao, seja o
manual, seja o mecnico, deve enfocar a etapas fundamentais de um procedimento
correto que inclui: a i) pr-lavagem; ii) aplicao dos detergentes; iii) enxagagens e

removidos. A temperatura da gua importante, pois se estiver muito elevada pode


provocar a desnaturao de protena; se estiver muito baixa, causa a solidificao
de gordura. Assim, recomendvel que a temperatura seja cerca de 5 C acima do
ponto de solidificao da gordura do alimento. Geralmente, temperaturas entre 35 C
e 40 C atendem maioria das indstrias.
A lavagem com alcalinos para remoo de resduos orgnicos, como protenas
e gorduras, deve ser efetuada, quando possvel, a cerca de 80 C. A lavagem com
cido tem a funo de remover os sais minerais das superfcies e, quando possvel,
deve ser efetuada a 70 C. A temperatura elevada favorece as reaes qumicas
para retirada desses resduos das superfcies, mas somente pode ser utilizada na
higienizao pela metodologia CIP. A higienizao manual no permite o uso de
temperaturas elevadas, por serem danosas aos manipuladores. As enxaguagens

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

iv) a sanitizao. Na pr-lavagem, cerca de 90 % dos resduos solveis em gua so

removem das superfcies os resduos reagidos com os detergentes. So realizadas


aps a limpeza com alcalinos, com cidos e, s vezes, aps o uso de sanitizantes
qumicos. A sanitizao tem a funo de controlar os microrganismos pelo uso de
agentes fsicos, como o calor ou agentes qumicos como o cloro.
A ttulo de ilustrao, um Procedimento Operacional Padronizado (POP) para a
higienizao de um pasteurizador pode ser descrito como se segue (Tabela 11).
Tabela 11 - Proposio de um procedimento operacional padronizado para a higienizao de um
pasteurizador de leite

cap.04

203

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Um exemplo de riscos associados ao procedimento de higienizao mostrado na Tabela12.


Tabela 12 - Riscos de um procedimento de higienizao de um pasteurizador de leite

2.6. Sanitizantes

204

A sanitizao complementa o procedimento de higienizao, assegurando a


qualidade microbiolgica das superfcies. Deve ser realizada, de preferncia, imediatamente antes do uso de equipamento, pois, aps as etapas de limpeza, pode ocorrer a multiplicao de microrganismos indesejveis que no foram eliminados ou,
mesmo, a recontaminao ambiental das superfcies. Essa etapa do procedimento
de higienizao visa eliminao dos microrganismos patognicos e reduo dos
alteradores em nveis que atendam s especificaes previamente propostas. O uso
de detergentes diminui a contaminao microbiana das superfcies, mas geralmente
h necessidade da aplicao dos sanitizantes para efetivamente atingir as contagens
indicadas para que uma superfcie seja considerada em condies higinicas para o
processamento de alimentos.
Deve-se selecionar sanitizantes que: i) sejam aprovados pelos rgos competentes, como os Ministrios da Sade e da Agricultura; ii) apresentem amplo espectro de ao antimicrobiana e capazes de destruir rapidamente os microrganismos; e
iii) sejam estveis sob variadas condies de uso e que possuam baixa toxicidade e
corrosividade. No existe um sanitizante que apresente todas essas caractersticas
desejveis. Assim, necessrio conhecer as propriedades, vantagens e desvantagens de cada sanitizante disponvel para que seja selecionado o mais apropriado a
cada aplicao especfica. importante saber que a ao dos sanitizantes afetada
pelas caractersticas da superfcie; pelo tempo e pela temperatura de contato, pela

Assim, so importantes as informaes disponveis sobre sanitizantes fsicos,


como calor e radiao ultravioleta e sobre sanitizantes qumicos que incluem compostos clorados, compostos quaternrios de amnio, compostos iodados, clorhexidina, cido peractico, perxido de hidrognio, derivados de fenol, lcoois, extrato
de semente de grape fruit e aldedos. Ainda, com relao aos sanitizantes, necessrio conhecer suas funes, suas concentraes de uso, seus modos de ao,
como e onde sero empregados e a forma correta de prepar-los.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

concentrao de uso e pelos tipos de resduos presentes nas superfcies, pelo pH,
pelas propriedades fsico-qumicas da gua e, ainda, por substncias inativadoras.
O tipo e a concentrao de microrganismos contaminantes da superfcie tambm
influenciam a eficincia do sanitizante. Os esporos so mais resistentes do que as
clulas vegetativas. Certos sanitizantes so mais efetivos sobre bactrias Grampositivas do que Gram-negativas. Outros apresentam boa eficincia contra fungos
filamentosos e leveduras, mas no sobre vrus ou cistos de protozorios, como
Cryptosporidium e Giardia.

Agentes Fsicos
Calor

O calor, quando possvel, deve ser o agente sanitizante escolhido: atinge toda a
superfcie, incluindo pequenos orifcios e ranhuras e no seletivo contra os microrganismos. A gua quente deve ser usada numa temperatura de 80 C durante 5 min.
O ar quente deve ser aplicado a 90 C durante 20 min. J o vapor direto, considerado
a verdadeira sanitizao pelo calor, deve der aplicado o mais prximo possvel da
superfcie durante 1 min. Deve-se ter cuidado na sanitizao de tubulaes com o
vapor, pois a eficincia deste pode ser diminuda em tubulaes longas, se a temperatura no for controlada.

205

cap.04

Tabela 13 - Condies de uso e mecanismo de ao de sanitizantes fsicos mais usados para


controle dos microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Radiao Ultravioleta

A radiao ultravioleta usada no controle microbiolgico em situaes especficas de reas de processamento, de laboratrios, cmaras de repicagens de
micorganismos, superfcies de processamento de alimentos, como polietileno usado como embalagem de leite. Tambm, pode ser usada no controle microbiolgico de alimentos. Lmpadas ultravioleta que imitem radiao 254 nm tm atividade
antimicrobiana. Como essa atividade diminui com o uso, as lmpadas devem ser
substitudas periodicamente, em geral aps seis meses.

Agentes Qumicos
As Tabelas 14, 15 e 16 descrevem as caractersticas de uso, eficincia antimicrobiana e mecanismo de ao dos principais sanitizantes qumicos.
Tabela 14 - Condies de uso de sanitizantes qumicos mais usados para controle dos microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos

206

Tabela 15 - Eficincia sobre microrganismos de alguns sanitizantes qumicos nas condies de uso
para controle de microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos


207

cap.04

Tabela16 - Mecanismos de ao dos sanitizantes qumicos mais usados no controle de microrganismos em superfcies para processamento na indstria de alimentos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Compostos Clorados

Os compostos clorados podem ser classificados em inorgnicos e orgnicos.


Dentre os primeiros, incluem-se o cloro gs (Cl2), o hipoclorito de sdio (NaClO),
o hipoclorito de clcio (CaClO2) e o dixido de cloro (ClO2). A forma gasosa amplamente utilizada na desinfeco de gua para abastecimento pblico e industrial,
sendo comercializada em cilindros de ao carbono, onde se encontra na forma lquida, apresentando 100 % de cloro residual total, expresso em Cl2. Em condies
de presso atmosfrica, passa ao estado gasoso, forma em que extremamente
txico aos manipuladores. Por isso, h necessidade de pessoal bem treinado para
sua utilizao. Para o procedimento de higienizao na indstria de alimentos, o
hipoclorito de sdio, ainda, o mais utilizado, sendo comercializado na forma lquida, em concentraes entre 2 % e 10 % de cloro residual total, expresso em Cl2. O
hipoclorito de sdio apresenta uma srie de vantagens comparativas em relao aos
outros sanitizantes qumicos: i) relativamente baratos; ii) ao rpida; iii) no afetados pela dureza da gua; iv) efetivos contra grande variedade de microrganismos,
inclusive esporos bacterianos e bacterifagos; v) efetivos em baixas concentraes;
vii) relativamente no-txicos nas condies de uso; viii) solues de fcil preparao e aplicao; ix) concentrao facilmente determinada; x) usado em tratamento
de gua, e xi) os equipamentos no necessitam ser enxaguados aps a sanitizao,
se a concentrao de uso for controlada adequadamente. Dentre as desvantagens
do uso do hipoclorito de sdio, encontram-se: i) instabilidade ao armazenamento;
ii) inativao pela matria orgnica; iii) corroso, se no usados corretamente; iv)
irritao da pele; v) precipitao em gua contendo ferro; vi) menor eficincia em

208

pH mais elevado; e vii) oxidao da borracha, que muitas vezes so componentes


de equipamentos, por exemplo gaxetas de pasteurizadores.
Nas indstrias de alimentos, tem aumentado o uso dixido de cloro. Esse composto clorado disponibilizado pela sua gerao no prprio local de uso, por meio
da reao entre o clorito de sdio e o cloro gs. Para isso, deve-se dispor de equipamento que pode ser caro e de difcil manuteno, exigindo pessoas treinadas.
Pode ser encontrado comercialmente na forma estabilizada que consiste de uma
soluo de clorito de sdio, que pode ser convertido para ClO2 no local de uso pela
adio de cido fosfrico ou ctrico, por exemplo. Umas das principais vantagens do
ClO2 a sua baixa reatividade com a matria orgnica, no formando as substncias
denominadas de trihalometanos, que so cancergenos, como ocorre no caso do
cloro gasoso e dos hipocloritos.
Os compostos clorados orgnicos, conhecidos como cloraminas orgnicas, so
produzidas pela reao do cido hipocloroso com aminas, iminas, amidas e imidas.
As mais utilizadas so a cloramina T, a dicloramina T, o diclorodimetil hidantona, as
formas sdicas do cido dicloroisocianrico e o cido tricloroisocianrico (Figura 12).

cloro residual total, expresso em Cl2. Em comparao com os clorados inorgnicos,


liberam mais lentamente o cido hipocloroso, permanecendo efetivos por perodos
de tempo maiores e so menos reativos com a matria orgnica, portanto formam
menos trihalometanos e so mais estveis ao armazenamento.

Figura 12 - Sanitizantes clorados orgnicos: a) cloramina T, b) dicloroisocianurato de sdio e


c) diclorodimetilhidantona.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Esses compostos se apresentam na forma de p em teores entre 24 % e 90 % de

Os compostos clorados so amplamente usados na indstria de alimentos por


serem geralmente de baixo custo e efetivo na eliminao de bactrias Gram-positivas
e negativas, fungos filamentosos e leveduras. Dependendo do pH da soluo, esses
compostos sanitizantes apresentam ao sobre esporos bacterianos, grupo microbiano
importante em processamento de alimentos. Em solues com pH mais baixo, em
que h maior presena de cido hipocloroso (HClO), que a forma no dissociada,
a eficincia esporicida do cloro pode ser esperada. Em pH 7,5, por exemplo, 50%
do cloro residual livre, como o determinado pelo teste da ortolidina, encontram-se
na forma de cido hipocloroso. Em pH 10 e 5, as concentraes dessa forma no
dissociada so de 0,3 % e 99,7 %, respectivamente. Assim, a soluo clorada de pH

209

igual a 5 ser muito mais esporicida do que aquela de pH igual a 12.


Na indstria de alimentos, os compostos clorados podem ser utilizados para a
sanitizao de superfcies de paredes, pisos, tetos e equipamentos e utenslios, para
a reduo do nmero de microrganismos em carcaas bovinas, sunas e de aves,
para a reduo do nmero de microrganismos em frutas e vegetais minimamente
processados, para o controle microbiolgico de gua de resfriamento de alimentos
enlatados esterilizados.
A ao antimicrobiana dos compostos clorados, exceo do dixido de cloro,
est relacionada liberao do cido hipocloroso em soluo aquosa. Essa forma
no dissociada cerca de 80 vezes mais bactericida do que a forma dissociada. Por
meio da equao de Henderson-Hasselblach, possvel determinar a concentrao
do cido hipocloroso na gua. Para isso, necessrio que se conhea a concentrao de cloro residual livre e o pH da gua. Por exemplo, uma soluo contendo 100

cap.04

mg.L-1 de cloro residual livre, com um pH de 7,5, tem 50 mg.L-1 de cido hipocloroso.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Da mesma forma, se o pH da gua for 8,5 ou 6,5, as concentraes de cido hipocloroso sero, respectivamente, 9 mg.L-1 e 90 mg.L-1, conforme determinado pela
reaes qumicas e frmula a seguir.

Iodforos
Os iodforos (Figura 13) so compostos derivados do iodo empregados como
sanitizantes na indstria de alimentos. So formulaes que combinam o iodo e
um agente tensoativo, como a polivinilpirrolidona e um agente veiculador cido.
Para manipuladores, normalmente usa-se uma soluo-tampo formada pelo cido
actico e pelo acetato de sdio, originando uma soluo de uso com pH entre 5 e 6,
de modo a no afetar a mo de manipuladores. J, em equipamentos e utenslios,
o cido utilizado para a veiculao do iodo geralmente o fosfrico. Nesse caso, as
solues sanitizantes diludas apresentam um pH em torno de 2, que otimiza a sua

210

ao antimicrobiana, j que h maior concentrao de I2 livre, a forma bactericida. As


solues diludas de iodforos so usadas numa concentrao entre 10-25 mg.L-1, que
devem ser controladas.

Figura 13 - Estrutura qumica do complexo iodo-nonilfenoletoxilado.

Por conter tensoativo em sua composio, os iodforos apresentam boa ao


de molhagem, de penetrao em fissuras e ranhuras e de espalhamento, alm de facilidade de solubilizao em gua. Alm disso, i) no so afetados pela gua dura, ii)
previnem a formao de incrustaes por ser de natureza cida, iii) sua colorao marrom/castanha um indicativo de nveis de concentrao, iv) sua concentrao facilmente determinada e v) as solues de rotina so facilmente preparadas. No entanto,

bacterianos e bacterifagos, ii) podem causar odores indesejveis em alguns produtos,


iii) causam descolorao em alguns materiais como o plstico, iv) tornam-se menos
eficientes com o aumento do pH e v) so mais caros do que o hipoclorito de sdio.
So eficientes sobre variados grupos de microrganismos, com exceo de esporos e bacterifagos. Esses sanitizantes so utilizados para diminuio da microbiota
das mos de manipuladores de alimentos, sanitizao de equipamentos e utenslios e
diminuio da microbiota ambiental, quando aplicados na forma de nebulizao.
A ao bactericida dos compostos iodados se deve, principalmente, ao I2 liberado a partir dos complexos com agentes tensoativos. As formulaes comerciais
encontram-se na faixa de 0,5 % a 1,75 % de iodo residual livre, expresso em I2. As
solues diludas de iodforos so usadas numa concentrao entre 10-25 mg.L-1.
A concentrao tanto do produto comercial quanto das solues diludas deve ser
controlada por meio de anlises volumtricas de fcil execuo.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

i) esses sanitizantes so menos eficientes do que compostos clorados sobre esporos

cido Peractico
O cido peractico comercial um sanitizante constitudo por uma mistura de
cido peractico, perxido de hidrognio, cido actico e um veculo estabilizante
(Figura 14). Algumas formulaes contm, ainda, um cido orgnico como o octanico. produzido pela reao de cido actico com perxido de hidrognio na
presena de um cido mineral como catalisador, geralmente o cido sulfrico.
211

Figura 14 - Formao do cido peractico.

O cido peractico um agente antimicrobiano mais eficiente do que o perxido


de hidrognio, sendo ativo contra grande espectro de microrganismos. esporicida
em baixas temperaturas e permanece ativo na presena de matria orgnica. Dentre as
vantagens do cido peractico, verifica-se que so excelentes santizantes contra bactrias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos filamentosos e leveduras, vrus e esporos
bacterianos. corrosivo ao ao inoxidvel, mas no h necessidade de ser enxaguados das superfcies, quando as concentraes das solues de uso so corretamente
controladas. amigvel ao meio ambiente, pois os produtos de sua decomposio so
o cido actico e a gua. No so afetados pela dureza da gua, mas possuem baixa

cap.04

estabilidade ao armazenamento, so irritantes pele e s mucosas. So incompat-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

veis com cidos e alcalinos concentrados e borrachas naturais ou sintticas. Na forma


concentrada, em que comercializado, deve ser manuseado com precauo pelos
manipuladores, que devero usar equipamentos de proteo individual.
As solues de cido peractico tm sido crescentemente empregadas nas etapas de sanitizao nas indstrias de alimentos, principalmente laticnios e cervejarias.

Compostos de Amnia Quaternria


So substncias tensoativos catinicas que contm em sua estrutura em tomo de nitrognio ligado covalentemente a quatro grupos alquil ou aril. A frmula
geral das amnias quaternrias est apresentada na Figura 15.

212

Figura 15 - Quaternrios de amnia: a) frmula geral, b) cloreto de estearalcnio, c) cloreto de


benzalcnio.

Esses sanitizantes so eficientes sobre bactrias Gram-positivas e microrganismos termodricos. No entanto, apresentam baixa ao sobre bactrias Gram-negativas. So pouco eficientes contra coliformes e psicrotrficos e ineficientes contra
esporos. So incompatveis com agentes tensoativos aninicos. No so corrosivos
nem txicos. Geralmente, so utilizados para a sanitizao de pisos, paredes e equipamentos e no controle microbiolgico do ar de ambientes de processamento.

A clorhexidina um composto qumico sinttico pertencente srie das


bisbiguanida, apresentando frmula estrutural conforme Figura 16.

Figura 16 - Estrutura qumica de clorhexidina.


O digluconato de clorhexidina a forma deste sanitizante disponibilizada comercialmente em soluo aquosa contendo cerca de 20 % p/v do princpio ativo. Na
indstria de alimentos, a soluo diluda na proporo de 1:2000 o que corresponde

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Clorhexidina

a uma concentrao de 100 mg.L-1 do princpio ativo e origina um pH entre 5 e 8.


Essas solues so eficientes sobre clulas vegetativas de bactrias Gram-negativas e
Gram-positivas. Os compostos base de clorhexidina originam solues aquosas que
podem ser inativadas por sais minerais, como os responsveis pela dureza da gua.
Como no possuem boa ao de molhagem, podem ser formulados com a participao de tensoativos catinicos ou no-inicos. Normalmente, as solues diludas
desse sanitizante no possuem cor nem odor e parecem apresentar baixa toxicidade
em animais. Tambm, no provocam danos pele e s mucosas de manipuladores.
Na indstria de alimentos, as solues diludas de clorhexidina so usadas para
reduo da microbiota de manipuladores e para sanitizao de equipamentos e uten-

213

slios, sendo ainda recomendadas para o controle microbiolgico de salmoura no processamento de queijo. A eficincia desse sanitizante foi constatada na diluio 1:3000,
que corresponde a cerca de 70 mg.L-1 do princpio ativo no tratamento de salmoura e
na superfcie de queijo minas curado. Verificou-se reduo de 96 % na contagem de
aerbios mesfilos e de 70 % na de coliformes totais.

Perxido de Hidrognio
As solues de perxido de hidrognio apresentam forte ao oxidante devido liberao de oxignio, que possui atividade sobre microrganismos Grampositivos e Gram-negativos. O perxido de hidrognio uma composto inorgnico que se caracteriza por conter um par de tomos de oxignio (-O-O-).
Na indstria de alimentos usado como sanitizante quando se encontra nas
concentraes entre 0,3 % e 6 %, pH 4,0, e desde a temperatura ambiente at 80 C,
durante 5 a 20 min de contato. As solues desse agente sanitizante apresentam baixa

cap.04

toxicidade e no requerem enxaguagem. No entanto, so corrosivas ao cobre, zinco

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

e bronze; ii) se usadas em baixas temperaturas, requerem longo tempo de contato;


iii) exigem precauo no manuseio; e iv) a concentrao do princpio ativo deve ser
controlada.
O uso principal do perxido de hidrognio na indstria de alimentos na esterilizao de embalagens de produtos envasados assepticamente. Nessa ltima aplicao, as solues contm cerca de 30 % do principio ativo, apresentado atividade
sobre esporos bacterianos. O perxido de hidrognio participa de formulaes de
sanitizantes base de cido peractico.
Comercialmente, encontram-se solues aquosas de perxido de hidrognio
contendo cerca de 6 %, 12 % ou 30 % de perxido de hidrognio, denominadas
20V, 40V e 100V (volumes), respectivamente.

Oznio
Descoberto em 1840 pelo qumico alemo Christian Schbein, o oznio um
alotrpico de oxignio, naturalmente presente como um gs sem cor e com odor
prprio. Ele produzido na superfcie da atmosfera pela ao da radiao ultravioleta nas molculas de oxignio.
O oznio tem sido utilizado na desinfeco de gua, ar de ambientes de processamento e, tambm, no controle microbiolgico de alguns alimentos. O uso desse sanitizante aconselhvel, por exemplo, quando a clorao origina subrodutos
indesejveis. A eficincia antimicrobiana do oznio dependente da concentrao,
do tempo de contato, do efeito residual e da temperatura de aplicao. Pode ser

214

usado como agente antimicrobiano de duas formas, no estado gasoso ou dissolvido


em gua purificada para produzir gua ozonizada. A forma gasosa produzida por
diferentes mtodos, dependendo da concentrao requerida. Concentraes baixas
de oznio (0,03 mg.L-1) podem ser obtidas pela exposio do ar radiao ultravioleta com lmpadas que emitem 185 nm. Altas concentraes podem ser geradas
no local de uso, pela passagem do ar seco ou do oxignio entre dois eletrodos
separados por um meio cermico dieltrico. A energia do campo eltrico rompe o
O2, formando o oxignio atmico que reage com outro O2, gerando o O3.
A ao antimicrobiana do oznio est associada inativao enzimtica pela
oxidao de grupos sulfidrilas de aminocidos componentes de enzimas e pela liberao de constituintes do citoplasma devido oxidao de lipdeos da membrana
celular. O oznio um efetivo agente antimicrobiano devido ao seu alto poder oxidante (+2,07 volts), comparado com outros oxidantes como perxido de hidrognio
(+1,77, cido hipocloroso (+1,49 volts) e iodo (+0,54) (Quadro 17). altamente
reativo e se decompe rapidamente, produzindo oxignio. Portanto, no pode ser
estocado e deve ser produzido in situ.

Na Frana, o oznio utilizado no tratamento de gua potvel desde 1906.


Aps a aprovao pela FDA, em 26 de junho de 2001, o uso de oznio como agente
antimicrobiano para tratamento, estocagem e processamento de alimentos, a apli-

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Quadro 17 - Caractersticas fsico-qumicas do oznio

cao do oznio expandiu-se para desinfeco de equipamentos, ambientes de produo e reduo de clulas viveis aderidas em superfcies de ao inoxidvel.
O nvel de exposio recomendado para aplicao do oznio em ambientes
foi proposto pela Administrao de Sade e Segurana Ocupacional (OSHA), pelo
Instituto Nacional Americano de Padres (ANSI), pela Conferncia Americana de Higienistas Governamentais para a Indstria (ACGIH) e pela Associao Americana de
Higiene Industrial (AIHA). Os manipuladores no podem ser submetidos ao excesso
de oznio. Na concentrao de 0,2 mg.m-3, o tempo de exposio do manipulador
no pode ultrapassar 8 h por dia de trabalho. Nenhum manipulador de alimentos
ser exposto concentrao de oznio que exceda a 0,6 mg.m-3, por mais de 10

215

min. Esses limites recomendados para concentrao de oznio so maiores do que


as concentraes que podem ser sentidas pelo olfato. Geralmente, pessoas podem
perceber concentrao de 0,02 mg de oznio por m3.
Vrias so as aplicaes desse sanitizante na indstria de alimentos. Pode ser
utilizado em lavagem de alimentos, tratamentos de gua e esgoto, gua de poos
artesianos e torres de resfriamento, sanitizao de vasilhames, sanitizao de superfcies de equipamentos e utenslios, sanitizao de ar de ambientes de processamento de alimentos, no tratamento CIP (Clean in Place) e no tratamento de piscinas
comerciais e residenciais.
O oznio apresenta maior capacidade de oxidao qumica e maior eficincia
antimicrobiana s temperaturas mais baixas e sobre vrus e protozorios, quando
comparados a outros sanitizantes qumicos de uso comum, embora apresente tambm excelente ao antimicrobiana sobre bactrias, fungos filamentosos e levedu-

cap.04

ras (Quadros 18, 19 e 20).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Quadro 18 - Valores de Q10 do oznio em diferentes temperaturas sobre vrus e protozorios

Quadro 19 - Ao do oznio sobre microrganismos

Quadro 20 - Comparao da ao antimicrobiana entre sanitizantes em mg.L-1

216

Associao entre cidos e Tensoativos Aninicos


Formulaes entre cidos inorgnicos e orgnicos com tensoativos tm sido
usadas como sanitizantes. Os cidos actico, ltico, propinico, frmico e fosfrico
so os que mais freqentemente participam dessas formulaes.

lcoois
Os lcoois etlico, proplico e isoproplico so usados como sanitizantes na indstria de alimentos. Dentre esses, o lcool etlico apresenta maior aplicao, sendo
preferencialmente preparado numa concentrao de 70 % do princpio ativo. A essa
soluo, podem ser adicionados 2 % de iodo e 2 % de glicerina para controle da
microbiota de mos de manipuladores de alimentos.

As solues de alcolicas so alternativas viveis para a sanitizao de algumas superfcies, em reas de processamento de alimentos em p, onde o uso de
gua deve ser evitado.

Extrato de Semente de Grape Fruit


O extrato de semente de grape fruit um sanitizante de origem orgnica,
sendo um complexo estabilizado fisicamente e integrado por pequenas concentraes de substncias qumicas naturais. Dentre essas substncias, encontram-se cido ascrbico, cido ctrico, cido palmtico, glicerdeos, tocoferis e aminocidos.
Produtos comerciais contendo cerca de 10 % do princpio ativo so disponibilizados
s indstrias de alimentos. Solues diludas contendo cerca de 400 mg.L-1 desse
extrato so aplicadas em ambientes de processamento, instalaes, equipamentos
e utenslios.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Na concentrao de 70 %, o sanitizante tem ao antimicrobiana mais eficiente,


pela desnaturao protica e remoo de lipdeos da membrana celular dos microrganismos. Em concentraes mais elevadas, por exemplo, 95 % de sua eficincia
diminui, pois atua somente por desidratao das clulas microbianas.

Derivados do Fenol
O uso do fenol como agente antimicrobiano data dos meados do sculo XIX,
na desinfeco em procedimentos cirrgicos. O fenol uma substncia cristalina,
incolor, muito solvel em gua, mas de difcil manipulao. Solues aquosas contendo 2 a 5 % podem ser usadas na desinfeco de equipamentos contaminados.
Este sanitizante altera a permeabilidade da membrana celular, permitindo a sada de
alguns constituintes celulares essenciais, como os aminocidos. Alguns compostos
fenlicos so excelentes fungicidas, mas apresentam baixa eficincia sobre esporos
bacterianos e vrus. Deve-se mencionar o fato, no entanto, que atualmente existem
alternativas de sanitizantes mais adequadas indstria de alimentos.

217

Vrios outros derivados de fenol com uma atividade antimicrobiana mais eficiente foram obtidos por sntese qumica. Dentre eles incluem-se os cresis (orto,
meta e para), o hesilresorcinol, o hexaclorofeno e o irgasan.

cap.04

Dentre esses, o hexaclorofeno destacou-se pelo uso na desinfeco de mos


por um extenso perodo, como participante de formulaes de sabes. Em concentraes entre 0,75 % e 3 %, o hexaclorofeno apresenta eficcia, econmico e
no irrita a pele. Pesquisas revelaram, no entanto, que formulaes testadas com
ou sem este bactericida mostravam pouca diferena na reduo de bactrias na
superfcie de mos. Foi constatada, ainda, que a reduo bacteriana era mais notada
aps uso contnuo e que o efeito redutor desaparecia quando uma recontaminao
intensa ocorria. Posteriormente, a observao sobre a possibilidade de absoro
atravs da pele e de toxicidade do hexaclorofeno, inclusive com possibilidade de ser
cancergeno, resultou na limitao do seu uso.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Irgasan e triclosan so os nomes comerciais de um derivado fenlico normalmente constituinte de formulaes detergentes com atividade sanitizante indicado
para higienizar mos de manipuladores de alimentos. Este sanitizante, o 2,4,4tricloro 2-hidroxidifenil ter, apresenta um largo espectro de ao antimicrobiana e vasto campo de aplicao. A ao do irgasan/triclosan ocorre em nvel de membrana
citoplasmtica e para assegurar rpida destruio bacteriana o sanitizante tem sido
formulado com agentes tenso-ativos apropriados.
Um fato histrico em relao ao fenol merece registro. Este agente qumico foi
utilizado como antimicrobiano padro, quando se desenvolveu, no incio do sculo
XX, a primeira tcnica laboratorial para avaliar a eficincia de sanitizantes. Modificaes ocorreram, mas ainda hoje, o princpio desta metodologia, conhecida como
teste do coeficiente fenlico, basicamente a mesma: comparar a ao microbiana
de um determinado agente qumico contra uma soluo padro de fenol. No h
dvidas, no entanto, que outras tcnicas mais apropriadas para avaliar sanitizantes foram desenvolvidas, mas a determinao do coeficiente fenlico um mtodo
padronizado recomendado pela AOAC (American of Official Analytical Chemists) e
tambm usado no Brasil pelo INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade
em Sade) da FIOCRUZ (Fundao Osvaldo Cruz).

3. Avaliao da Eficincia do Procedimento de Higienizao


A higienizao deve ser avaliada periodicamente de forma a garantir a pro218

duo de alimentos seguros, devendo-se adotar medidas corretivas em casos de


desvios desses procedimentos. Os resultados dos testes podem ser comparados
com as especificaes ou as recomendaes de rgos oficiais ou por entidades
cientficas conceituadas, como a American Public Health Association (APHA), a
Organizao Mundial de Sade (OMS) e a Organizao Pan-Americana de Sade
(OPAS). Em funo dos resultados, mantm-se as tcnicas de higienizao adotadas
ou so tomadas medidas corretivas.
Quando um procedimento qualquer de higienizao, durante o processamento
de alimentos, no eficiente ou falho, o primeiro indcio do problema pode ser o
aumento nos nmeros de contaminantes microbianos, o que refora ainda mais a
importncia da implantao de um programa de monitoramento pelas indstrias de
alimentos. Por isso, a escolha de um mtodo adequado deve estar de acordo com a
situao especfica, considerando-se o tipo de alimento processado.
Um dos principais fatores que influenciam a escolha do mtodo para a avaliao de superfcies na indstria o tipo de microrganismo contaminante, em razo
das condies de sobrevivncia de sua concentrao esperada. Alm disso, influen-

de ranhuras e de resduos de detergentes, de sanitizantes e de alimentos.


No h uma metodologia universal para a avaliao microbiolgica na indstria.
Entretanto, pela combinao de metodologias, possvel verificar as condies higinicas durante o processamento dos alimentos. Como em qualquer anlise, o sucesso
e a eficincia do mtodo dependem do conhecimento prvio sobre distribuio e
adeso bacteriana, sobrevivncia e recuperao de microrganismos estressados.
A indstria de alimentos deve propor limites de segurana que devero ter um
sistema de monitoramento, de medio e de registro com freqncia definida para
assegurar que o procedimento ser efetivo e o que foi estabelecido ser alcanado.
Dentro dos limites estabelecidos, pode-se considerar que os perigos qumicos, fsicos e ou microbiolgicos sero controlados. Dentre esses controles esto includos,
por exemplo: i) as concentraes (mg. L-1) dos princpios ativos das solues saniti-

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

ciam tambm a topografia e as condies das superfcies, que envolve a presena

zantes; ii) as concentraes dos detergentes; e iii) as recomendaes de qualidade


microbiolgica estabelecida com critrio tcnico para superfcies higienizadas, ambientes de processamento, manipuladores e de equipamentos.
Como exemplo, especificaes para a avaliao microbiolgica para manipuladores de equipamentos, utenslios e ar de ambientes de processamento so sugeridas abaixo (Quadro 21).
Quadro 21 - Algumas especificaes microbiolgicas no proessamento de alimentos
219

Os limites crticos devem ser monitorados por tcnicas convencionais e, ou,


de desenvolvimento recente, desde que sejam recomendadas por entidades oficiais ou por entidades de reconhecida competncia como a Association Official of
Analytical Chemists (AOAC) e American Public Health Association (APHA). Normalmente, so os testes em uso que melhor avaliam o procedimento de higienizao. Esses testes consistem em remover microrganismos das superfcies de mos,
equipamentos e utenslios. Em seguida, os microrganismos so recuperados em
meios de cultura e em condies de incubao apropriadas. No caso do ar de
ambientes de processamento, coletam-se os microrganismos usando tcnicas de
sedimentao ou por aspirao de determinados volumes de ar sobre as superfcap.04

cies de meios de culturas apropriados.

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3.1. Teste do Swab


O teste do swab considerado como classe O pela APHA, ou seja, uma metodologia-padro de anlise microbiolgica. Desenvolvido em 1917 por Manheimer
e Ybanez, o mtodo mais antigo e utilizado para a avaliao das condies microbiolgicas ambientais.
Essa tcnica consiste em friccionar um swab esterilizado e umedecido em
soluo diluente apropriada, na superfcie a ser avaliada, com o uso de um molde
esterilizado que delimita a rea amostrada, por exemplo 100 cm2. Aplica-se o swab
com presso constante, em movimentos giratrios, numa inclinao aproximada
de 30, descrevendo movimentos da esquerda para a direita inicialmente e depois
de baixo para cima. A parte manuseada da haste do swab deve ser quebrada na
borda interna do frasco que contm a soluo da diluio, antes de se mergulhar o material amostrado com os microrganismos aderidos. O diluente , ento,
examinado por plaqueamento de alquotas em meio de cultura apropriadas, e o
resultado dado por UFC.cm-2 de superfcie.
Para as mos de manipuladores, a remoo de microrganismos ocorre numa
rea correspondente s superfcies das palmas e bordas das mos, partindo da regio dos punhos. De forma angular, o swab passado com movimentos giratrios
da parte inferior das palmas at a extremidade dos dedos e voltando ao punho, repetindo-se esse procedimento trs vezes na direo de cada dedo. Os movimentos
nas bordas so do tipo vai e vem, de modo a avanar em um dos lados da mo onde
as linhas dos punhos se iniciavam, passando depois entre os dedos, e no final, no

220

outro lado da mo, encontrando-se de novo com as linhas dos punhos.


Os swabs podem ser usados em superfcies irregulares e curvas. Devem ter
cerca de 12 cm de comprimento de haste, com a parte absorvente (algodo) com
aproximadamente 2 cm de comprimento e 0,5-1,0 cm de dimetro. A facilidade de
remoo dos microrganismos da superfcie depende da textura desta, de sua natureza e do tipo de microrganismo presente.
Os swabs com alginato de clcio tm a vantagem de liberar os microrganismos
para o diluente pela dissoluo do alginato. Embora o alginato e componentes dissolvidos no meio de diluio possam inibir o crescimento microbiano, esses swabs
tm bom desempenho. Nos swabs de algodo, os microrganismos podem ficar
aderidos as fibras deste e subestimar as contagens.
Em situaes onde se deseja verificar a eficincia de procedimentos de higienizao e sanitizao, agentes neutralizantes especficos devem ser adicionados ao
diluente. Para sanitizantes que atuam por oxidao, como cloro, iodo e cido peractico, recomenda-se como neutralizante soluo de tiossulfato de sdio 0,25 %. Para

tween 80 a 2 % so sugeridas Alm disso, na literatura encontram-se recomendaes


para uso do que se denomina neutralizante universal, cuja composio capaz de
neutralizar qualquer tipo de resduo de sanitizante usado. Mesmo com limitaes, o
swab um mtodo rpido, simples e barato de verificao das condies higinicas
ambientais.

3.2. Tcnica da Rinsagem


O mtodo de rinsagem consiste em remover os microrganismos das superfcies, usando-se a tcnica da lavagem superficial, com certo volume de diluente.
Posteriormente, determina-se a populao bacteriana da soluo de rinsagem, pelo
plaqueamento de uma alquota ou por tcnicas de filtrao. Geralmente, volumes
de 20, 50 e 100 mL so utilizados nessa tcnica, dependendo do equipamento ou da

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

outros sanitizantes como amnia quaternria e clorhexidina, solues de lecitina ou

superfcie a ser avaliada. uma tcnica indicada para superfcies irregulares.

3.3. Placas de Contato


As placas de contato para a anlise microbiolgica so indicadas para superfcies
planas, envolvendo a impresso de um meio de cultura slido contra a superfcie.
Para a remoo dos microrganismos, um contato de 5 segundos sob presso do meio
com a superfcie a ser avaliada suficiente para uma boa remoo das clulas das
superfcies. Aps a incubao das placas, as unidades formadoras de colnia so
contadas, a fim de avaliar as condies microbiolgicas da superfcie amostrada.
As placas de contato Replicate Organism Direct Agar Contact (RODAC) dispo-

221

nveis comercialmente so preenchidas com uma camada de 15,5 a 16,5 mL de meio


de cultura, que ultrapassa a borda da placa de Petri, permitindo o contato facilitado
do meio de cultura com a superfcie analisada. Com 100 cm2 de rea, essas placas
fornecem boa avaliao das condies higinicas da superfcie e so muito utilizadas, pela facilidade e convenincia de uso. o mtodo de escolha para superfcies
midas, firmes e no porosas. Foram desenvolvidas por Hall e Hartnett em 1964 e
so ineficazes para superfcies muito contaminadas, exceto quando esse problema
minimizado pelo uso de meios seletivos de anlise.
Estudos mostram que o mtodo RODAC remove somente cerca de 0,1 % da
microbiota da superfcie. Isso sugere que 101 UFC.cm-2 detectados so referentes a
uma contaminao real de aproximadamente 104 UFC.cm-2 .
Quando superfcies de ao inoxidvel foram contaminadas por esporos de
Bacillus subtilis, 41 % dos esporos foram removidos pelas placas RODAC e 47 % pelo

cap.04

mtodo de swab. Em outro estudo, swabs tiveram melhor desempenho em relao s

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


222

placas RODAC, quando a contaminao era superior ou igual a 100 UFC/21-25 cm. Mas
com contagens menores, as placas de contato mostraram melhores resultados.
Para superfcies curvas ou com ranhuras, as placas Petrifilm comercializadas
pela empresa 3M podem ser utilizadas para a avaliao por contato direto. Essas
placas contm uma camada de meio de cultura na forma de gel, em um filme flexvel, com um indicador para facilitar a enumerao das colnias. Aps a hidratao
assptica do gel com 1 mL de soluo de diluio esterilizada, a placa pode ser,
ento, pressionada contra a superfcie a ser avaliada, sendo posteriormente incubada de forma usual. Uma vantagem dessa tcnica que o gel pode ser moldado,
comprimindo-o contra a superfcie curva.
O uso de neutralizantes no meio de cultura utilizado nas placas de contato
tambm se faz necessrio quando a eficincia de processos de higienizao e sanitizao est sendo avaliada.

3.4. Sedimentao de Microrganismos do Ar em Meio Slido


A tcnica da sedimentao simples consiste basicamente em expor uma placa
de Petri contendo meio de cultura solidificado por determinado tempo e posterior
incubao nas condies apropriadas ao microrganismo que se deseja avaliar. Nesse
caso, h a necessidade da deposio das partculas viveis sobre o meio de cultura. O
resultado expresso em UFC.cm-2.semana-1. Para isso, para se expressar o resultado
nessa forma, deve-se considerar o tempo de exposio, a rea da placa de Petri e o
nmero de colnias contadas aps o tempo de incubao. De acordo com recomendao da APHA, o tempo de exposio de 15 min e a rea de placa, de 65 cm2, pois
geralmente o dimetro das placas de Petri mede 91 mm. Veja o exemplo em que,
aps a incubao, foram enumeradas 30 colnias. Trinta colnias em 15 min equivalem uma semana: 30x4x24x7. Dividindo esse valor por 65, determina-se o nmero de
microrganismos sedimentados por cm2 em uma semana.

3.5. Mtodo da Seringa com Agar


Neste mtodo, o meio de cultura apropriado aos microrganismos sob avaliao
adicionado a uma seringa ou um tubo de plstico, onde o meio solidifica-se. Aps o
contato do meio com a superfcie, corta-se com uma esptula esterilizada uma fatia de
aproximadamente 1 cm de espessura desse meio, que coletado numa placa de Petri
para a incubao adequada. As vantagens e desvantagens desse mtodo so semelhantes quelas j mencionadas para as placas RODAC. Normalmente, devem-se amostrar
no mnimo cinco impresses, ou seja, coletam-se cinco fatias. O resultado expresso em
UFC.cm-2. A rea de cada fatia determinada pela equao: A = 3,1416xr2, em que A =
rea de contato do meio com superfcie , r = raio fatia de meio de cultura, em cm.

Este mtodo consiste em usar esponjas de poliuretano, esterilizadas, de dimenses aproximadas de 13x7,5x4 cm, para a remoo dos microrganismos. A coleta
dos microrganismos realizada com o auxlio de uma bolsa esterilizada de plstico
com dimenses aproximadas de 30x40 cm. No ato da coleta, a bolsa de plstico ser
utilizada como uma luva. Assim, a superfcie externa da bolsa entra em contato com
a pele da pessoa que vai efetuar a coleta. Vestido com a luva, tira-se uma esponja
que ser friccionada de forma adequada na superfcie que se deseja avaliar. s vezes,
necessrio umedecer a esponja com gua peptonada esterilizada, principalmente
quando a superfcie estiver muito seca. Aps a coleta, retira-se a luva, retornando-a
posio original, com a face esterilizada para dentro e contendo a esponja com os
microrganismos removidos da superfcie. A partir da, usa-se o procedimento convencional para as contagens microbianas: os microrganismos so retirados da esponja
usando-se solues diluentes, que sero plaqueadas em meios de cultura, sendo as
placas incubadas em condies apropriadas. O resultado expresso em UFC.cm-2.

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

3.6. Mtodo da Esponja

3.7. Impresso de Microrganismos do Ar em Meio Slido


Quando se usa a tcnica do amostrador ar, h uma suco de determinado
volume de ar que provoca impresso das partculas viveis na superfcie do meio
de cultura solidificado, contido em placa de Petri inserida em local apropriado no
mostrador. Os resultados so expressos em UFC.m-3.
Aps cada coleta, as placas removidas do amostrador so tampadas, invertidas e incubadas sob condies ideais para cada determinao, sendo 30 C/3-5 dias
para fungos filamentosos e leveduras e 35 C/48 h para mesfilos aerbios.
A contagem de colnias corrigida por meio de uma tabela desenvolvida e
baseada no clculo de probabilidade estatstica total, conforme mostrado a seguir:

223

cap.04

Essa correo reflete a pressuposio de que quanto maior o nmero de partculas viveis impressas na placa, menor a probabilidade de as prximas partculas
passarem em orifcios vazios, subestimando a contagem. Dessa forma, o nmero de
UFC por volume de ar em m3 pode ser determinado (ANDERSEN, 1958).

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224

3.8. Tcnica do ATP-Bioluminescncia


Tambm, as condies higinicas das superfcies para o processamento de
alimentos podem ser avaliadas pela quantidade de ATP presente nessas superfcies.
Quanto maior a concentrao de ATP, pior a condio higinica das superfcies.
Existem comercialmente equipamentos que se fundamentam na tcnica do ATP-bioluminescncia, que expressam resultados em Unidades Relativas de Luz (URL), que
esto relacionadas quantidade de luz formada entre o ATP presente na superfcie e
o complexo enzimtico luciferina e luciferase (Figura 17). Por exemplo, determinado
equipamento informa que superfcies que apresentam at 150 URL encontram-se
em condies higinicas adequadas, de 151 at 300 URL em condies de alerta e
acima de 300 URL em condies higinicas insatisfatrias.

Figura 17 - Reao enzimtica na formao de luz na tcnica do ATP-bioluminescncia.

ANDERSEN, A.A. New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable airborne particles.
Journal of Bacteriology, Washington, D.C., v. 76, p. 471-484, 1958.
ANDRADE, N.J.; MACDO, J.A.B. Higienizao na indstria de alimentos. So Paulo: Editora Varela,
1996. 182 p.
ANTUNES, M. A . Sistema de apoio deciso para procedimentos de higiene para Unidade de Alimentao e Nutrio. Dissertao ( Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Departamento
de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viosa, Viosa, MG. 2003.
APHA - Standard methods for the examination of dairy products. 16th. ed. Washington, D.C.: Richardson, G.H. American Public Health Association,1985.
BRASIL. Ministrio da Sade. Portaria 518, de 25 de maro de 2004. Estabelece os procedimentos e
responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e
seu padro de potabilidade e d outras providncias. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 26 de maro de
2004. 2004
BRASIL. Leis e Decretos, etc., Resoluo CONAMA no 357, de 17 de maro de 2005. Dispe sobre
a classificao dos corpos de gua e diretrizes ambientes para seu enquadramento, bem como
estabelece condies e padres de lanamento de efluentes e d outras providncias. 2005

Controle da Higienizao na Indstria de Alimentos

Referncias

CARDOSO, R. C.; CHAVES, J. B. P.;. ANDRADE, N. J.; TEIXIERA, M. A. Avaliao da eficincia de


agentes sanficantes para mos de manipuladores de alimentos em servios de alimentao. Higiene
Alimentar, v. 10 p.17-22, 1996
COSTA, P. D. Avaliao da tcnica de ATP-bioluminescncia no controle do procedimento de higienizao na indstria de laticnios. 2001. 63f. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viosa, Viosa, MG.
COSTA P. D.; ANDRADE, N. J.; SOARES, N. F. BRANDO, S. C. C. ATP-bioluminescence assay as
an alternative for hygiene-monitoring procedures of stainless steel milk contact surfaces. Brazilian
Journal of Microbiology, v.37 p345-349, 2006
GRAHAM, D. W. Use of ozone for food processing. Food Technology, v. 51, p. 72-75, 1997.
GREENBERG, A . E.; CLESCERI, L. S.; EATON, A . D. ed. Standard methods examination of water and
wastewater. 18th , APHA, Washington, D.C, 1992.

225

HAWRONSKYJ, J. M. e HOLAH, J. ATP universal hygiene monitor. Trends in Food Science and Technology. v. 8, p. 79-84, 1997.
FIELDING, L., BAILEY R. Ozone decontamination in hygiene management. In: LELIEVELD, H. L. M.,
MOSTERT, M. A., HOLAH, J. (Ed.) Handbook of hygiene control in the food industry. 1st ed., chapter
31, p. 507-515, 2005.
HAYES, P.R. Food microbiology and hygiene. 2nd ed. London: [S.l.], 1995. 515p
HEDRICK, T.I.; HELDMAN, D.R. Air quality in fluid and manufactured milk products plants. Journal of
Milk and Food Technology, Alban, N.Y., v. 32, p. 265-269, 1969.
HELDMAN, D.R.. Significance and Control of Airborne Contamination in Milk and Food Plants. Journal
Milk Food Technology. 30, p 13-17. 1967
HELDMAN, D.R. Factors influencing air-borne contamination of foods. A review. Journal of Food
Science, Chicago, I.L., v. 39, p. 962-969, 1974.
KANG, Y.J.; FRANK, F.J. Biological aerosols: a review of airborne contamination and its measurement
in dairy processing plants. Journal of Food Protection, Des Moines, I.A., v. 52, p. 512-524, jul.1989.
KANG, Y.J.; FRANK, F.J. Characteristics of biological aerosols in dairy processing plants. Journal of
Dairy Science, Champaing, I.L., v. 73, p 621-626, 1990.

cap.04

LUTGRING, R.K. et al. Distribution and quantification of bioaerosols in poultry-slaughtering plants.


Journal of Food Protection, Des Moines, v. 60, p 804-810, 1997.

MACHER, M.J. Air sampling methods for biological contaminants. Net. U.S.A., 2000. Disponvel em:
<http://anderseninstruments.com/Macher.htm>. Acesso em mar./2001.
MARTINS, A. D.O. Eficincia do cido peractico sobre esporos de Bacillus sporothermodurans.
Viosa, MG: UFV, 2001.67p. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos)-Universidade Federal de Viosa, 2001.
MEHTA, S.K.; MISHRA, S.K.; PIERSON, D.L. Evaluation of three portable samples for monitoring
airborne fungi. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, D.C., v. 62, p. 1835-1838, maio
1996.
MERCK, http://www.merck.com.tw/ Microbial Air Monitoring- MAS 100 Air Sampler-Techinical Information, p. 1-2. 2001
OTTAVIANI, F. Detection and control of fungal contamination of the air. Experience and methodological proposals. Tecnologie Alimentari, Itlia, v. 5, p. 16-26, 1982.
OTTAVIANI, F.; FRANCESCHETTI, E. Air-borne moulds in the dairy industry - Review. Latte, Milan, v. 7,
p. 446-455, 1982.
OVIEDO, M. T. P. Resistncia de psicrotrfico acidificante isolado de leite cru a agentes sanitizantes, Viosa, MG: UFV, 1996. 51p. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos)-Universidade Federal de Viosa, 1996.
RADMORE, K.; HOLZAPFEL, W.H.; LUCK, W. Proposed guidelines for maximum acceptable airborne
microorganism levels in dairy processing and packaging plants. Internacional Journal of Food Microbiology, Amsterdamn Netherlands, v. 6, p. 91-95, 1988.
REN, T.J.; FRANK, F.J. A survey of four fluid milk processing plants for airborne contamination using
various samplig methods. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 55, p 38-42, jan.1992a.
REN, T.J.; FRANK, F.J. Measurement of airborne contamination in two commercial ice cream plants.
Journal of Food Protection, Des Moines, v. 55, p 43-47, 1992b.
REN.T.J. e FRANK,F.J., Sampling of Microbial Aerosols at Various Locations in Fluid Milk and Ice
Cream Plants. Journal of Food Protection, v. 55, p 279-283. 1992.
SALUSTIANO, V.C. Avaliao da microbiota do ar de ambientes de processamento em uma industria de laticnios e seu controle por agentes qumicos. 2002 48p. Tese ( Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos.) Universidade Federal de Viosa, Viosa,MG
RESTAINO, L., FRAMPTON, E. W., HEMPHILL, J. B., PALNIKAR, PAUL. Efficacy of ozonated water
against various food-related microorganisms. Applied and Environmental Microbiology, v. 61, p.
3471-3475, 1995.
SILVA, R.M.M. Especificaes Microbiolgicas para Ambientes, Manipuladores e Equipamentos em
restaurantes industriais. Editora UFV. Universidade Federal de Viosa. 69p 1996 (Dissertao de mestrado)
SMILANICK, J. L. Use of ozone in storage and packing facilities. Disponvel em: <http://postharvest.
tfree.wsu.edu/PC2003H>. Acesso em: 01 dez. 2006.
SULLIVAN, J.J. Air microbiology and dairy processing. Australian Journal of Dairy Technology, Highett Victoria, v. 34, p. 133-138, 1979.
SUSLOW, T. V. Basics of ozone applications for postharvest treatment of fresh produce. Disponvel
em: <http://www.ozonio.com.br/water_desinfection1891.pdf>. Acesso em: 28 nov. 2006.
SVEUM, W. H.; MOBERG, L. J.; RUDE, R. A .; FRANK, J. F. Microbiological monitoring of the food
processing environment. In: VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESSER, D. F. (Eds). Compendium of methods for the microbiological examination of foods. 3rd ed., APHA, Washington, DC, 1992, 51-74.
VICKERS, V.T. Control of airborne contamination in dairy processing plants. New. Zealand Journal of
Dairy Science Technology, v. 21, p. 89-98, 1986.
WICKRAMANAYAKE, G. B.; SPROUL, O. J. Kinects of the inactivation of microorganisms. In: Block,
S. Disinfection, Sterilization and Preservation, chapter 5; p.72-84, 1991

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05

1.

Introduo

2.

Os Fatores do Crescimento Microbiano e o Processamento de


Alimentos
2.1. Fatores do Crescimento Microbiano
2.2. Alguns Aspectos de Processamento versus Fatores do Crescimento

3.

Avaliao de Surtos de Doenas de Origem Alimentar


3.1. Microrganismos Patognicos
3.2. Elucidao de Surtos

4.

Concluso

5.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Maria do Socorro Rocha Bastos
Lcia Helena de Freitas
Patrcia Campos Bernardes

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Informaes sobre fatores do crescimento microbiano so fundamentas para a


definio da melhor maneira de processar um alimento.

1. Introduo
O homem durante sua vida est sujeito a contrair um nmero elevado de
doenas de origem alimentar. Cerca de 250 diferentes doenas podem ser veiculadas ao homem por alimentos contaminados (CDC 2006). Apesar da evoluo
dos conhecimentos sobre os microrganismos, dos mecanismos de intoxicaes e
das tcnicas de higienizao, tem-se observado ainda a ocorrncia de um nmero
elevado de surtos e de casos dessas doenas. Isso se deve, principalmente, a
eventuais alteraes nos mtodos de processamento de alimentos que resultam
em menor controle microbiolgico e a comercializao de grande nmero de alimentos prontos para o consumo.
Dentre os agentes etiolgicos das doenas de origem alimentar que podem
contaminar os alimentos desde o campo at a mesa do consumidor, incluem-se as
bactrias, os fungos, os agentes qumicos, os parasitas, os vrus e as substncias
txicas de origens animal e vegetal. Agentes qumicos, como metais pesados, parasitas, incluindo Tricnela spiralis e Entamoeba histolytica, Giardia lamblia e Cryptosporidium spp. e, ainda, vrus, como o da hepatite, so incriminados em alguns
surtos de doenas alimentares. No entanto, no h dvidas de que so as bactrias

228

os principais agentes etiolgicos das doenas causadas por alimentos, sendo responsveis por cerca de 70 % dos surtos e 95 % dos casos (Quadro 1).
Quadro 1 - Etiologia dos surtos e casos de doenas de origem alimentar

Os principais fatores que contribuem para os surtos de origem alimentar so


a temperatura inadequada de armazenagem, tempo e temperatura de cozimento
incorretos, equipamentos e utenslios contaminados, matria-prima de qualidade
insatisfatria e ms condies higinicas dos manipuladores (Quadro 2).
Alm disso, podem contribuir no aparecimento de surtos de intoxicaes alimentares: o preparo de alimentos com muita antecedncia ao momento de servir,

alimentos contaminados veiculando microrganismos para outros em boas condies higinicas; e a adio de ingredientes contaminados a alimentos j cozidos,
sem reaquecimento.
Quadro 2 - Principais causas de surtos de doenas de origem alimentar

importante frisar que a maioria desses problemas pode ser controlada. Sem
dvida, a conscientizao dos manipuladores, dos processadores, enfim, daqueles
que de uma forma ou de outra trabalham com alimentos contribui para evitar ou
diminuir os surtos de doenas causadas por alimentos.
Com relao aos locais de produo, sabe-se que cerca de 40 % dos surtos de doenas veiculadas por alimentos ocorrem em servios comunitrios de

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

sem condies adequadas de armazenagem; a contaminao cruzada, ou seja,

alimentao, como servios de alimentao e nutrio. No entanto, os alimentos


industrializados so responsveis por aproximadamente 5 % dos surtos. No entanto, deve-se observar que a possibilidade de esses alimentos contaminarem grande
nmero de pessoas maior, considerando-se que podem ser distribudos em di-

229

ferentes regies de um pas. Nos ltimo anos, o nmero de surtos por contaminao de alimentos em cozinhas domsticas tem aumentado consideravelmente,
atingindo, s vezes, 50 %.
A postura do profissional da rea de alimentos deve ser eminentemente preventiva, no sentido de evitar que os surtos de doenas por alimentos ocorram.
Para isso, fundamental ter e usar conhecimentos de processamento de alimentos, de controle de qualidade, de microbiologia de alimentos e de higienizao
industrial, entre outros.
No entanto, mesmo tomando-se todas as precaues, existe o risco de que os
alimentos venham causar doenas, seja por acidentes, seja por outro motivo. Por
isso, o profissional da rea de alimentos deve estar preparado para ter condies
de avaliar as causas e determinar o agente etiolgico responsvel pela doena.

cap.05

Deve-se, ainda, saber tomar medidas para evitar que novos surtos aconteam.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2. Os Fatores do Crescimento Microbiano e o Processamento de


Alimentos
2.1. Fatores do Crescimento Microbiano
O conhecimento sobre os fatores que afetam o crescimento microbiano importante no controle de doenas de origem alimentar. Esses fatores so classificados
em intrnsecos e extrnsecos. A atividade de gua, o pH, o potencial de oxirreduo,
a composio dos alimentos e substncias antimicrobianas naturalmente presentes
so fatores intrnsecos, ou seja, inerentes aos alimentos. J, temperatura de armazenamento, a umidade relativa, presena e concentraes de gases e a competio
entre microrganismos so fatores extrnsecos.

2.1.1. Fatores Intrnsecos


2.1.1.1. Atividade de gua (AA)
A atividade de gua um importante fator do crescimento microbiano. Ela define
a quantidade de gua disponvel ao desenvolvimento dos microrganismos. A atividade de gua a razo entre a presso de vapor de gua no alimento e a presso de
vapor da gua pura a 25 C. Por exemplo, esse fator intrnseco, cujos valores esto
entre 0 e 1, determina a possibilidade de desenvolvimento de bactrias patognicas
ou produo de suas toxinas. Assim, S. aureus se desenvolve numa atividade de gua
de 0,86, mas a produo de sua toxina ocorre em valores de 0,90. Dependendo do

230

tipo de C. botulinum e em alimentos com pH superior a 4,6, a toxina produzida em


AA de 0,93, enquanto o desenvolvimento do microrganismo j ocorre a 0,90. Outros
patgenos, como Salmonella spp., E. coli, Shigella spp., exigem AA acima de 0,95
para se multiplicarem nos alimentos, e atingir nveis que provoquem as doenas. No
entanto, sabe-se que, geralmente, as bactrias exigem AA maior do que leveduras.
Estas, porm, so mais exigentes do que os fungos (Quadro 3).
De acordo com os valores de AA, os alimentos apresentam a seguinte classificao: i) alimentos com AA acima de 0,86; ii) alimentos com AA entre 0,60 e 0,86; e
iii) alimentos com AA abaixo de 0,60.
Os alimentos que apresentam AA acima de 0,86 incluem os leites comerciais,
a maioria dos queijos, as frutas, os vegetais, as carnes bovina, suna e de aves, os
peixes, pudins e ovos, entre outros.
Esses alimentos permitem o crescimento de todas as formas microbianas. Assim, podem se desenvolver bactrias, leveduras e fungos filamentosos alteradores
de alimentos. Tambm, h condies potenciais para a multiplicao de bactrias
patognicas e fungos filamentosos micotoxignicos.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Quadro 3 - Atividade de gua para crescimento e produo de toxinas de alguns microrganismos

231

Os alimentos com AA entre 0,60 e 0,86 tambm so conhecidos como alimentos com atividade de gua intermediria. Nesse grupo de alimentos, esto as carnes
curadas, os queijos duros, como o parmeso, o mel, as farinhas lcteas, o doce de
leite e o leite condensado, entre outros. Nesses alimentos no h crescimento de
bactrias patognicas, mas eles so passveis de alteraes por bactrias halfilas,
leveduras osmoflicas e fungos filamentosos xerfilos. As bactrias haloflicas so
capazes de crescer em altas concentraes de sal at valores de AA prximo de
0,75. As leveduras osmoflicas crescem em altas concentraes de acar, como no

cap.05

doce de leite ou leite condensado. J os fungos filamentosos xerfilos so capazes

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

de se desenvolverem em alimentos com baixos teores de gua. Dentre os fungos


filamentosos xerfilos alguns so micotoxignicos. No entanto, para que haja a produo de micotoxinas os valores de AA devem ser superiores a 0,80.
Os cereais, o leite em p desnatado ou integral, as frutas secas, o caf em p,
o acar, os biscoitos e vrios tipos de condimentos esto dentre os alimentos que
apresentam AA abaixo de 0,60. So produtos microbiologicamente estveis, sem
a possibilidade de crescimento microbiano. No entanto, nesses alimentos a sobrevivncia das clulas vegetativas de bactrias e de fungos filamentosos e leveduras
varivel, podendo estender-se de dias a meses, ao passo que os esporos bacterianos podem permanecer viveis durante anos. Por isso, esses produtos podem
veicular microrganismos quando so usados como ingredientes de outros alimentos, como o caso do acar e condimentos. Tambm, podem-se tornar perecveis
e veicular patgenos se antes de consumidos forem reidratados e permanecerem
em condies favorveis ao desenvolvimento microbiano, como acontece, por
exemplo, com o leite em p.

2.1.1.2. pH
Os valores de pH dos produtos alimentcios tambm apresentam grande importncia na determinao dos possveis microrganismos presentes. Em razo desses
valores, os alimentos so classificados como muito cidos, quando apresentam pH
abaixo de 3,7, cidos em valores entre 3,7 e 4,6, de mdia acidez entre 4,6 e 5,3
e, ainda, de baixa acidez quando acima de 5,3. Em processamento de alimentos, o

232

pH 4,6 relevante, pois abaixo desse valor no h desenvolvimento de Clostridium


botulinum. Alm disso, o tipo de processamento para determinado produto definido
levando-se em considerao o pH. Por exemplo, alimentos de baixa acidez e com alta
AA recebem o tratamento da esterilizao comercial, quando possvel.
De forma similar AA, as bactrias geralmente necessitam de pH mais alto do
que as leveduras para se desenvolverem. No entanto, os fungos so os microrganismos que crescem em menores valores de pH (Quadro 4).

2.1.1.3. Potencial de Oxirreduo


O potencial de oxirreduo (Eh) um fator intrnseco dos alimentos que associado a outros fatores afeta o desenvolvimento microbiano. Esse fator medido
por eletrodos ou corantes apropriados, e sua unidade o milivolt (mV). De acordo
com a composio do alimento e a atmosfera que o envolve, o potencial redox pode
variar de oxidante a redutor. Embora o oxignio seja de grande importncia, o Eh
determinado pelo equilbrio entre os agentes oxidantes e redutores presentes nos
alimentos.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Quadro 4 - Valores de pH para o desenvolvimento de alguns microrganismos

Os microrganismos se desenvolvem em determinadas faixas de potencial redox. Assim, os aerbios estritos usam o oxignio como aceptor final de eltrons.

233

Dependendo de diversas condies, as bactrias aerbias crescem numa faixa que


varia de +100 at -100 mV.
Dentre os aerbios, encontram-se bactrias, fungos alteradores e patognicos
e, ainda, leveduras alteradoras. So exemplos de aerbios: Bacillus subtilis que se
desenvolve na superfcie de po, Pseudomonas fluorescens que produz limosidades
em superfcies de carnes e os diversos fungos micotoxignicos como Aspergillus
flavus produtor da aflatoxina em alimentos.
J os anaerbios facultativos utilizam o oxignio e tambm substncias qumicas
orgnicas ou inorgnicas, por exemplo, nitratos e sulfatos, como aceptores finais de
eltrons. Freqentemente, devido grande diversidade de metablitos produzidos, so
responsveis por alteraes em produtos de baixo Eh. Alm disso, vrios microrganismos patognicos pertencem ao grupo de anaerbios facultativos. Dentre eles, encon-

cap.05

tra-se Staphylococcus aureus capaz de se desenvolver entre +180 e -230 mV.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


234

Os microrganismos anaerbios so, no entanto, aqueles que necessitam de


potenciais redox mais baixos para seu desenvolvimento. Geralmente, os valores de
Eh mximo de crescimento dos anaerbios varia entre +30 e -250 mV. Clostridium
perfringens e Clostridium botulinum so patgenos anaerbios de importncia em
alimentos. Clostridium paraputrificum um anaerbico alterador que cresce numa
faixa de Eh de -30 a -550 mV. Pesquisas mostram que o efeito inibidor do oxignio
sobre as bactrias anaerbias est relacionado sua presena e no sua influncia no potencial redox. O oxignio provoca o aparecimento de radicais livres, que
so altamente txicos s bactrias anaerbias, j que esses microrganismos no
possuem a enzima superxido dismutase, capaz de degradar os radicais txicos,
tornando-os incuos aos microrganismos.
Com relao aos alimentos, sabe-se, por exemplo, que as carnes, por conterem
compostos qumicos com grupos SH; e as frutas, hortalias e verduras, ricas em
cidos orgnicos e acares apresentam carter redutor. Outros alimentos vegetais
como os sucos, possuem valores de Eh entre +300 e +400 mV, o que favorece a
alterao por bactrias aerbias e fungos filamentosos e leveduras.

2.1.1.4. Composio do Alimento


Outro fator intrnseco do crescimento microbiano que, sem dvida, influencia
os microrganismos presentes a composio dos alimentos. Assim, carboidratos,
protenas, lipdeos, vitaminas, sais minerais e diversos outros compostos presentes
em pequenas propores determinam as caractersticas particulares de cada alimento, definindo os tipos de microrganismos capazes de se desenvolverem.
Devido a esse fato, os produtos de laticnios, carnes, vegetais, frutas e cereais, entre outros, apresentam microbiota especfica, originando problemas bastante diferenciados.

2.1.2. Fatores Extrnsecos


2.1.2.1. Temperatura de Armazenagem
Em funo das faixas de temperatura para seu desenvolvimento, as bactrias classificam-se nos seguintes grupos: psicrfilas, psicrotrficas, mesfilas
e termfilas (Quadro 5).
Quadro 5 - Temperatura para o Desenvolvimento Bacteriano

haja controvrsia. As bactrias psicrfilas crescem temperatura de 0 C, apresentam timo de crescimento em torno ou abaixo de 15 C e um mximo prximo de
20 C. So encontrados, geralmente, em ambientes marinhos de regies muito frias,
abrangendo um nmero relativamente pequeno desses microrganismos. Por isso, e
tambm devido sua maior sensibilidade a temperaturas mais elevadas, as bactrias
psicrfilas so menos importantes, em tecnologia de alimentos, do que as psicrotrficas. Estas ltimas so capazes de crescer temperatura prxima de 0 C, mas seu
desenvolvimento timo est em torno de 25 - 30 C, sendo, inclusive, considerada
um subgrupo das mesfilas. As bactrias psicrotrficas so capazes de alterar produtos armazenados sob refrigerao, representando, assim, um grupo de grande
importncia na indstria de alimentos.

2.1.2.2. Umidade Relativa


A umidade relativa est diretamente relacionada a AA, j que a umidade do
alimento entra em equilbrio com a do ambiente. Em alimentos enlatados, por exemplo, a umidade do alimento est em equilbrio com a umidade no espao superior
(head space) da lata. No entanto, um queijo minas frescal, dependendo das condies de armazenamento, vai perder gua at atingir o equilbrio com a umidade

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Os termos psicrfilas e psicrotrficas devem ser bem definidos para que no

que o envolve.
A relao matemtica entre a atividade de gua e a umidade relativa a seguinte: AA=UR/100.

2.2. Alguns Aspectos do Processamento de Alimentos versus Fatores de


Crescimento Microbiano

235

2.2.1. Esterilizao Comercial


O tratamento trmico dos alimentos tem sido amplamente usado e uma das
formas mais seguras para evitar a ocorrncia de doenas de origem alimentar por
microrganismos patognicos. Quando o processamento permite, ele o melhor tratamento aplicado para alimentos de baixa acidez, ou seja, aqueles que apresentam
pH acima de 4,6 e AA acima de 0,86. Nesses produtos, o objetivo do tratamento
trmico obter a esterilidade comercial, pois apenas alguns tipos de esporos, que
no C. botulinum, podem sobreviver. No entanto, esses sobreviventes no apresentam condies de desenvolvimento sob armazenagem temperatura ambiente, por
serem esporos de espcies termfilas, como Bacillus stearothermophilus.
Na maioria das vezes, o alvo da esterilizao comercial o controle de C. botulinum. Para isso, trabalha-se com binmios tempo e temperatura de processamento
cap.05

em que a possibilidade de contaminao com esse tipo de esporo uma unidade

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

contaminada em cada 1012 processadas. Nesse caso, nos clculos dos tratamentos
trmicos, parte-se do pressuposto de que os valores D121 C das espcies de C. botulinum de mxima resistncia ao calor situam-se em torno de 0,21 minutos e que o
alimento a ser processado apresente um desses esporos por unidade de alimento
processado.
Alm do rgido controle do binmio tempo temperatura, nesse tipo de preservao do alimento importante o cuidado para evitar a recontaminao do produto
por defeitos na embalagem ou no seu fechamento hermtico.

2.2.2. Tecnologias de Barreiras


A preservao de alimentos por barreiras ou mtodos combinados consiste
na combinao adequada de vrias barreiras, para obter alimentos estveis em
suas caractersticas fsicas, qumicas, microbiolgicas e sensoriais nas condies de
armazenamento, com baixo custo de produo (URBAIN, 1989; CHIRIFE; FAVETO,
1992; ALZAMORA, 1994; LEISTNER; GORRIS, 1995; ROBERTS; HOOVER, 1996; FELOWS, 1997; DAZA, 2000).
As barreiras mais importantes e mais usadas para preservao de alimentos tm
sido a alta ou baixa temperatura, atividade de gua, acidez, pH, potencial redox, conservantes (nitritos, sorbatos e sulfitos) e competio microbiana, como aquela causada
pelas bactrias lticas. No entanto, mais de 60 barreiras potenciais para manuteno
da qualidade e estabilidade de gneros alimentcios tm sido descritas.

236

As barreiras a serem empregadas dependem fundamentalmente do tipo de alimento. No entanto, em qualquer caso, tais barreiras devem ser capazes de manter a
microbiota do alimento sob controle. Os microrganismos presentes no devem ser
capazes de superar as barreiras presentes, caso contrrio ocorrer a deteriorao do
produto e at mesmo a veiculao de doenas.
A combinao de pasteurizao e pH uma alternativa para muitos produtos
alimentcios em que a esterilizao comercial pelo calor invivel, pois eles perderiam suas propriedades caractersticas. Por isso, nesses casos usam-se mais de uma
medida de controle na preservao do alimento. Nessa associao de medidas de
controle, a temperatura aplicada elimina uma srie de microrganismos alteradores
e, tambm, de microrganismos patognicos, mas no os esporos de C. botulinum.
Entretanto, a transformao desses esporos em clulas vegetativas com possvel
formao de toxina evitada pelo pH que se apresenta abaixo de 4,6. Produtos com
pH abaixo desse valor podem ser obtidos pela adio de cidos, por processos fermentativos ou, ainda, caracterstico do alimento. So exemplos desses alimentos
os sucos de frutas cidas pasteurizadas e os picles.

barreira ao desenvolvimento microbiano. Nesse caso, como os esporos sobrevivem ao tratamento trmico, a temperatura de armazenagem responsvel pelo
controle do desenvolvimento de C. botulinum. importante frisar que, nesse caso,
a temperatura de armazenamento ideal deve ser inferior a 3 C, pois a temperatura mnima para a produo de toxina por C. botulinum do tipo E, que pode
contaminar produtos marinhos.
Por exemplo, na pasteurizao do leite pelo sistema HTST, geralmente realizada a 72-75 C por 15 seg, h sobrevivncia de microrganismos termodricos,
como espcies dos gneros Micrococcus e Streptococcus, e, ainda, esporos bacterianos. O crescimento desses microrganismos controlado pelo armazenamento
temperatura em torno de 5 C. A pasteurizao do leite visa reduo de 15 ciclos
logaritmos na populao de Coxiella burnetii, a forma bacteriana vegetativa patognica mais resistente que contamina esse produto. Se a pasteurizao for realizada
corretamente e se a contaminao inicial for de uma C. burnetii por unidade processada, haver a probabilidade de uma unidade estar contaminada com a presena do
patgeno em 1015 unidades processadas.
Uma combinao de pasteurizao, sal, nitrito, refrigerao pode tambm

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Tambm, a pasteurizao e refrigerao associadas podem ser usadas como

controlar o crescimento de microrganismos em alguns alimentos processados.


Nesses alimentos, os esporos sobreviventes no se desenvolvem devido ao
do cloreto de sdio, do nitrito de sdio e do controle da temperatura do alimento
j processado. O cloreto de sdio, alm de abaixar a AA at nveis que dependem

237

de sua concentrao, apresenta, tambm, poder inibitrio sobre os microrganismos atravs da ao do on cloreto e da interferncia na atividade de enzimas. J
o nitrito de sdio usado geralmente nas concentraes entre 150 e 200 mg.L-1, em
produtos curados de carne, atua inibindo o crescimento ps-germinativo de esporos e a multiplicao de clulas vegetativas de C. botulinum. Esse procedimento
ocorre, por exemplo, em salame e no presunto.
Na aplicao associada da secagem, pH, AA e substncias antimicrobianas, a
preservao do alimento fundamenta-se no controle dos fatores extrnsecos e em
propriedades inibitrias do crescimento dos patgenos por substncias qumicas.
Usam-se, por exemplo, o cloreto de sdio e o nitrito de sdio. A carne seca conservada por esse mtodo de preservao.
O tratamento trmico da pasteurizao em combinao com o abaixamento do
pH, utilizando culturas lticas, e adio de cloreto de sdio o fundamento do pro-

cap.05

cessamento de diversos tipos de queijos. Entretanto, a salga associada secagem,

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

originando uma baixa atividade de gua, a forma de se conservar alguns tipos de


peixe, como no caso do bacalhau.

2.2.3. Irradiao
A irradiao de alimentos tem sido estudada por mais de 30 anos, em todo o
mundo, como uma tcnica de processamento para prolongar a vida de prateleira
de vrios alimentos (LOAHARANU, 1984; LLORENTE FRANCO et al., 1992; DIEHL,
1993; FARKAS, 1998). O processo tem sido relacionado como um mtodo para aumentar a segurana de alimentos, por destruir microrganismos patognicos, como
E. coli O157:H7 (MONK et al., 1995; LAANEN, 1999).
A irradiao consiste na exposio dos alimentos radiao com uma energia
de 2 a 5 kGy em comprimento de onda de 2.000 , ou menos. As radiaes beta,
gama, raios X e as microondas esto includas nesse intervalo de comprimento de
ondas. Os raios gama so o tipo de irradiao mais usado para processamento de
alimentos e obtido do radioistopo cobalto60.
Em 1983, o FDA aprovou a irradiao como mtodo de controle de microrganismos em condimentos, principalmente pelo fato de esse tipo de processo ser uma
alternativa para alguns aditivos qumicos usados em alimentos (MURANO,1995). De
acordo com World Health Organization (WHO,1997), doses inferiores a 10 KGy no
causam alteraes substanciais no valor nutritivo dos alimentos e, do ponto de vista
toxicolgico, no promovem nenhum efeito adverso sade humana. No entanto, a
qualidade sensorial dos alimentos pode ser alterada para pior em doses de radiao
gama mais elevadas.

238

A irradiao controla, portanto, a contaminao microbiolgica de alimentos,


porm no pode ser utilizada para devolver a qualidade a alimentos deteriorados.
Por isso, a irradiao deve ser associada s boas prticas de fabricao, para a reduo da incidncia de doenas causadas por alimentos, e cuidados devem ser
tomados para que os alimentos irradiados no sejam recontaminados.

2.2.4. Alta presso hidrosttica


A partir da dcada passada, a tecnologia de alta presso tem-se expandido
na indstria de alimentos. A inativao de microrganismos com alta presso tem
sido reconhecida h muito tempo (SHIGEHISA et al., 1991; STYLES et al., 1991). No
entanto, apenas recentemente os pesquisadores se empenharam em estudar o potencial de comercializao da tecnologia de alta presso na indstria de alimentos.
Os efeitos biolgicos da alta presso so variados e depende de cada microrganismo. A inativao de microrganismos com alta presso depende do pH, composio, presso osmtica e temperatura do meio. Presses moderadas diminuem
a velocidade de crescimento microbiano.

negativas e fungos filamentosos e leveduras. A inativao de esporos por alta presso est fortemente influenciada pela temperatura e em menor escala por pH, atividade de gua e fora inica. A temperatura tima para a germinao de esporos
difere nas diferentes presses (BARBOSA; CANOVAS, 1998).
A irradiao provoca a germinao dos esporos e em seguida elimina o esporo
germinado, que se comporta como uma clula vegetativa. Presses entre 300 - 400
MPa inativam os formadores de esporos. Baixas presses (<100 MPa) induzem a
germinao, mas no eliminam todas as clulas vegetativas de Clostridium spp. e
Bacillus spp.
A alta presso hidrosttica um mtodo interessante de conservao de alimentos, principalmente para aqueles que tm caractersticas sensoriais, funcionais
e nutricionais termossensveis. Um aspecto importante nessa tecnologia a possibilidade da manuteno do aroma e textura do alimento, devido inativao de
enzimas ocorrida nesse processamento.

3. Avaliao de Surtos de Doenas de Origem Alimentar

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Geralmente, as bactrias Gram-positivas so mais resistentes do que as Gram-

3.1. Microrganismos Patognicos


As bactrias patognicas so freqentemente encontradas em alimentos contaminados. s vezes, esto em nmero que podem provocar doenas de gravidade varivel em razo do patgeno, mas sempre indesejveis no sentido de sade

239

pblica. As doenas de origem alimentar so classificadas como intoxicaes ou


toxinfeces, dependendo de sua etiologia. A intoxicao causada pela ingesto
de toxina pr-formada no alimento. Quando encontram condies favorveis, algumas bactrias patognicas se multiplicam no alimento, liberando toxinas que, ao
serem ingeridas, provocam a doena. So exemplos de intoxicaes as doenas
causadas pelas toxinas produzidas por C. botulinum, por S. aureus e B. cereus na
sua forma vomitiva.
Nas intoxicaes alimentares, os sintomas podem apresentar-se rapidamente,
dependendo das quantidades de toxinas ingeridas e da resistncia do organismo.
exceo da intoxicao por C. botulinum, a durao da doena no prolongada, ocorrendo a recuperao em torno de 24 h, em mdia, aps o aparecimento
dos sintomas. Alm disso, na maioria das vezes, nas intoxicaes alimentares no
ocorre febre, e os sintomas caractersticos geralmente so dor abdominal, nuseas,

cap.05

vmitos e diarrias. Para intoxicao com a toxina botulnica, a esses sintomas, que

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

podem aparecer na fase inicial da doena, so acrescidos sintomas neurolgicos


tpicos, como a diplopia, perda de reflexos luz, disfonia, dificuldade de deglutio
e paralisia respiratria.
Epidemiologicamente, nas toxinfeces alimentares pressupe-se a ingesto
de alimentos contendo grande nmero de clulas viveis que podem posteriormente multiplicar no organismo; invadir a parede intestinal; disseminar para outros rgos ou produzir toxinas no intestino, dependendo do patgeno. So exemplos de
toxinfeces alimentares as doenas causadas por Salmonella, Shigella, Escherichia
coli enteropatognica, enterotoxignica ou enterohemorrgica, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Clostridium
perfringens, entre outros.
Nas toxinfeces, geralmente os perodos de incubao e durao da doena so maiores do que nas intoxicaes. As febres usualmente esto presentes, e
quando os microrganismos invadem a mucosa intestinal h ocorrncia de fezes com
sangue e muco. Em alguns casos pode haver septicemia com as bactrias disseminando para outros rgos do organismo.
Assim, importante o conhecimento das principais caractersticas dos patgenos responsveis por doenas de origem alimentar. Dentre eles, destacam-se o
C. jejuni, Campylobacter coli, Salmonella spp., E. coli patognicas, Shigella spp.,
L. monocytogenes, Yersinia enterolitica, Staphylococcus aureus, Clostridium per-

240

fringens, Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio


vulnificus, Streptococcus spp., vrus Norwalk, hepatite A, hepatite E, rotavrus, Brucella melitensis, Brucella abortus, Brucella suis, Aeromonas hydrophila, Aeromonas
caviae, Aeromonas sobria e Pleisiomonas shigelloides.

3.1.1. Salmoneloses
As espcies do gnero Salmonella pertencem famlia Enterobacteriaceae.
So Gram-negativas, bastonetes curtos, anaerbias facultativas e no formam esporos. A temperatura tima de crescimento de 38 C e a mnima, de 5 C. A faixa de
pH para crescimento situa-se entre 4 e 9. Como no formam esporos, so relativamente termossensveis, podendo ser destrudas pelo tratamento de 60 C durante
15 a 20 min (ICMSF, 1996).
Salmonella encontrada nos tratos intestinais de mamferos, pssaros, anfbios
e rpteis. Uma ampla variedade de alimentos contaminados associada salmoneloses, incluindo carne bovina crua, aves domsticas, ovos, leite e derivados, peixes,

cascas de ovos e gemas. A contaminao de alimentos ocorre devido ao controle


inadequado de temperatura, de prticas de manipulao no apropriadas ou contaminaes cruzadas de alimentos crus com processados (FORSYTHE, 2002).
Duas sndromes diferentes em humanos so causadas por salmonelas: a febre entrica e a gastroenterite. A primeira sndrome provocada por S. Typhi,
responsvel pela febre tifo e S. paratyphi, causadora de febre paratifo. A doena
ocorre pela ingesto de gua e alimentos contaminados com fezes e apresentam
como os principais sintomas a septicemia, febre alta, dor de cabea, constipao,
vmitos e diarria. A dose infecciosa varia de acordo com a idade e a sade da
vtima, com o alimento e, ainda, com a estirpe de Salmonella. As doses infecciosas
podem variar de 20 at 106 clulas.
As gastroenterites so causadas pelas demais espcies de Salmonella, que
incluem mais de 2.000 estirpes, todas patognicas ao homem ou animais, sendo
cerca de 200 delas isoladas em surtos em humanos (LAMIKANRA, 2002). Estas linhagens diferentes, denominadas sorotipos ou sorovares, so diferenciveis pelos
seus antgenos O, H e Vi, utilizando o esquema de Kaufmann-White. As espcies
de Salmonella possuem estrutura complexa de lipopolissacardeos composta por
lipdeo A, centro e antgeno O (FORSYTHE, 2002). O lipdeo A ancora a molcula

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

camares, temperos para saladas, mistura para bolos, cacau, manteiga de amendoim,

na membrana externa e txica, sendo o fator de virulncia. A regio do centro


composta por molcula de acar, e sua seqncia reflete a identidade do organismo. A regio O mais varivel: em alguns organismos, a regio O pode conter
apenas alguns resduos de acar, enquanto em outros pode conter repetidas unidades de acar (FORSYTHE, 2002).

241

De acordo com o CDC (2003), todo ano aproximadamente 40.000 casos de salmoneloses so relatados nos Estados Unidos. Devido ausncia de relatos ou diagnstico de muitos casos, esse nmero de infeces pode ser trs vezes maior. Crianas,
idosos e imunodreprimidos so mais vulnerveis a essas infeces. A estimativa de
que aproximadamente 600 pessoas morram a cada ano com salmonelose aguda.
Em 1999, um surto de salmonelose envolveu 300 pessoas que consumiram
cidra de ma no pasteurizada (CDC, 1999). Produtos frescos podem ser contaminados ainda no campo atravs de adubo, gua contaminada e, ainda, por contato
humano (LAMIKANRA, 2002).
Vrios surtos de salmoneloses provocados por frutas, principalmente meles
cantaloupes, tm sido relatados pelo Centro de Controle e Preveno de Doenas
dos Estados Unidos e Canad. Em 1990, um surto com esses meles foi causado
por Salmonella chester, que afetou 245 indivduos, com duas mortes, em 30 esta-

cap.05

dos. O melo era proveniente do Mxico e Guatemala (UKUKU; SAPERS, 2001).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Uma grande incidncia de surtos humanos causados pela espcie S. Enteritidis


nos EUA, Gr-Bretanha e outros pases da Europa a partir de 1980 chamou a ateno
para fontes comuns da infeco (CDC, 1990, 1991, 1992). As trs mais importantes
espcies implicadas por surtos em 2002 foram S. Typhimurium, S. Enteritidis e S.
newport, com 51% dos isolados (CDC,2002). A Salmonella Enteritidis a espcie
responsvel pela maioria das salmoneloses nos ltimos anos, suplantando as espcies S.agona, S.hadar e S.Typhimurium.
Num extenso estudo de 115 surtos alimentares por S. Enteritidis ocorridos na
regio de Campinas, no Estado de So Paulo, que engloba 87 municpios, Simes
et al. (2001) mostraram que ovos e derivados ou alimentos crus contendo esses
ingredientes foram os principais responsveis pelos surtos. Destacou-se a maionese
caseira, com 57% dos casos, seguida pela cobertura de bolos, com 15%. Nesse
estudo, 807 pessoas ficaram doentes, ocorrendo cinco bitos.
O problema da salmonelose em humanos se agrava quando a cepa apresenta
resistncia s drogas usadas para o seu tratamento. H consenso em vrios pases
que o uso indiscriminado de antibiticos na produo animal uma das causas
do aumento da resistncia antimicrobiana (SILVA; DUARTE, 2002). O uso de antimicrobianos pode selecionar bactrias resistentes no ecossistema. Tem sido uma
recomendao da Organizao Mundial de Sade o controle e restrio do uso de
antimicrobianos na produo animal (WHO, 2001).
A preveno da salmonelose est baseada em aspectos de higiene, alm de
evitar o consumo de bebidas ou alimentos que contenham ovos crus e leite no-

242

pasteurizado. Evitar o uso de utenslios que entraram em contato com carnes bovinas ou avcolas cruas. Ter muito cuidado no preparo de alimentos para crianas,
idosos e imunodeprimidos. Lavar as mos aps contatos com rpteis, pssaros ou
fezes de animais de estimao e no trabalhar em reas de carnes cruas e processadas ao mesmo tempo.

3.1.2. Intoxicao por Enterotoxina Estafiloccica


Staphylococcus aureus um microrganismo Gram-positivo que se apresenta
na forma de cocos em pares, pequenas cadeias ou cachos semelhantes aos de uva.
anaerbio facultativo e cresce na faixa de 7 C a 48 C, mas a produo das enterotoxinas, responsveis pela doena, ocorre entre 10 C e 46 C, sendo essa produo
maior entre 40 C e 45 C. Em condies timas de crescimento do microrganismo,
a enterotoxina detectada em 4 a 5 h. O microrganismo dividido em diversos biotipos, tendo como base os testes bioqumicos e padres de resistncia (FRANCO;
LANDGRAF,1996; FORSYTHE, 2002).
S. aureus o principal agente responsvel pela intoxicao estafiloccica, que
ocorre devido ingesto de alimentos que apresentam toxina pr-formada (FRAN-

pertencem a um grupo de nove exoprotenas sorologicamente distintas e classificadas como EEA, EEB, EEC1, EEC2, EEC3, EED, EEE, EEG e EEH (HALPIN DOHNALEK;
MARTH, 1989; BERGDOLL, 1996; OLIVEIRA; HIROOKA, 1999).
S. aureus pode ser encontrado no solo, no ar, na gua, nos homens e nos animais. No homem, o microrganismo encontrado principalmente nas fossas nasais,
de onde se propaga direta ou indiretamente para pele e feridas. A maioria das cepas
de S. aureus cresce na faixa de pH de 4,5 a 9, 3, estando o valor de pH mais adequado
para a produo da toxina na faixa da neutralidade, entre 6 e 7 (BERGDOLL; BENNETT, 1989). Esse microrganismo possui capacidade de crescer numa atividade de
gua acima de 0,86, no entanto a produo de enterotoxina possvel a partir de uma
atividade de gua de 0,90, sendo a tima 0,99 (BENNETT, 1992).
S. aureus apresenta grande variedade de fatores de patogenicidade e virulncia: estafiloquinases, hialuronidases, fosfatases, coagulases e hemolisinas.
As intoxicaes alimentares so causadas pelas enterotoxinas. Uma toxina previamente denominada enterotoxina F agora reconhecida como responsvel
pela sndrome de choque txico ou por enterite. Essas toxinas so altamente
termoestveis (D98,9 2 h) e resistentes coco ou a enzimas proteolticas
(FORSYTHE, 2002).
Os alimentos geralmente envolvidos na intoxicao estafiloccica incluem carne de bovinos, sunos e aves e seus derivados e ovos. Tambm, leite e seus derivados, como os queijos cremosos, bem como outros produtos, como sanduches,
saladas de atum, doces recheados com creme, chocolates e outros, so geralmente
incriminados em surtos. Os sintomas aparecem rapidamente aps a ingesto, em
forma de nuseas, vmitos e dores abdominais.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

CO; LANDGRAF, 1996; OLIVEIRA; HIROOKA, 1999). As enterotoxinas estafiloccicas

243

A toxina estafiloccica termoestvel e muitas vezes no inativada por


pela coco usual, sendo, ento, necessrio evitar a contaminao do alimento
pelo microrganismo.

3.1.3. Infeco por Escherichia coli

cap.05

Escherichia coli uma bactria da famlia Enterobacteriaceae e que apresenta


algumas estirpes patognicas. Dentre essas, encontram-se E. coli enteropatognica (EPEC), E. coli enterotoxignica (ETEC), E. coli invasoras (EIEC) e E. coli hemorrgica (EHEC), capazes de causar infeco de origem alimentar. A EPEC provoca
diarria aquosa em crianas, e a ETEC a causadora da diarria dos viajantes. A
EIEC provoca febre e diarrias profusas, contendo muco e sangue, e a EHEC
responsabilizada por diarria sanguinolenta, colite hemorrgica e sndrome urmica hemoltica. Neste ltimo grupo, esto includos os sorotipos 0157, 026 e 0111
(FORSYTHE, 2002; CDC, 2003).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

E.coli est presente no trato intestinal dos animais e homens e pode ser
encontrada como contaminante do solo, gua e plantas. As principais fontes no
ambiente so as fezes. Dentre as estirpes, as enterohemorrgicas so as mais perigosas, e a dose infecciosa est abaixo 100 clulas por grama de alimento, sendo
que menos de duas clulas por 25 g j foram responsabilizadas em surtos (IFPA,
2001; LAMIKANRA, 2002). E. coli O157:H7 um representante das estirpes enterohemorrgicas. A maioria das estirpes de E. coli se aloja em intestinos humanos
e de animais inofensiva, entretanto E. coli O157:H7 produz uma toxina potente
e causa doena severa. A cada ano, nos Estados Unidos, essa estirpe enterohemorrgica responsvel por 73.000 casos de infeces e 61 mortes. A infeco
geralmente leva diarria com sangue e, ocasionalmente, a problemas renais. A
maioria das doenas tem sido associada alimentos mal cozidos e carnes contaminadas. O contato de pessoas para pessoas tambm uma forma de transmisso.
Frutas e vegetais tambm podem ser contaminados com E. coli O157:H7 no campo
ou, ainda, por gua contaminada ou pelo pessoal envolvido na colheita. A infeco
tambm pode ocorrer aps a ingesto de leite cru e, ou, gua contaminada. Devido
existncia desses microrganismos nos intestinos de bovinos saudveis, medidas
preventivas em fazendas de gado e durante o processamento de carnes devem ser
avaliadas (CDC, 2004).
E. coli O157:H7 difere da maioria das outras linhagens, j que cresce pouco ou
no cresce a 44 C. Esse microrganismo se desenvolve temperatura de 7 C - 8 C e
tolerante a pH cido. Nos Estados Unidos, quatro surtos de E. coli O157:H7 foram
epidemiologicamente associados ao consumo de cidra de ma no pasteurizada

244

(CDC,1997; HEALTH CANADA, 1999). Em agosto de 1993, um surto foi associado


com E. coli O157:H7, que contaminava melo cantaloupe e melancia.
De acordo com a Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos, a dose
infecciosa para E. coli O157:H7 desconhecida. No entanto, h relatos na literatura sugerindo que dose infecciosa pode ser to baixa quanto 10 clulas (FORSYTHE, 2002).

3.1.4. Campilobacteriose
As espcies do gnero Campylobacter so bastonetes, Gram-negativas, de tamanho entre 1,5 - 5 m. So microrganismos microaerfilos, que requerem de 3 % a
5 % de oxignio e de 2 % a 10 % de dixido de carbono e temperatura de 42 - 43 C.
como condies timas de crescimento. So sensveis ao estresse ambiental, sendo
afetadas pela presena de oxignio em concentraes de 21%, pela baixa umidade, pelo calor, pela acidez e pela ao de desinfetantes usuais, dentre outros (FDA,
2001). Essas bactrias so encontradas nos intestinos de pssaros saudveis e na
maioria de carne crua de aves.

tros alimentos que entram em contato com o exsudado da carne crua de frangos (CDC, 2002). Tambm, provocada pelo consumo de alimentos crus contaminados pela gua ou devido contaminao cruzada, principalmente entre
animais e produtos vegetais. Esse microrganismo tambm capaz de crescer
em vegetais crus e, ou, minimamente processados, embalados sob condies
microaeroflicas (LAMIKANRA, 2002).
A campilobacteriose uma doena que apresenta como sintomatologia febre,
dor abdominal e diarria, que pode ser profusa, aquosa e, freqentemente, com
sangue. O perodo de incubao de 2 a 10 dias e a durao da doena, de cerca de
uma semana. O microrganismo secretado nas fezes durante vrias semanas aps
os sintomas terem cessado. Existem duas espcies principais de Campylobacter
causadores dessas doenas. A espcie C. jejuni causa a maioria dos surtos, envolvendo-se em 89 % a 93 %, seguindo-se a espcie C. coli com 7 % a 10 %. Tambm,
as espcies C. upsaliensis e C. iari, ocasionalmente, so implicadas em surtos alimentares. Tais microrganismos so encontrados em aves domsticas, gado, sunos,
ovinos, roedores e pssaros (SKIRROW, 1991).
A dose de C. jejuni responsvel pela infeco situa-se na faixa de 500 a 10.000
clulas, dependendo da espcie, danos da clula pelo estresse ambiental e suscep-

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

A doena pode ser causada pelo consumo de frangos mal cozidos ou ou-

tibilidade do hospedeiro (BLACK et al, 1988). As infeces so manifestadas como


meningite, pneumonia e a sndrome de Guillain-Barr, caracterizada por paralisia
flcida aguda (ALLOS, 1998).
De acordo com a WHO (2004), geralmente no so indicados tratamentos para

245

essas enterites, exceto uma recuperao de eletrlitos e reidratao. Tratamento


antimicrobiano, com eritromicina, tetraciclina e quinolonas indicado em casos invasivos ou para erradicar o microrganismo de portadores.
A preveno da infeco requer medidas de controle em todos os estgios da
cadeia produtiva de alimentos, desde a produo agrcola na fazenda at o processamento e preparao de alimentos em estabelecimentos comerciais ou domsticos.
Mtodos especficos de interveno nas granjas de produo tm sido eficientes
para reduzir a incidncia de Campylobacter em aves. As medidas incluem aumento
da biossegurana para evitar transmisso direta do ambiente para as aves quando
estas so mantidas em locais fechados. Em fazendas de bovinos mais difcil o controle da contaminao com esses microrganismos, portanto a pasteurizao do leite
fundamental. Medidas adequadas de higiene durante o processamento reduzem
a contaminao das carcaas por fezes, nas prticas de abate, mas no garante a
ausncia de Campylobacter na carne e produtos derivados. A conscientizao do

cap.05

pessoal de abate na produo de carnes cruas para a importncia dos bons hbitos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

de higiene essencial para manter a contaminao microbiolgica dentro do aceitvel. Tratamentos bactericidas, como calor (cozimento ou pasteurizao), e irradiao
so efetivos na eliminao de Campylobacter em alimentos contaminados.

3.1.5. Shigeloses
As espcies de Shigella so bactrias altamente contagiosas que colonizam o
trato intestinal de homem e de animais. O microrganismo se propaga por contato
indireto ou direto com indivduos infectados. O alimento ou a gua podem ser contaminados por material fecal de pessoas infectadas. Esse microrganismo sobrevive
por mais tempo quando as temperaturas de manuteno dos alimentos so inferiores a 25 C e, em menor tempo, em produtos cidos (ICMSF, 1996).
O gnero Shigella dividido em quatro espcies: S. dysenteriae, S. sooney, S. flexneri e S.boydii, sendo todas responsveis por shigeloses em humanos. Essas doenas
so geralmente associadas gua e alimentos contaminados com fezes humanas (FORSYTHE, 2002). Assim, produtos frescos podem ser contaminados pela gua de irrigao,
pelo uso da compostagem como fertilizantes, por insetos e, ainda, pelo contato humano.
Frutas e vegetais processados tm sido relacionados com surtos de shigeloses. Espcies
de Shigella podem estar presentes em frutas em pores minimamente processadas,
como melancia e mamo, armazenadas sob refrigerao (LAMIKANRA, 2002).
Os principais sintomas da shigelose so diarrias branda ou grave, aquosa ou
com sangue, febre, nuseas, vmitos e dores abdominais. Os sintomas aparecem
de 12 at 96 h aps a exposio a Shigella (FORSYTHE, 2002). A shigelose pode

246

ser prevenida por lavagem freqentemente das mos com detergente apropriado,
principalmente aps utilizar banheiros. Evitar que pessoas com diarrias preparem
alimentos para outros e procurar no engolir gua de piscina (CDC, 2003).

3.1.6. Listerioses
L. monocytogenes uma bactria Gram-positiva, apresentando-se na forma de
bastonete, anaerbia facultativa, no esporulada, psicrotrfica, produz flagelo a 25
C, mas no a 35 C. Pode ser encontrada em pelo menos 38 espcies de mamferos
e 17 de vegetais. Esse microrganismo pode contaminar carnes e produtos crneos,
queijos brancos, gelados, frutas e hortalias, alm de alimentos de origem marinha
(ICMSF,1996). A dose infecciosa desse microrganismo ainda no est definida. Entretanto, parece ser necessrio um nmero acima 103 UFC.g-1 para causar a doena.
L. monocytogenes amplamente distribuda no ambiente e sobrevive por longos
perodos sob condies adversas (IFPA, 2001; LAMIKANRA, 2002). Essa bactria foi
isolada a partir de vrios ambientes, incluindo vegetao em decomposio, terra,
rao animal, esgoto e gua (FORSYTHE, 2002).

com atmosfera modificada. Alm disso, sobrevive e cresce em faixas variadas de


temperatura e pH e, uma vez estabelecida na planta de processamento, difcil de
ser erradicada. A bactria sobrevive preferencialmente em reas que so constantemente frias e molhadas, como drenos, tubulaes e unidades de refrigerao
(ALZAMORA et al., 2000; IFPA, 2001).
Dentre os alimentos identificados com alto risco de veicular a listeriose, incluem-se produtos vegetais refrigerados e minimamente processados (UKUKU;
FETT, 2002). L. monocytogenes tem sido isolada de saladas mistas de vegetais
previamente embalados, como alfaces e pepinos cortados e, ainda, em frutas,
como tomates e melo cantaloupe. Tambm, frutas inteiras e no minimamente
processadas tm sido implicadas em surtos de listeriose (LAMIKANRA, 2002).
A listeriose tem sido reconhecida como um problema de sade pblica nos
Estados Unidos. Essa doena afeta principalmente mulheres grvidas, recm-nascidos e adultos com sistema imunolgico comprometido. Essa bactria apresenta
trofismo pela placenta, provocando aborto em mulheres. Os principais sintomas
da listeriose so: febre, dores musculares e, algumas vezes, sintomas gastrointestinais, como nusea e diarria. Se a infeco espalha para o sistema nervoso,

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

L. monocytogenes cresce em baixas concentraes de O2, como embalagens

sintomas como dores de cabea, tonturas ou convulses podem ocorrer. Nos Estados Unidos, h uma estimativa de que 2.500 pessoas adoeam com listeriose a
cada ano, ocorrendo bito de 500 delas (CDC, 2003).

3.1.7. Yersinioses

247

Yersnia enterecolitica um microrganismo Gram-negativo, na forma de


bastonete, com dimenses de 1,0-3,5 m x 0,5-1,3 m. geralmente isolado de
pessoas contaminadas com o microrganismo, partir de feridas, fezes, saliva e
ndulos linfticos mesentricos. Entretanto, no parte da microbiota humana
normal. Outras espcies do gnero Yersinia so responsveis por doena similar causada por Y. enterocolitica. Por exemplo, Y. pseudotuberculosis capaz
de provocar doenas no homem por outras rotas que no seja aquela ingesto
de alimentos. Outro exemplo Y. pestis, que pode provocar epidemia. Somente
algumas estirpes de Y. enterocolitica causam doenas no homem. Tais estirpes
so encontradas com maior freqncia em sunos, mas tambm aparecem em
roedores, coelhos, ovelhas, gado, cavalos, ces e gatos. Em sunos, a bactria
mais facilmente encontrada nas amdalas (CDC, 2004; FDA, 2004).
O crescimento timo do microrganismo ocorre na faixa de 30 C a 37 C,

cap.05

entretanto tambm capaz de crescer temperatura de refrigerao, como 8 C.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Os principais sintomas das enfermidades causadas por Yersinia so dores abdominais, febre, diarria (que pode durar vrias semanas), inflamao da garganta,
fezes com sangue, erupes cutneas, nuseas, dor de cabea, mal estar, dores
nas articulaes e vmitos (FORSYTHE, 2002).
A infeco por Y. enterocolitica geralmente adquirida por consumo de alimento contaminado, especialmente produtos sunos crus ou mal cozidos. A preparao de embutidos crus a partir de intestinos de porco uma fonte potencial de
risco. Leite no pasteurizado e gua no tratada podem transmitir esse patgeno
ao homem. Ocasionalmente, a yersiniose ocorre aps contato com animais infectados. Em raras ocasies, essa infeco pode ser transmitida, como resultado da
bactria, passando dos resduos ou dedos sujos de uma pessoa para a boca de
outra pessoa. A causa exata da contaminao desconhecida (CDC, 2004).
As enfermidades causadas por Yersinia no ocorrem com freqncia, estando muito associadas ausncia das boas prticas de fabricao na produo de
alimentos. A populao mais suscetvel a doena so as crianas, os debilitados,
pessoas idosas e imunocomprometidas (FDA,2004).

3.1.8. Envenenamento Alimentar por Clostridium perfringens


Clostridium perfringens um bacilo Gram-positivo, anaerbio estrito e formador de esporos. Esse organismo agrupado em cinco tipos identificados como A,
B, C, D e E, de acordo com as exotoxinas produzidas. Os tipos A, C e D so patognicos para o homem, enquanto os animais so suscetveis aos tipos de B, E e,
248

possivelmente, ao tipo A (GERMANO; GERMANO, 2001).


O primeiro relato de seu envolvimento com intoxicao alimentar ocorreu em
1943. amplamente distribudo no ambiente e freqentemente encontrado no
intestino de humanos e animais (FORSYTHE, 2002).
A forma mais comum de enfermidade por C. perfringens caracterizada por
intensas dor abdominal, nusea e diarria aguda. O perodo mdio de incubao
de cerca de 12 h, aps o consumo de alimentos que contm grande nmero de C.
perfringens na forma vegetativa e produtores de toxina. Os esporos desses microrganismos so resistentes a tratamento trmico e podem, inclusive, ser ativados para se
desenvolverem como clulas vegetativas. A doena normalmente dura 24 h, e sintomas menos severos podem persistir em alguns indivduos por uma ou duas semanas.
Poucas mortes tm sido relatadas e so geralmente resultantes da desidratao ou
de outras complicaes (FDA, 2004). Na maioria das vezes, a causa primria da doena por C. perfringens a manuteno de alimentos preparados, por exemplo carne
cozida, sob temperatura abusiva que favorece a multiplicao celular. As carnes, os
produtos crneos e os molhos so alimentos mais freqentemente implicados.

fatais. Essa doena tambm inicia com a ingesto de grandes quantidades, acima de
108 UFC.g-1 de C. perfringens do tipo C em alimentos contaminados. As mortes por
enterites necrticas so causadas pela infeco e necrose dos intestinos, resultando
em septicemia (FORSYTHE, 2002; FDA, 2004).
A preveno da presena desse microrganismo nos alimentos pode ser obtida
pelo controle do binmio tempo temperatura do processo de coco e pela temperatura adequada de armazenamento.

3.1.9. Botulismo Alimentar


Clostridium botulinum um bastonete Gram-positivo, anaerbio estrito, formador de esporos e o responsvel pelos botulismos alimentar, infantil e de ferida.
O infantil ocorre quando crianas de at um ano ingerem a forma esporulada do
microrganismo. Nesse caso, como a microbiota intestinal da criana no est completamente formada, o esporo de C. botulinum capaz de se multiplicar no intestino
e formar a toxina, causando a doena. J o botulismo de ferida ocorre quando esporos do ambiente contaminam ferimentos no homem, se denvolvem nessas feridas e
as toxinas produzidas atingem a corrente sangnea.
Existem sete tipos de toxinas botulnicas designadas pelas letras de A a G, que

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

As enterites necrticas (pig-bel) causadas por C. perfringens so quase sempre

so baseadas em diferenas fisiolgicas e no tipo de neurotoxina. Somente os tipos


A, B, E e F causam doenas em humanos (CDC, 2004).
O botulismo uma intoxicao alimentar provocada pela ingesto de toxinas
produzida por C. botulinum e caracterizada por distrbios digestivos e neurolgicos.

249

Essa doena associada com alimentos enlatados de baixa acidez, principalmente


aqueles de produo caseira, vegetais, peixes e produtos de carne. O mel associado ao botulismo infantil, e, por isso, esse produto deve ser usado com cuidado
na alimentao de crianas com menos de um ano de idade (FORSYTHE, 2002;
GERMANO; GERMANO, 2001).
Os sintomas do botulismo so: viso dupla, nusea, vmito, fadiga, tonturas,
dor de cabea, dor de garganta e nariz seco e falhas respiratrias. C. botulinum no
cresce em condies cidas (pH<4,6) ou em condies de aerobiose. A maioria
das estirpes de C. botulinum associada com produtos frescos no cresce ou produz
toxinas em temperaturas abaixo de 10 C. No entanto, deve-se mencionar que C.
botulinum tipo E, encontrado em produtos marinhos, se desenvolve a 3,3 C. A
produo de toxina por C. botulinum normalmente causa alteraes sensoriais em
produtos frescos. A toxina do tipo A a mais comum em vegetais (IFPA, 2001). Essa
toxina produzida em faixa de temperatura variando de 10 C a 50 C, sendo a faixa

cap.05

tima de 35 C a 40 C e pH de 4,6 a 9,0.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

As clulas vegetativas de todos os tipos de C. botulinum so eliminadas


rapidamente pelas temperaturas de pasteurizao e de coco dos alimentos.
As toxinas botulnicas so extremamente potentes, podendo ocasionar mortes
mesmo em quantidades mnimas como 0,1 mg a 1,0 mg. Essas toxinas so termolbeis, e as condies necessrias para sua inativao dependem do tipo de
toxina. No entanto, de modo geral, so inativadas a 80 C por 30 min ou 100
C por 3 min (GERMANO; GERMANO, 2001). O tratamento trmico de alimentos
enlatados de baixa acidez a 121 C por 3 min ou equivalente eliminar os esporos
de C. botulinum.

3.1.10. Doenas Alimentares por Bacillus cereus


Bacillus cereus um patgeno alimentar, com morfologia de bastonetes
grandes, formadores de esporos no-intumescidos, Gram-positivos, aerbios facultativos; so mveis, apresentam atividade hemoltica, no produzem cristais
de toxina e no apresentam crescimento rizide. Essas caractersticas so usadas
para diferenciar B. cereus das espcies B. thuringensis, B. cereus var. mycoides e
B. antrhacis.
B. cereus cresce numa faixa 4 C a 55 C, sendo de 30 C a 40 C o intervalo
de temperatura tima para o seu desenvolvimento, de acordo com a estirpe. O microrganismo cresce bem numa faixa de pH entre 5 e 6, podendo se desenvolver
em pH de at 8 (GERMANO; GERMANO, 2001). Esse microrganismo encontrado
por toda a natureza, sendo isolado do solo, da vegetao, da gua e dos plos dos

250

animais. comumente encontrado em baixos nveis nos alimentos (<102 UFC.g-1),


considerados aceitveis. As intoxicaes alimentares iniciam quando o alimento
armazenado em temperatura abusiva por longo perodo, propiciando que um nmero baixo de microrganismos se multiplique at nveis (>105 UFC.g-1) capazes de
causar a doena (FORSYTHE, 2002).
As doenas provocadas por B. cereus se classificam nas formas diarrica e
emtica. A forma diarrica causada por uma toxina de natureza protica de alto
peso molecular produzida no intestino humano. J a emtica se manifesta provavelmente devido a um peptdeo termoestvel de baixo peso molecular, sendo as
toxinas pr-formadas no alimento. Ambas as doenas geralmente tm evoluo
benigna e a recuperao ocorre em 24 h. Algumas toxinas como enterotoxina diarrica, fator emtico, hemolisina I, hemolisina II e fosfatase C tm sido identificadas
(FORSYTHE, 2002; FDA, 2004).
A enfermidade tipo diarrica est associada com produtos crneos, hortalias,
leite e derivados, creme, sopas e molhos, alm de pur de batatas e salada de legumes. No entanto, a enfermidade emtica est relacionada com produtos amilceos e

tatas e massas, alm de produtos de queijo, foram implicados em surtos provocados


por esse agente etiolgico (GERMANO; GERMANO, 2001). Alimentos como ervas e
especiarias tm sido relatados como veculos de esporos de B. cereus.
Como o microrganismo se encontra por todo o meio ambiente, baixos nmeros ocorrem comumente em alimentos. Por isso, o principal mecanismo de controle
a preveno da germinao e a multiplicao dos esporos em alimentos cozidos
prontos para o consumo. A estocagem de alimentos abaixo de 10 C inibir o crescimento de B. cereus (FORSYTHE, 2002).

3.1.11. Vibrio parahaemolyticus


Vibrio parahaemolyticus uma bactria encontrada em gua salgada e causa
gastroenterite nos homens. As espcies patognicas e no-patognicas podem ser
isoladas de ambientes marinhos, de peixes e de depsitos de carcaas de peixes
nesses ambientes (CDC, 2004; FDA, 2004).
Este microrganismo capaz de crescer em concentraes de 1 % a 8 % de
NaCl, apresentando seu crescimento timo nas concentraes entre 2 % e 4 %. Sua
temperatura mxima de crescimento de 44 C, sendo a tima entre 30 C e 35 C
(JAY,1994). Os vbrios so bacilos Gram-negativos, pleomrficos, curvos ou retos,

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

cereais, em especial o arroz. Entretanto, outros alimentos ricos em amido como ba-

mveis, catalase e oxidase positivos, anaerbios facultativos e so extremamente


sensveis s temperaturas de coco (GERMANO; GERMANO, 2001).
Os microrganismos esto presentes, normalmente, em quantidade inferior
a 103 UFC.g-1 em peixes e frutos do mar, exceto em guas mornas, onde a con-

251

tagem pode aumentar para 10 UFC.g . As infeces causadas por esse micror6

-1

ganismo so associadas ao consumo de peixes e frutos do mar crus, impropriamente cozidos ou cozidos corretamente, mas recontaminados, sendo a ostra
um dos maiores riscos. Os sintomas tpicos de doena alimentar causada por V.
parahaemolyticus so diarrias, dores abdominais, nuseas, vmitos, dores de
cabea, febre e tremores (FORSYTHE, 2002).
De acordo com CDC (2004), na sia, estes microrganismos tm sido uma causa comum de doena alimentar. Nos Estados Unidos, eles so pouco implicados
como agentes etiolgicos de doena, estimando-se de 30 a 40 casos por ano. O
controle dessas infeces pode ser realizado por meio de resfriamento adequado
aps a pesca e pela coco completa dos produtos. Tambm, pode ser controlada,
evitando-se a mistura de pescados, oriundos de guas costeiras, nas pocas mais
quentes do ano, que apresentam elevadas contagens de Vibrio spp. sobretudo V.
parahaemolyticus, com produtos marinhos capturados em guas mais profundas

cap.05

(CDC, 2004; GERMANO; GERMANO, 2001).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

3.1.12. Vibrio vulnificus


Vibrio vulnificus um microrganismo Gram-negativo, haloflico, Gram-negativo
que fermenta lactose. um patgeno oportunista, sendo encontrado em ambientes
marinhos e em guas salobras de lagos. Est associado a vrios alimentos de origem
marinha, como ostras, moluscos e caranguejos (FDA, 2004).
O microrganismo tem a capacidade de invadir e destruir tecidos, sendo, portanto, associado com infeces que originam feridas e septicemias fatais. Os sintomas
tpicos da doena alimentar causada por V. vulnificus so febre, tremores, nuseas e
leses na pele (FORSYTHE, 2002). A dose infecciosa para os sintomas gastrointestinais em pessoas saudveis desconhecida, mas para pessoas predispostas septicemia pode ocorrer com doses menores que 100 microrganismos (FDA, 2004).
De acordo com CDC (2004), V. vulnificus raramente causa doena. Pessoas
imunodeprimidas, especialmente aquelas com doenas crnicas no fgado, so as
que apresentam maiores riscos quando ingerem produtos marinhos crus, particularmente as ostras. No existem evidncias de transmisso do microrganismo de
pessoa para pessoa.
O controle do microrganismo deve ser feito principalmente pela interrupo de coleta de ostras se as temperaturas da gua excederem 25 C e tambm
pelo resfriamento e manuteno das ostras a temperaturas menores que 15 C
(FORSYTHE, 2002).

3.1.13. Streptococcus spp.


252

Streptococcus spp. so cocos Gram-positivos microaerfilos, imveis e se


apresentam em cadeias ou pares. O gnero definido por meio da combinao de
caractersticas antignicas, hemolticas e fisiolgicas nos grupos A, B, C, D, F e G.
Os grupos A e D podem ser transmitidos aos humanos via alimentos. Os sintomas
de infeces causadas por estreptococos do grupo A so: inflamao e irritao na
garganta, dores ao engolir, amidalite, febre alta e dor de cabea, nusea e vmito,
mal-estar e escorrimento do nariz (FORSYTHE, 2002).
Os alimentos em que se pode encontrar Streptococcus do grupo A incluem leite,
sorvetes, ovos, lagostas ao vapor, presunto, salada de batata, salada de ovos, manjar,
pudim de arroz e salada de camares. A contaminao dos alimentos o resultado
de prticas higinicas inadequadas, manipulao de alimentos por pessoas doentes
ou portadoras assintomticas, ou uso de leite no pasteurizado. Os alimentos que
apresentam contaminao com Streptococcus do grupo D incluem salsichas, leite
evaporado, queijos, croquetes de carne, torta de carne, leite cru e pasteurizado. A
sua entrada na cadeia produtiva devida ao processamento inadequado e condies
higinicas de preparao de alimentos insatisfatria (FDA, 2004).

A preveno e controle de contaminao de alimentos por estreptococos so


realizados por meio de cuidados com higiene pessoal e da excluso de manipuladores com dor de garganta da rea de produo.

3.1.14. Doenas Alimentares por Vrus


O vrus Norwalk o representante de patgeno conhecido como Small
Round Structured Viruses, ou SRSV, que provoca doenas denominadas caliciviroses. Esses microrganismos subdividem-se em cinco grupos distintos, quanto sorologia, e tm sido nomeados de acordo com os locais onde as doenas
ocorrem. Quatro grupos so conhecidos como patgenos humanos: o vrus tipo
Norwalk, com estrutura pequena e redonda, o vrus da hepatite E, o vrus Sapporo
e a forma marinha (animal) de calicivrus. O quinto grupo que causa uma doena
hemorrgica em coelhos ainda no foi incriminado como patgeno humano (FDA,
2004; FORSYTHE, 2002). O vrus tipo Norwalk foi o primeiro a ser associado com
surtos de gastroenterite aguda e foi nomeado com base na localizao do surto de
Norwalk (Snow Mountain, Hawaii) (FORSYTHE, 2002).
A doena caracterizada por nusea, vmito, diarria e dor abdominal, dor
de cabea, e febre de intensidade mdia tambm pode ocorrer. A dose infecciosa
desconhecida, mas presume-se ser baixa. As gastroenterites causadas pelo vrus
Norwalk so transmitidas por via fecal-oral atravs da gua e dos alimentos contaminados (FDA, 2004). A gua pode ser de origem municipal, como de poos, lagos
de recreao, piscinas e guas armazenadas em navios de cruzeiro. Em relao
aos alimentos, podem-se destacar os moluscos e ostras, principalmente crus, e
os ingredientes para saladas. O controle do vrus baseia-se em evitar o contato de
alimentos com gua contaminada e manipuladores infectados.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Em surtos de doenas alimentares causadas por estreptococos, um grande


nmero de estreptococos, hemolticos ou no, foram isolados de alimentos. Na
maioria dos surtos, implicado S. faecalis. No entanto, S. viridans tambm pode
ser incriminado (HOBBS; ROBERTS, 1999).

253

O vrus da hepatite A (HAV) um vrus RNA de fita simples, pertencente ao


grupo dos enterovrus da famlia Picornaviridae. A hepatite A, anteriormente denominada hepatite infecciosa, transmite-se pela via fecal-oral (FRANCO; LANDGRAF,
1996). Seu perodo de incubao mdio de 30 dias, porm pode variar de 15 a 45
dias. Esse perodo depende da quantidade de partculas virais ingeridas, diminuindo
medida que aumenta a dose infectante. Os principais sintomas so: fadiga, febre,
perda de apetite e nuseas. Na evoluo da doena, observam-se dor abdominal e
vmitos e, em fase mais adiantada, ictercia e escurecimento da urina (GERMANO;
GERMANO, 2001).

cap.05

O HAV excretado nas fezes de pessoas infectadas e pode produzir doenas quando indivduos susceptveis consomem alimentos ou gua contaminados.
Presunto e sanduches, frutas e sucos de frutas, leite e produtos lcteos, vegetais,

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254

saladas, moluscos e bebidas geladas so normalmente implicados em surtos. A


contaminao de alimentos por intermdio de manipuladores infectados comum.
O vrus no se multiplica nos alimentos, que so apenas veculos (FORSYTHE, 2002).
O vrus da hepatite A tem resistncia ao calor elevado, suportando temperaturas de
60 C por 30 min.
O vrus da hepatite E (HEV) tambm um importante agente etiolgico de
doenas. Trata-se de um vrus esfrico com fita simples de RNA, no encapsulado,
que possui aproximadamente 32 a 34 nm (FORSYTHE, 2002). O homem tem sido
incriminado como hospedeiro natural do vrus da hepatite E, embora haja possibilidade de ser encontrado em outros animais, como os ratos. Essa doena no
deve ser confundida com outras hepatites, transmitidas por via parenteral, como
a hepatite C ou outras. A transmisso do vrus ocorre principalmente por meio da
ingesto de gua contaminada, o que o pode determinar a ocorrncia de casos
isolados ou at mesmo de epidemias.
Os sintomas incluem indisposio, anorexia, dor abdominal e febre. A dose
infectante no conhecida. A taxa de letalidade similar da hepatite A (FDA,
2004). De acordo com o CDC (2003), o perodo de incubao em mdia de 40 dias,
podendo variar de 15 a 60 dias. Os casos fatais esto na mdia de 1 % a 3 %, no
entanto, em mulheres grvidas atingem entre 15 % a 25 %. gua ou alimentos, principalmente moluscos contaminados por esgoto so os principais veculos do vrus.
O rotavrus pertence famlia Reoviridae, tem aproximadamente 70 nm de dimetro e contm RNA com fita dupla. Seis grupos sorolgicos foram identificados,
em que trs deles (A, B e C) contaminam o homem. As gastroenterites causadas por
rotavrus so autolimitantes, variam de brandas a graves e so caracterizadas por
vmitos, diarria aquosa e febre baixa. Presume-se que a dose infecciosa esteja entre 10 e 100 partculas virais (JAY, 1994; FORSYTHE, 2002). Os vrus causam leses
nas clulas do intestino delgado, principalmente naquelas da parede lateral e do
topo das vilosidades. O processo infeccioso instala-se em cerca de 48 h, regredindo
aps trs a cinco dias (FRANCO; LANDGRAF, 1996).
Os rotavrus do grupo A so responsveis por endemias de abrangncia
mundial. Eles tm sido causa de diarrias severas entre crianas e jovens e responsveis pela metade dos casos de hospitalizao. Mais de trs milhes de casos
de gastreenterite por rotavrus ocorrem anualmente nos Estados Unidos, mas o
nmero atribudo aos alimentos contaminados desconhecido. O grupo B que
causa uma doena conhecida como diarria de adulto afeta milhares de pessoas anualmente na China. O grupo C tem sido associado a casos espordicos de
diarria em crianas, em muitos pases. Entretanto, as primeiras enfermidades do
grupo C foram relatadas no Japo (FDA, 2004).
A via oral o principal modo de transmisso. A contaminao pode ser alcanada de pessoa a pessoa e disseminada por mos contaminadas. Os manipulado-

3.1.15. Outros Microrganismos


Alm dos microrganismos patognicos anteriormente mencionados, deve-se
tambm relacionar outros Gram-negativos de importncia na produo de alimentos seguros. Dentre eles, esto Brucella melitensis, Brucella abortus e Brucella
suis e tambm Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae e Aeromonas sobria e
Pleisiomonas shigelloides.
As bactrias do gnero Brucella provocam a doena denominada brucelose,
importante do ponto de vista de sade pblica. Brucella um coco-bacilo Gramnegativo, estritamente aerbio. Esse microrganismo aloja-se em animais e causa
infeces acidentais em humanos. Brucella melitensis, causa brucelose em caprinos, B. abortus em gado e B. suis em suno (FORSYTHE, 2002). O homem suscetvel infeco pelas brucelas clssicas: a espcie mais patognica e invasora para
o homem Brucella melitensis, seguindo-se de B. suis e B. abortus (GERMANO;
GERMANO, 2001).
O homem torna-se contaminado pelo contato com animais ou com produtos

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

res contaminados podem contaminar os alimentos servidos crus, como saladas e


frutas (FDA, 2004). O controle do vrus consiste na preveno da contaminao de
alimentos por gua poluda ou por manipuladores contaminados.

de animais que so contaminados com essa bactria. No homem, a brucelose pode


causar sintomas similares aos da gripe, como febre, suor, dor de cabea e fraqueza. No entanto, infeces severas do sistema nervoso central ou da membrana do
corao podem ocorrer. Bruceloses tambm podem originar sintomas crnicos que
incluem febres constantes, dores musculares e fadiga (CDC, 2004).

255

Os alimentos incriminados como via de transmisso de B. melitensis para


o homem so os queijos frescos e o leite cru de cabra ou ovelha. J o leite de
vaca cru e os produtos lcteos contaminados por B. abortus podem levar a casos
espordicos de brucelose.
A preveno da brucelose est baseada na erradicao ou no controle do microrganismo nos animais hospedeiros, nas prticas higinicas corretas e na adequao dos tratamentos trmicos de produtos lcteos e outros alimentos.
O gnero Aeromonas pertence a famlia Vibrionaceae e apresenta dois grupos
distintos: o primeiro representado pelas espcies imveis deste gnero como A.
salmonicida, um microrganismo psicrotrfico e no patognico ao homem. O segundo grupo formado por espcies mveis desse gnero e inclui A. hydrophila,
A. caviae e A. sobria. As espcies mveis do gnero Aeromonas so bacilos Gramnegativos, anaerbios facultativos. Possuem flagelo polar, geralmente monotrquio,
so heterotrficas, produtoras de oxidase e catalase e fermentadoras de carboidracap.05

tos, com produo de cido e gs (FRANCO; LANDGRAF, 1996).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


256

Algumas espcies de A. hydrophila causam doenas em peixes, em anfbios e


no homem e so encontradas em guas frescas e, ou, salobras. Esses microrganismos tm sido freqentemente encontrados em peixes, carnes vermelhas e aves. O
homem adquire a infeco atravs de feridas ou por ingesto de gua e de alimentos
contaminados. Poucas informaes so conhecidas sobre o mecanismo de virulncia
de A. hydrophila; ento se presume que nem todas as espcies so patognicas. Estudos com voluntrios humanos (dose 1011 clulas) falharam em demonstrar qualquer
associao do agente com a doena no homem (FDA, 2004; FORSYTHE, 2002).
Os sintomas gerais de gastroenterites causadas por A. hydrophila so: diarria,
dores abdominais, nuseas, tremores e dores de cabea, colite, podendo ocorrer,
ainda, septicemia, meningite, endocardite e lceras das crneas. As espcies A. caviae e A. sobria tambm podem causar enterite em qualquer pessoa ou septicemia
em pessoas imunodeprimidas ou debilitadas.
As espcies de Pleisiomonas so bastonetes Gram-negativos, anaerbias facultativas, catalase e oxidase positivas e fermentadoras de acares. Pertencem famlia
Vibrionaceae e apresentam vrios antgenos O e alguns H (FRANCO; LANDGRAF,
1996). No h certeza de que P. shigelloides seja causadora de doena no homem.
No entanto, h fortes indcios de sua associao com diarrias em humanos (FDA,
2004).
Esses microrganismos tm sido isolados de gua, peixes, frutos do mar e, ainda, de muitos tipos de animais, como bovinos, caprinos, sunos, gatos, cachorros,
macacos, abutres, cobras e sapos. Suspeita-se de que nascentes de gua sejam a
principal origem de possveis surtos causados por P. shigelloides. A ingesto de P.
shigelloides nem sempre causa doena no animal hospedeiro, que pode se tornar
um veiculador temporrio do microrganismo.
A dose infecciosa presumidamente acima de 106 UFC.g-1. A patogenicidade
da infeco causada por P. shigelloides no conhecida. Os sintomas tpicos de
gastroenterite causada por esse microrganismo incluem diarria, dor abdominal,
nusea, tremores, febre branda, dores de cabea e vmitos (FORSYTHE, 2002).
O principal mtodo de controle desses microrganismos a coco adequada de
moluscos antes da ingesto.

3.2. Elucidao de Surtos


Para que a avaliao de surtos de doenas de origem alimentar seja bem-sucedida,
as etapas de uma investigao epidemiolgica devem ser conhecidas. As informaes
necessrias investigao so obtidas aplicando-se questionrios envolvendo pessoas
e os alimentos relacionados no surto, o comportamento de manipuladores, as condies de processamento (Quadro 6) e um bom conhecimento dos possveis agentes
etiolgicos. Alm disso, devem ser realizadas avaliaes laboratoriais dos alimentos
suspeitos e, tambm, de amostras de sangue, fezes e vmitos de pessoas doentes,
quando necessrio.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos


257

cap.05

Quadro 6 - Um exemplo de modelo de um questionrio para avaliao epidemiolgica de surtos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Dentre os aspectos levantados pela epidemiologia, so importantes a determinao da sintomatologia e do perodo de incubao, a durao da doena e os
alimentos envolvidos.
Em relao sintomatologia, devem-se considerar aqueles predominantes, que
fornecem fortes indcios do tipo de enfermidade envolvida no surto (Quadro 7). Se a
ocorrncia sintomatolgica principal do surto for em vmitos sem febre, a suspeita
recai sobre a intoxicao emtica, o que remete a S. aureus, e a forma vomitiva de
B. cereus. Esses sintomas devem atingir porcentuais elevados de incidncia entre as
pessoas doentes envolvidas no surto. Por exemplo, nesse surto, acima de 80% das
pessoas devem apresentar vmitos sem febre como principal sintoma.
Quadro 7 - Sintomas predominantes, tipos de doenas e possveis agentes etiolgicos.

258

Uma sintomatologia caracterizada por diarria sem febre indica que a doena pode no entanto, ser uma intoxicao diarrica, que por sua vez sugere que
o agente etiolgico B. cereus em sua forma clssica ou C. perfringens. Se a
diarria aquosa semelhante gua de arroz, coloca-se sob suspeio a clera e
como possvel agente etiolgico V. cholerae. Diarria sanguinolenta e com muco
e pus sugere invaso do tecido celular intestinal, evidenciando-se uma infecco
disentrica. Enquanto febre caracteriza uma infeco, problemas neurolgicos
esto relacionados ao botulismo alimentar.
Os sintomas complementares so importantes para auxiliar o diagnstico da doena. Dores musculares e abdominais, mal-estar, calafrios e cefalia, dentre outros,
fazem parte desses sintomas. Alm disso, caso no sejam identificados como predominantes, diarria, vmitos e febre so tambm considerados complementares.
O perodo de incubao da doena tambm auxilia o diagnstico. Refere-se
ao tempo decorrido entre a ingesto do alimento contaminado e a manifestao da

Quando se dispe de informaes corretamente obtidas pelo levantamento


epidemiolgico, pode-se determinar o perodo mdio de incubao pela mdia
ponderada obtida dos diversos perodos de incubao e dos respectivos nmeros
de casos ocorridos no surto (Quadro 8).
Quadro 8 - Exemplo de clculo do perodo mdio de incubao

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

doena. A ocorrncia de uma intoxicao emtica pode ser diferenciada da diarrica


por meio do perodo de incubao. A toxina causadora da intoxicao emtica atua
no trato gastrointestinal superior e comea a agir num tempo mdio de 2 h, aps
a ingesto do alimento contaminado. J aquela que provoca a intoxicao por C.
perfringens atua no trato digestrio inferior aps um perodo mdio de incubao
de 12 h. Entretanto, prev-se que a maioria das infeces tem em mdia perodos
de incubao acima de 24 h.

259

A durao da doena corresponde ao perodo necessrio para a recuperao


dos pacientes, e pode ser determinada em um levantamento epidemiolgico corretamente realizado. Normalmente, as intoxicaes emtica e diarrica apresentam
durao mdia de 24 h. As infeces normalmente apresentam um tempo de durao maior, podendo-se passar dias ou semanas at que os pacientes se recuperem.
comum a necessidade do auxlio mdico com internao hospitalar, a exemplo do
que acontece com a febre tifo. Uma doena parte, em razo de sua gravidade, a
intoxicao botulnica: quando no resulta em morte, pode durar dias a meses, com
um prolongado tratamento clnico.
A determinao do alimento suspeito envolvido no surto importante na definio do tipo de doena, considerando-se a relao entre alimentos e sua microbiota. A incriminao de determinado alimento fundamenta-se nos ndices especficos
de ataques (IEA) dos diversos alimentos suspeitos. incriminado o alimento que
apresentar o maior ndice de ataque positivo.

cap.05

O IEA consiste na diferena entre as taxas de ataque das pessoas que comeram
determinado alimento e ficaram doentes (TCFD) e aquelas que no o comeram e no

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ficaram doentes (TNCFD). Obtm-se a TCFD pela diviso do nmero de pessoas que
comeram um alimento especfico e ficaram doentes (CFD) pelo nmero total (T) dos
que ingeriram o alimento, multiplicando-se por 100. De forma semelhante, obtm-se
a TNCFD dividindo o nmero de pessoas que no comeram um alimento especfico,
mas que ficaram doentes (NCFD), multiplicando-se por 100.
Assim, pode-se representar matematicamente IEA, TCFD e TNCFD:

A seguir, encontra-se um exemplo hipottico para a definio do alimento suspeito em surto. A partir dos dados epidemiolgicos do Quadro 9, foram obtidas as
informaes contidas no Quadro 10.
Quadro 9 - Dados de um levantamento epidemiolgico hipottico

260

Quadro 10 - Taxas e ndices de ataques para alimentos especficos

Verifica-se, assim, que os ndices de ataque (Quadro 10) para os alimentos A, B,


C e D foram -20, -15, 38 e 12, respectivamente. Portanto, o alimento C o principal
suspeito de provocar a doena, pois apresentou o maior ndice de ataque positivo.
Sem dvida, a avaliao laboratorial dos alimentos suspeitos imprescindvel
para elucidar completamente o surto, complementando e confirmando as informaes obtidas na avaliao epidemiolgica. Sugerem-se dois grupos de anlises

elucidao: as anlises especficas que esto diretamente relacionadas ao surto.


Essas anlises se referem principalmente presena de microrganismo ou toxina
nos alimentos suspeitos e, ou, no sangue, vmitos e fezes dos pacientes. Assim,
havendo suspeita de ocorrncia de intoxicao emtica, deve-se avaliar a presena da enterotoxina estafiloccica nos alimentos, nos vmitos e nas fezes. Em caso
de botulismo, determina-se a presena da toxina botulnica nas fezes e no sangue.
Nas demais doenas, busca-se a presena dos microrganismos nos vmitos, nas
fezes e, se for o caso, no sangue dos pacientes.
Outro grupo de anlises que pode ser til na compreenso do surto e que
auxilia a sua elucidao refere-se s anlises para atendimento da RDC n 12, da ANVISA/MS, de 02 de janeiro de 2001. De acordo com essa Resoluo e dependendo
do tipo de alimento, devem-se efetuar uma ou mais das seguintes anlises microbiolgicas: presena de Salmonella spp em 25 g ou mL; estafilococos coagulase
positiva; aerbios mesfilos viveis; Bacillus cereus; Pseudomonas aeruginosa;
fungos filamentosos e leveduras; coliformes a 35 C; coliformes a 45 C; clostrdios
sulfito-redutores; Vibrio parahaemolyticus e, ainda, o teste de esterilidade, quando for o caso. A denominao coliformes a 45 C equivalente denominao
de coliformes de origem fecal e de coliformes termotolerantes. A presena de

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

microbiolgicas para auxiliar o diagnstico da doena. Um deles decisivo na

clostrdio sulfito redutor a 46 C indica a ocorrncia de Clostridium perfringens. A


enumerao de estafilococos coagulase positiva tem por objetivo substituir a determinao de Staphylococcus aureus. A determinao da capacidade de produo de
termonuclease e de toxinas estafiloccicas das cepas isoladas deve ser realizada, a
fim de obter dados de interesse sade pblica. Para conhecer as anlises adequa-

261

das a um alimento especfico, deve-se consultar RDC n12/2001.


Essas anlises de rotina podem reforar as informaes obtidas no levantamento epidemiolgico e permitem que no diagnstico final sejam levados em considerao aspectos da legislao vigente sobre a qualidade dos alimentos envolvidos
em determinado surto.
As metodologias para amostragem, colheita, acondicionamento, transporte
e anlise microbiolgica de amostras de produtos alimentcios devem atender a
uma ou mais das seguintes publicaes de reconhecimento internacional: Codex
Alimentarius, International Commission on Microbiological Specifications for Foods
(ICMSF); Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods e
Standard Methods for the Examination of Dairy Products da American Public Health
Association (APHA); Bacteriological Analytical Manual da Food and Drug Administration, editado pela Association of Official Analytical Chemists (FDA/AOAC), em
suas ltimas edies e, ou, revises, assim como outras metodologias publicadas
cap.05

por rgos nacionais ou internacionais reconhecidos.

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Quadro 11 - Grupos de alimentos que tm padres microbiolgicos estabelecidos pela RDC


n12, da Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria, em 2 de janeiro de 2001

262

Por exemplo, caso a avaliao epidemiolgica indique a possibilidade de uma


intoxicao emtica, sendo o principal suspeito um prato base de carne, haver
mais indcios para confirmar o laudo se a contagem de coliformes fecais, grupo in-

a anlise de Staphylococcus aureus ou de Bacillus cereus, os principais agentes


etiolgicos suspeitos. Se o nmero mais provvel (NMP) de coliformes fecais for
maior do que 100 por g ou mL, a RDC indica tratar-se de um alimento em condies
higinico-sanitrias insatisfatrias.
No caso da aplicao da RDC n12, importante que as amostras sejam colhidas dentro de planos de amostragem bem estabelecidos. Para o entendimento
correto desses planos, os significados de alguns valores devem ser conhecidos.
Por exemplo, o valor m o limite que, em um plano de trs classes, separa o
lote aceitvel do produto ou lote com qualidade intermediria aceitvel. J M o
limite que, em plano de duas classes, separa o produto aceitvel do inaceitvel. Em
um plano de trs classes, M separa o lote com qualidade intermediria aceitvel do
lote inaceitvel. Valores acima de M so inaceitveis. No entanto, n o nmero de
unidades a serem colhidas aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente. Nos casos em que o padro estabelecido de ausncia em 25 g, como
em Salmonella e L. monocytogenes, possvel a mistura das alquotas retiradas
de cada unidade amostral, respeitando-se a proporo p/v (uma parte em peso da
amostra, para 10 partes em volume do meio de cultura em caldo). E, ainda, c o

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

dicador de condies higinico-sanitrias, estiver elevada, mesmo que no se tenha

nmero mximo aceitvel de unidades de amostras com contagens entre os limites


de m e M em planos de trs classes. Nos casos em que o padro microbiolgico seja
expresso por ausncia, c igual a zero, aplica-se o plano de duas classes.
As anlises microbiolgicas embasam a interpretao dos resultados, que, con-

263

forme a RDC n12, incluem-se em duas categorias: 1) produtos em condies sanitrias satisfatrias que se referem queles cujos resultados analticos esto abaixo ou
igual aos estabelecidos para uma amostra indicativa ou uma amostra representativa, e
2) produtos em condies sanitrias insatisfatrias que so aqueles cujos resultados
analticos esto acima dos estabelecidos para amostra indicativa ou amostra representativa. Essa interpretao permite a emisso de laudos com as seguintes alternativas: a) produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) de
acordo com os padres legais vigentes para as situaes enquadradas na categoria
1; b) produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) imprprio para o consumo humano por apresentar (citar o(s) resultado(s) analtico(s) e
o(s) parmetro(s) no atendido(s) do anexo i) nas situaes na interpretao 2; ou c)
produto ou lote (se amostra indicativa ou representativa, respectivamente) imprprio
para o consumo humano por apresentar (microrganismo patognico ou toxina que

cap.05

representa perigo severo sade do consumidor).

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Veja, como exemplo, as informaes contidas no Quadro 12, conforme constam


do grupo de alimentos nmero 15 da RDC, referente s especiarias.
Quadro 12 - Padres microbiolgicos definidos na RDC n12, da Agncia Nacional de Vigilncia
Sanitria (ANVISA) de 2 janeiro de 2001 para especiarias

Nesse caso, significa que uma amostra indicativa pode apresentar um mximo
de 5x102 de coliformes 45 C por grama de especiarias ntegras e modas para que
seja considerado de acordo como os padres legais vigentes. Quando a amostra
for representativa, isso significa que foram coletadas cinco amostras e que, para
que o lote seja considerado de acordo com os padres legais vigentes, no mximo
duas delas (c) apresentam contagens entre 102 (m) e 5x102 UFC.g-1 (M) contagens de
coliformes a 45 C. As contagens desses microrganismos foram inferiores ou iguais
a 102 UFC.g-1, nas outras trs amostras.

264

Deve-se considerar, para auxlio ao diagnstico, a disponibilidade de informaes sobre anlises microscpicas realizadas nos alimentos envolvidos no surto.
Embora de execuo simples, essas tcnicas exigem analistas bem treinados e experientes. importante na elucidao do surto o conjunto de informaes envolvendo morfologia, agrupamento e caractersticas tintoriais, como colorao Gram
para clulas vegetativas e verde-malaquita, que permite determinar localizao e
tamanho de esporos bacterianos (Quadro 13).
Por exemplo, a constatao de bastonetes Gram-positivos e a presena simultnea de esporos centrais no intumescidos em determinado alimento pode auxiliar
a incriminao de Bacillus cereus. indcio de contaminao com Staphylococcus
aureus a constatao no alimento suspeito da presena de nmero elevado de cocos
em cacho Gram-positivo. No entanto, se a avaliao epidemiolgica fornece subsdios
para suspeitar-se de uma salmonelose, deve-se pesquisar na anlise microscpica a
ocorrncia de bastonetes curtos Gram-negativos, no formadores de esporos.

Concluso
A produo de alimentos com qualidades nutritivas e sensoriais e seguros sob

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

Quadro 13 - Caractersticas morfolgicas e tintoriais de clulas vegetativas e de esporos


bacterianos

os aspectos fsico-qumicos e microbiolgicos envolve conhecimentos sobre fatores do crescimento microbiano associados com o processamento. Alm disso, os
profissionais da rea devem estar preparados para elucidar e diagnosticar possveis
de novos surtos.

265

cap.05

surtos de doenas de origem alimentar e para tomar medida visando preveno

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Referncias
ALLOS, B.M. Campylobacter jejuni infection as a cause of the Guillain Barr syndrome. Emerging
Infectious Disease., v.12, p.173-184. 1998.
ALZAMORA, S. M.; TAPIA, M.S.; LPEZ-MALO, A. Minimally Processed Fruits and Vegetables. Fundamental Aspects and Applications. An Aspen Publication. Maryland, 2000.360p
ALZAMORA, S.M. Fundamentos del mtodo de conservao por fatores combinados. In: MAUPEY,
P. F.; GRAU, A. A. BOIX, A. C. eds. Aplications de factores combinados en la conservacion de alimentos: Valencia : Universidade Politcnica de Valencia, Servicio de Publicaciones 1994. p. 1-26.
BARBOSA-CNOVAS, G. V., POTHAKAMURY, U. R., PALOU, E., SWANSON, B. G. Conservacin no
Trmica de los Alimentos. Zaragoza, Editorial Acribia S.A, 280p. 1998.
BARNHART HM, DREESEN DW, BASTIEN R, PANCORBO O.C. Prevalence of Salmonella enteritidis and
other serovars in ovaries of layer hens at time of slaughter. Journal of Food Protection; v.54, p.488-491.
1991
BENNETT, R.W. Staphylococcal enterotoxins. In: Compendium of Methods for the Microbiological
Examinations of Foods.Ch 34. 3td ed. American Public Association; Washington D.C. 1992.
BERGDOLL, M.S. Enterotoxin H in staphylococcal food poisoning. Journal of Food Protection, v.59,
p.559-561, 1996.
BERGDOLL, M.S; BENNETT, R.W. Staphylococcal enterotoxins. In Compendium of Methods for the
Microbiological Examinations of Foods. Ch 34. 2nd ed. American Public Association; Washington
D.C. p428-457. 1989.
BLACK, R.E., M.M. LEVINE, M.L. CLEMENTS, T.P. HUGHES AND M.J. BLASER.. Experimental Campylobacter jejuni infection in humans. Journal of Infectious Disease, v. 157, p.472-479,1988.
BRASIL, 1995. Ministrio da Agricultura - Portaria SDA. N.126, de 06 novembro 1995. Dirio Oficial da
Unio, Braslia, DF. MAA. [ Normas para diagnstico das Salmoneloses avirias,. 1995
CDC- Center for Diseases Control and Prevention. Multistate Outbreaks of Salmonella Serotype Poona Infections Associated with Eating Cantaloupe from Mxico- United States and Canada, 20002002. v. 51, p.1044-1047. 2002.

266

CDC- Center for Diseases Control and Prevention. Preliminary FoodNet Data on the Incidence of
Foodborne Illnesses-Selected Sites, United States, v.51, p.325-329. 2002.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Botulism. 2004. Disponvel em http:\\www.
cdc.gov. Acesso em julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Brucellosis. 2003. http:\\www.cdc.gov. Acesso em julho de 2004.
CDC- Center or Diseases Control. Disease Information. Escherichia coli O157:H7. 2004. Disponvel em
http:\\ www.cdc.gov. Acesso em Julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Hepatitis E. 2003. Disponvel em http:\\www.
cdc.gov. Acesso em julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Listeriosis. 2003. Disponvel em http:\\ www.
cdc.gov. Acesso em Julho de 2004
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Shigellosis. 2003. Disponivel em http:\\www.
cdc.gov. Acesso em Julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Vibrio parahaemolyticus. 2004. Disponvel
em http:\\www.cdc.gov. Acesso em julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Disease Information. Yersinia enterocolitica. 2004. Disponvel em
http:\\www.cdc.gov. Acesso em julho de 2004.

CDC- Center for Diseases Control. SE outbreaks reported; 1992. MMWR 1993. Disponvel em http:\\
www.cdc.gov. Acesso em julho de 2004.
CDC- Center for Diseases Control. Update: Salmonella enteritidis infections and shell eggs - United
States, 1990. MMWR 1990; 39: 902-912 / 41: 369-372.
CDC- Centers for Disease Control and Prevention. Disease Information. Salmonellosis. reviewed in
2003. Disponvel em http://www.cdc.org. Acesso em julho de 2004.
CDC- Centers for Disease Control and Prevention. Disponvel em http://www.cdc.org./ncidod/dbmd/
diseaseinfo/foodborneinfections.htm Acesso em novembro de 2006.
CENEPI - FUNASA - MS. Manual Integrado de Preveno e Controle de Doenas Transmitidas por
Alimentos, 2001.
CHIRIFE, J.; FAVETTO, G.J. Some physico-chemical basis of food preservation by combined methods. Food Research International, v.25, p. 389-396, 1992.
DAOUST, J.-Y. Salmonella and the International Food Trade. International Journal of Food Microbiology, v.24, p.11-31, 1994.
DAZA, M. S. T.; ALZAMORA, S.M.; WELTI-CHANES, J. Minimally processed high-moisture fruit
products by combined methods. Results of a multinational project. In : FITO, P.; ORTEGA-RODRIGUEZ, E.; BARBOSA-CANOVAS,G.V (Ed). Food Engineering, New York: Chapman & Hall, 1997. Cap.
10, p.161-180., 2000.
DIEHL, J.F. Will irradiation enhance or reduce food safety?. Food Policy, v. 18 p.143-151.1993.
EBEL ED, DAVID MJ, MASON J. Occurrence of Salmonella enteritidis in the US commercial egg
industry. Report on a national spent hen survey. Avian Diseases 1992; 36: 646-654.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

CDC- Center for Diseases Control. Outbreak of Salmonella enteritidis associated with consumption of rAA shell eggs; 1991. MMWR 1992. Disponvel em http:\\www.cdc.gov. Acesso em Julho de
2004.

FARKAS, J. Irradiation of Dry Food Ingredients, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988.
FELLOWS, P. Food processing technology, principles and practice. Ed. Woodwead Pub. Limited,
Cambridge, England. p. 186-194. 1997.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety & Applied Nutrition. Bacteriological Analytical
Manual, 8th Edition, Revision A, 1998 Chapter 7. March 2001. Disponvel em http:\\www.fda.org.
Acesso em junho de 2004.

267

Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Yersinia enterocolitica. 2004. Disponvel em http:\\
www.fda.gov. Acesso em Julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Cl. perfringens. 2004. Disponvel em http:\\www.fda.
gov. Acesso em Julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Bacillus cereus and other Bacillus. 2004. Disponvel
em http:\\www.fda.gov. Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Vibrio parahaemolyticus. 2004. Disponvel em
http:\\www.fda.gov. Acesso em Julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Vibrio vulnificus. 2004. Disponvel em http:\\www.
fda.gov. Acesso em julho de 2004.

cap.05

Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Yersinia enterocolitica. 2004. Disponvel em http:\\
www.fda.gov. Acesso em julho de 2004.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Streptococcus spp. 2004. Disponvel em http:\\
www.fda.gov. Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Norwalk Vrus. 2004. Disponvel em http:\\www.
fda.gov. Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook.Hepatitis E. 2004. Disponvel em http:\\www.fda.
gov. Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Rotavrus. 2004. Disponvel em http:\\www.fda.gov.
Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Aeromonas hydrophila. 2004. Disponvel em http:\\
www.fda.gov. Acesso em julho de 2004.
Food and Drug Administration. Center for Food Safety and Applied Nutrition. Foodborne Pathogenic
Microorganisms and Natural Toxins Handbook. Plesiomonas. 2004. Disponvel em http:\\www.fda.
gov. Acesso em julho de 2004.
FORSYTHE, S., J. Microbiologia da segurana alimentar. ARTMED, Porto Alegre - RS, 2002.
FRANCO, B.D.G.M., LANDGRAF, M. Microbiologia de Alimentos. So Paulo: Atheneu, 1998. 182 p.
GERMANO, M. P. L.; GERMANO, M. I. S. Higiene e Vigilncia Sanitria de Alimentos, So Paulo:
Livraria Varela. 2001. 629 p.
HALPIN-DOHNALEK, M.I.; MARTH, E.H. Staphylococcus aureus: production of extracellular compounds and behavior in foods, a review. Journal of Food Protection, v.52, n.4, p.267-268, 1989.
HEALTH CANADA. An outbreak of Escherichia coli O157:H7 infection associated with unpasteurized
on-commercial, custom-pressed apple cider- Ontrio 1998. Disease Report., v.25, 7 pp. 1999.

268

HOBBS, B.C; ROBERTS, D. Toxinfeces e Controle Higinico- Sanitrio de Alimentos. Ed. Varela,
1999. 376p.
ICMSF. International Commission on Microbiological Specifications for Foods. Microrganisms in Foods
6. Microbial Ecology of Food Commodities. First edition. 1998. Blackie Academic and Professional.
615 p.
IFPA- International Fresh-cut Produce Association. Food Safety Guidelines for the Fresh-cut Produce
Industry. 4th, 2001. 213p.
JAY, J. M. Microbiologia Moderna de Los Alimientos. Terceira Edicion. Editorial ACRIBIA. S. A.
Zaragoza. 1994. 804 p.
LAANENM P. V. Understanding food irradiation (http://ifse.tamu.edu/ifse/irradiationart.html), 1999.
LAMIKANRA, O.; Fresh-cut Fruits and Vegetables: Science, Technology and Market. CRC Press,
Washington, D.C. 2002.
LEISTNER, L., GORRIS, L. G. M. food preservation by hurdle technology. Trends in Food Science and
Technology. v. 6, p.41-46, 1995.
LLORENTE FRANCO,S.,GIMENEZ, J.L., MARTINEZ SANCHEZ,F., AND ROMOJARO, F. Effectiveness
of ethylene oxide and gamma irradiation on the microbiological population of three types of paprika.
Journal of Food Science v.51, p.1571-1572,1574,1992.

MONK, J. D, BEUCHAT, L.R; Doyle, M. P. Irradiation inactivation of foodborne microorganisms. Journal of Food Protection. v.58, p.197-208,1995.
MURANO, E.A. Irratiation of Fresh Meats. Food Technology. v.49, p.52-52, 1995
OLIVEIRA, T.C. R. M; HIROOKA, E.Y. Low cost production and purification of polyclonal antibodies to
staphylococcal enterotoxin A. Ver. Microbiolo., v.30, p.120-124, 1999.
ROBERTS, C. M.; HOOVER, D. G. Sensitivity of Bacillus coagulans spores to combinations of hygh
hydrostatic, pressure, heat, acidity and nisin. Journal of Applied Bacteriology, v.81, p.363-368,1996.
SHIGEHISA, T.; OHMORIT.; SAITO,A ; TAJI, S AND HAYASHI, R. Effects of high hydrostatic pressure
on characteristics of pork slurries and inactivation of microorganisms associated with meat products.
International Food Microbiology v.12, p. 207-216,1991.
SILVA, E.N; DUARTE, A. Salmonella Enteritidis em Aves: Retrospectiva no Brasil. Revista Brasileira
de Cincia Avcola V.4, n.2, 2002.
SIMES M., MARQUES E.G. L., ROCHA M. M. M, PRANDI, M. A. G., PISANI B. Surtos alimentares por
Salmonella enteritidis ocorridos na regio de Campinas no perodo de maro de 1995 a maro de
2001. In: XXI Congresso Brasileiro de Microbiologia; 2001; Foz do Iguau, Paran. Brasil. p.413.
SKIRROW, M.B. Epidemiology of Campylobacter enteritis. International Journal. Food Microbiology,
12, 9-16. 1991.
SNOEYENBOS GH, SMYSER CF, VAN ROEKEL H. Salmonella infections of the ovary and peritoneum
of chickens. Avian Diseases; v.13, p.668-670. 1969
STYLES, M.F.; HOOVER, D.G and FARKAS, D.F. Response of Listeria monocytogenes and Vibrio
parahaemolyticus to high hydrostatic pressure. Journal of Food Science, v.56, p.1404-1407, 1991.

Controle de Doenas de Origem Alimentar no Processamento de Alimentos

LOAHARANU, P. Status and prospects of food irradiation. Food Technology. v.48, p124:131,1994.

THAYER, D.W. Wholesomeness of Irradiated Foods. Food Techonogy, v. 48, p.132-137, 1994.
TOLEDO, A. G.; VIANNA, M. S. R. Boletim de Divulgao Tcnica e Cientfica. Centro de Estudos.
Superintendncia de Controle de Zoonoses, Vigilncia e Fiscalizao Sanitria. Secretaria Municipal de Sade. Prefeitura da Cidade do Rio de Janeiro., n. 12, 2002.

269

UKUKU, D.O.; FETT, W. Behavior of Listeria monocytogenes Inoculated n Cantaloupe Surfaces and
Efficacy of Washing Treatments to Reduce Transfer from Rind to Fresh-Cut Pieces. Journal of Food
Protection. v.65, p.924-930. 2002.
UKUKU, D.O.; SAPERS, G.M. Effect of sanitizer treatments on Salmonella stanlety attached to the
surface of cantaloupe and cell transfer to fresh - cut tissues during cutting practices. Journal of Food
Protection. v.64,. p.1286-1291. 2001.
URBAIN, W.M. Food Irradiation: the past fifty years as prologue to tomorrow. Food Technology v.
43, p.76,92, 1989.
WALTMAN, WD, HORNE AM, PIRKLE C, JOHNSON D.C. Prevalence of Salmonella enteritidis in spent
hens. Avian Diseases v.36, p.251-255, 1992
WHO-World Health Organization. Campylobacter. Disponvel em http:\\www.who.int. Acesso em
julho de 2004.
WHO - World Health Organization. WHO consultation on the monitoring of antimicrobial usage in
food animals for the protection of human health; Oslo, Norway. 2001.

cap.05

WORLD HEALTH ORGANIZATION (WHO). Toxicology. In: Safety and nutritional adequacy of irradiated food. Ed. WORLD HEALTH ORGANIZATION, p. 81-108. 1997.

da o
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06

1.

Introduo

2.

Monitoramento da Qualidade da gua


2.1 Caractersticas Sensoriais
2.2 Indicadores de Riscos Sade
2.3 Indicadores da Formao de Incrustaes
2.4. Indicadores de Poluio
2.5. Indicadores da Qualidade Microbiolgica

3.

Aspectos do Tratamento da gua


3.1. Potabilizao da gua
3.2 Tratamentos Especficos de gua na Indstria de Alimentos

4.

Referncias

Nlio Jos de Andrade

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


272

A gua usada na indstria de alimentos deve ser de boa qualidade


uma vez que um insumo fundamental.

1. Introduo
Os microrganismos surgiram em meio aquoso e, a partir desse ambiente, adaptaram-se tambm ao solo, ar, plantas, trato intestinal de homens e animais, pele de
manipuladores e, ainda, em lagos, lagoas, rios e mares, que constituem as fontes
primrias da contaminao dos alimentos. O controle de qualidade da gua para
qualquer uso na indstria de alimentos necessrio para evitar possveis riscos
sade dos consumidores dos produtos comercializados. Esse controle reduz efeitos
negativos que as caractersticas fsicas, qumicas e microbiolgicas da gua podem
provocar na indstria, como processos corrosivos, depsitos de matria orgnica
e sedimentos; alm de auxiliar a fabricao de alimentos que atendam aos critrios
de qualidade exigidos dos produtos industrializados. A gua pode ser usada como
um componente da formulao de um produto e participa de vrias etapas do processamento, alm de estar em contato com alimentos, equipamentos e utenslios e
ser usada para lavagem de mos e asseio pessoal.
A indstria de alimentos deve oferecer sua contribuio sociedade, no que
se refere utilizao racional da gua e, para tanto, tem de usar esse recurso natural renovvel, j considerado escasso, com conscincia, bom senso e tecnologia
adequada. Apenas a conscientizao para a economia pode reduzir em at 30 % o
gasto de gua no processamento de alimentos. Sabe-se que a atividade industrial
no Brasil onde esto inseridas as indstrias alimentcias consome 10 % da gua
total gasta pelos diversos setores (Figura 1). A atividade agrcola consome 70 %, e
o consumo humano utiliza os 20 % restantes. Do total da gua na Terra, apenas pequena parte, cerca de 1 % potvel ou pode ser potabilizada, encontrada em rios e
lagos, dentre outros. Alm disso, prev-se que a escassez de gua j constatada em
vrias regies da Terra se aprofunde e se estenda a outras reas nos prximos anos.
Em um ranking proposto por organizaes internacionais, baseado na pontuao
obtida no apenas em funo da quantidade disponvel, o Brasil ocupa a 50 posio
dentre 147 pases avaliados (Tabelas 1 e 2).

Figura 1 - Consumo de gua por diversos setores de atividade no Brasil.

Tabela 2 - Classificao de alguns pases quanto sade hdrica

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Tabela 1 - Critrio para a classificao dos pases quanto sade hdrica

O Brasil que, a princpio, estaria classificado na 12 posio, considerando apenas a quantidade disponvel, no bem avaliado em relao, por exemplo, ao porcentual da populao que atendida com o fornecimento de gua potvel e com

273

tratamento de esgoto, ou em relao ao controle do desperdcio domstico, agrcola


ou industrial. Alm disso, o Brasil est longe de ser considerado um pas-modelo no
que se refere ao controle da poluio dos mananciais nem sua preservao. Apesar
de o pas apresentar boa quantidade de gua passvel de ser potabilizada, deve-se
lembrar de que a maior parte se encontra na regio Amaznica e que existem reas,
como algumas partes no Nordeste, onde a escassez uma realidade preocupante.

cap.06

A gua para consumo humano e uso na indstria de alimentos deve atender


aos padres fsicos, qumicos e microbiolgicos estabelecidos na legislao brasileira, de acordo com a Portaria n 518, do Ministrio da Sade, publicada em 25 de
maro de 2004 (Tabela 3). A gua aceita como potvel quando se encontra dentro
de certos requerimentos de qualidade. J foram detectados cerca de 2.000 contaminantes diferentes na gua; aproximadamente 700 deles foram encontrados em gua
potvel, demonstrando a dificuldade em se determinar quais as anlises devem ser
realizadas para se definir a qualidade da gua. As entidades e os organismos nacionais, como os Ministrios da Sade e Ministrio da Agricultura, Agncia Nacional da
gua, ou internacionais, entendem que, na impossibilidade de uma anlise de todos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

esses possveis contaminantes, a qualidade da gua seja avaliada por determinado


nmero de anlises de grupos representativos da qualidade, com a finalidade de ser
monitorada. As metodologias analticas para determinao dos parmetros fsicos,
qumicos, microbiolgicos e de radioatividade devem atender s especificaes de
entidades nacionais e, ou, internacionais. So amplamente aceitas as metodologias
publicadas na edio mais recente do Standard Methods for the Examination of
Water and Wastewater, de autoria das instituies American Public Health Association (APHA), American Water Works Association (AWWA) e Water Environment
Federation (WEF) ou as metodologias publicadas pela International Standartization
Organization (ISO).
Tabela 3 - Legislaes importantes para o uso da gua na indstria de alimentos

2. Monitoramento da Qualidade da gua


A qualidade da gua para consumo humano e seu uso na indstria de alimentos devem ser controlados de forma contnua pelos responsveis pela operao de
sistema de tratamento de gua ou soluo alternativa de abastecimento de gua.
Esse controle consiste de um conjunto de medidas e anlises destinadas a verificar
se a gua fornecida populao potvel. Solues alternativas de abastecimento

274

de gua na indstria de alimentos incluem fonte, poo comunitrio, distribuio por


veculo transportador e instalaes condominiais horizontal e vertical.
Para melhor avaliar a qualidade, a indstria deve considerar a gua uma matria-prima e usar planos de amostragem adequados. Em algumas situaes, sugere-se a aplicao de planos completos em que a gua seria submetida s anlises
previstas na legislao, incluindo, por exemplo, uso de um novo manancial, grande
mudana no tratamento e grande mudana no sistema de distribuio. Os planos
completos so aplicveis durante a implantao da indstria e repetidos anualmente
naquelas em funcionamento. Planos reduzidos so propostos quando se conhecem
a qualidade do manancial, o histrico da qualidade da gua, os tratamentos prvios
e os riscos de contaminao. Alm disso, a freqncia de anlises dependente de
vrios fatores, dentre eles se inclui o fato de ser gua de sistema de abastecimento
pblico ou de solues alternativas e dos pontos de amostragem. Assim, sugere-se
que as anlises de indicadores de poluio sejam realizadas semestralmente, que as
anlises dos indicadores da qualidade microbiolgica sejam semanais e a de cloro
residual, seja diria (Tabelas 4, 5 e 6).

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Tabela 4 - Freqncia mnima de amostragem para o controle da qualidade da gua de sistema


de abastecimento, para fins de anlises fsicas, qumicas e de radioatividade, de acordo com o
ponto de amostragem e o tipo de manancial

Tabela 5 - Nmero mnimo de amostras para o controle da qualidade da gua de sistema de


abastecimento, para fins de anlises fsicas, qumicas e de radioatividade, de acordo com o
ponto de amostragem e o tipo de manancial

275

cap.06

Tabela 6 - Nmero mnimo de amostras e freqncia mnima de amostragem para o controle da


qualidade da gua de soluo alternativa, para fins de anlises fsicas, qumicas e microbiolgicas, em razo do tipo de manancial e do ponto de amostragem

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Acerca da freqncia das anlises de gua, dois aspectos devem nortear essa
deciso: a exigncia da legislao e as especificidades de cada indstria, quando
deve prevalecer o conhecimento aliado ao bom senso dos tcnicos responsveis
pelo uso da gua.
A legislao atual prev a anlise de cerca de 90 parmetros que, sem dvida,
um nmero bastante elevado. As anlises propostas fundamentam-se em cinco
grupos principais (Tabela 7).
Tabela 7 - Grupos de anlises propostos para avaliar a qualidade da gua

As metodologias para anlises de gua so selecionadas de acordo com diversos fatores; dentre esses, podem-se citar: limite de deteco; preciso e rapidez;
equipamentos disponveis; nvel de treinamento de laboratoristas; custo da anlise;
e exigncias especficas de legislao. Aquelas usadas no Brasil fundamentam-se
em propostas de entidade de reconhecimento internacional, como APHA e AOAC
276

(American Oficial Analytical Chemist). Na Tabela 8, so mostrados os padres exigidos pela legislao brasileira para alguns parmetros das anlises

2.1. Caractersticas Sensoriais


No grupo relacionado s anlises sensoriais esto os testes de turbidez, cor,
sabor e odor. A turbidez causada por material de qualquer natureza em suspenso, como plnctons, bactrias, argila, areia e poluio de forma geral. A gua
potvel deve apresentar turbidez menor que 5 UT (Unidades de Turbidez), determinada no nefelmetro.
A cor no deve ser superior ao valor mximo permitido pela Portaria 518/MS,
que de 15 uH (Unidade Hazen - PtCO/L). A cor definida pela decomposio de
matria orgnica e, tambm, pela presena de ons metlicos, como ferro e mangans, plnctons e resduos industriais.
A legislao exige que a gua no apresente sabor nem odor que impeam seu
consumo. Poluio industrial ou domstica, matria orgnica e atividade biolgica
de microrganismos so responsveis pela ocorrncia de sabor e odor na gua.

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Tabela 8 - Alguns padres de qualidade exigidos pela Resoluo n 357, do Conselho Nacional
do Meio Ambiente (CONAMA), e Portaria n 518, do Ministrio da Sade, no que se refere aos
mananciais (para gua doce) e gua potvel, respectivamente)

277

2.2. Indicadores de Riscos Sade


No grupo referente aos riscos sade humana esto as anlises de metais
pesados, pesticidas, solventes orgnicos, nitratos, nitritos e microrganismos patognicos, dentre outros. Esses contaminantes so oriundos, por exemplo, de resduos industriais ou contaminao fecal. Os valores mximos permitidos podem ser

cap.06

encontrados na Portaria n 518/MS (Tabela 9).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Tabela 9 - Concentraes mximas para algumas substncias qumicas na gua que representam risco sade

278

2.3. Indicadores da Formao de Incrustaes


Um terceiro grupo de anlises inclui aquelas que indicam possibilidade de formao de incrustaes e corroso e representado pelos sais minerais, cidos e
gases presentes, que mostram grande importncia em processos de adeso microbiana e formao de biofilmes. Os locais onde ocorrem corroses e, ou, depsitos
minerais geralmente so apropriados para o desenvolvimento de microrganismos.
Esses eventos alteram a microtopografia das superfcies que processam alimentos,

crustaes desses minerais muitas vezes so denominadas pedras, no dia-a-dia


da indstria, e, assim, ocorrem as formaes minerais conhecidas como pedras do
leite e pedras da cerveja. No caso de laticnios, essas incrustaes so constitudas de minerais da gua, principalmente aqueles responsveis pela dureza, como
clcio e magnsio, minerais dos detergentes e sanitizantes, como sdio, fsforo e
cloretos, resduos de protenas, gordura, acares, vitaminas e sais minerais do leite
(Tabela 10). Alm disso, nessas incrustaes podem-se agregar microrganismos de
origens diversas, como aqueles presentes no ar, na gua, nos manipuladores e no
prprio alimento. Esses microrganismos, encontrando condies favorveis ao seu
desenvolvimento, atingem nmeros elevados e, ao se liberarem, contaminam os
alimentos processados nessas superfcies incrustadas.
Tabela 10 - Composio tpica de uma pedra de leite

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

facilitando a deposio de matria orgnica, nutrientes e microrganismos. As in-

Na indstria de alimentos, aconselhvel o uso de gua com pH prximo de


8,3, j que no contm acidez, evitando processos de corroso em superfcies para
processamento de alimentos. A acidez na gua causada pela absoro do CO2

279

atmosfrico ou oriunda de material vegetal em decomposio e da atividade biolgica de microrganismos. O cido carbnico e os bicarbonatos - de sdio, clcio,
magnsio, ferro e mangans, dentre outros - presentes na gua formam um tampo.
Em pH prximo de 4,6, predomina o cido carbnico e, em pH prximo de 8,3,
prevalece o nion bicarbonato, de acordo com a metodologia analtica que usa os
indicadores fenolftalena e metilorange e a titulao com soluo de NaOH. Em virtude do tampo formado pelo cido carbnico e bicarbonatos, a gua pode apresentar
acidez e alcalinidade simultaneamente, dependendo do pH. Por exemplo, as guas
naturais da regio da Zona da Mata de Minas Gerais tm entre 5 e 20 mg.L-1 de acidez, expressa em CO2, e entre 10 e 50 mg.L-1 de alcalinidade, expressa em CaCO3.
Em gua com pH abaixo de 4,6, a acidez denominada mineral, devido presena de cidos minerais, provenientes provavelmente da poluio industrial ou do
metabolismo microbiano. De acordo com a legislao vigente, a gua considerada
potvel com pH entre 6 e 9,5, j a de um manancial ser considerada em condies
cap.06

de ser potabilizada quando o pH estiver numa faixa de 5 a 9,5. A gua usada em

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

caldeiras dever ter seu pH corrigido para valores entre 10,5 e 11,5, para evitar processos corrosivos ao ao carbono, constituinte de caldeiras.
A alcalinidade da gua ocorre em virtude da presena de bicarbonatos, carbonatos e hidrxidos de sdio, clcio, magnsio e ferro. Os bicarbonatos acontecem
quando a gua tem pH abaixo de 8,3. Outros tipos de sais responsveis pela alcalinidade so encontrados em gua com pH igual ou superior a 8,3. As guas potveis
no podem apresentar alcalinidade de hidrxido, cuja presena indica a ocorrncia
de poluio. exceo nesse caso para a gua de alimentao de caldeiras, cujo
pH deve ser corrigido para valores entre 10,5 e 11,5 com substncias alcalinas, de
forma a liberar uma alcalinidade custica entre 400 e 700 mg.L-1, expressa em OH-.
A alcalinidade apresenta relao com a dureza quando constituda de bicarbonatos, carbonatos e hidrxidos de clcio e de magnsio, que originam a dureza da
gua, causadora de uma srie de problemas para a indstria de alimentos. Plenamente aceitveis para gua potvel, em que concentraes de 500 mg.L-1 de dureza,
expressa em CaCO3, no apresenta significado sanitrio, a dureza pode ser responsvel por processos corrosivos e formao de incrustaes em diversas superfcies
e equipamentos de processamento de alimentos, particularmente em trocadores
de calor. Alm disso, as incrustaes diminuem o fluxo em tubulaes, reduzem a
transferncia de calor, por exemplo, provocando maior gasto de energia para a produo de vapor em caldeiras, alm de poderem causar contaminao microbiana de
alimentos com diversos microrganismos.
Na Tabela 11 so apresentados resultados de anlises fsicas e qumicas de

280

amostras de gua de um sistema de tratamento e de uma indstria de laticnios, em


que se observam diferenas nos resultados analticos devido composio da gua.
Tabela 11 - Caractersticas fsicas e qumicas de amostras de gua coletadas em um sistema
de tratamento e em uma indstria de laticnios

A dureza variou entre 20 mg.L-1 e 183 mg.L-1 de CaCO3 no vapor condensado e


na gua de resfriamento de amnia, respectivamente. Observou-se, pelos resultados, que a gua apresenta qualidade tal que depende do uso e tratamentos recebidos e que h necessidade de maior controle por meio de anlises e de um plano de
amostragem adequado para seu melhor uso na indstria de alimentos

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

A turbidez variou entre 0,5 UT na gua filtrada e 91,5 na gua dos floculadores
do sistema de tratamento. O pH oscilou entre 6,9 e 8,6 na gua industrial e do sistema
de resfriamento de amnia, respectivamente. Em relao acidez, observou-se desde
ausncia na gua de resfriamento de amnia at 10,4 mg.L-1, expressos em CO2, na
amostra coletada no floculador. O vapor condensado apresentou o menor contedo de
alcalinidade, com 23,8 mg.L-1, expressos em CaCO3. A gua do sistema de resfriamento
da amnia, coletada na torre de resfriamento, tinha concentrao mais elevada com
231,7 mg.L-1. Quanto concentrao de cloretos, a gua mostrou o menor nvel, ou seja,
11,9 mg.L-1 de NaCl, e a gua do sistema resfriamento da amnia, o maior, atingindo
140,3 mg.L-1.

As anlises fsicas e qumicas das amostras coletadas no manancial encontram-se dentro dos padres propostos pela Resoluo n 357, do Conselho Nacional
do Meio Ambiente (CONAMA), de 2005. Da mesma forma, as caractersticas da gua
industrial atenderam Portaria n 518, do Ministrio da Sade, de 2004.
Na Tabela 12 so apresentadas as anlises fsicas e qumicas da gua usada em
cinco microindstrias de laticnios, ressaltando-se que estas necessitavam de subsdios tecnolgicos para produo de alimentos com melhor qualidade. O conhecimento das condies higinicas de processamento nesses pequenos estabelecimentos
uma das maneiras de buscar a produo de leite e derivados com melhor qualidade

281

higinico-sanitria, e a avaliao da qualidade da gua um aspecto importante que


deve ser considerado na produo de alimentos seguros para o consumidor.
Tabela 12 - Caractersticas fsico-qumicas da gua de microindstrias de laticnios

As cinco microindstrias de laticnios avaliadas poca da pesquisa no tinham Selo de Inspeo Municipal e foram codificadas como A, B, C, D e E. A quali-

cap.06

dade fsico-qumica da gua indica pequeno risco de incrustaes, mas as anlises

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microbiolgicas mostraram a necessidade do controle dos nveis de cloro residual


livre, constatando-se que as microindstrias apresentaram resultados considerados
normais nas anlises fsico-qumicas, exceo do cloro residual livre.
Os valores de pH variaram entre 5,9 e 7,4, portanto encontram-se dentro dos
padres da legislao vigente (Portaria 518/MS), que indica valores de 6 a 9,5. Os
valores de dureza das guas analisadas entre 15 e 43 mg.L-1 de CaCO3 classificamnas como gua mole ( 50 mg.L-1 CaCO3), no oferecendo grandes riscos de formar
incrustaes. Constatou-se que as concentraes de cloreto nas guas analisadas
foram muito baixas, entre 3 e 9, expressas em mg.L-1 de NaCl, quando comparadas
com o limite mximo permitido pela legislao, que de 250 mg.L-1, indicando pequeno risco de formao de incrustaes e de processos corrosivos. Em relao ao
cloro residual livre, cujo objetivo o controle microbiolgico, foi constatada a sua
presena apenas nas amostras de gua de uma microindstria, que, poca, usava
gua do sistema municipal de tratamento.

2.4. Indicadores de Poluio


Um quarto grupo de substncias presentes na gua compreende os indicadores de poluio, em que esto includas as anlises de amnia, nitrato e nitrito.
A presena dessas substncias nitrogenadas, dependendo da concentrao, indica
poluio fecal.

2.5. Indicadores da Qualidade Microbiolgica


282

Um quinto grupo de anlises est relacionado ocorrncia de microrganismos


na gua. Na Tabela 13 so apresentados os padres microbiolgicos da gua, exigidos pela Portaria n 518/MS.
Entende-se por coliformes totais as bactrias do grupo coliforme, representado
por bacilos Gram-negativos, aerbios ou anaerbios facultativos, no formadores de
esporos, oxidase-negativos, capazes de se desenvolver na presena de sais biliares ou
agentes tensoativos, que fermentam a lactose com produo de cido, gs e aldedo a
35,0 0,5 C em 24-48 h, podendo apresentar atividade da enzima b-galactosidase. A
maioria das bactrias do grupo coliforme pertence aos gneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella e Enterobacter, embora outros gneros e espcies possam ser includos.
Os coliformes termotolerantes so um subgrupo das bactrias do grupo coliforme que fermentam a lactose a 44,5 0,2 C, em 24 h, tendo como principal
representante a Escherichia coli, de origem exclusivamente fecal. A Escherichia coli
um espcie bacteriana do grupo coliforme que fermenta lactose e manitol, com
produo de cido e gs a 44,5 0,2 C em 24 h, produz indol a partir do triptofano,
oxidase negativa, no hidrolisa a uria e apresenta atividade das enzimas b-galacto-

minao fecal recente e de eventual presena de organismos patognicos.


Tabela 13 - Padres microbiolgico de potabilidade da gua para consumo humano

Em 20 % das amostras de gua analisadas quanto a coliformes totais nos sistemas de distribuio, exige-se que seja realizada a contagem de bactrias heterotrfi-

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sidase e b-glucoronidase, sendo considerada o mais especfico indicador de conta-

283

cas, que no deve exceder 5,0x102 UFC.mL-1. A contagem de bactrias heterotrficas


consiste na determinao da densidade de bactrias que so capazes de produzir
unidades formadoras de colnias (UFC), na presena de compostos orgnicos contidos em meio de cultura apropriado, como o gar para contagem-padro, sob condies preestabelecidas de incubao, ou seja, 35,0 0,5 C por 48 h.
Para avaliao adequada da qualidade microbiolgica da gua, recomenda-se a incluso de pesquisa de organismos patognicos, com o objetivo de
atingir, como meta, um padro de ausncia, dentre outros, de enterovrus, cistos
de Giardia spp. e oocistos de Cryptosporidium sp., por representarem srios
perigos a indivduos imunodeprimidos ou, mesmo, saudveis. Em gua que recebe o tratamento de filtrao rpida, cuja turbidez esteja inferior a 0,5 UT, h
considervel segurana de que enterovrus, cistos de Giardia spp. e oocistos de
Cryptosporidium sp. foram removidos.
A exposio do homem a esses parasitas envolve vrias rotas complexas e
cap.06

interligadas, que culminam com a ingesto de gua ou alimentos contaminados

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com oocistos, que so estruturas reprodutivas altamente resistentes ao cloro.


Basicamente, a presena desses protozorios no meio ambiente se deve contaminao ambiental por esgoto domstico e rural, alm da contaminao por
fezes de animais domsticos e silvestres. Sua presena na cadeia alimentar se associa ao uso de gua contaminada na indstria de alimentos, subprocessamento,
matria-prima contaminada, sejam produtos de origem animal ou vegetal, particularmente os minimamente processados, bem como contaminao via manipuladores de alimentos com hbitos inadequados de higiene pessoal ou portadores
assintomticos ou convalescentes.
Uma breve descrio sobre os gneros anteriormente mencionados e sua importncia e riscos para questes de sade pblica ser feita a seguir.

Cryptosporidium spp./Cryptosporidium parvum


O primeiro caso de criptosporidiose humana foi relatado em 1976, e, desde
essa poca, casos e surtos no param de ser mencionados. Tanto homens como
animais, em especial bovinos, podem ser reservatrios desse protozorio. A
dose infectiva considerada baixa, e apenas 10 oocistos j podem desencadear
a doena. O processo infectivo ocorre no intestino delgado, onde os protozorios se multiplicam na forma sexuada e assexuada no citoplasma das clulas
epiteliais, culminando o ciclo com a liberao de oocistos pelas fezes. O perodo
de incubao da doena pode variar de 2-10 dias. Os sintomas mais comuns so

284

diarria, vmitos e dores abdominais, geralmente sendo necessria a hospitalizao. A invaso de outros tecidos e rgos tambm pode ocorrer. A grande
particularidade desse protozorio, que o torna to importante para questes de
sade pblica, corresponde sua resistncia clorao.
Considera-se que as etapas de floculao, sedimentao e filtrao sejam
eficientes na eliminao desse agente, porm, quando essas fases so realizadas de forma inadequada, esses protozorios podem chegar ao homem. O surto
mais divulgado pela literatura ocorreu em Milwaukee, EUA, em 1993, acometendo 403.000 pessoas, em razo do consumo de gua contaminada, levando 104
pessoas HIV positivos a bito. O surto ocorreu devido a processos inadequados de remoo de oocistos durante as etapas de coagulao/sedimentao no
tratamento da gua. O surto, alm dos danos provocados sade de milhares
de consumidores, ainda acarretou grandes prejuzos s empresas de alimentos
locais, principalmente as produtoras de bebidas. Esse protozorio suscetvel ao
oznio, radiao UV e ao tratamento trmico de 71,7 C por 15 seg.

Os protozorios deste gnero, responsveis por distrbio denominado giardase, so os mais isolados no mundo, sendo estimados, aproximadamente, 2,5 milhes
de casos, por ano, nos EUA. O cistos, estruturas de resistncia a agentes qumicos,
depois de ingeridos liberam os tropozodeos, estgio reprodutivo, no duodeno, onde
estes se multiplicam assexuadamente, colonizando rapidamente o intestino delgado
e liberando oocistos nas fezes. Os sintomas mais freqentes so diarria, flatulncia e
inchao no abdmen, em razo de danos provocados na mucosa intestinal. A dose
infectiva pode variar de 10-100 cistos. O perodo de incubao normalmente varia
de uma e duas semanas, podendo a doena prevalecer por at cinco dias. Assim
como Cryptosporidium sp., microrganismos pertencentes a esse gnero tambm
so resistentes clorao, sendo as etapas de floculao, sedimentao e filtrao
eficientes na reduo desses agentes. Caso a gua utilizada no receba qualquer
tratamento, recomenda-se ferv-la por pelo menos 1 min, sendo o tratamento de
71,5 C por 15 seg j suficiente para eliminar oocistos. Esse protozorio suscetvel
a sanitizantes base de fenol.

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Giardia spp. (G.duodenale, G. lamblia, G. intestinale)

Cyclospora sp.
Embora existam muitas espcies neste gnero, apenas C. cayetanensis tem
sido associado ao homem, sendo reconhecido como patgeno desde 1977. Seu
ciclo de vida ainda no est totalmente esclarecido, mas j se sabe que esses protozorios se multiplicam nas clulas do intestino delgado, culminando com a liberao
de oocistos nas fezes. O perodo de incubao varia de 2 a11 dias, podendo a doena se estender por duas semanas. Os sintomas incluem diarria no-sanguinolenta,
perda de apetite e peso, clica estomacal, nusea, vmito, fadiga e febre. Poucos
estudos tm sido desenvolvidos para determinar o comportamento desses protozorios diante de agentes de desinfeco, assim pouco se sabe sobre sua resistncia
ao cloro nos nveis usados no tratamento da gua.

285

Toxoplasma gondii
A toxoplasmose uma zoonose, ou seja, doena transmitida entre animais
e homens, sendo os felinos os hospedeiros primrios. Dentre os hospedeiros secundrios, incluem-se outros vertebrados, como roedores, bem como bovinos e
outros animais relacionados produo animal. Quando os oocistos so ingeridos
por esses hospedeiros, ocorre a liberao de esporozodeos que se multiplicam assexuadamente, colonizando rapidamente o intestino delgado. Esses esporozodeos
podem invadir outros tecidos e rgos do corpo do hospedeiro, via sistemas circulatrio e linftico, ocorrendo a formao de cistos nos tecidos. A ingesto de tecidos
infectados pode desencadear um mecanismo infectivo semelhante ingesto de
oocistos, como ocorre, por exemplo, no consumo de carne contaminada. A infeco
pode ser sintomtica ou assintomtica, sendo o inchao das glndulas linfticas,
cap.06

fadiga e dores nas articulaes e musculaturas os sintomas mais freqentes.

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Com relao aos protozorios, faz-se necessrio conhecer aspectos fisiolgicos, virulncia, viabilidade e sobrevivncia desses patgenos a tratamentos empregados na indstria de alimentos e a qualidade dos suprimentos de gua para que
estratgias de controle sejam traadas. Porm, os aspectos biolgicos e ecolgicos
complexos, como ciclo de vida e os cistos altamente resistentes apresentados por
Cryptosporidium spp., Giardia spp. e Cyclospora spp. dificultam sua preveno e
controle. Associadas a essas questes, ainda existem as dificuldades impostas pela
carncia de tcnicas de anlises apropriadas e padronizadas para deteco e enumerao desses agentes.

286

Figura 1 - Ilustraes de clulas vegetativas de protozorios.

As tcnicas de controle incluem preocupao com a sanidade animal, qualidade da gua empregada na produo e irrigao; adoo de tcnicas adequadas de
higiene na produo e processamento de alimentos; ateno a todas as etapas do
tratamento convencional da gua, tanto aquela a ser utilizada na produo primria
e na indstria, bem como em atividades recreacionais e, se possvel, introduzir etapas que podem reduzir esses agentes; e manejo adequado de resduos (esgoto), de
forma a minimizar a disseminao de oocistos no ambiente.

Em relao aos aspectos microbiolgicos da gua, h a preocupao com


a presena de cianobactrias, microrganismos procariticos autotrficos, tambm denominados cianofceas ou algas azuis, capazes de ocorrer em qualquer
manancial superficial, especialmente naqueles com elevados nveis de nutrientes, como nitrognio e fsforo, podendo produzir toxinas com efeitos adversos
sade quando ingeridas. Dentre elas, podem-se citar: i) as microcistinas, que so
hepatotoxinas heptapeptdicas cclicas, com efeito potente de inibio de protenas fosfatases dos tipos 1 e 2A, que so promotoras de tumores; ii) cilindrospermopsinas, que so alcalides guanidnicos cclicos, inibidores de sntese protica,
predominantemente hepatotxicos, apresentando tambm efeitos citotxicos nos
rins, bao, corao e outros rgos; e iii) saxitoxinas, que pertencem ao grupo
de alcalides carbamatos neurotxicos, no sulfatados (saxitoxinas) ou sulfatados
(goniautoxinas e C-toxinas) e derivados decarbamil, apresentando efeitos de inibi-

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


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Cianobactrias

o da conduo nervosa por bloqueio dos canais de sdio.


O controle microbiolgico da gua est intimamente relacionado concentrao de cloro residual livre, e, normalmente, considera-se que uma gua contendo
de 0,2 a 1,0 mg.L-1 de cloro residual livre segura dentro desse ponto de vista. No
entanto, no se elimina a necessidade de realizar as anlises microbiolgicas, para
o controle da qualidade da gua de sistema de abastecimento. Na Tabela 14 so
apresentados resultados de anlise de amostras de gua coletada em um sistema
de tratamento de um laticnio.

287

Tabela 14 - Nmero de aerbios mesfilos e coliformes totais em amostras de gua coletadas


em um sistema de tratamento de uma indstria de laticnios

Observa-se que as amostras apresentaram contagens de aerbios mesfilos


entre 2,7x100 UFC.mL-1 e 4,4x103 UFC.mL-1 para gua industrial e resfriamento de
amnia, respectivamente.
As contagens de coliformes totais, expressas em NMP.mL-1, foram to baixas
cap.06

quanto <2 e to altas quanto 1,1x103 para gua floculada.

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Na Tabela 15 so apresentadas as contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais nas microindstrias de laticnios j mencionadas. Verificou-se, pelos
resultados, que pelo menos uma das anlises para mesfilos aerbios efetuadas
nas microindstrias A, B e C apresentou contagens acima de 500 UFC.mL-1, limite
mximo recomendado pela legislao. Todas as anlises nas microindstrias A, B,
E e uma anlise da C apresentaram coliformes totais acima de 3 NMP.100 mL-1. A
microindstria D utilizava gua do sistema de abastecimento municipal, apresentando, assim, os melhores resultados microbiolgicos. Esses resultados indicaram a
necessidade de clorao da gua, que deve apresentar nveis entre 0,2 e 1,0 mg.L-1
de cloro residual livre na gua de consumo humano e, principalmente, entre 4 e 8
mg.L-1 de cloro residual livre para uso geral nas indstrias.
Tabela 15 - Caractersticas microbiolgicas da gua das microindstrias de laticnios

288

A gua, quando no adequadamente clorada, veicula grande nmero de microrganismos alteradores ou patognicos. Dentre os alteradores, encontram-se
espcies psicrotrficas dos gneros Pseudomonas, Aeromonas, Alcaligenes,
Flavobacterium e Achromobacter. As espcies P. aeruginosa e P. fluorescens e
A. hydrophila so exemplos de microrganismos formadores de limosidades em
superfcies usadas no processamento de alimentos capazes de aderir e formar
biofilmes. Tambm, espcies esporulantes dos gneros Bacillus e Clostridium
podem ser veiculadas pela gua. J as espcies C. tyrobutiricum e B. coagulans
so alteradoras e responsveis pelo estufamento tardio de queijo e pela coagulao do leite UAT, respectivamente. Dentre as alteradoras, incluem-se ainda as

uma srie de cidos orgnicos nos alimentos; e E. aerogenes, causadora do estufamento precoce de queijo. Outro grupo de microrganismos que podem ser
veiculado pela gua so espcies do gnero Enterococcus, representado por E.
faecium, microrganismo que apresenta estirpes psicrotrficas, acidificantes de
leite e resistentes ao tratamento trmico de 65 C por 30 min.
Vrios microrganismos patognicos em suas formas vegetativas ou esporulantes so veiculados pelas gua. Os alimentos podem ser contaminados com
Clostridium botulinum, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Staphylococcus
aureus, Salmonella Typhi, Salmonella paratyphi, Yersinia enterocolitica, Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Escherichia coli H7: O157 e Vibrio
cholerae, dentre outros.
interessante, portanto, observar a importncia do tratamento correto da
gua e do controle do processo de desinfeco ou, mais especificamente, do processo de clorao.

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

do grupo coliforme, em que sobressaem E. coli, responsvel pela produo de

3. Aspectos do Tratamento da gua


3.1. Potabilizao da gua
Na indstria de alimentos, usa-se gua dos sistemas de abastecimento
pblico ou providenciado o tratamento proveniente de diversos mananciais,
como rios, lagos, lagoas e poos artesianos, dentre outros. Para atingir a qualidade exigida pela legislao vigente, a gua passa por diversas etapas, ou seja, a
sedimentao simples, a sedimentao com agentes coagulantes, a decantao,
a filtrao e a desinfeco (Figuras 2 e 3).

289

A sedimentao simples ocorre nos mananciais onde h melhoria na qualidade da gua, ocorrendo a deposio de partculas mais pesadas, em virtude
do processo de decantao e reduo no nmero de microrganismos aderidos
s partculas responsveis pela turbidez. Tambm, nas lagoas, nos rios e lagos,
ocorre um efeito bactericida da radiao ultravioleta emitida pelo sol que, dependendo da turbidez da gua, capaz de penetrar a certas profundidades

cap.06

Nesse processo de sedimentao, partculas muito pequenas poderiam demorar anos para se depositarem at atingir valores menores de 1 UT de turbidez.
Por isso, a etapa de sedimentao com agentes coagulantes fundamental para
obter gua com a qualidade que se deseja na indstria de alimentos. Normalmente
so utilizadas substncias qumicas que formam hidrxidos em soluo aquosa,
principalmente originrios de sulfatos de alumnio ou de ferro. O hidrxido formado tem carga eltrica positiva e adsorve as partculas negativas responsveis pela
turbidez, cor, sabor e odor (Reaes Qumicas 1), resultando no aumento do di-

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290

Figura 2 - Etapas de um tratamento convencional de gua: a), b), c) vistas de um manancial, d) mistura
rpida dos agentes de floculao, e) floculao, f)-decantao, g) filtrao e h) tanque de clorao por
contato.

Reaes Qumicas 1 - Formao de hidrxido de alumnio a partir do sulfato de alumnio

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

metro e na densidade das partculas. Nesse caso, a velocidade da sedimentao


fundamenta-se na Lei de Stokes (Equao 1), sendo proporcional densidade e ao
quadrado do dimetro das partculas. Assim, esses agentes reduzem a turbidez da
gua rapidamente para valores propostos pela legislao vigente. Para a formao
de hidrxidos, a gua deve apresentar alcalinidade adequada, naturalmente presente ou adicionada.

Equao 1 - Lei de Stokes que determina a velocidade de sedimentao das partculas na gua
em razo de vrios fatores

A ao de agentes coagulantes ocorre nos floculadores, havendo, inicialmente, uma mistura rpida entre a gua e o agente qumico, que obtida pelo
aumento da velocidade da gua, e, em seguida, essa velocidade diminuda para
que haja formao adequada dos flculos, o que acontece geralmente no ltimo
floculador. Na seqncia, a gua transferida para o decantador, onde os flculos
se depositam antes do processo de filtrao. A etapa de floculao simulada no
laboratrio, para determinar a quantidade de agente qumico a ser adicionada
gua. Essa simulao efetuada pelo Teste do Jarro, que consiste em adicionar
certas concentraes da substncia floculante e, com o auxlio da anlise de turbidez, determinar qual quantidade do floculante origina flculos adequados tanto
no aspecto tcnico quanto econmico.

291

cap.06

A etapa de filtrao, geralmente realizada em filtros de areia, responsvel


pela reteno dos flculos no sedimentados no decantador, pela reduo do
nmero de microrganismos e pela complementao da reduo da turbidez da
gua. Aps a filtrao, a turbidez da gua deve apresentar no mximo 5 UT, de
acordo com a Portaria 518/MS. necessrio proceder-se desinfeco que
normalmente feita pela clorao, para que se atinjam os ndices microbiolgicos
exigidos. Assim, a gua deve apresentar <2 NMP.100mL-1, que considerado au-

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292

sncia por 100 mL, para coliformes totais na estao de tratamento e <2 NMP.100
mL-1 para coliformes fecais ou termotolerantes a 45 C, em pontos do sistema de
distribuio. Para a anlise, aplicada a tcnica do Nmero Mais Provvel (NMP)
em trs sries de cinco tubos, sendo utilizados volumes de 10 mL, 1,0 mL e 0,1 mL
da amostra. Podem ser usados vrios meios de cultura, por exemplo Caldo Verde
Brilhante para coliformes totais e Caldo EC para coliformes termotolerantes, com
incubao a 37 e 45 C, respectivamente.
Aps a incubao, determina-se o que se denomina nmero-chave, que
consiste dos tubos positivos - produo de gs nos tubos de Durham - em cada
srie. Com base no nmero-chave, determina-se o NMP.100 mL-1 por meio de
uma tabela apropriada. Por exemplo, se o nmero-chave for 521, a contagem de
coliformes ser de 70 NMP.100 mL-1, de acordo com tabela prpria. Geralmente,
o processo de desinfeco atinge seus objetivos quando a gua contiver entre
0,2 e 1,0 mg.L-1 de CRL.

3.2. Tratamentos Especficos da gua na Indstria de Alimentos


O ideal seria se as indstrias de alimentos dispusessem de tecnologias para
realizar tratamentos especficos em razo do uso da gua (Tabela 16 e Figuras 4, 5,
6 e 7). Assim, gua para caldeiras, resfriamento de produtos enlatados esterilizados,
controle da microbiota da superfcies de carnes e de frutas e hortalias minimamente processadas, diluio de bebidas destiladas e concentrados e fermentao de
cervejas so situaes que demonstram a necessidade de tratamentos especficos
da gua pela indstria (Tabela 17).
Na indstria de alimentos, deve-se usar gua mole, com concentraes abaixo
de 50 mg.L-1 de dureza. A ao de calor e alcalinos sobre os sais responsveis pela
dureza mostrada nas reaes qumicas 2. Nesse caso, essa gua, se utilizada em
caldeiras, dever ter sua dureza corrigida para valores prximos de zero, por meio
do tratamento interno, realizado nas caldeiras. Para isso, utilizam-se, geralmente,
fostatos, polifosfatos e sais sdicos do EDTA. Esses produtos ou suas formulaes
podem ser adquiridos em empresas especializadas, sob diversos nomes comerciais. Como informao, pode-se afirmar que o fosfato trissdico atua por precipitao da dureza, o que no conveniente, pois haver depsitos na superfcie do
ao carbono. Os polifosfatos, em contrapartida, atuam sobre a dureza por formao
de quelatos com os sais, no ocorrendo, portanto, a deposio. A capacidade de
formao de quelatos varivel de acordo com o polmero; por exemplo, 1,0 g de
hexametafosfato de sdio complexa cerca de 74 mg de dureza. Outros polifosfatos, como o tripolifosfato de sdio e o tetrafosfato de sdio so capazes de quelar,
respectivamente, 57 e 38 mg de dureza por grama do quelante. O EDTA-Na e o
gluconato de sdio atuam seqestrando os sais responsveis pela dureza, e cada
miligrama dessas substncias seqestram 200 e 300 mg de dureza, respectivamente; no entanto, so de custo mais elevado do que os polifosfatos.

Tabela 17 - Alguns tratamentos especficos da gua na indstria de alimentos

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Tabela 16 - Alguns dos usos da gua na indstria de alimentos

293

cap.06

Figura 4 - Caldeira flamotubular, lenha e de baixa de presso, de uso comum na indstria de alimentos.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


294

Figura 5 - a), b), c) Incrustaes minerais em caldeiras; d) Vlvula para controle de purga; e) Realizao
de uma purga.

Figura 6 - Aspectos de um sistema de resfriamento da amnia: a) torre de resfriamento, b)


condensador e c) tubos contendo amnia sendo resfriada.

Reaes Qumicas 2 - Ao de calor e alcalinos sobre os sais responsveis pela dureza

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Figura 7 - a) trocador de calor, b) placa do trocador e c) pontos de corroso na placa.

295

Mesmo quando a gua classificada como mole, podem ocorrer processos


de incrustaes em superfcies de troca de calor. Por isso, sugere-se que os detergentes utilizados no procedimento de higienizao sejam formulados com agentes quelantes ou seqestrantes. Por exemplo, na indstria de processamento de
leite condensado e fabricao de leite em p, onde h possibilidade de formao
de grossas pelculas de gordura e protena, contendo minerais e microrganismos,

cap.06

recomenda-se uma formulao de detergente alcalino com 95 % de hidrxido de


sdio adicionado de 5 % de um seqestrante como o EDTA-Na, que ser usada na
concentrao de 1 % a 80 C.

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296

Quando a gua classificada como moderadamente dura, com concentraes


de dureza entre 51 e 150 mg.L-1 ou dura com valores entre 151 e 300 mg.L-1 ou, ainda, muito dura com ndices de dureza acima de 300 mg.L-1, a indstria de alimentos
deve utilizar outras alternativas. Uma alternativa tecnologicamente vivel aquela
que utiliza trocadores de ctions para a remoo dos sais de clcio e magnsio.
Nesse caso, podem ser usadas as resinas sintticas, por exemplo as constitudas de poliestireno, como matriz polimrica. Essas resinas geralmente tm um porcentual de divinilbenzeno entre 5 % e 8 % e cido sulfnico ou sulfonato de sdio,
que so o stio ativo de troca de ctions. Essa resina mencionada como exemplo,
dentre outras, pode ser usada como leito filtrante em reatores ou filtros, onde os sais
causadores da dureza ficam retidos, liberando a gua mole. As resinas apresentam
determinada capacidade de troca e, aps um tempo de uso, devem ser regeneradas;
processo geralmente realizado pela lavagem do filtro em contracorrente com uso de
cido forte, para as resinas base de cido sulfnico e soluo de cloreto de sdio,
em concentraes entre 5 % e 10 %, para aquelas base de sulfonato de sdio. Por
meio da troca inica, pode-se eliminar a dureza ou reduzi-la a valores mais baixos e
usar as outras alternativas de tratamento e controle. Se a gua disponvel para uma
indstria de latcinios tem em sua composio 120 mg.L-1 de dureza, recomenda-se:
i) reduzir essa concentrao para valores prximos de zero e utiliz-la na gerao
de vapor em caldeiras; e ii) diminuir a concentrao dos sais de clcio e magnsio
para 50 mg.L-1 ou, a um valor prximo a esse, efetuar o tratamento interno da gua
de alimentao das caldeiras e adquirir detergentes com agentes abrandadores para
realizar a higienizao em superfcies para processamento de alimentos.
Outro nion de importncia relevante, constituinte da composio da gua, o
cloreto. Em gua potvel ou potabilizada, aceita a concentrao de at 250 mg.L-1
de cloreto, expressos em NaCl, de acordo com a Portaria 518/MS. Concentraes
elevadas de cloreto indicam possibilidades de poluio, por meio de resduos domsticos ou industriais ou devido atividade agrcola, em que fertilizantes como
cloreto de potssio so comumente aplicados.
O on cloreto sinnimo de corroso na indstria de alimentos e, em concentraes elevadas, podem corroer o ao carbono em caldeiras. Nesses geradores de vapor,
a anlise de cloreto usada como indicador da possibilidade de corroso. Recomendase para a gua de alimentao de caldeira de baixa presso, de at 10 kgf.cm-2, que as
concentraes de cloreto sejam inferiores a 200 mg.L-1. Para caldeiras de mdia presso,
entre 10 e 40 kgf.cm-2, normalmente so usadas na indstria de alimentos concentraes de at 50 mg.L-1. Recomenda-se gua de alimentao com ausncia de cloretos,
para evitar problemas de corroso, em caldeiras de alta presso, acima de 40 kgf.cm-2;
que, no entanto, no so utilizadas na indstria de alimentos. O cloreto em caldeiras
controlado por meio de purgas, que consistem na abertura peridica de uma vlvula
ou registro na caldeira, para se promover a denominada desconcentrao de sais no
interior da caldeira. O intervalo de tempo entre as purgas depende da concentrao

guas contendo concentraes elevadas de ferro e mangans tambm so


prejudiciais indstria de alimentos. Esses elementos, mesmo em concentraes
de 0,3 e 0,1 mg.L-1, respectivamente, consideradas normais em gua potvel, podem
participar de processos de corroso e formao de incrustaes em superfcies. Por
exemplo, excesso de ferro na gua usada em procedimentos de higienizao de
sistema de ultrafiltrao de leite bloqueia os poros das membranas, dificultando a
higienizao dos equipamentos.
As solues cloradas so amplamente usadas na indstria de alimentos, e as
concentraes de cloro residual livre vo depender do uso especfico. Na maioria
das aplicaes, sugere-se que a gua seja clorada em concentraes acima daquela
exigida pela Portaria 518/MS (Tabela 18).

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

de sais de clcio e magnsio na gua. Recomendam-se, por exemplo, intervalos de


quatro horas quando a dureza da gua atingir 10 mg.L-1. Intervalos de trs, duas e uma
h so recomendados quando a gua de alimentao das caldeiras apresentar de 11 a
20 mg.L-1, de 21 a 30 mg.L-1 e de 31 a 40 mg.L-1 de dureza, respectivamente.

Tabela 18 - Concentraes de cloro residual recomendados para alguns usos especficos na


indstria de alimentos

297

Recomenda-se que a gua usada rotineiramente na indstria de alimentos


apresente uma concentrao entre 4 e 8 mg.L-1 CRL. Esse procedimento, conhecido
como clorao na indstria, traz uma srie de benefcios no dia-a-dia, por reduzir limosidade de origem microbiana nos ambientes de processamento e diminuir
odores indesejveis, alm de contribuir para a obteno de alimentos com menor
contagem microbiana, estendendo a vida de prateleira desses vveres.

cap.06

Teores de cloro entre 5 e 10 mg.L-1 de CRL so utilizados para a gua de resfriamento de produtos enlatados esterilizados, como leite condensado, milho verde e
ervilhas. Aps o tratamento trmico, esses alimentos devem ser resfriados da maneira mais rpida possvel, para temperatura ambiente, e no podem permanecer
temperatura prxima de 50 C por tempo prolongado, uma vez que favorece o desenvolvimento de microrganismos termoflicos esporulantes que, geralmente, so
aqueles que sobrevivem ao tratamento da esterilizao comercial. Particularmente,
naquelas embalagens com espao vazio na parte superior h formao de vcuo

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


298

que pode favorecer a entrada de gua. Se esta estiver contaminada e ocorrerem


pequenos orifcios na embalagem, o alimento seria contaminado com um nmero
grande e diversificado de microrganismos.
O uso da gua clorada tambm comum no controle microbiolgico de superfcies de alimentos e nas solues contendo 200 mg.L-1 de CRL indicadas para
o controle microbiolgico de vegetais minimamente processados. Para reduo da
microbiota de superfcies de carnes bovinas, sunas e de aves, sugere-se a asperso
de gua clorada em concentraes entre 5 mg.L-1 e 7 mg.L-1 de CRL. Os ovos, imediatamente antes de serem quebrados para a produo de ovo lquido pasteurizado,
devem ser imersos em solues contendo 200 mg.L-1 de CRL, durante 1 a 2 min.
A gua clorada ainda amplamente usada para a etapa de sanitizao do procedimento geral de higienizao de equipamentos e utenslios. Nesse caso, so recomendadas solues cloradas de 100 mg.L-1 de CRL quando o procedimento de
sanitizao imerso ou circulao e 200 mg.L-1 quando o procedimento asperso
ou nebulizao.
Diversos compostos so usados no processo de desinfeco da gua ou no
preparo de solues cloradas (Tabela 19). O cloro gs, comercializado na forma lquida, em cilindros apropriados, geralmente utilizado em estaes de tratamento
de gua. O hipoclorito de sdio encontrado sob a forma lquida, com teores entre
2 % e 10 % de CRT, bastante aplicado na etapa de sanitizao do procedimento
de higienizao na indstria de alimentos. O hipoclorito de clcio, um produto em
p, contendo cerca de 60 % de CRT , tambm pode ser utilizado, embora, s vezes,
apresente problemas de solubilidade
Esses compostos clorados inorgnicos so instveis ao armazenamento e
muito reativos com a matria orgnica; e, em razo disso, guas contendo cidos
flvicos e hmicos, oriundos de matria orgnica em fase final de decomposio,
podem reagir com esses compostos e ocorrer a formao de tri-halometanos, conhecidos como THM. Esses compostos representados pelo triclorometano, bromodiclorometano, dibromoclorometano e tribromometano so considerados nocivos
sade, pois existem evidncias de que relacionam com cncer de intestino. A
Portaria 518/MS exige que a concentrao de THM totais no ultrapasse a 100 g.L-1.
Para controle dos nveis desses compostos na gua, dentre as alternativas disponveis e viveis, esto o controle dos precursores, que pode ser realizado durante o
tratamento convencional da gua, nas etapas de floculao, decantao e filtrao, e
o uso de agentes clorados menos reativos com a matria orgnica. Na Tabela 20 so
apresentadas concentraes de THM presentes na gua tratada com cloro gasoso.
Na Tabela 21 so mostradas as concentraes de triclorometano e bromodiclormetano encontradas em guas j cloradas em um sistema de abastecimento pblico de
gua formadas por um agente clorado inorgnico, o hipoclorito de sdio, e outro,
clorado orgnico, o dicloroisocianurato de sdio.

O dixido de cloro, por exemplo, um composto clorado inorgnico cerca de


2,7 vezes mais oxidante do que o cloro gs, por conter em sua molcula o oxignio,

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Tabela 19 - Compostos clorados aplicados na desinfeco da gua

alm do cloro, e ser muito menos reativo com matria orgnica. No entanto, esse
composto apresenta dificuldades operacionais, pois deve ser gerado no prprio local de uso, por meio de equipamentos especiais, pela mistura controlada de clorito
de sdio (NaClO2) e cido sulfrico (H2SO4) ou cloro gs mais clorito de sdio. Isso
significa que h necessidade de treinamento dos operadores, para evitar acidentes
de trabalho e ensin-los a usar corretamente as solues geradas. Atualmente, encontram-se disponveis comercialmente solues estabilizadas de dixido de cloro.
Tabela 20 - Formao de tri-halometanos na gua aps a desinfeco com Cl2

299

Tabela 21 - Concentraes de triclorometano e bromodiclorometano aps a desinfeo com 7


mg.L-1 de cloro residual livre, a partir de hipoclorito de sdio e diclorosiocinaurato de sdio

As cloraminas orgnicas so bastante estveis ao armazenamento, so comercializadas na forma de p e pouco reativas com matria orgnica. As principais

cap.06

cloraminas orgnicas so o dicloroisocianurato de sdio, o tricloroisocianurato de

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

sdio, a cloramina T, a dicloramina T e o diclorodimetilhidantona. Essas substncias


apresentam concentraes diferentes de princpio ativo, que devem ser levadas em
considerao no preparo das solues de uso. Por exemplo, existe comercialmente
um produto base de diclorosiocianurato de sdio contendo cerca de 3 % de CRT e
outro com 5 % de CRT. Naturalmente, as quantidades desses produtos, necessrias
para o preparo de 1.000 L de uma soluo, contendo 200 mg.L-1 de CRL, sero diferentes. Nesse caso, seriam pesados e diludos no volume de 1.000 L de gua 6,67
kg e 4 kg dos produtos com 3 e 5 % de CRT, respectivamente. Isso mostra que no
preparo e uso correto das solues cloradas importante que se conhea a concentrao do princpio ativo dos diversos produtos clorados disponveis no mercado,
por meio de metodologia simples de titulao, baseada em reao de oxirreduo
entre cloro e tiossulfato de sdio.
necessrio conhecer as reaes do cloro na gua para que seja entendida a
terminologia empregada na clorao (reaes qumicas 3). Uma vez que, ao ser adicionado gua, ele reage com sais minerais e com a matria orgnica. Esse cloro
consumido atende demanda e, nessa oportunidade, pode ocorrer a formao dos
tri-halometanos. O restante do cloro est presente na forma de cloro residual total, que
compreende o somatrio das concentraes de monocloraminas, dicloraminas e tricloraminas inorgnicas, que se formam no processo de clorao, e das concentraes
de cido hipocloroso (HClO) e do on hipoclorito (ClO-).

300

Reaes qumicas 3 - Reaes do cloro na gua


O cloro residual total pode ser determinado por diferentes mtodos. Por exemplo, pelas tcnicas do DPD (N,N-dietil-p-phenylenediamine), de amplo uso em estaes de tratamento de gua. Pode ser determinado tambm por mtodos de oxirreduo, geralmente usado na avaliao de concentraes elevadas de cloro. No
caso da tcnica titulomtrica, a soluo clorada acidificada, para que todo o cloro
seja transformado em Cl2 e, em seguida, promove-se uma reao de oxirreduo
entre o Cl2 e o KI, em que o Cl2 reduzido para Cl- e o I- oxidado para I2. Assim, a
quantidade de I2 formada na reao equivalente de Cl2 e pode ser determinada

cloro residual total. Na seqncia, por meio de clculos matemticos, determinase a concentrao de cloro residual total, expressa em mg.L-1 de CRT, em Cl2. Por
exemplo, o hipoclorito de sdio comercial de uso comum na indstria de alimentos
geralmente contm 10 % de cloro residual total.
A concentrao de cloro residual livre o somatrio das concentraes de cido hipocloroso e do on hipoclorito. Esse tipo de cloro determinado por diferentes
mtodos nas estaes de tratamento de gua; dentre eles, incluem-se os testes da
ortotolidina e do DPD. A ortotolidina, suspeita de causar danos sade humana, tem
sido substituda pelo DPD. Por exemplo, determinada estao de tratamento de gua libera ao consumo gua contendo entre 0,8 e 1,0 mg.L-1 de cloro residual livre, expresso
em Cl2. Aps a desinfeco, a gua tratada na estao deve conter um teor mnimo de
cloro residual livre de 0,5 mg.L-1, sendo obrigatria a manuteno de, no mnimo, 0,2
mg.L-1 em qualquer ponto da rede de distribuio, recomendando-se que a clorao
seja realizada em pH inferior a 8,0 e tempo de contato mnimo de 30 min.

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

pela titulao com Na2S2O3. Um mililitro de Na2S2O3 0,01 N equivale a 0,3545 mg de

No existe mtodo de laboratrio que determine a concentrao de cido hipocloroso na gua. Essa determinao muito importante, uma vez que o cido
hipocloroso, forma no dissociada, o responsvel pela atividade bactericida dos agentes clorados. A forma no dissociada cerca de 80 vezes mais bactericida do que a
dissociada. Por meio da equao de Henderson-Hasselblach, possvel determinar a
concentrao do cido hipocloroso na gua (reaes qumicas 4 e Equao 2). Para
isso, necessrio que se conheam a concentrao de cloro residual livre e o pH da
gua. Por exemplo, uma gua contendo 0,8 mg.L-1 de cloro residual livre com um pH
de 7,5 tem 0,4 mg.L-1 de cido hipocloroso. Da mesma forma, se o pH da gua for 8,5

301

ou 6,5, as concentraes de cido hipocloroso sero, respectivamente, 0,07 e 0,73


mg.L-1, conforme determinado pela Equao 2.

Reaes Qumicas 4 - Formao do cido hipocloroso na gua

cap.06

Equao 2 - Quantificao da concentrao de cido hipocloroso


usando-se a equao de Henderson-Hasselbalch adaptada

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O acido hipocloroso capaz de atravessar a membrana celular dos microrganismos e, no citoplasma, inativar enzimas da via glicoltica, pela reduo de grupos
SH de aminocidos constituintes dessas enzimas. Essa tem sido a teoria mais aceita
para a ao antimicrobiana do cloro. No entanto, outras possibilidades para o mecanismo de ao desse agente sanitizante so mencionadas. Por exemplo, a reao do
cido hipocloroso com compostos nitrogenados da parede celular ou da membrana
celular, ou de ambos, formando substncias cloro-nitrogenadas txicas s clulas.
Dependendo da concentrao e do pH, as solues cloradas podem ser esporicidas, e, para isso, o cido hipocloroso deve alterar a permeabilidade da capa
do esporo, que contm cerca de 15 % de cistena em sua composio, aminocido
responsvel pela resistncia da capa ao cloro, pois confere a essa camada do esporo uma estrutura semelhante ao fio de cabelo ou queratina de insetos. No entanto,
o esporo perde essa resistncia a partir do momento em que o cido hipocloroso
consegue romper a capa, naturalmente em outros pontos dela, onde no est presente a cistena. H duas teorias que tentam explicar como o cloro inativa o esporo
bacteriano. Em uma delas, afirma-se que, aps o rompimento da capa, o esporo
absorve gua e nutrientes, germina, e o cloro elimina o esporo germinado, que j
no apresenta resistncia ao agente qumico. Em outra, tem-se que, aps a alterao da permeabilidade da capa, o cloro oxidaria as demais camadas constituintes
do esporo at atingir o protoplasma, onde se encontram DNA, RNA, ribossomos e
enzimas essenciais transformao do esporo em clula vegetativa.
Um experimento comparou a resistncia de formas vegetativas e esporuladas

302

de Bacillus subtilis, s solues cloradas, contendo 100 mg.L-1 de cloro residual livre,
em pH 9,8, temperatura de 25 C. Observou-se que o tempo para que a populao
de clulas vegetativas do microrganismo reduzisse em um ciclo logartmico foi de 6
seg. J nos esporos, esse tempo foi de 88 min, ou seja, 5.280 seg, que corresponde
a uma resistncia 880 vezes maior. No experimento, constatou-se que a fase que
corresponde ao tempo necessrio para que o agente qumico rompesse a capa do
esporo foi de 60 min. Solues com pH 7,0 reduziram em um ciclo logartmico a
populao dos esporos em apenas 30 segundos, com uma fase lag de 15 seg. Isso
mostra a importncia do pH das solues cloradas na rotina de sanitizao de uma
indstria de alimentos, particularmente quando se deseja eliminar esporos bacterianos alm de clulas vegetativas.

ANDRADE, N. J, Higiene industrial (Anlises fsico-qumicas de gua, detergentes e sanitizantes).


Viosa, MG: UFV, Imprensa Universitria, 1984, 41 p.
ANDRADE, N. J. MACDO, J. A. Higienizao na Indstria de Alimentos, Ed. Varela, So Paulo,
1996.
ANDRADE, N.J.; MARTYN, M.E.L. A gua na Indstria de Alimentos. Viosa, MG: UFV, Imprensa
Universitria, 1993. 38p.
AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION (APHA). Standard methods for the examination of dairy
products. 16. ed. Washington: APHA, 1992. 646 p.
BRASIL Ministrio da Sade. Portaria 518, de 25 de maro de 2004 Estabelece os procedimentos e
responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e
seu padro de potabilidade e d outras providncias. Dirio Oficial da Unio, Braslia, 26 de maro
de 2004.
BRASIL. (2005). Leis e Decretos etc. Resoluo CONAMA no 357, de 17 de maro de 2005. Dispe
sobre a classificao dos corpos de gua e diretrizes ambientes para seu enquadramento, bem
como estabelece condies e padres de lanamento de efluentes e d outras providncias.
DAWSON, D. Foodborne protozoan parasites. International Journal of Food Microbiology 2005

Qualidade e Tratamento da gua no Controle de Adeso


Microbiana na Indstria de Alimentos

Referncias

DOWNES, F. P.; ITO, K. (Ed.) Compendium of methods for the microbiological examination of foods.
4.th. 2001. Chapter. 3, p. 25-35.
FRAZIER, W.C.; WESTHORFF, D.C. Microbiologia de los alimentos. 3.ed Zaragoza: Editorial Acribia,
1978. 522 p.
GREEBERG, A. E.; CLESCERI, L. S . EATON, A. D. (Eds.). Standard methods for the examination of
water and wastewater. 18.th. ed. American Public Health Association, 1992.
JAY, J. M. Modern Food Microbiology. 6.th ed Gaithersburg, Maryland, USA: Aspen Publishers, 2000.
679 p.
LAGGER, J. R.; MATA, H. T.; PECHIN, G. H. et al. La importancia de la calidad del agua en produccion
lechera. Veterinaria Argentina, v. 27, n. 165, p. 346-354, 2000.

303

MACDO, J.A.B.; ANDRADE, N.J.; CHAVES, J.B.P. et al. Formao de trihalometanos em solues
sanificantes utilizadas no processo de desinfeco em indstrias de alimentao. Revista do Instituto
de Laticnios Cndido Tostes, v. 54, n. 309, p. 216-230, 1999.
MACDO, J. A. B. Determinao de trihalometanos em guas de abastecimento pblico e de indstria de alimentos. Viosa, MG: UFV, 1997. 90f. Tese (Doutorado em Cincia e Tecnologia de Alimentos). Universidade Federal de Viosa - Viosa.
COSTA, P. D. Avaliao da tcnica de ATP-bioluminescncia no controle do procedimento de higienizao na indstria de laticnios. Viosa, MG: UFV. 2001. 63 f. Dissertao (Mestrado em Cincia e
Tecnologia de Alimentos) Universidade Federal de Viosa, Viosa.
COSTA P. D.; ANDRADE, N. J.; SOARES, N. F. BRANDO, S. C. C. ATP-bioluminescence assay as
an alternative for hygiene-monitoring procedures of stainless steel milk contact surfaces. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 37 p. 345-349, 2006.
PALUMBO, S. A.; RAJKOWSKI, K.T.; MULLER, A. J. Current approaches for reconditioning process
water and its use in food manufacturing operations. Trends in food Science &Technology, v. 8, p.
69-74, 1997.
PORETTI, M. Quality control of water as raw material in the food industry. Food Control, v. 4, p. 79-83,
1990.

cap.06

PORTO, R.L.; BRANCO, S.M.; CLEARY, R.W., et al. Hidrologia ambiental, So Paulo, SP: USP Imprensa Universitria, 1991. 414 p.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


304

RUZANTE, J.M.; FONSECA, L.F.L. gua: mais um fator para atingir a qualidade do leite. Revista
Batavo, v. 8, n. 108, p. 40-42, 2001.
SILVA, R. M. M. Especificaes microbiolgicas para ambientes, manipuladores e equipamentos em
restaurantes industriais. [s.l.:s.n.t.].
VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESSER, D. F. (ed.) Compendium of methods for the microbiological
examination of foods, 3rd ed. American Public Health Association 1992. 1219 p.
YOKOYA, F. Controle de qualidade, higiene e sanitizao nas fbricas de alimentos. So Paulo:
Secretaria de Indstria, Comrcio, Cincia e Tecnologia, 191 p.
YOKOIA, F. Higiene e sanitizao na fbrica alimentos. So Paulo: Secretaria da Indstria, Comrcio
e Tecnologia, [s.d.]117p

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07

1.

Introduo

2.

Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar


2.1. Sedimentao em Placas
2.2. Impresso em gar

3.

Resultados de Avaliao da Qualidade Microbiolgica de Ar de Ambientes de Processamento


3.1. Em uma Unidade de Alimentao e Nutrio
3.2. Em uma Indstria de Processamento de Leite
3.3. Em Indstria de Produtos Crneos
3.4. Em uma Microindstria de Processamento de Leite
3.5. Em Cmaras Refrigeradas de uma Indstria de Laticnios

4.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Valria Costa Salustiano

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1. Introduo
O ambiente em uma indstria de alimentos, dependendo das condies higinicas e do tempo em que o produto permanece exposto, pode contamin-lo.
Superfcies de contato com alimentos e equipamentos sempre foram consideradas as fontes importantes de contaminao de produtos alimentcios. Entretanto,
o estgio atual do desenvolvimento de equipamentos para processamento de
alimentos e de instalao industriais permite uma higienizao eficiente. A contaminao por microrganismos transportados pelo ar do ambiente de processamento tem sido constatada.
Na indstria, o ar pode entrar em contato com produtos alimentcios durante
as diversas etapas de manipulao, armazenagem, processamento e embalagem.
Deve-se atentar possibilidade da contaminao dos produtos alimentcios com
microrganismos patognicos e, ou, alteradores provenientes do ar, comprometendo a segurana alimentar; alm disso, a vida-de-prateleira e a qualidade do
alimento tambm podem ser afetadas.
A busca do aumento da vida de prateleira tem levado a uma preocupao
maior com a qualidade microbiolgica do ar dos ambientes de processamento
na indstria de laticnios, por exemplo, considerando que mesmo se presentes
em baixo nmero, os microrganismos oriundos do ar podem causar deteriorao.
Uma pesquisa mostrou correlao elevada (r=0,86) entre o nmero de microrganismos presentes no ar ambiental na rea de embalagem de leite e o nmero de
microrganismos contaminantes do produto final. Calculou-se que durante 60 seg

306

de exposio ao ambiente com contagens de 3,0x102 UFC.m-3 a 3,9x103 UFC.m-3


de ar, 1,5 % dos microrganismos presentes seriam capazes de contaminar 1 L de
um produto embalado, em um recipiente com abertura de 100 cm2 e, conseqentemente, reduzir a vida de prateleira desse produto.
Os microrganismos, a partir de fontes ambientais, podem estar presentes em
aerossis e ser transportados como clulas isoladas ou aglomerados em partculas
slidas ou lquidas. Muitos pesquisadores reconhecem como fontes de aerossis
nas reas de processamento de produtos lcteos a atividade de pessoal, os drenos
do piso, os sistemas de ventilao, a comunicao entre salas distintas, o leite derramado no piso, os sistemas de transporte e a gua usada sob presso durante o
procedimento de higienizao. Quaisquer superfcies onde microrganismos possam
aderir ou depositar iro agir como fontes de contaminao do ar, em condies
apropriadas para a formao de aerossis.
Resultante da atividade de pessoal, a contaminao microbiolgica do ar caracterizada por aerossis formados por clulas vegetativas de bactrias, especialmente estafilococos, estreptococos, micrococos e outros microrganismos associados ao
trato respiratrio humano, cabelos e pele.

gua corre para dentro destes, respinga ou forma bolhas. A quantidade de partculas viveis detectada na contagem de bactrias transportadas pelo ar reduz
proporcionalmente com o nmero de vezes em que os drenos so usados. Essa
relao indica que a populao microbiana que cresce nos produtos slidos do
interior dos drenos forma aerossis que so contaminados pelo deslocamento do
ar devido ao fluxo de gua.
O sistema de ventilao, quanto presentes nas plantas de processamento,
pode contribuir para a contaminao microbiolgica do ar. Para que se obtenha
um design ou manuteno adequada desse sistema, deve-se conhecer o movimento do ar atravs da fbrica, assim como a difuso das partculas pelo ar. Um
sistema de ventilao eficiente pode, no entanto, auxiliar o controle de microrganismos do ambiente, contribuindo para a melhor qualidade microbiolgica do ar,
da temperatura ambiental e da umidade relativa do ambiente.
Em muitas situaes, a contaminao de produtos por bioaerossis ocorre em virtude do transporte de microrganismos de reas adjacentes na linha de
processamento; transporte esse que depende de um gradiente de concentrao

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Os drenos contribuem para aumentar os nveis de bioaerossis, quando a

de microrganismo e de outros fatores, como a ventilao, e de um gradiente de


temperatura e turbulncia do ar no espao de comunicao entre as salas.
De acordo com a forma de gerao do ar e das condies ambientais, a dimenso dos bioaerossis varia de 0,1 m a mais de 100 m de dimetro, provocando um
comportamento aerodinmico diferenciado, influenciando bastante a difuso e deposio de partculas. Tais partculas podem conter bactrias, fungos filamentosos,
leveduras, esporos, antgenos, toxinas, vrus, plen de plantas e material fecal.

307

Clulas vegetativas de bactrias podem estar presentes em menor nmero no


ar, em comparao com esporos bacterianos e fungos, devido ao fato de elas no sobreviverem por longo perodo no ar, a menos que a umidade relativa ou outros fatores
sejam favorveis ou, ainda, que essa clula esteja em alguma matriz protetora.

2. Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar


A qualidade microbiolgica do ar pode ser determinada por uma variedade de mtodos, incluindo sedimentao em placas, impresso em superfcie de gar, filtrao,
centrifugao, precipitao eletrosttica, coliso em lquido e precipitao trmica. Cada
mtodo possui suas vantagens e limitaes, e a seleo de um mtodo adequado ao
que se pretende importante para um bom monitoramento da qualidade do ar.

cap.07

Sedimentao e impresso em gar so os mtodos mais freqentemente


usados e permitem a utilizao de meios seletivos ou no para determinao de
microrganismos presentes nos bioaerossis.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.1. Sedimentao em Placas


O mtodo de sedimentao em placas baseado na deposio de partculas transportadas pelo ar na superfcie de meio de cultura e influenciado pela
dimenso dessas, contendo clulas viveis. Aquelas que apresentam dimenses
de aproximadamente 10 m depositam-se mais facilmente do que partculas menores; no entanto, dependendo da velocidade e direo de correntes de ar, a deposio de partculas menores pode ser facilitada.
Geralmente, so realizadas as anlises de mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras. No entanto, outros grupos microbianos incluindo microrganismos
patognicos podem ser determinados. Qualquer que seja a anlise, fundamenta-se
em metodologias reconhecidas, como aquelas propostas pela APHA (1992).
As contagens microbianas no ar dos ambientes so determinadas pela frmula:

No Standard Methods for the Examination of Dairy Products/APHA (1985), as


metodologias para avaliao do ar de ambientes de processamento na indstria
de alimentos foram classificadas em quatro categorias: classes O, A1, ou A2; clas308

se B; classe C; e classe D (Quadro 1). No h um mtodo classe A para testar a


qualidade microbiolgica do ar, e mtodo de sedimentao em placas tido como
classe D, recomendando-se 15 min de exposio para placas de Petri (90 mm de
dimetro) contendo meios de cultura adequados determinao do microrganismo desejado.

Figura 1 - Tcnica da sedimentao simples.

2.2. Impresso em gar


Os amostradores de ar por suco consistem em imprimir certo volume de
ar em meio seletivo ou no, podendo ser de um ou mltiplos estgios, ou seja,
contendo uma ou uma srie de placas de metal, com orifcios igualmente dispostos e sucessivamente menores. Essa srie de placas permite que partculas menores sejam coletadas nos estgios finais, devido a um aumento na velocidade
do ar, fornecendo tambm a informao da distribuio das partculas de acordo
com as suas dimenses.
Com um fluxo constante de 100 L de ar por minuto, o MAS 100 Air SamplerMerck um amostrador com capacidade de coletar e recuperar partculas viveis
acima de 1 mm ( MERCK, 2001ab). Com base no princpio do amostrador de ar de
Andersen (1958), ele coleta e imprime o ar em uma superfcie de meio de cultura,
logo aps atravessar uma placa de metal com 400 poros, igualmente distribudos,
velocidade de 0,45 m.s-1, para aspirao horizontal.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 1 - Classificao de metodologias de anlise do ar de ambientes de processamento na


indstria de alimentos

309

cap.07

Para as determinaes dos grupos de microrganismos analisados so utilizadas placas de Petri de 90 mm de dimetro, contendo 20 mL dos respectivos
meios de cultura, conforme recomendaes da APHA (1992). Durante a coleta de
amostras, a tampa do amostrador pr-autoclavada (121 C por 15 min) sanitizada, usando-se algodo umidecido com lcool etlico 70 %, no intervalo de cada
amostragem. Aps cada coleta, as placas removidas do amostrador so tampadas, invertidas e incubadas sob condies ideais para cada determinao, sendo
30 C/3-5 dias para fungos filamentosos e leveduras e 35 C/48 h para mesfilos
aerbios (APHA, 1992). A contagem de UFC corrigida por meio de uma tabela
desenvolvida com base em probabilidade estatstica:

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Essa correo mostra que, quanto maior o nmero de partculas viveis impressas na placa, menor a probabilidade de as prximas partculas passarem em
orifcios vazios, subestimando a contagem. Dessa forma, o nmero de UFC por volume de ar em m3 pde ser determinado:

Compensando fatores como influncia do fluxo de ar, volume de gar e dimenso da placa, o amostrador fornece resultados corretos e precisos, sendo classificado pela 16 edio do Standard Methods for the Examination of Dairy Products
como mtodo Classe B.

310

Figura 2 - Princpio de funcionamento do amostrador de ar.

A eficincia de qualquer avaliao microbiolgica do ar varia de acordo com o


amostrador utilizado e a natureza dos aerossis a serem amostrados. As recomendaes para a qualidade microbiolgica do ar podem ser estabelecidas de acordo
com os grupos de microrganismos pesquisados por volume de ar ou deposio de
partculas viveis em rea e tempo definidos e nveis crticos de contaminao para
cada alimento em questo ou tipo de indstria de alimentos. As recomendaes
propostas pela NASA (Quadro 2) e adotadas pela APHA tambm podem ser usadas
como referncias para se estabelecer uma especificao prpria para determinadas
situaes na indstria de alimentos.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Figura 3 - MAS 100 Air Sampler/Merck.

311

Quadro 2 - Recomendao da APHA (American Public Health Association) para o controle


microbiolgico do ar ambiental

A partir de um estudo realizado em ambientes de embalagem de produtos


lcteos, foi proposta outra recomendao para a qualidade microbiolgica do ar de
acordo com os seus nveis mximos de microrganismos, quanto ao tempo de exposio do produto (Quadro 3). Esses nveis mximos foram estabelecidos de forma a
garantir que a contaminao resultante em 1 L de produto no provoque alteraes
indesejveis. Esses nveis so dados para recipientes de vrias dimenses de abercap.07

tura e diferentes perodos de exposio ao ar.

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Quadro 3 - Nveis mximos aceitveis de microrganismos por m3 de ar, em virtude do tempo de


exposio e da dimenso da abertura do recipiente de embalagem

Um programa de monitoramento da qualidade do ar pode ser aplicado em plantas de processamento de laticnios, com a finalidade de controlar patgenos e aumentar a vida de prateleira dos produtos. Um acrscimo de sete dias na vida de prateleira
de leite pasteurizado foi obtido com o uso de um sistema assptico de embalagem
que elimina o risco de contaminao por microrganismos transportados pelo ar.
A seguir so descritos alguns trabalhos que envolvem avaliaes microbiolgicas do ar em estabelecimentos produtores de alimentos.

312

3. Resultados de Avaliao da Qualidade Microbiolgica do Ar de


Ambientes de Processamento
3.1. Em uma Unidade de Alimentao e Nutrio
fundamental proceder-se avaliao das condies microbiolgicas em Unidade de Alimentao e Nutrio (UANs), por meio de um monitoramento correto,
com especificaes ou recomendaes apropriadas, determinando-se se o nvel de
higiene aceitvel, efetuando-se as correes, se necessrias, e mantendo-se o
processo sob controle.
Em um dos trabalhos (SILVA, 1996) foram avaliadas as condies microbiolgicas de ar de ambientes de processamentos em 12 Unidades de Alimentao e Nutrio (UANs) das Zonas da Mata e Metalrgica de Minas Gerais, com capacidade para
produzir entre 1.000 e 4.000 refeies/dia, comparando-as com as recomendaes da
American Public Health Association (APHA). A partir de anlises dos dados, foram sugeridas especificaes microbiolgicas, com o propsito de fornecer subsdios para a
melhoria da qualidade higinico-sanitria dos alimentos produzidos nessas UANs.

UANs foi avaliado pela tcnica de sedimentao simples. Em razo das exigncias
de qualidade microbiolgica dos ambientes, as UANs foram enquadradas na classe
menos exigente, conforme recomendao da APHA.
Verificou-se, em relao aos mesfilos aerbios, que apenas 18,5 % dos ambientes avaliados encontravam-se corretamente higienizados. Usando essa mesma
recomendao para fungos filamentosos e leveduras, constatou-se que 32,28 % dos
ambientes apresentavam condies satisfatrias de higiene (Figura 4).

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Um total de 63 ambientes selecionados pelos responsveis tcnicos pelas

Figura 4 - Porcentuais de ambientes com contagens de mesfilos aerbios e de fungos e leveduras dentro
da recomendao da APHA (at 30 UFC.cm-2.semana-1).

Muitas vezes, essa recomendao americana considerada rgida pelos restaurantes brasileiros. As recomendaes da APHA ou da OMS (Organizao Mundial

313

de Sade) devem ser utilizadas apenas como referncia, pois de se esperar que,
dentre as UANs nacionais, encontram-se aquelas que trabalham dentro de condies preconizadas pela APHA e tambm muitas outras, provavelmente a maioria,
que no atendem s recomendaes adotadas nos Estados Unidos.
Um procedimento de higienizao pode ser considerado inadequado ou aceitvel se o nmero de bactrias de interesse ultrapassar ou no determinado limite.
O smbolo m usado para representar esse limite, como uma linha que divide um
processo considerado bom e outro de qualidade insatisfatria, e os valores de m
devem ser consistentes com as Boas Prticas de Processamento (BPP) e determinados de acordo com a importncia atribuda ao microrganismo. J o smbolo M
igual ao menor valor capaz de causar prejuzos sade ou problemas relacionados
higiene na indstria de alimentos.
Existem diferentes sugestes para se determinar um valor para m. Uma

cap.07

delas se baseia em levantamento de dados, em um universo representativo, em

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

que a mdia e o desvio-padro so estimados. Para evitar a tendenciosidade,


esses levantamentos devem ser feitos sob amostragem estatstica, propondo-se
valores de m= X + 2s, em que X a mdia aritmtica dos logaritmos das contagens e s o desvio-padro desses valores.
No trabalho mencionado anteriormente, trs metodologias para a determinao de especificaes para ambientes (valor m) foram testadas. Na primeira,
todos os restaurantes que atendiam s BPP foram includos na anlise estatstica
dos dados. Uma segunda estratgia incluiu apenas os restaurantes que atendiam
s BPP, em que nenhum ambiente obtivesse contagens elevadas, ou seja, acima da
mdia mais o intervalo de confiana de 5%. A terceira estratgia agrupou os estabelecimentos que atendiam s BPP e excluiu da anlise apenas os ambientes cujas
contagens eram elevadas.
Para a classificao dos restaurantes como estabelecimentos que operavam
dentro das BPP, foram aplicados questionrios em que se avaliaram os seguintes
fatores: controle de procedncia e recebimento da matria-prima; condies de
processamentos, sendo considerados a qualidade da gua, equipamentos, pontos
crticos de controle do processo, procedimentos de limpeza e sanitizao, condies da estrutura fsica e, ainda, processo de manipulao de alimentos nos
estabelecimentos avaliados.
Nesse critrio de avaliao dos restaurantes quanto s BPF, foi estabelecida
uma tabela de pontuao para as respostas negativas e positivas dos questionrios,
sob o julgamento de um especialista da rea. Ao atingir total de 105 pontos em 150

314

(pontuao mxima), ou seja, um porcentual de 70 %, o restaurante seria classificado dentro das BPF. Esse porcentual foi estabelecido considerando-se simulaes
feitas ao se usar questionrios que obtiveram valores iguais ou superiores a 70 %
em restaurantes comprovadamente operando em Boas Prticas de Processamento.
Para a determinao do valor m, a terceira estratgia foi escolhida, pois as
outras metodologias forneciam valores irreais, muito baixos ou elevados, para serem
tidos como especificaes microbiolgicas recomendadas. Os valores de m, expressos em UFC.cm-2.semana-1, determinados para os ambientes refrigerados, em relao a microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras, foram,
respectivamente, 80 e 50 e para os no-refrigerados, 250 e 100 (SILVA, 1996).
Esses valores foram utilizados para avaliar e classificar as condies de higiene
das 12 UANs avaliadas. Quanto aos mesfilos aerbios, constatou-se que 32,3 % dos
ambientes refrigerados e 24,3 % dos no-refrigerados apresentaram contagens acima
dos valores de m sugeridos, o que significa condies higinicas insatisfatrias.
Uma interpretao das contagens encontradas em relao ao valor m foi proposta por Silva (1996), conforme Quadro 5.

Quadro 5 - Interpretao dos resultados das contagens de mesfilos aerbios no ar de ambientes de processamento de alimentos

Com base na classificao proposta, observaram-se ainda, nas contagens de

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 4 - Valores de m propostos para ar de ambientes em unidade de alimentao e nutrio, usando-se o mtodo da sedimentao em placas

microrganismos mesfilos aerbios, situaes imprprias ao processamento de


alimentos, estando nessas condies 0,74 % dos ambientes no-refrigerados das
UANs avaliadas
Os valores de m encontrados por Silva et al. (2003) servem como especificaes para os restaurantes industriais situados nas regies das Zonas da Mata e Metalrgica mineiras, sendo tambm teis como referncias ao controle de qualidade
das UANs que desejam produzir alimentos que, alm de apresentar qualidades nu-

315

tricionais e sensoriais, tenham boas condies higinico-sanitrias, no oferecendo,


portanto, riscos sade do consumidor.

3.2. Em uma Indstria de Processamento de Leite


3.2.1. Contagem Microbiana pelas Tcnicas da Sedimentao em Placas e Impresso em gar
A eficincia de qualquer forma de tratamento do ar, para melhorar sua qualidade microbiolgica, segundo Wilson (1958), pode ser avaliada por meio da taxa de
morte da populao de microrganismos transportados pelo ar, sob a influncia de
um agente germicida e tambm pela medida do porcentual de reduo de microrganismos viveis no ar aps a aplicao de determinado tratamento antimicrobiano.
A desinfeco qumica do ar de ambientes requer o emprego de um germicida
que tenha fcil acesso aos bioaerossis; por essa razo, sanitizantes na forma de
gs ou nvoa fina so os mais efetivos. As concentraes recomendadas de agentes
cap.07

qumicos sanitizantes para desinfeco do ar em ambientes de processamento de

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

alimentos so variadas, mas com limites mximos de uso preconizados pelos fabricantes (Quadro 6). Esses limites, segundo os prprios fabricantes, ainda carecem
de base cientfica slida, tendo sido realizados apenas alguns estudos internos e
empricos de sua eficcia.
Quadro 6 - Concentraes para uso, sugeridas para alguns agentes qumicos para desinfeco
do ar de ambientes na indstria de alimentos

Em um trabalho realizado em uma indstria de laticnios de porte mdio, avaliou-se a microbiota do ar de seis ambientes de processamento: i) recepo de leite
cru, ii) embalagem de leite, iii) pasteurizao de leite, iv) processamento de queijo, v)
processamento de iogurte e vi) processamento de doce de leite e manteiga. Foram
utilizadas as tcnicas da impresso em gar e da sedimentao em placas. Avaliouse, ainda, a eficincia de solues diludas de sanitizantes base de digluconato de
clorohexidina, de cido peractico e de quaternrio de amnia, pulverizadas no ar
a uma presso de 9 kgf.cm-2, temperatura entre 20 C e 25 C . Simultaneamente
coleta de amostras, tambm foram medidas a temperatura ambiente e a umidade
relativa do ar de cada local de amostragem.

316

Em cada ambiente de processamento, foram determinadas as contagens de


microrganismos mesfilos aerbios, de coliformes totais, de fungos filamentosos e
leveduras e de Staphylococcus spp., por meio de Plate Count Agar (PCA), Violet Red
Bile Agar (VRBA), Potato Dextrose Agar (PDA) e BairdParker Agar (BPA), conforme
metodologias propostas pela APHA.
No Quadro 7, so mostradas as faixas de contagem, as mdias e os desvios-padro
dos nmeros de fungos filamentosos e leveduras e de microrganismos mesfilos aerbios, presentes no ar de seis ambientes de processamento da indstria de laticnios,
avaliados pela tcnica de impresso em gar.
Os resultados da determinao de microrganismos mesfilos aerbios foram
comparados com a recomendao da APHA, para contagem total em placas. No
havendo recomendao especfica da APHA para o nmero mximo sugerido de
fungos filamentosos e leveduras, tomou-se como base para comparao o mesmo
valor recomendado para contagem total em placas. Observou-se que as contagens
mdias em todos os ambientes estiveram acima de 90 UFC.m3 de ar, ou seja, superior
recomendada pela APHA. No entanto, deve-se salientar que recomendaes menos

das na literatura (KANG; FRANK, 1989). Esses autores sugeriram de 180 a 360 UFC.
m-3 de ar para microrganismos mesfilos aerbios e de 70 a 430 UFC.m-3 para fungos
filamentosos e leveduras, dependendo do ambiente de processamento. Outros autores recomendaram contagens menores que 200 UFC.m-3 para salas de embalagem de
produtos lcteos e menores que 1.400 UFC.m-3 de ar para plantas de processamento
de sorvete. Neste trabalho, realizado em laticnios, adotaram-se para comparao os
valores recomendados pela APHA.
Quadro 7 - Faixa de contagem, mdias e desvio-padro de fungos filamentosos e leveduras e
de microrganismos mesfilos aerbios, em UFC.m-3, no ar de ambientes de processamento de
uma planta de laticnios, pela tcnica de impresso em gar

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

exigentes para ambientes de processamento na indstria de laticnios so encontra-

317

As contagens dos diferentes grupos microbianos variaram entre 10 e 1310


UFC.m-3 de ar nos ambientes de processamento, que podem originar problemas de
qualidade nos diversos produtos lcteos. Sullivan (1979) constatou que 40 % da variao da vida de prateleira de queijo cottage pode ser devida contaminao do ar.
O predomnio da contaminao de iogurte por coliformes na superfcie do produto
envasado em potes plsticos evidenciou que esses microrganismos foram transportados pelo ar, contaminando o produto. A qualidade de um produto lcteo base de
acar, ovo e farinha de trigo, esterilizado pelo processo UAT, tambm foi afetada
pela contaminao do ambiente de processamento. A contaminao intencional do
ar em torno da mquina de embalagem (procedimento no-assptico) com pulverizao de trs esporos de Bacillus spp. por litro de ar causou alterao em 24 %
das amostras desse produto; no entanto, apenas 2,5 % das amostras apresentaram
alterao quando pulverizados 210 esporos por litro de ar ao redor de uma mquina
cap.07

de empacotamento assptico.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Vrios fatores podem ter contribudo para a contaminao do ar dos ambientes


de processamento, por exemplo a localizao do laticnio e a falta de maior controle
das possveis fontes de contaminao dentro da indstria. As reas crticas, onde os
produtos e as superfcies que entram em contato com os alimentos esto expostos
ao ar, devem estar fisicamente separadas de reas no-crticas, como salas de administrao e estocagem de leite cru. Outros detalhes que deveriam ser observados
so os sistemas de ventilao e exausto, o prprio desenho e a estrutura da planta
e as prticas de fabricao.
Os nmeros de coliformes totais e de Staphylococcus spp. variaram de <1,0 a
1,7 UFC.m-3 e < 1,0 a 4,3 UFC.m-3, respectivamente. Essas contagens so consideradas inferiores quelas obtidas por Sullivan, na faixa de 0,1-1,0 UFC/10 L de ar, o que
corresponde a 10,0 e 100,0 UFC.m-3. Os baixos nmeros observados tanto neste experimento quanto no de Sullivan, em relao aos obtidos na determinao de outros
grupos microbianos, evidenciam que esses microrganismos parecem no sobreviver muito bem em aerossis. Essas contagens baixas podem, ainda, ser devidas
associao do uso de meios seletivos e ao estado de estresse dos microrganismos
em aerossis, que, segundo Sveum et al. (1992), podem dificultar o crescimento e
a determinao de microrganismos.
No Quadro 8, encontram-se as faixas de contagem, mdias e desvios-padro dos
nmeros de fungos filamentosos e leveduras e microrganismos mesfilos aerbios,
expressos em UFC.cm-2.semana-1, obtidos pela tcnica de sedimentao, nos
ambientes de processamento da indstria de laticnios. Dois ambientes atenderam

318

recomendao da APHA de 30 UFC.cm-2.semana-1: a sala de processamento de leite


pasteurizado para fungos filamentosos e leveduras e a sala de embalagem de leite
pasteurizado para microrganismos mesfilos aerbios.
No Quadro 9, so apresentadas as anlises de varincia dos nmeros de fungos filamentosos e leveduras e de microrganismos mesfilos aerbios, expressos
em UFC.cm-2.semana-1, nos ambientes de processamento. Constatou-se que no
houve diferena (p>0,05), com relao a ambos os grupos microbianos avaliados,
entre os diferentes ambientes.
A tcnica de sedimentao no se mostrou capaz de recuperar, de forma considervel, clulas viveis de coliformes totais e Staphylococcus spp. do ar, tendo em
vista que as contagens, quase que em sua totalidade, foram menores que 10 UFC.
cm-2.semana-1 em todos os ambientes avaliados.
Quanto distribuio da microbiota do ar, houve a predominncia de fungos
filamentosos e leveduras pela tcnica de impresso em gar e de microrganismos
mesfilos aerbios pela tcnica de sedimentao, o que pode ser explicado pelo
comportamento aerodinmico diferenciado dos microrganismos.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 8 - Faixas de contagem, mdias e desvios-padro de fungos filamentosos e leveduras e


de microrganismos mesfilos aerbios, obtidos pela tcnica de sedimentao

Quadro 9 - Resumo da anlise de varincia do nmero de fungos filamentosos e leveduras e de


microrganismos mesfilos aerbios, pela tcnica de sedimentao, expresso em UFC.cm-2.semana-1, nos ambientes de processamento da indstria de laticnios

319

Apesar de haver dados na literatura sobre a influncia da temperatura no aumento da microbiota do ar, neste experimento parece que no houve essa relao
entre as contagens obtidas, em razo da variabilidade das condies de anlise. A
influncia da umidade relativa nas contagens obtidas neste trabalho pode ser explicada pela maior facilidade de as clulas microbianas permanecerem viveis em
aerossis na presena de maiores teores de umidade.
As tcnicas de anlise foram comparadas com base na relao de 1:3
estabelecida entre as recomendaes da APHA de 30 UFC.cm -2.semana-1 e de
90 UFC.m -3 de ar. Pela tcnica da impresso em gar, houve contagens que
variaram de 5 a 10 e de 2 a 10 vezes mais, respectivamente, que as obtidas por
sedimentao, evidenciando-se a maior capacidade da tcnica de impresso

cap.07

em gar de determinar microrganismos do ar.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Essa menor capacidade da tcnica de sedimentao em recuperar microrganismos do ar pode ser explicada pela necessidade de certo tempo de exposio,
para deposio das partculas nas placas de Petri. Da mesma forma, a dimenso
dos esporos tambm influencia a deposio. Diversos gneros de fungo foram listados e classificados em trs categorias, quanto s suas dimenses: esporos maiores
(Alternaria, Stemphilium, Epicoccum, Nigrospora, Diplospora, Monotospora e Sepedonium); esporos intermedirios (M. sitophilia, Geotrichum, Cndida, Pullularia,
Saccharomyces, Aspergillus, Hormodendrum e Penicillium); e esporos menores
(Ustilago, Rhodotorula, Rhizopus, Oospora, Gliocladium, Paecilomyces, Hemispora
e Streptocyces). Analisados pelas tcnicas de sedimentao simples e impresso
em gar, para esporos maiores, intermedirios e menores, as relaes encontradas
entre as duas tcnicas foram de aproximadamente 1:5, 1:14; e 1:19, respectivamente. Portanto, quanto menor a dimenso do esporo, mais visvel a diferena entre as
duas tcnicas e a superioridade da tcnica de impresso em gar.
O tempo de anlise requerido tambm um fator importante para a comparao das tcnicas, pois a sedimentao exige tempo maior de exposio das placas
de Petri ao ar ambiente. Perodo longo de exposio dessas placas pode resultar
em ressecamento do meio de cultura, dificultando o crescimento das colnias e subestimando as contagens. Na tcnica de impresso em gar, embora o ar que entra
no amostrador seja considerado seco, a umidade dentro do amostrador aumenta
rapidamente, no permitindo o ressecamento do meio de cultura. Em um estudo,
essa umidade do ar era de 23 % antes de entrar no amostrador e passou para 39 %
dentro deste, ficando tambm evidenciado que a passagem do ar pelo amostrador,

320

durante 1 h, no reduziu as contagens de Serratia marcescens.

3.2.2. Avaliao de Agentes Qumicos Sanitizantes no Controle Microbiolgico do Ar


A eficincia de agentes qumicos sanitizantes pulverizados no ar foi avaliada,
aplicando-se soluo sanitizante no controle da microbiota do ar nas reas de embalagem de leite pasteurizado; de processamentos de doce de leite e manteiga; e de
queijo, previamente selecionadas, aps o trmino do expediente. Um bico pulverizador ligado linha de ar comprimido da prpria indstria foi utilizado, com aplicao
de uma fina nvoa, com presso de aproximadamente 9 kgf.cm-2 (Figura 5).
Na proporo de 1.000 mL por 160 m3 de ar, as solues sanitizantes foram
aplicadas nos ambientes de processamento de queijo (330 m3 de ar), doce de leite
e manteiga (330 m3 de ar) e de embalagem de leite (80 m3 de ar). Equipamentos de
proteo, como luvas, mscaras de gs, culos de proteo e gorros, foram utilizados para segurana e proteo do aplicador (Figura 5). O intervalo das aplicaes
com a mesma concentrao foi de trs dias e nas solues com concentraes
diferentes, de uma semana.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Figura 5 - Aplicao da soluo sanitizante por pulverizao no ar dos ambientes.

Para avaliao da eficincia dos sanitizantes, foram realizadas anlises de microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras presentes no
ar. Neutralizantes para os sanitizantes aplicados e avaliados foram adicionados aos
meios PCA e PDA, para inibir a interferncia dos sanitizantes nas anlises, de acordo
com as recomendaes usuais (Quadro 10).

321

Quadro 10 - Neutralizantes adicionados aos meios de cultura, ao e concentrao de uso em


meios slidos ou lquidos

Esses grupos de microrganismos foram determinados em quatro tempos distintos: antes da aplicao, aps 30 min, 12 e 24 h, pelas tcnicas de sedimentao e
impresso em gar. Assim, aps realizar a anlise no tempo zero (T0), a aplicao
foi feita aps o expediente, s 17 h, com trmino at as 17 h 30; o tempo um (T1)
foi analisado s 18 h, o tempo dois (T2) s 5 h 30 do dia seguinte e, finalmente, o

cap.07

tempo trs (T3) s 17h 30 tambm do dia seguinte.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


322

Em razo dos resultados e de informaes da literatura, considerou-se neste trabalho que houve ao antimicrobiana do sanitizante quando a reduo das
contagens microbianas foi de pelo menos 15 % em duas das trs aplicaes do
agente qumico, 30 min aps a pulverizao ambiental. Considerou-se, ainda, que a
soluo sanitizante apresentou efeito residual quando ocorreram redues de pelo
menos 10 % nas contagens determinadas antes da pulverizao, da primeira para a
segunda aplicao e da segunda para a terceira aplicao. O uso de sanitizantes foi
avaliado nos diferentes tempos de anlise do ar dos ambientes: To, antes, e T1, T2 e
T3 respectivamente, 30 min, 12 e 24 h depois da pulverizao.
Nas aplicaes de digluconato de clorohexidina a 2.000 mg.L-1 e de quaternrio de
amnia a 700 mg.L-1, foi observada a ao antimicrobiana da soluo sanitizante contra
fungos filamentosos e leveduras. Contra microrganismos mesfilos aerbios, foi constatada a ao antimicrobiana de cido peractico a 45 mg.L-1 (Quadro 11). Nas aplicaes
de digluconato de clorohexidina a 1.000 mg.L-1, foi constatado efeito residual contra fungos filamentosos e leveduras. Constatou-se, tambm, efeito residual da aplicao de
cido peractico a 75 mg.L-1, contra fungos filamentosos e leveduras (Quadro 12).
Quadro 11 - Log10 UFC.m-3 de fungos filamentosos e leveduras e mesfilos aerbios antes da
aplicao do sanitizante (T0) e aps 30 min de aplicao (T1) e a porcentagem de diminuio (-)
ou aumento (+) aps a pulverizao do sanitizante no ar de ambiente de processamento em
um laticnio

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 12 - Efeito residual de sanitizantes pulverizados no ar de ambientes de processamento


de uma indstria de laticnios contra fungos filamentosos e leveduras e mesfilos aerbios

323

Em relao aos fungos filamentosos e leveduras, as solues de digluconato de


clorohexidina a 1.000 mg.L-1 e de cido peractico a 75 mg.L-1 e em relao aos microrganismos mesfilos aerbios, as solues de digluconato de clorohexidina a 2.000
mg.L-1 e de quaternrio de amnia a 700 mg.L-1 apresentaram tendncia de reduo
nas contagens de 30 min aps as aplicaes, embora no atendam ao critrio adotado
para consider-las como de ao antimicrobiana. A soluo de quaternrio de amnia
a 700 mg.L-1 para microrganismos mesfilos aerbios teve tambm tendncia ao efeito
residual, com redues prximas a 10 % nas contagens.

cap.07

Em pesquisa realizada em uma indstria de alimentos, a pulverizao, duas vezes


por semana, do ar de ambientes de processamento com p-hidroxifenilsalicilamida para
controle da contaminao por fungos apresentou redues de 20-25 % na contagem
de esporos de fungos do ar aps algumas semanas de tratamento. Outra pesquisa
tambm mostrou redues similares quando se utilizou o mesmo agente qumico, em
indstrias de laticnios com contagens iniciais de fungos de 2.000 UFC.m-3 de ar. Aps
tratamento com 1,5 g.m-3 de p-hidroxifenilsalicilamida e tratamento de manuteno

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

com 1,0 g.m-3 de ar duas semanas depois, houve reduo de 15 % nas contagens;
aps mais cinco tratamentos, a reduo passou para 23-25 %. Nessa indstria de laticnios, a contaminao da manteiga que vinha ocorrendo em torno de 1.200 esporos
de fungos por grama foi completamente controlada; redues essas compatveis com
as encontradas no experimento ora citado.
As contagens de 12 e 24 h aps a aplicao das solues sanitizantes (T2 e T3)
apresentaram nmeros elevados em relao aos outros tempos de anlise, uma
explicao para essas maiores contagens seria a variabilidade das condies de
anlise, que nem sempre puderam ser controladas nos ambientes, principalmente
nesses tempos.
Com base nos resultados deste estudo, sugere-se a avaliao, pela tcnica da
impresso em gar, da aplicao de sanitizantes por perodos mais longos, fazendose o rodzio de agentes qumicos e realizando, ainda, a associao da pulverizao
desses agentes com o controle de fontes na indstria que possam contribuir para a
contaminao do ar.

3.3. Em uma Indstria de Produtos Crneos


3.3.1. Consideraes Gerais

324

As amostras para avaliao da qualidade microbiolgica do ar foram coletadas em oito ambientes distintos de uma indstria de processamento de carnes:
setor de cozimento, setor de embutimento de lingia, setor de embutimento, setor de embalagem, sala do cutter, setor de preparo de massas, setor de produtos
especiais e sala de pesagem.
Os resultados obtidos pelas tcnicas de sedimentao simples e de impresso
em gar foram comparados usando-se a relao na recomendao da APHA (1992):
de 3 UFC da tcnica de impresso em gar, para 1 UFC da tcnica de sedimentao
simples, e, com os resultados transformados, as duas tcnicas foram comparadas.

3.3.2. Avaliao Microbiolgica


Em relao ao ar dos ambientes, somente 12,5 % encontravam-se dentro das
recomendaes para mesfilos aerbios e 33,3 % para fungos filamentosos e leveduras, pela tcnica da sedimentao simples.
Quadro 13 - Mesfilos aerbios (UFC.cm-2.semana-1) no ar de ambientes de processamento em
uma indstria de crneos

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 14 - Contagens de fungos filamentosos e leveduras (UFC.cm-2.semana-1 ) em ambientes


de uma indstria de produtos crneos

Figura 5 - Porcentagem de mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras dentro e fora do padro
proposto pela APHA, por meio da tcnica de sedimentao simples.

3.3.3. Tcnica de Impresso em gar


Pela tcnica de impresso em gar, 33 % dos ambientes no atenderam s
recomendaes para a contagem de mesfilos aerbios e 12,5 % para fungos

325

filamentosos e leveduras.
Quadro 15 - Mesfilos aerbios (UFC.m-3) no ar de ambientes de processamento em uma
indstria de crneos

cap.07

Quadro 16 - Contagens de fungos filamentosos e leveduras, expressos em UFC.m-3

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Figura 6 - Porcentagem de mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras conforme recomendao


proposta pela APHA, por meio da tcnica de impresso em gar.

3.3.4. Comparao entre as Tcnicas de Sedimentao Simples e Impresso em gar


Os resultados das contagens de microrganismos mesfilos aerbios e fungos
filamentosos e leveduras, obtidos atravs da tcnica de impresso em gar, expressa em UFC.m-3, e da tcnica de sedimentao simples, em UFC.cm-2.semana-1, foram
utilizados a ttulo de comparao.
De acordo com a APHA, um ambiente considerado em condies higinicas
quando a contagem de mesfilos for no mximo de 30 UFC.cm-2.semana-1, para a
tcnica de sedimentao simples, e de 90 UFC.m-3, para a tcnica de impresso em
gar. Assim, existe a relao numrica de 1:3 (30:90) entre as contagens recomen-

326

dadas para as tcnicas de avaliao, usada na anlise do resultado.


No Quadro 17 mostrado que, para fungos filamentosos e leveduras, a tcnica
de impresso em gar obteve contagens de 2 a 14 vezes mais que as contagens
obtidas pela tcnica de sedimentao simples, exceo da sala de embutimento
de lingia, na qual a contagem da tcnica de sedimentao simples foi duas vezes
maior que a contagem pela tcnica de impresso em gar.
Constatou-se, portanto, que a tcnica de impresso em gar recuperou do ar
maior nmero de fungos filamentosos e leveduras, na maioria dos ambientes analisados. Cinco dos oito ambientes analisados apresentaram relaes entre as contagens obtidas pelas duas tcnicas maiores que 1:3.
As contagens de aerbios mesfilos foram, no mximo, trs vezes maiores
quando se utilizou a tcnica de impresso em gar, no se confirmando essa tendncia de maior recuperao dos microrganismos por essa tcnica. Os resultados
indicam que as informaes fornecidas pelas duas tcnicas devem ser usadas com
cuidado e bom senso.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro 17 - Diferentes grupos de microrganismos determinados pelas tcnicas de impresso em


gar e sedimentao simples, dentro de cada ambiente de processamento na indstria de carnes

O ambiente de processamento apresentou contagem de microrganismos mesfilos aerbios e fungos filamentosos e leveduras superiores ao recomendado pela APHA.
Deve-se salientar, porm, que a coleta foi feita com a indstria em processamento, o
que pode ter elevado o nmero de microrganismos presentes no ambiente analisado.

327

3.4. Em Microindstria de Processamento de Leite


Em trabalho realizado em parceria com um Servio de Inspeo Municipal (SIM)
foi avaliada a qualidade do ar de ambiente de processamento de cinco microindstrias que processavam de 100 a 600 L por dia, de um total de 24 inicialmente conveniadas ao SIM. Essas cinco microindstrias estavam se ajustando s exigncias da
legislao municipal 1252/89 e Decreto Municipal 3424/99, para posterior obteno
do selo de garantia de qualidade fornecido pelo SIM. O ar dos ambientes de processamento foi avaliado pela tcnica da sedimentao simples em placas, pelas
contagens de aerbios mesfilos e fungos filamentosos e leveduras. Nesse caso,
especfico das microindstrias, considerou-se em boas condies microbiolgicas
o ar dos ambientes com valores abaixo de 1,0x102 UFC.cm-2.semana-1.
No Quadro 18, observa-se que os ambientes de todas as indstrias no se en-

cap.07

contram em boas condies higinicas para o processamento de alimentos. Nesse

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

caso, sugeriu-se o controle microbiolgico dos ambientes analisados pelo uso de


sanitizao ambiental com um produto base de cloro. Assim, pulverizaram-se duas
vezes por semana uma soluo de 100 mg.L-1 de cloro residual total, expresso em
Cl2, preparada a partir de hipoclorito de sdio 2 % de cloro residual total.
Quadro 18 - Porcentagem de anlises de ambientes que apresentaram contagem de mesfilos
aerbios e fungos filamentosos e leveduras acima da recomendao (1,0x102 UFC.cm-2.semana-1)

Aps 30 dias, ou seja, cerca de oito aplicaes do sanitizante, o ar das reas


de processamento de uma microindstria selecionada apresentava contagens de
mesfilos aerbios e fungos filamentos e leveduras abaixo do recomendado, ou
seja, abaixo de 1,0x102 UFC.cm-2.semana-1.
Mostrou-se, assim, que medidas simples e adaptadas s condies reais das
microindstrias foram eficientes para minimizar o risco de produo de alimentos
que venham causar problemas de intoxicaes e infeces.

328

3.5. Em Cmaras Refrigeradas de uma Indstria de Laticnios


As amostras para a avaliao da qualidade microbiolgica foram coletadas em
trs cmaras frias de uma indstria de laticnios destinadas maturao de queijo,
salga de queijo e de armazenamento de iogurte.
A qualidade microbiolgica do ar das cmaras foi determinada pelos mtodos de sedimentao simples e impresso em gar, analisando-se mesfilos aerbios, fungos filamentosos e leveduras e psicrotrficos, conforme metodologias
propostas pela APHA (1992).
Os resultados do Quadro 19 indicam que as contagens de mesfilos aerbios
nos ambientes avaliados encontravam-se abaixo da recomendao da APHA para
as tcnicas de impresso em gar (90 UFC.m-3) e de sedimentao simples (30
UFC.cm-2.semana-1), exceto na cmara de armazenamento de iogurte, que ultrapassou o recomendado para a tcnica de impresso em gar. As contagens de
fungos filamentosos e leveduras encontravam-se acima das recomendaes nos
trs ambientes avaliados por ambas as tcnicas.

Para a comparao da performance das tcnicas usadas foi estabelecida a


relao numrica de 1:3, correspondente s recomendaes da APHA, ou seja, 30
UFC.cm-2.semana-1 e 90 UFC.m-3. A impresso em gar determinou contagens de
aerbios mesfilos e fungos filamentosos e leveduras entre 2,4 e 27 vezes maior. As
relaes numricas foram maiores do que 1:3 em 67 % das anlises efetuadas. Com
base nessa relao, pode-se concluir que a tcnica de impresso em gar recuperou
maior nmero de microrganismos presentes no ar dos ambientes avaliados.
O Quadro 20 mostra as contagens de microrganismos psicrotrficos no ar dos
ambientes avaliados. Considerando que as cmaras de resfriamento em indstrias
de laticnios apresentam condies propcias ao desenvolvimento de fungos, utilizou-se o meio de cultura Batata Dextrose gar (BDA) para a deteco desse grupo
microbiano em temperaturas baixas de incubao, alm do gar para contagem
total (PCA), indicado para a deteco de bactrias. As contagens para esses grupos microbianos encontravam-se de 2,3 a 18,9 vezes acima da recomendao da
APHA. Alm disso, observou-se crescimento de fungos filamentosos e leveduras
nas placas contendo PCA.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Quadro - 19. Contagens de microrganismos mesfilos aerbios (MA) e fungos filamentosos e


leveduras (FFL) determinadas pelas tcnicas de sedimentao simples e impresso em gar,
em cmaras de refrigerao de um laticnio

329

Quadro 20 - Contagens de microrganismos psicrotrficos pela tcnica de impresso em gar


em cmaras de refrigerao de um laticnio

Observou-se pelo Quadro 21 que houve a predominncia de fungos filamentosos e leveduras nos ambientes, que se caracterizam por serem microrganismos
Gram-positivos. Na cmara de maturao de queijo e de salga de queijo contatou-se
a presena de bactrias Gram-positivas e Gram-negativas; no entanto, as bactrias

cap.07

isoladas na cmara de armazenamento de iogurte eram Gram-positivas.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


330

Quadro 21 - Caracterizao morfolgica e colorao Gram de microrganismos psicrotrficos


isolados em gar para contagem total nas cmaras de refrigerao de um laticnio. Percentual
de colnias analisadas

Assim, conclui-se que, de forma geral, o ar das cmaras de resfriamento encontrava-se em condies higinicas inadequadas para o processamento e armazenamento de alimentos, apresentando contagens microbianas acima das recomendaes da APHA, para as tcnicas de impresso em gar e sedimentao em placas.
A tcnica de impresso em gar recuperou maior nmero de microrganismos
do ar dos ambientes, a microbiota era constituda principalmente de fungos filamentosos e leveduras, e a maioria das bactrias isoladas era Gram-positiva.

ANDERSEN, A.A. New sampler for the collection, sizing, and enumeration of viable airborne particles.
Journal of Bacteriology, Washington, D.C., v. 76, p. 471-484, 1958.
ANDRADE, N.J.; MACDO, J.A.B. Higienizao na indstria de alimentos. So Paulo: Editora Varela,
1996. 182 p.
APHA Standard methods for the examination of dairy products. 16. ed. Washington, D.C.: Richardson, G.H. American Public Health Association,1985.
CARDOSO,R.C.V. Eficincia de Agentes Sanitizantes na Reduo da Microbiota das Mos de Manipuladores de Alimentos. [S.l.:s.n.], 1993.
HAYES, P.R. Food microbiology and hygiene. 2. ed. London: [S.l.], 1995. p. 515.
HEDRICK, T.I.; HELDMAN, D.R. Air quality in fluid and manufactured milk products plants. Journal of
Milk and Food Technology, Alban, N.Y., v. 32, p. 265-269, 1969.
HELDMAN, D.R. Significance and control of airborne contamination in milk and food plants. Journal
of Milk and Food Technology, Alban, N.Y., v. 30, p. 13-17, 1967.
HELDMAN, D.R. Factors influencing air-borne contamination of foods. A review. Journal of Food
Science, Chicago, I.L., v. 39, p. 962-969, 1974.
JOOSTEN, R.L. Methods to extend the shelf life of pasteurized milk. Dairy Packaging Newsletter,
Brussels, n.12, p. 1-3, 1985.

Qualidade Microbiolgica do Ar de Ambientes de Processamento

Referncias

KANG, Y.J.; FRANK, F.J. Biological aerosols: a review of airborne contamination and its measurement
in dairy processing plants. Journal of Food Protection, Des Moines, I.A., v. 52, n. 7, p. 512-524, jul.
1989.
KANG, Y.J.; FRANK, F.J. Characteristics of biological aerosols in dairy processing plants. Journal of
Dairy Science, Champaing, I.L., v. 73, p. 621-626, 1990.
LUTGRING, R.K. et al. Distribution and quantification of bioaerosols in poultry-slaughtering plants.
Journal of Food Protection, Des Moines, v. 60, n. 7, p 804-810, 1997.
MACHER, M.J. Air sampling methods for biological contaminants. Net. U.S.A., 2000. Disponvel em:
<http://anderseninstruments.com/Macher.htm>. Acesso em: mar./ 2001.

331

MERCK. Microbial air monitoring- MAS 100 air sampler: techinical information. Net. Taiwan, 2001a.
Disponvel em:<http://www.merck.com.tw/>. Acesso: em mar/ 2001.
MERCK. Air sampler MAS 100 system. Net. U.S.A., 2001b. Disponvel em: <http://www.merck.de/
english>. Acesso em: abr. 2001.
MEHTA, S.K.; MISHRA, S.K.; PIERSON, D.L. Evaluation of three portable samples for monitoring
airborne fungi. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, D.C., v. 62, n. 5, p. 1835-1838,
maio 1996.
OTTAVIANI, F. Detection and control of fungal contamination of the air. Experience and methodological proposals. Tecnologie Alimentari, Itlia, v. 5, n. 4, p. 16-26, 1982.
OTTAVIANI, F.; FRANCESCHETTI, E. Air borne moulds in the dairy industry - Review. Latte, Milan,
v. 7, n. 6, p. 446-455, 1982.
RADMORE, K.; HOLZAPFEL, W.H.; LUCK, W. Proposed guidelines for maximum acceptable airborne
microorganism levels in dairy processing and packaging plants. International Journal of Food Microbiology, Amsterdamn Netherlands, v. 6, p. 91-95, 1988.
REN, T. J.; FRANK, F. J. A survey of four fluid milk processing plants for airborne contamination using
various samplig methods. Journal of Food Protection, Des Moines, v. 55, n. 1, p 38-42, jan.1992a.

cap.07

REN, T. J.; FRANK, F. J. Measurement of airborne contamination in two commercial ice cream plants.
Journal of Food Protection, Des Moines, v. 55, n. 1, p. 43-47, jan.1992b.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


332

SAYER, W. J.; SHEAN, D. B.; GHOSSEIRI, B.S. Estimation of airborne fungal by the Andersen sampler
versus the gravity settling culture plate. Journal of Allergy, St. Louis, p. 214-227, out. 1969.
SILVA, R.M.M. . Especificaes microbiolgicas para ambientes, manipuladores e equipamentos em
restaurantes industriais. Viosa, MG: UFV, Imprensa Universitria, 1996.
SULLIVAN, J.J. Air microbiology and dairy processing. Aust. Journal of Dairy Technology, Highett
Victoria, v. 34, p. 133-138, 1979.
SVEUM, W.H. et al. Microbiological monitoring of the food processing environment. In: VANDERZANT, C.; SPLITTSTOESER, D.F. Compendium of methods for the microbiological examination of
foods. 3rd. [S.l.]: APHA, 1992. cap. 3, p. 51.
TOSHIO, E. D. G. Departamento de Microbiologia Diversey Lever/Brasil. Publicao eletrnica [mensagem pessoal]. Mensagem recebida por <valeriacosta@tdnet.com.br>, em 4 de jun. 2001.
VICKERS, VT. Control of airborne contamination in dairy processing plants. N. Zeal. Journal of Dairy
Science Technology, v. 21, p. 89-98, 1986.

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08

1.

Introduo
1.1. Mtodo do swab
1.2. Mtodo da Rinsagem
1.3. Mtodo da Placa de Contato
1.4. Mtodo da Seringa com gar
1.5. Mtodo da Esponja

2.

Resultados de Avaliaes das Condies Microbiolgicas de Equipamentos, Utenslios e Manipuladores


2.1. Em Unidades de Alimentao e Nutrio
2.2. Em uma Indstria Processadora de Carne
2.3. Em uma Indstria de Laticnios: Staphylococcus spp. em Superfcie
de Equipamentos e Manipuladores
2.4. Em Microindstrias de Processamento de Leite

3.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Valria Costa Salustiano
Roberta Torres Careli
Kelly Cristina Silva Brabes
Cludia Lcia de Oliveira Pinto

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1. Introduo
A implementao dos Procedimentos Operacionais (POP) deve ser avaliada
periodicamente, de forma a garantir uma produo segura de alimentos. Para isso,
preciso adotar medidas corretivas, em casos de desvios desses procedimentos,
evitando colocar em risco a sade dos consumidores, pela veiculao de microrganismos patognicos. imprescindvel, portanto, controlar e monitorar a contaminao, a multiplicao e a sobrevivncia microbiana nos produtos, superfcies,
equipamentos, utenslios e manipuladores, o que contribuir para a obteno de
alimentos com boa qualidade.
A atuao dos profissionais responsveis pela qualidade nas indstrias deve
ser eminentemente preventiva. Se fundamentado em planos de amostragem bem
definidos, o monitoramento microbiolgico dos ambientes de processamento pode
melhorar sensivelmente a qualidade, fornecendo informaes sobre o nvel e fonte
de contaminao do produto. Os resultados obtidos com esse monitoramento, normalmente, podem ser comparados com as especificaes ou com as recomendaes propostas por rgos oficiais ou por entidades cientficas conceituadas, como
a American Public Health Association (APHA), a Organizao Mundial de Sade
(OMS) e a Organizao Panamericana de Sade (OPAS). Dependendo dos resultados, mantm-se as tcnicas de higienizao adotadas ou so tomadas medidas
corretivas.
Quando determinado procedimento de higienizao, durante o processamento
de alimentos, no eficiente ou falho, o primeiro indcio do problema pode ser

334

o aumento nos nmeros de contaminantes microbianos, reforando ainda mais a


importncia da implantao de um programa de monitoramento. Por isso, a escolha
de um mtodo adequado deve estar de acordo com a situao especfica, considerando-se o tipo de alimento processado.
Os principais fatores que influenciam a escolha do mtodo para a avaliao
de superfcies na indstria so o tipo de microrganismo contaminante, em virtude
das condies de sobrevivncia e sua concentrao esperada; da geometria e as
condies das superfcies, envolvendo a presena de ranhuras e de resduos de
detergentes, de sanitizantes e de alimentos.
No h uma metodologia universal para se realizar uma avaliao microbiolgica na indstria. Entretanto, pela combinao de metodologias, possvel verificar as
condies higinicas durante o processamento dos alimentos. Como qualquer anlise,
o sucesso e a eficincia do mtodo dependem do conhecimento prvio sobre distribuio e adeso bacteriana, sobrevivncia e recuperao de microrganismos sob injrias.
A limpeza e sanitizao dos equipamentos so etapas fundamentais no controle
sanitrio em indstrias de alimentos, muitas vezes negligenciadas ou efetuadas em

materiais que facilitem a limpeza. necessrio tambm identificar o tipo de resduo


a ser removido, como protenas, carboidratos, lipdios e minerais. Outro fator de
destacada importncia conhecer a qualidade da gua a ser utilizada e selecionar
agentes de limpeza e empregar adequadamente as concentraes, o tempo, a temperatura e a presso, de forma a obter uma limpeza e desinfeco corretas.
A capacidade de determinar o grau de contaminao bacteriana em superfcies
de contato com alimentos, usando-se um procedimento acurado, de fcil manuseio,
de fundamental importncia para a indstria de alimentos. Dentre as metodologias usuais para a enumerao de microrganismos, esto os testes de rinsagem, do
Swab e das placas de contato, sendo os dois ltimos mais comumente escolhidos
para o controle das condies higinico-sanitrias na indstria de alimentos.

1.1. Mtodo do Swab


O mtodo do Swab, desenvolvido em 1917 por Manheimer e Ybanez, o mais
antigo e utilizado para avaliar as condies microbiolgicas ambientais. considerado como classe A pela APHA, ou seja, uma metodologia-padro para a remoo
de microrganismos de superfcies.
Essa tcnica consiste em friccionar um Swab esterilizado e umedecido em so-

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

condies inadequadas. Programas de higiene envolvem o uso de equipamentos e

luo diluente apropriada, na superfcie a ser avaliada, com o uso de um molde


esterilizado que delimita a rea amostrada, por exemplo 100 cm2. Aplica-se o Swab
com presso constante, em movimentos giratrios, numa inclinao aproximada
de 30, descrevendo movimentos da esquerda para a direita inicialmente e, depois,
da direita para esquerda (Figura 1). A parte manuseada da haste do Swab deve ser

335

quebrada na borda interna do frasco que contm a soluo da diluio, antes de


se mergulhar o material amostrado com os microrganismos aderidos. O diluente
ento examinado por plaqueamento de alquotas em meio de cultura apropriado, e
o resultado dado por UFC. cm-2 de superfcie.
Os Swabs podem ser usados em superfcies irregulares e curvas, devendo
ter cerca de 12 cm de comprimento de haste, com a parte absorvente (algodo)
com aproximadamente 2 cm de comprimento e 0,5 cm de dimetro. A facilidade de
remoo da microbiota da superfcie depende da rugosidade e natureza desta e do
tipo de microrganismo presente.
Os Swabs com alginato de clcio tm a vantagem de liberar os microrganismos para o diluente pela dissoluo do alginato, e, embora o alginato e componentes dissolvidos no meio de diluio possam inibir o crescimento microbiano, esses
Swabs tm boa performance. Nos Swabs de algodo, os microrganismos podem

cap.08

ficar aderidos s fibras e subestimar as contagens.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


336

Figura 1 - Metodologia do Swab para coleta em superfcies de processamento de alimentos.

Em situaes em que se deseja verificar a eficincia de procedimentos de higienizao e sanitizao, agentes neutralizantes especficos devem ser adicionados
ao diluente. Para sanitizantes que atuam por oxidao, como cloro, iodo e cido
peractico, recomenda-se como neutralizante uma soluo de tiossulfato de sdio a
0,25 %. Para outros sanitizantes como amnia quaternria e clorhexidina, sugere-se
soluo de lecitina ou tween 80 % a 2 %. Alm disso, recomenda-se o uso do que se

tipo de resduo de sanitizante.


Mesmo com limitaes, o Swab um mtodo rpido, simples e barato de
verificao das condies higinicas ambientais.

1.2. Mtodo da Rinsagem


O mtodo da rinsagem consiste em remover os microrganismos das superfcies, usando-se a tcnica da lavagem superficial, com certo volume de diluente.
Posteriormente, determina-se a populao bacteriana da soluo de rinsagem, pelo
plaqueamento de uma alquota ou por tcnicas de filtrao (EVANCHO et al., 2001).
Para a anlise de tanques de leite, volumes de 20 mL de soluo de rinsagem
devem ser usados para aqueles de capacidade de at 1000 L, enquanto para tanques
maiores devem ser utilizados de 50 a 100 mL de diluente.

1.3. Mtodo da Placa de Contato


As placas de contato para a anlise microbiolgica so indicadas em superfcies planas, pressionando-se contra elas o meio de cultura slido. Para a remoo
dos microrganismos, um contato de cinco segundos sob presso do meio com a

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

denomina neutralizante universal, cuja composio capaz de neutralizar qualquer

superfcie a ser avaliada o suficiente para uma boa remoo das clulas. Aps a
incubao das placas, as unidades formadoras de colnias so contadas, a fim de se
avaliarem as condies microbiolgicas da superfcie amostrada.
Em 1964, Hallee Hartnett desenvolveram as placas de contato Replicate Orga-

337

nism Direct Agar (RODAC). As disponveis comercialmente so preenchidas com


uma camada de 15,5 a 16,5 mL de meio de cultura, que ultrapassa a borda da placa
de Petri, permitindo o contato facilitado do meio de cultura com a superfcie analisada. Essas placas fornecem boa avaliao das condies higinicas da superfcie
e so muito utilizadas, em razo da facilidade e convenincia, sendo o mtodo de
escolha para superfcies midas, firmes e no porosas e, por isso, ineficazes para
superfcies muito contaminadas, exceto quando este problema minimizado pelo
uso de meios seletivos de anlise.
De acordo com estudos, o mtodo RODAC remove somente cerca de 0,1% da
microbiota da superfcie, o que sugere que 10 UFC. cm-2 detectado refere-se a uma
contaminao real de aproximadamente 104 UFC. cm-2.
Quando superfcies de ao inoxidvel foram contaminadas por esporos
de Bacillus subtilis, removeram-se 41 % dos esporos pelas placas RODAC e
47% pelo mtodo de Swab. Em outro estudo, Swabs apresentaram melhor

cap.08

desempenho em relao s placas RODAC, quando a contaminao era supe-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

rior ou igual a 100 UFC/21-25 cm; porm, em contagens menores, as placas


de contato mostraram melhores resultados.
Para superfcies curvas ou com ranhuras, as placas Petrifilm, comercializadas pela empresa 3M, podem ser utilizadas para a avaliao por contato direto.
Essas placas contm uma camada de meio de cultura na forma de gel, em um
filme flexvel, com um indicador, para facilitar a enumerao das colnias. Aps
a hidratao assptica do gel com 1 mL de soluo de diluio esterilizada, a placa
pode ser ento pressionada contra a superfcie a ser avaliada, sendo posteriormente
incubada de forma usual. Uma vantagem dessa tcnica que o gel pode ser moldado, comprimindo-o contra a superfcie curva.
O uso de neutralizantes no meio de cultura utilizado nas placas de contato tambm necessrio quando a eficincia de processos de higienizao e sanitizao
est sendo avaliada.

1.4. Mtodo da Seringa com gar


Neste mtodo, o meio de cultura apropriado aos microrganismos sob avaliao adicionado a uma seringa ou a um tubo de plstico, onde o meio solidifica-se.
Aps o contato do meio com a superfcie, corta-se, com uma esptula esterilizada,
uma fatia de aproximadamente 1 cm de espessura desse meio, que coletado numa
placa de Petri para a incubao adequada. As vantagens e desvantagens desse mtodo so semelhantes s mencionadas com relao s placas RODAC. Normalmente,
devem-se amostrar no mnimo cinco impresses, ou seja, coletam-se cinco fatias.

338

O resultado expresso em UFC. cm-2, sendo a rea de cada fatia determinada pela
equao: A=3,1416xr2, em que A=rea de contato do meio com a superfcie e r =
raio da fatia do meio de cultura, em cm.

1.5. Mtodo da Esponja


Este mtodo consiste em usar esponjas de poliuretano, esterilizadas, de dimenses aproximadas de 13 x 7 x 4 cm, para remoo dos microrganismos. Estes
so coletados com o auxlio de uma bolsa esterilizada de plstico, de 30x40 cm,
aproximadamente, a qual, no ato da coleta, ser utilizada como luva, pois a superfcie externa da bolsa entrar em contato com a pele da pessoa que realizar
a tarefa. Vestido com a luva, tira-se uma esponja que ser friccionada de forma
adequada na superfcie que se deseja avaliar. s vezes, necessrio umedecer a
esponja com gua peptonada esterilizada, principalmente quando a superfcie estiver muito seca. Aps a coleta, retira-se a luva, retornando-a posio original,
com a face esterilizada para dentro e contendo a esponja com os microrganismos
removidos da superfcie. A partir da, usa-se o procedimento convencional para as

solues diluentes, e plaqueados em meios de cultura, sendo as placas incubadas


em condies apropriadas. O resultado expresso em UFC. cm-2.

2. Resultados de Avaliaes das Condies Microbiolgicas de


Equipamentos, Utenslios e Manipuladores
Na seqncia, so apresentados resultados de avaliaes de manipuladores e
equipamentos em empresas produtoras de alimentos, com diferentes nveis tecnolgicos, usando-se a tcnica do Swab. Foram avaliadas: i) uma rede de unidades de
alimentao e nutrio, com nvel tecnolgico razovel; ii) uma empresa produtora
de derivados de carne, com bom nvel tecnolgico, e que inclusive exporta para
alguns pases; iii) uma indstria de laticnios de tamanho mdio, com bom nvel
tecnolgico; e iv) microindstrias para processamento de leite e derivados, as quais
necessitavam de informaes bsicas para estabelecer boas prticas de fabricao.

2.1. Em Unidades de Alimentao e Nutrio


Para avaliao das condies microbiolgicas de equipamentos e utenslios,
foram realizadas 17 visitas a 12 unidades de alimentao e nutrio, localizada nas

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

contagens microbianas: os microrganismos so retirados da esponja, usando-se

regies da Zona da Mata e Metalrgica de Minas Gerais, com capacidade para produo de 1.000 a 4.000 refeies/dia. Trinta e seis equipamentos e utenslios foram
avaliados nos diversos restaurantes, incluindo cortadores de frios, cortadores de
legumes, mquina de moer carne, placa de altileno, bandejas de refeio, talheres,

339

pratos de loua e liquidificadores.


Os microrganismos foram removidos das superfcies consideradas higienizadas
pela tcnica do Swab, conforme recomendao da APHA (EVANCHO et al., 2001),
utilizando-se Swab de algodo no-absorvente, de 0,5 cm de dimetro/2 cm de comprimento, em uma haste de 12 cm de comprimento, que foram esterilizados por
autoclavagem a 121 C, por 15 min. Aps ser umedecido, o Swab foi friccionado, por
trs vezes, formando um ngulo de 30 com a superfcie, no sentido vaivem, numa
rea de 2 x 25 cm. Em seguida, os microrganismos coletados foram transferidos para
tubos de ensaio, de 20 x 250 mm, contendo 10 mL de soluo neutralizante de tiossulfato de sdio 0,25 % em soluo Ringer 1:4, pH 7,0, esterilizada por autoclavagem
a 121 C por 15 min. Aps a imerso, o excesso de soluo do Swab foi retirado,
pressionando-o na superfcie do tubo. Esse mesmo Swab foi utilizado para coletar
microrganismos em outra rea de 2 x 25 cm da mesma superfcie e transferidos
para o mesmo tubo de ensaio. Esse procedimento foi repetido por mais trs vezes,

cap.08

totalizando uma rea de 250 cm2. Quando havia dificuldades para se determinar essa

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

rea nos equipamentos, foram feitas estimativas, sendo as coletas efetuadas sempre
da mesma forma. Depois da remoo dos microrganismos das superfcies, realizaram-se diluies adequadas, seguidas de plaqueamento e incubao em condies
apropriadas aos microrganismos sob avaliao.
Verificou-se, em relao aos mesfilos aerbios, que apenas 18,5 % dos
equipamentos e utenslios avaliados encontravam-se corretamente higienizados,
segundo a recomendao da APHA, que de 2 UFC. cm-2. Usando essa mesma
recomendao para fungos e leveduras, constatou-se que 32,28 % dos ambientes
apresentavam condies satisfatrias de higiene.
Muitas vezes, essa recomendao americana considerada rgida para os restaurantes brasileiros. As recomendaes da APHA ou da OMS devem ser utilizadas
apenas como referncia, pois de se esperar que, dentre os restaurantes nacionais,
encontram-se aqueles que trabalham dentro de condies preconizadas pela APHA
e, tambm, muitos outros, provavelmente a maioria, que no atendem s recomendaes adotadas nos EUA.
Alguns pesquisadores e algumas instituies como a OPAS e a OMS admitem
contagens de at 50 UFC.cm- de superfcie, e, nesse caso, os porcentuais de 52,9
para microrganismos mesfilos aerbios, 76,7 para coliformes totais e 77,1 para
fungos e leveduras encontram-se dentro dessa recomendao.

2.2. Em uma Indstria Processadora de Carne


340

2.2.1. Superfcies
Superfcies do misturador, do picador de toucinho, da embaladora de lingia,
da embaladora de salsicho, da embutideira de lingia e da mesa da linha de processamento de lingia foram avaliadas quanto contaminao microbiana, cujos
resultados so apresentados na Tabela 1.
Tabela 1 - Mesfilos aerbios (UFC. cm-2) em superfcies de processamento de uma indstria
de produtos crneos

de microrganismos mesfilos aerbios, coliformes totais e Staphylococcus spp.


abaixo do valor recomendado pela APHA (2 UFC. cm-2). Com relao a fungos filamentosos e leveduras, 77,7 % dos equipamentos mostraram contagens abaixo
dessa recomendao e apenas 23,3 % no se enquadraram.

2.2.2. Manipuladores
Ao realizar a coleta de microrganismos nas mos dos manipuladores, usou-se
a seguinte tcnica (Figura 2): um Swab com haste de 12 cm de comprimento e algodo hidrfilo de 2,5 cm de comprimento e 1,5 cm de dimetro, utilizando o Swab
esterilizado e iniciando a coleta com Swab umedecido em soluo-tampo-fosfato,
friccionando o algodo trs vezes em direo a cada um dos dedos a partir do punho. Em seguida, a comear do punho, friccionou-se o algodo do mesmo Swab entre os dedos, retornando novamente ao punho. Os microrganismos coletados foram
transferidos para o tubo contendo 10 mL de tampo-fosfato, acrescentando-se agentes
neutralizantes para inativar possveis quantidades residuais de agentes sanitizantes. Por
exemplo, para cloro, iodo, cido peractico usou-se como agente neutralizante soluo com 0,25 % de tiossulfato de sdio e para amnia quaternria, soluo de
lecitina 2 %. Em seguida, plaquearam-se diluies adequadas para meios de cultura
e incubaram-se as placas nas condies apropriadas a cada microrganismo: gar
para contagem total e 32 C por 48 h para mesfilos aerbios; gar Violet Red Bile

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

As superfcies de todos os equipamentos analisados apresentaram contagens

Agar (VRB) e 37 C por 24 h, para coliformes totais e gar Baird Parker e 30 C por
24 h, para Staphylococcus spp. As placas foram incubadas nas condies de crescimento de cada grupo ou espcie microbiana. Os resultados foram expressos em
UFC/mo.

341

No h padres ou especificaes para contagens microbianas em mos de


manipuladores de alimentos, por isso procurou-se determinar faixas de contagens
que pudessem servir de orientao para definir as condies higinico-sanitrias de
manipuladores. Foram consideradas as seguintes faixas, expressas em UFC/mo:
para mesfilos aerbios, fungos filamentosos e leveduras e coliformes totais:
Faixa I - at 103 UFC/mo e II - entre 103 e 104 UFC/mo; e para Staphylococcus
spp: Faixa I - at 102 UFC/mo e Faixa II - entre 102 e 103 UFC/mo, conseguindo-se
os seguintes resultados: i) 44,4 %, 5,5 % e 5,5 % das mos dos manipuladores apresentavam contagens de mesfilos aerbios e fungos filamentosos e coliformes
totais entre 103 e 104 UFC/mo, respectivamente; e ii) 55,6 %, 94,4 %, 94,4 %,
das mos dos manipuladores apresentavam contagens desses microrganismos
de at 103 UFC/mo. Para Staphylococcus spp, a distribuio da contagem nas
mos foi de 5,6 % entre 10 2 e 10 3 UFC/mo e o restante, at 102 UFC/mo. Na
Figura 3 mostrada a porcentagem dos diferentes microrganismos presentes

cap.08

nas mos de manipuladores.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


342

Figura 2 - Metodologia do Swab para coleta em superfcies de mos.

cap.08

343

Figura 3 - Avaliao microbiolgica de manipuladores de alimentos.


Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,
Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.3. Em Indstria de Laticnios: Staphylococcus spp em Superfcies de


Equipamentos e Manipuladores
2.3.1. Enumerao
As amostras para avaliao da qualidade microbiolgica foram coletadas nas
mos de manipuladores, nas superfcies do tanque de leite da plataforma de recepo, do tanque de pasteurizao de leite, da embaladora de leite pasteurizado, dos
tachos de processamento de manteiga e doce de leite, do tanque de processamento
de queijos e de produo de iogurte, totalizando sete superfcies. Os microrganismos foram removidos das superfcies de equipamentos e das mos consideradas
higienizadas, j mencionado no item 2.2. Aps a coleta, a partir dos tubos contendo
os microrganismo prepararam-se as diluies apropriadas, que, em seguida, foram
plaqueadas, usando-se gar Baird-Parker, e incubadas a 35 C, por 24 h (EVANCHO,
2001). Os resultados obtidos em UFC. cm-2 de superfcie ou UFC/mo foram convertidos em log10, avaliados descritivamente e comparados com as especificaes ou
recomendaes da APHA e de alguns pesquisadores e instituies.

2.3.2. Identificao
Para a purificao dos isolados, foi utilizado o meio de cultivo gar Baird-Parker,
onde foram selecionadas cepas caractersticas e no-caractersticas: i) colnias negras e lustrosas, devido precipitao de telurito de potssio; e ii) com e sem halo
transparente ao redor das colnias.

344

As colnias caractersticas foram repicadas em gar para contagem total (Plate


Count Agar) a 37 C, por 24 h. Estas cepas foram testadas bioquimicamente: i) produo de coagulase livre; ii) catalase, utilizando-se H2O2 a 30 %; iii) oxidase; e iv)
hemlise, em meio slido adicionado de sangue de carneiro.
Os isolados de Staphylococcus, quanto s espcies, foram identificadas pelo
sistema de identificao de estafilococos e micrococos API Staph da Biolab-Merieux,
que composto por testes bioqumicos padronizados e miniaturizados.
Aps a identificao pelo sistema API/Staph (Biomerieux), as cepas foram submetidas produo de enterotoxinas. Para a identificao das enterotoxinas, as cepas
foram agrupadas em pools contendo em mdia trs amostras, utilizando-se para isso
as mesmas espcies e com caractersticas bioqumicas semelhantes. Para esse teste,
utilizaram-se cinco repeties, para a confirmao de positividade no caso da presena de algum tipo de enterotoxina com o desmembramento dos pools.
Constata-se, pelos resultados apresentados nas Tabelas 2 e 3, que houve o
isolamento de 91 cepas, sendo 51 delas provenientes de manipuladores e 40 de
superfcies que entravam em contato com alimentos.

res avaliados, ocorreu a prevalncia do S. aureus, com um porcentual de cerca de 22 %,


portanto, acima daquele encontrado nos ambientes de processamento.
Tabela 2 - Especies de Staphylococcus isoladas de mos de manipuladores de um laticnio

Como ocorre normalmente em qualquer programa de segurana alimentar nas


indstrias, os manipuladores representam uma das principais fontes de contaminao
e, embora no existam padres na legislao brasileira, a presena de estafilococos
pode indicar condies higinico-sanitrias insatisfatrias. Tal fato evidencia a necessidade real de treinamento dos funcionrios que trabalham diretamente com a linha

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

Observa-se na Tabela 2, que entre as espcies isoladas das mos de manipulado-

de produo dos alimentos, independentemente dos tipos de estabelecimentos.


Observa-se, pela Tabela 3, que em superfcies para processamento de produtos
lcteos foram encontrados 27,5 % de S. aureus, seguidos de 25 % identificados por S.
xylosus. Das 91 cepas isoladas e submetidas identificao, 65,7 % foram caracteriza-

345

das como coagulase negativa e 34,3 %, como coagulase positiva. Dos isolados coagulase negativa, 5,5 % foram identificados como S. aureus; dos isolados coagulase positiva, 84,6 %. Esses resultados demonstram que a prova de coagulase varivel, no
podendo ser relacionada patogenicidade das espcies de estafilococos. A coagulase
livre uma enzima produzida por algumas espcies de estafilococos, principalmente
S. aureus, que reage com plasma de coelho formando cogulos. Esse teste tem sido
largamente utilizado para identificao de S. aureus patognicos.

cap.08

Tabela 3 - Espcies de Staphylococcus isoladas da superfcies de equipamentos de laticnios

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

As pesquisas tm sugerido um teste adicional que identifique a produo


ou no de enterotoxina por testes imunolgicos, devido ao fato de cepas com
caractersticas de no produo de coagulase terem sido incriminadas em razo
de surtos de intoxicao alimentar. Um surto causado por espcies no produtoras
de coagulase envolveu 40 estudantes, na cidade de Osaka, Japo. Outro surto
relatado por Breckinridge e Bergdoll (1971), envolvendo 264 pessoas, foi causado
por alimentos contaminados com S. epidermidis, uma espcie no produtora de
coagulase, porm de SEA.
Em face desses resultados, observa-se que necessrio o uso de programas
de higienizao para melhor avaliar e controlar o ar do ambiente, das superfcies
que entram em contato com os alimentos e dos manipuladores que trabalham diretamente na linha de produo com contato direto com os alimentos. Diferentes
espcies de estafilococos foram identificadas nessas trs situaes, destacando-se
que esses microrganismos podem representar uma fonte de recontaminao dos
alimentos. Os tipos de enterotoxinas, para cada fonte de origem, esto apresentados na Tabela 4.
Tabela 4 - Tipos de enterotoxinas produzidas por espcies de Staphylococcus isoladas de
superfcies, manipuladores e ar de ambientes de processamento de um laticnio

346

Observa-se, pelos resultados, que todas as cepas produtoras de enterotoxinas so de espcies coagulase negativa, contrariando aspectos conhecidos de
patogenicidade e de legislao. Observa-se tambm que, na maioria dos casos,
uma nica cepa foi capaz de produzir mais de um tipo de enterotoxina, de acordo
com a interpretao do kit SET-RPLA. necessrio salientar ainda a necessidade

risco para a sade pblica.

2.4. Em Microindstrias de Processamento de Leite


Em 2003, avaliaram-se as condies higinicas no processamento de leite de
microindstrias na regio da Zona da Mata de Minas Gerais, assistidas pelo Servio
de Inspeo Municipal (SIM). Foram aplicados questionrios de avaliao com 32
itens, envolvendo a obteno do leite, a estrutura fsica, as condies de processamento e a manipulao. Propuseram-se tambm os fundamentos para implantao
de sistema de higienizao para esses estabelecimentos. Na Tabela 5 foram mostradas algumas informaes acerca de caractersticas de obteno da matria-prima
utilizada nas microindstrias avaliadas.
Tabela 5 - Avaliao do leite processado em algumas microindstrias de laticnios

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Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

de no se exclurem os microrganismos com essas caractersticas bioqumicas do

O leite utilizado nas microindstrias era caracterizado por algum tipo de controle de qualidade, por exemplo a realizao do teste do alizarol. Os responsveis
pela produo, na sua maioria, no eram treinados em processamento de produtos

347

lcteos. O leite normalmente no era estocado de forma adequada, embora em alguns casos fosse processado logo aps a ordenha.
As microindstrias, em sua maioria, eram construdas em reas inadequadas
quanto s condies gerais de higiene, como a proximidade de granja, curral, galinheiro, brejo e fbrica de suco, o que contribua para o mau cheiro e atrao de
moscas. Em todas as microindstrias era utilizada a pasteurizao lenta (65 C/30
min) da matria-prima. Porm, em algumas delas, esse processo era realizado de
maneira inadequada, devido s falhas no controle do binmio tempo-temperatura.
Em virtude do pequeno porte das empresas, era invivel a existncia de um laboratrio de anlise, e por causa dessa limitao esse servio era terceirizado, sendo as
anlises realizadas esporadicamente.
Em relao aos equipamentos e utenslios, foram avaliadas as condies de
conservao e funcionamento, como: presena de solda, ranhuras, ferrugem, equicap.08

pamentos velhos e desgastados e funcionamento adequado dos equipamentos.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

As microindstrias eram vistoriadas periodicamente pela Empresa de Assistncia Tcnica e Extenso Rural (EMATER) e por veterinrios que controlavam a
sanidade do rebanho. As microindstrias, em sua maioria, no costumavam ter
produtos de retorno, devido pequena produo e ao consumo praticamente
imediato do produto. Quando ocorria algum retorno, o produto era consumido
pela famlia e empregados.
Na Tabela 6 so mostradas algumas informaes acerca de caractersticas
de consies de processamento nas microindstrias selecionadas.
Tabela 6 - Condies de processamento de uma microindstria de laticnios

Os resduos no eram tratados pelas microindstrias, por exemplo o soro


era destinado produo de ricota, bebida lctea (para o consumo da famlia)
e alimentao do rebanho, contribuindo, dessa maneira, para a preservao do
348

meio ambiente.
Na Tabela 7 so mostradas algumas informaes acerca de caractersticas da
estrutura fsica das microindstrias de laticnios.
Tabela 7 - Estrutura fsica de uma microindstria de laticnios

Em geral, as microindstrias no foram projetadas para a fabricao de produtos lcteos, mas, medida que a fiscalizao e tambm a assistncia tcnica se
intensificavam, essas empresas estavam se adequando s especificaes vigentes.
Por exemplo, preocupavam-se em melhorar o sistema de ventilao, as instalaes

a gerao de vapor, pois as microindstrias no possuam estrutura adequada para


isso, utilizando em sua maioria aquecimento a gs. Alm disso, muitas delas no
tinham espao fsico adequado. Em geral, os sanitrios localizavam-se ao lado da
microindstria, na residncia do proprietrio, por ser produo familiar.
Na Tabela 8 so apresentadas algumas informaes acerca de caractersticas
de pessoal nas microindstrias selecionadas.
Tabela 8 - Condies higinicas de manipuladores de uma microindstria de laticnios

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Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

hidrulicas e eltricas e a implantao de portas teladas. Um fator preocupante era

Em relao aos manipuladores, constatou-se que as microindstrias apresentavam condies bastante variadas. Em uma delas, manipuladores trabalhavam com

349

uniforme completo, incluindo botas, gorro, cala e camisas brancas, avental, mscara, e mantinham cabelos aparados e totalmente cobertos pelo gorro. Em outras,
manipuladores trabalhavam com uniforme incompleto, mas mantinham cabelos
aparados e cobertos pelo gorro. E ainda, em outras, os manipuladores trabalhavam
totalmente desuniformizados e sem gorro, touca, rede ou similares.
As empresas, em sua maioria, apresentavam manipuladores com unhas em
bom estado, mantidas curtas, limpas e sem esmalte. Com relao ao estado de sade dos manipuladores, havia situaes diversas nas microindstrias, mas poucas
delas providenciavam o afastamento de pessoas do trabalho de manipulao do
alimento quando se encontravam afetadas por enfermidades infectocontagiosas ou
quando apresentavam inflamaes, infeces ou afeces na pele ou outras anormalidades. Boa parte das microindstrias submetia os manipuladores a exame mdico pelo menos uma vez por ano. Mais da metade dos manipuladores higienizava
as mos adequadamente e no utilizava acessrios como brincos, anis, colares,

cap.08

pulseiras, relgios e outros.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

2.4.1. Qualidade Microbiolgica das reas de Processamento, Equipamentos e Utenslios e


Manipuladores
Para a obteno de alimentos com boa qualidade, necessrio que equipamentos, utenslios e manipuladores estejam dentro de determinadas recomendaes microbiolgicas. Na Tabela 9, constatou-se que em todas as microindstrias analisadas
foram encontradas contagens microbianas acima das recomendadas para a superfcie. As anlises de mesfilos aerbios indicaram valores entre 14 % e 80 % acima
das recomendaes e as de coliformes totais valores, de 10 % e 83 %. Observa-se,
portanto, a necessidade de melhoria das condies higinicas dos equipamentos e
utenslios em todas as microindstrias.
Tabela 9 - Avaliao microbiolgica de superfcies de equipamentos em uma microindstria de
laticnios

Verifica-se, pela Tabela 10, que os manipuladores das microindstrias, em sua


maioria, se encontravam com mesfilos aerbios acima das recomendaes, va350

riando de 33 % a 100 %, exceo dos manipuladores da microindstria B, que


apresentaram contagens abaixo de 1,0 x 104 UFC/mo. Para coliformes totais, nenhuma anlise mostrou contagens acima de 1,0 x 103 UFC/mo. necessrio que
as microindstrias tenham maiores cuidados em relao ao controle da microbiota
presente nas mos dos manipuladores durante o processamento dos alimentos.
Tabela 10 - Avaliao microbiolgica de mos de manipuladores de uma microindstria de
laticnios

De acordo com os resultados dos itens anteriores, selecionou-se uma microindstria para proposio e implantao de um Programa de Boas Prticas de Fabricao que, posteriormente, foi avaliado. O critrio de seleo baseou-se em interesse,
permisso e disposio do proprietrio em implantar o sistema de higienizao, o
qual foi constitudo de vrias etapas, descritas subseqentemente.

2.4.2.1. Proposio e Implantao


A. Clorao da gua
Para a clorao da gua, utilizou-se um clorador por difuso, cuja operao
consistiu nos seguintes passos: i) misturar 340 g de hipoclorito de clcio com 850
g de areia lavada; ii) colocar essa mistura em embalagem plstica, de aproximadamente, 1 L; iii) fazer duas perfuraes de 0,6 cm de dimetro, a 10 cm abaixo do
gargalo, para que o cloro pudesse ser liberado; e iv) amarrar o clorador ao fio ou fita
de nilon e coloc-lo na gua a poucos centmetros abaixo do nvel. Essa mistura
suficiente para tratar 2.000 L de gua, por cerca de 30 dias. Quando a quantidade de
gua for superior a 2.000 L ou quando h retirada diria muito grande de gua, recomenda-se colocar mais de um clorador. Para verificar o nvel de cloro residual, adi-

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

2.4.2. Avaliao dos Procedimentos de Higienizao Implantados na Microindstria


Selecionada

ciona-se trs gotas de soluo de N,N-dietil-p-phenylenediamine (DPD) a 0,1 %, em


cerca de 10 mL de gua. A presena de cloro confirmada pela colorao rsea.

B. Higienizao do Reservatrio de gua

351

O reservatrio de gua foi higienizado, seguindo-se estes passos: a) esvaziar a


caixa de gua; b) escovar toda a superfcie interna; c) enxaguar abundantemente; d)
sanitizar, adicionando 2 L de hipoclorito de sdio (gua sanitria com 2 % de CRT)
para cada 1.000 L de gua; e) deixar o cloro em contato por 1 a 2 h, f) escoar toda
a gua clorada; e g) encher o reservatrio para posterior clorao, utilizando-se o
clorador por difuso.

C. Higienizao do Ar dos Ambientes de Processamento


Pulverizar, com uma soluo clorada a 100 mg. L-1 de cloro residual total (CRT),
toda a rea de processamento. Recomendou-se que tal procedimento fosse efetuado duas vezes por semana.

D. Higienizao de Equipamentos e Utenslios


Higienizar equipamentos e utenslios, seguindo-se a rotina de higienizao

cap.08

listada a seguir:

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

1. Limpeza alcalina, realizada diria e imediatamente aps o processamento:


a) pr-lavagem com gua temperatura ambiente; b) limpeza com detergente de baixa
alcalinidade, base de tensoativos, com o auxlio de uma esponja apropriada, utilizando-se
gua morna, se possvel; c) enxge com gua temperatura ambiente; e d) sanitizao,
com gua clorada a 100 mg. L-1 CRT.

2. Limpeza alcalina/cida: realizada uma vez por semana e imediatamente aps o


processamento. Esta limpeza foi proposta para o tanque de fabricao, empacotadeira
e envasadora de iogurte:
a) pr-lavagem com gua temperatura ambiente; b) limpeza com detergente de baixa
alcalinidade, base de tensoativos, com o auxlio de uma esponja apropriada, utilizando-se
gua morna, se possvel; c) enxge com gua temperatura ambiente; d) limpeza cida
com cido ntrico 0,5%, com o auxlio de uma escova apropriada, utilizando-se gua
temperatura ambiente; e) sanitizao com gua clorada a 100 mg. L-1 de CRT.

D.1. Observaes Sobre a Higienizao de Utenslios


Frmas para fabricao de queijos: depois de higienizadas, foram imersas em
gua clorada (100 mg. L-1 de CRT) por cerca de 30 min, colocadas para escorrer e,
antes de serem novamente utilizadas, foram rapidamente imersas em gua clorada.
Coadores e dessoradores: depois de higienizados, foram imersos em gua

352

clorada (100 mg. L-1 de CRT) por cerca de 10 min, colocados para escorrer e, antes
de serem novamente utilizados, foram rapidamente imersos em gua clorada.
No caso de utenslios de ao inoxidvel, como mesa, agitador, lira e tanque
de fabricao, seguiu-se o processo de limpeza alcalina, sendo o tanque submetido a uma limpeza cida uma vez por semana, para evitar problemas de formao
de pedra de leite.
Mesa de granito: seguiu-se o processo de limpeza alcalina e, logo aps essa
higienizao, foi sanitizada com gua clorada contendo 100 mg.L-1 de CRT, por
aproximadamente 10 min.

D.2. Observaes sobre a higienizao de pisos e paredes azulejadas


Os pisos e as paredes azulejadas foram higienizados diariamente, ao final
das atividades, utilizando-se detergente alcalino, com o auxlio de uma esponja
apropriada, enxaguados com gua em abundncia e sanitizados com gua clorada a 100 mg. L-1 de CRT.

Os manipuladores seguiram este procedimento de higienizao: a) pr-lavagem das mos com gua at aproximadamente os cotovelos; b) lavagem com detergente neutro; c) enxge com gua em abundncia; d) sanitizao com gua
clorada a 50 mg. L-1 de CRT ou utilizando lcool 70 GL; e) imerso em gua clorada
das mos, braos e cotovelos periodicamente durante o processo de produo e,
nos casos de interrupo desse processo, os manipuladores repetiram o procedimento de higienizao.
Depois de implantado o sistema de higienizao, foram realizadas anlises
fsico-qumicas e microbiolgicas da gua, ambiente, superfcie de equipamentos
e utenslios e manipuladores.
Constata-se, pela Tabela 11, que as caractersticas fsico-qumicas da gua variaram dentro do esperado aps a realizao do procedimento de higienizao do
reservatrio de gua e a instalao do clorador por difuso. A dureza permaneceu
praticamente inalterada; ocorreu aumento do pH e alcalinidade total; houve aumento
considervel no teor de cloretos e, pela primeira vez, foi detectada a presena de cloro
residual livre na gua de uso industrial. Todas as anlises encontravam-se de acordo
com a legislao vigente (Portaria n 518/MS, de 25 de maro de 2004).

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

D.3. Observaes sobre a Higienizao de Manipuladores

Tabela 11 - Anlise de gua de uma microindstria de laticnios antes e depois higienizao do


reservatrio

353

As anlises microbiolgicas revelaram a boa qualidade da gua aps a clorao, reafirmando a importncia desse procedimento no controle de microrganismos
alteradores e patognicos.
Na rea de processamento da microindstria selecionada, as anlises de mesfilos aerbios, fungos filamentosos e leveduras encontravam-se de acordo com as
especificaes sugeridas aps a pulverizao de 100 mg. L-1 de cloro residual livre,
realizada duas vezes por semana, com valores abaixo de 100 UFC. cm-2. semana-1,
cap.08

coforme Tabela 12.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Tabela 12 - Anlise microbiolgica do ar de ambientes de processamento de uma microindstria


de laticnios

As anlises microbiolgicas de mesfilos aerbios e coliformes totais de equipamentos e utenslios encontravam-se abaixo de 50 UFC. cm-2, de acordo com a Tabela
13. As contagens microbianas nas mos de manipuladores foram em mdia de 5,0x102
UFC/mo de mesfilos aerbios e de <1,0x101 UFC/mo de coliformes totais.
Tabela 13 - Anlise microbiolgica de superfcie de processamento de uma microindstria de
laticnios

De acordo com os valores encontrados, conclui-se que os resultados foram


354

bastante satisfatrios, revelando o sucesso do sistema de higienizao implantado.


As microindstrias tm atingido relevante crescimento nos ltimos anos e, no
Brasil, constituem fonte importante de gerao de empregos. As micro e pequenas
indstrias da rea de alimentos e bebidas, em Minas Gerais, representam 97,1% do
total de indstrias. Esse cenrio revela o interesse socioeconmico de viabilizar e
dar suporte sobrevivncia dessas empresas. Verifica-se que h grande risco da
produo e comercializao de alimento fora das especificaes vigentes pelos rgos competentes, colocando em perigo a sade do consumidor.
Nesse contexto, a difuso de tecnologia gerada nas universidades e nos
rgos de pesquisa de suma importncia para a produo de alimentos com
qualidade. As autoridades competentes tm cumprido seus deveres para com a
sociedade ao estimular e dar suporte ao desenvolvimento de microindstrias de
processamento de alimentos.
Observa-se, pelos resultados das anlises realizadas, a necessidade de melhoria da qualidade nas microindstrias de processamento de leite, uma vez que

dores, havendo, assim, a necessidade de orientao tcnica e de implantao de


sistemas efetivos de higienizao.
Conforme se esperava, em guas utilizadas nas microindstrias provenientes
de poos semi-artesianos no havia a presena de cloro residual livre, o que revelou
uma situao de risco, com a possibilidade de ela veicular diversos microrganismos alteradores de alimentos ou patognicos. Portanto, imprescindvel que a gua
usada na microindstria seja tratada de forma correta, para mant-la dentro dos
padres microbiolgicos adequados.
Constatou-se, aps a implantao do sistema de higienizao, que a microbiota
foi reduzida e que medidas simples e adaptadas s condies reais das microindstrias foram eficientes para solucionar ou amenizar o risco de produo de alimento
que viesse causar problemas de intoxicaes e infeces.

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

lgicas em ambientes de processamento, equipamentos e utenslios e manipula-

355

cap.08

estas se mostravam em situao de risco com as elevadas contagens microbio-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Referncias
AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA. Regulamento tcnico sobre procedimentos
operacionais padronizados aplicados aos estabelecimentos produtores/industrializadores de
alimentos e a lista de verificao das boas prticas de fabricao em estabelecimentos produtores/
industrializadores de alimentos. Resoluo-RDC n. 275. 2002
ANDERSEN, A. A. . New Sampler for the Collection, Sizing, and Enumeration of Viable Airborne
Particles. Journal Bacteriology. , v. 76, p 471-484. , 1958
ANDRADE, N. J. , MACDO, J. A. B. Higienizao na indstria de alimentos. So Paulo: Livraria
Varela, 182 p. , 1996.
ANDRADE, N. J. ; SILVA, R. M. M; BRABES, K. C. S. Avaliao das condies microbiolgicas em
unidades de alimentao e nutrio. Cincia e Agrotecnologia. v. 27, p. 590-596
ANGELOTTI,R. ; WILSON, J. L. ; LITSKY,W. ; WALTER,W. G. Comparative evaluation of the cotton
Swab and RODAC methods for the recovery of Bacillus subtilis spores contamination from stainless
steel surfaces. Hlth. Lab. Sci. 1:289-296, 1964.
APHA. . Standard Methods for the Examination of Dairy Products. 16th ed, ed. G. H. Richardson. Am.
Pub. Health Assoc. Washington, D. C. 1992
BAIRD-PARKER, A. C. An improved diagnostic and seletive medium for isolating coagulase positive
staphylococci. Journal of Applied Bacteriology, Oxford, v. 25, p. 12-19, 1962.
BAYLES, K. W. ; IANDOLO, J. J. Genetic and molecular analyses of the gene encoding staphylococcal
enterotoxin D. Journal of Bacteriology, USA, v. 171, p. 4799-4806, 1989.
BERGDOLL, M. S. ; REISER, R. Aplication of radioimmunoassay for detection staphylococcal enterotoxins in foods. Journal of Food Protection v. 43, p. 68-72, 1980.
BONETTI, F. B. Caracterizao de Staphylococcus aureus enterotoxignicos utilizando as tcnicas
de RAPD e SDS-PAGE. Campinas: UNICAMP. 1996. 79p. (Dissertao - Mestrado em Microbiologia de
Alimentos).
BRECKINRIDGE, J. C. ; BERGDOLL, M. S. Outbreak of food-borne gastroenteritis due to a coagulasenegative enterotoxin producing Staphylococcus. Medical Intelligence, v. 284, p. 542-543, 1971.

356

CARDOSO, R. C. ; CHAVES, J. B. P. ;. ANDRADE, N. J. ; TEIXIERA, M. A. . . Avaliao da eficincia de


agentes sanficantes para mos de manipuladores de alimentos em servios de alimentao. Higiene
Alimentar, v. 10, p. 17-22, 1996
CARMO, L. S. ; BERGDOLL, M. Staphylococcal Food Poisoning in Belo Horizonte (BRAZIL). Revista de
Microbiologia, So Paulo, v. 21, p. 320-323,1990.
CASMAN, E. P. ; BENNETT, R. W. Detection of staphylococcal enterotorotoxin in food. Applied Microbiology, USA, v. 13, p. 181-189, 1965.
COSTA, P. D. Avaliao da tcnica de ATP-bioluminescncia no controle do procedimento de higienizao na indstria de laticnios. 2001. 63f. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viosa, Viosa, MG.
COSTA P. D. ; ANDRADE, N. J. ; SOARES, N. F. BRANDO, S. C. C. ATP-bioluminescence assay as
an alternative for hygiene-monitoring procedures of stainless steel milk contact surfaces. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 37 p345-349, 2006
CRASS, B. A. ; BERGDOLL, M. S. Involvement of coagulase-negative staphylococci in toxic shock
syndrome. Journal of Clinical Microbiology, v. 23, p. 43-45, 1986.
DE OLIVEIRA, T. C. R. M. ; HIROOKA, E. Y. Atualidades sobre a deteco de enterotoxinas estafiloccicas. Boletim SBCTA, So Paulo, v. 30, p. 121-131, 1996
EVANCHO, G. M. ; SVEUM, W. H. ; MOBERG, L. J. ; FRANK, J. F. Microbiological Monitoring of the
Foods Processing Environment. In: DOWNES, F. P. ; ITO, K. ed. Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. 4th. Chapter. 3, p. 25-35, 2001

HAYES, P. R. . Food Microbiology and Hygiene- 2nd ed. London, 515p. 1995.
HEDRICK, T. I; D. R. HELDMAN, Air Quality in Fluid and Manufactured Milk Products Plants. Journal
Milk Food Technol. v. 32, p 265-269. 1969.
HELDMAN, D. R. Significance and Control of Airborne Contamination in Milk and Food Plants. Journal
Milk Food Technol. v. 30, p 13-17. 1967.
HELDMAN, D. R. Factors Influencing Air-Borne Contamination of Foods. A Review. Journal of Food
Science - v. 39, p 962-969. 1974
HYCHECK(R) slides versus Rodac(R) plates compared to the Swab technique for the recovery of
bacteria from hard smooth surfaces. Dairy,-Food-and-Environmental-Sanitation. v. 14, p. 529-531
; 1994;
JAY, J. M. Modern Food Microbiology. Chapman and Hall: 4th ed., Nova York. 701p, 1992.
KANG, Y. J; FRANK, F. J. , Biological Aerosols: A review of airborne Contamination and its Measurement in Dairy Processing Plants. Journal of Food Protection, v. 52, p 512-524. 1980.
KANG, Y. J; FRANK, F. J. , Characteristics of Biological Aerosols in Dairy Processing Plants. Journal of
Dairy Science - v. 73, p 621-626, 1990
KIM, K. Y. ; FRANK, J. F. Effect of grwoth nutrients on attachment of Listeria monocytogenes to stainless steel. Journal of Food Protection, v. 57, p. 720-726, 1994.
LARSON, E. L. et al. Bioluminescence ATP monitoring as a surrogate marker for microbial load on
hands and surfaces in the home. Food Microbiology, v. 20, p. 735-739, 2003
LEGNANI, P. et al. Hygienic control of mass catering establishments, microbiological monitoring of
food and equipment. Food Control. , v. 15, p. 20 -211, 2004

Metodologias Convencionais para Anlises Microbiolgicas de Equipamentos,


Utenslios e Manipuladores na Indstria de Alimentos.

GRIFFITH, C. Improving surface sampling and detection of contamination. In: Lelieveld, H. L. M. Mosterte. A; Holah, J. Handbook of hygiene control in the food industry. Woodhead Publishing, Cambridge, England, Chapter 36. 588-618, 2005

MERCK, 2001 a http://www. merck. com. tw/ Microbial Air Monitoring- MAS 100 Air Sampler-Techinical Information, p. 1-2.
MERCK, 2001b http://www. merck. de/english Air Sampler MAS 100 System, p1-5. Miller,-A-J;
Schultz,-F-J; Oser,-A; Hallman,-J-L; Palumbo,-S-A

357

PARK, C. E. ; WABURTON, D. ; LAFFEY, P. J. A Collaborative Study on the Detection of Staphylococcal


Enterotoxin in Foods with na Enzyme Immunoassay Kit (TECRA). Journal of Food Protection, USA,
v. 59, p. 390-397, 1996.
PEREIRA, M. L. Estafilococos Coagulase Negativos Pauciprodutores de Enterotoxinas Estafiloccias e Relato de um Surto Por Espcie Coagulase Positiva. Campinas: Unicamp, 1996. 143p. (Tese
- Doutorado em Cincia dos Alimentos).
RADMORE, K, W. H HOLZAPFEL, LUCK H. Proposed Guidelines for Maximum Acceptable Airborne
Microorganism Levels in Dairy Processing and Packaging Plants. International Journal of Food Microbiology, v. 6, p 91-95. 1988
REN. T. J. e FRANK,F. J. ,. Samplig of Microbial Aerosols at Various Locations in Fluid Milk and Ice
Cream Plants. Journal of Food Protection. , v. 55, p 279-283, 1992
SCOTT,E.; BLOMFIELD,S. F.; BARLOW,C. G. ,. A comparison of contact plate and calcium alginate
swab techniques of environmental surfaces. Journal. Applied Bacteriology. v. 56, p. 317-320, 1984
SILVA, C. A. S. Avaliao da radiao ultravioleta no controle de microrganismos aderidos em
filmes de polietileno de baixa densidade. Editora UFV, Viosa, 2000. (Dissertao de Mestrado em
Cincia e Tecnologia de Alimentos, UFV)

cap.08

SILVA, R. M. M. Especificaes microbiolgicas para ambientes, manipuladores, equipamentos e


utenslios em restaurantes industriais. 1996. 89f. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia
de Alimentos) - Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viosa, Viosa,
1996.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


358

SIMM, E. M. Interferncia de substncias orgnicas e microrganismos na tcnica de ATP-Bioluminescncia. 2004. 64f. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) - Departamento
de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de Viosa. Viosa, MG
STILES, M. E. ; NG, L. K. ; Use of Baird-Parkers Medium to Enumerate Staphylococcus aureus in
Meats. Journal of Food Protection v. 44, p. 583-587, 1981.
SU, Y. C. ; WONG, A. C. L. Identification and purification of new staphylococcal enterotoxin H. Applied
and Environmental Microbiology, USA, v. 61, p. 1438-1443, 1995.
SULLIVAN. J. J. Air microbiology and dairy processing. Australian Journal of Dairy Technology,. v
34, p 133-138. , 1979.
SVEUM. W. H. ; MOBERG, L. J. ; RUDE,R. & FRANK, J. F. Microbiological monitoring of the food
processing environment. In: Vanderzant, C. , & Splittstoeser, D. F. Compendium of methods for the
microbiological examination of foods. 3rd. APHA, Cap,3 p. 51-1992.
VICKERS, VT. Control of airborne contamination in dairy processing plants. N. Zeal. Journal of Dairy
Sci. Technol. v. 21, p 89-98, 1986.

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09

1.

Introduo

2.

Uso do ATP-Bioluminescncia na Avaliao da Qualidade da gua

3.

Adeso Bacteriana em Superfcies de Ao Inoxidvel Avaliada pela


Tcnica do ATP-bioluminescncia

4.

Condies Higinicas de Equipamentos para a Produo de Leite


Pasteurizado Avaliadas por ATP-bioluminescncia

5.

Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans em Ao Inoxidvel Avaliada pela Tcnica do ATP-bioluminescncia

6.

Interferncia de substncias Orgnicas e de Microrganismos na Medida do ATP-bioluminescncia


6.1. Interferncia de Substncias Orgnica no-aderidas Superfcies
6.2. Interferncia de Substncias e Microrganismos Aderidos ao Ao Inoxidvel AISI 304, n4

7.

Concluso

8.

Referncias

Nlio Jos de Andrade


Roberta Torres Careli
Patrcia Dolabela Costa
Erny Marcelo Simm

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Pela tcnica do ATP-bioluminescncia, pode-se monitorar o procedimento de


higienizao em tempo real e complementar as informaes das anlises
microbiolgicas.

1. Introduo
A segurana dos alimentos tem-se tornado preocupao cada vez maior, tanto
para os consumidores quanto para os rgos governamentais responsveis pela
sade pblica. Como conseqncia, tem aumentado a exigncia sobre as indstrias
envolvidas no processamento de alimentos e bebidas, no que diz respeito aos padres de qualidade durante a manufatura e obteno do produto final.
A avaliao do procedimento de higienizao de equipamentos e utenslios,
que entram em contato direto com os alimentos, constitui preocupao constante
das indstrias de alimentos, que necessitam de resultados rpidos para garantir a
qualidade dos produtos processados e a segurana dos consumidores.
A reduo da vida de prateleira de leite pasteurizado, por exemplo, devida, principalmente, a microrganismos contaminantes na ps-pasteurizao, como
as bactrias Gram-negativas, particularmente as do gnero Pseudomonas, ou em
virtude da presena de microrganismos resistentes ao tratamento trmico, como
as espcies de Enterococcus e de esporulantes. A presena dessas bactrias deteriorantes em sistemas de processamento de leite deve-se geralmente a programas
inadequados de limpeza e sanitizao, em que resduos de leite so deixados nas

360

superfcies dos equipamentos, permitindo o crescimento de microrganismos contaminantes e alteradores (MURPHY et al., 1998).
Os mtodos tradicionais de anlises microbiolgicas, como a contagem-padro
em placas, so trabalhosos, alm de demorados, necessitando de um tempo de incubao de 24 a 72 h, retardando a deteco de condies sanitrias insatisfatrias
e contaminaes microbianas que podem afetar a segurana dos produtos (KENNEEDY; OBLINGER, 1985). Alm disso, esses mtodos no detectam a presena dos
resduos que permanecem nas superfcies aps a higienizao, os quais so fontes
de contaminao de alimentos e diminuem a eficincia dos sanitizantes.
Para atender s necessidades das indstrias de alimentos, tm sido desenvolvidos mtodos rpidos para enumerao de microrganismos e deteco de resduos orgnicos (KENNEEDY; OBLINGER, 1985; HAWRONSKYJ; HOLAH, 1997; HOLAH
et al., 2005). Dentre esses mtodos rpidos, encontram-se aqueles que se fundamentam nos conceitos de biofsica ou no crescimento e metabolismo microbiano,
na radiometria, nas medidas de impedncia, na microcalorimetria e na medio da

ATP presente sobre as superfcies avaliadas, seja este de origem microbiana ou no


(KENNEEDY; OBLINGER, 1985; GIESE, 1991; GRIFFITHS, 1993; TYDRICH, 1996).
A tcnica da bioluminescncia pode gerar resultados em minutos, e um laboratorista consegue analisar 20 a 30 amostras por hora, dependendo dos equipamentos
e mtodo utilizados (CROMBRUGGE; WAES, 1991ab).
Na Figura 1 mostrado um tipo de equipamento utilizado nessa tcnica.

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

bioluminescncia. Este ltimo tem como princpio a determinao da quantidade de

361

Figura 1 - Equipamento utilizado na tcnica do ATP-bioluminescncia (Biotrace).

Vrias informaes so fundamentais para o uso e o entendimento correto da


tcnica do ATP-bioluminescncia (COMBRUGGE; WAES, 1991a; TYDRICH, 1996;
BARRICHELLO; ALLIL, 1997). Todas as clulas vivas contm molculas de adenosina trifosfato (ATP), incluindo as da pele, do sangue, de plantas e de microrganismos,
como bactrias, fungos filamentosos e leveduras, tornando possvel a deteco des-

cap.09

ses agentes quando presentes nos equipamentos e utenslios.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

O ATP um nucleotdeo utilizado pelos microrganismos como fonte de energia, desaparecendo depois de 2 h aps a morte da clula e sendo sua quantidade
por clula geralmente constante. O uso de ATP para medir a qualidade bacteriolgica est fundamentado no fato de todas as clulas vivas conterem ATP, o que no
ocorre com as clulas no viveis. Cada bactria contm, em mdia, 1 fentograma
(10-15 g) de ATP, podendo variar de 0,1 a 5,5. Dentre as vrias razes para a variao
desse contedo entre as bactrias, encontra-se a fase do crescimento celular, pois
na estacionria se observa o mais baixo contedo. Alm disso, o contedo intracelular de ATP pode diminuir em resposta a alguma condio de estresse, por exemplo
limitao de nutrientes, alteraes no pH e presena de inibidores, e a quantidade
desse nucleotdeo depende da forma de extrao. O ATP, s vezes, est presente
em uma variedade de alimentos, podendo ser de origem microbiana ou no.
Uma limitao do mtodo a necessidade de um nmero mnimo de microrganismos na amostra, para que o ATP seja detectado. Apenas contagens acima de
104-105 UFC por mililitro ou grama originam quantidade detectvel do nucleotdeo
(ADAMS; HOPE, 1989).
O mtodo descrito por Stannard e Wood (1983) produziu resultados em 20-25
min; tempo esse considerado curto, se comparado com 24-48 h necessrias para
uma contagem convencional de colnias. Nesse experimento, amostras de carne
fresca foram analisadas, e o mtodo mostrou uma estimativa da populao microbiana, quando o alimento apresentava contagens acima de 105 UFC.g-1.
A tcnica de ATP-bioluminescncia foi utilizada com sucesso para detectar o

362

ATP em superfcies de equipamentos usados em cirurgias orais na rea odontolgica, como um indicador da presena de contaminao por saliva ou microrganismos, e avaliar a eficincia dos procedimentos de rotina de higienizao. Tais rotinas
so difceis de serem monitoradas, em razo do tempo e do trabalho despendido na
realizao das tcnicas microbiolgicas. Esse monitoramento vital no controle de
infeces cruzadas, ou seja, de um paciente para outro ou, ento, para as pessoas envolvidas na cirurgia, como os dentistas e seus auxiliares. A ateno sobre o controle
de contaminao cruzada em cirurgia oral aumentou principalmente com o advento
da AIDS (HIV), embora outra grande preocupao seja referente ao vrus da hepatite B
(HBV), presentes no somente no sangue, mas tambm em secrees como a saliva.
Embora a maior preocupao com a transmisso do HIV e HBV durante as cirurgias
orais seja relacionada aos acidentes perfurocortantes, a transmisso envolvendo superfcies contaminadas no pode ser descartada (DOUGLAS; ROTHWELL, 1991).
O princpio da tcnica do ATP-bioluminescncia consiste em quantificar
ATP presente em uma superfcie ou em uma amostra lquida, utilizando-se
Swabs apropriados.

pamentos e utenslios, indicando a forma de aplicar o Swab, o ngulo e movimento


circular do Swab, a rea e a forma diagonal para a coleta.

Figura 2 - Tcnica adequada para remoo de ATP na superfcie de equipamentos e utenslios, mostrando a
forma de segurar o Swab, o ngulo de contato, a rea (10 cm x 10 cm) e a coleta em diagonal.

O ATP coletado reage com o complexo luciferina/luciferase, extrado da cauda


do vaga-lume da espcie Photinuis pyralis ou de peixes abissais (GIESE, 1991; GRIFFITHS, 1993; VELAZQUEZ; FEIRTAG, 1997). A enzima luciferase utiliza a energia
qumica contida na molcula de ATP para promover a descarboxilao oxidativa
da luciferina, resultando na emisso de luz, ressaltando-se que para cada ATP um
fton de luz emitido. A quantidade de luz emitida proporcional quantidade de
ATP presente coletada na superfcie dos equipamentos e utenslios (GIESE, 1991;
HAWRONSKYJ; HOLAH, 1997), conforme esquema mostrado na Figura 3:

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

Na Figura 2, mostrada a tcnica para remoo de ATP na superfcie de equi-

363

Figura 3 - Esquema da reao entre a adenosina trifosfato (ATP) e o complexo luciferina/


luciferase.

A medida de ATP pelo mtodo da bioluminescncia afetada por certos fatores que causam reduo na emisso dos ftons de luz. Essa reao acontece em
pH timo de 7,75. Quando o pH est abaixo ou acima desse valor pode ocorrer
diminuio na produo de luz. A temperatura tima da reao de 25 C, e em

cap.09

temperaturas mais elevadas a luciferase pode ser inativada, enquanto em tempera-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

turas mais baixas a velocidade da reao diminui. A turbidez e a cor das amostras,
por exemplo no caso de anlise de gua, tambm causam diminuio na produo
de luz (COMBRUGGE; WAES, 1991a; TYDRICH, 1996).
Os instrumentos disponveis para medir a luminescncia so os fotmetros
sensveis emisso de luz. Relativamente simples, baseiam-se na deteco de luz
por fotomultiplicadores. A amostra colocada em uma cmara escura, para que o
fotomultiplicador e o amplificador sejam protegidos da luz externa. Os resultados
so usualmente dados em unidades relativas de luz (URL) ou em logaritmos decimais das unidades relativas de luz (log10URL) (COMBRUGGE; WAES, 1991a; HAWRONSKYJ; HOLAH, 1997).
A tcnica de ATP-bioluminescncia tem sido utilizada para determinar a qualidade microbiolgica de produtos alimentcios, como leite e derivados, bebidas,
vegetais e carnes e derivados; para avaliar a qualidade da gua de abastecimento
pblico e no processo de limpeza e desinfeco, tanto em indstria de alimentos
quanto em hospitais e indstria farmacutica (KENNEDY; OBLINGER, 1985; GRIFFITHS, 1993; TYDRICH, 1996; VELAZQUEZ; FEIRTAG, 1997; GOMEZ, 1999; CORBITT et al., 2000; GRIFFITHS et al., 2000). Atualmente, h vrios fabricantes desses
equipamentos, e muitos deles so comercializados no Brasil. Alguns estudos tm
mostrado as diferenas na sensibilidade e reprodutibilidade desses aparelhos.
De acordo com Hawronskyj e Holah (1997) e Tydrich (1996), quanto tcnica

364

do ATP-bioluminescncia, algumas vantagens e desvantagens podem ser citadas


(Quadro 1).
Quadro 1 - Vantagens e desvantagens da tcnica de ATP-bioluminescncia

convencionais de cultivo de microrganismos a rapidez na obteno dos resultados. Em alguns casos, so necessrios dias para a finalizao de mtodos de cultivo, enquanto a anlise de ATP requer apenas alguns minutos. Assim, programas
de higienizao podem ser monitorados em tempo real, e, se os nveis de ATP
encontrados estiverem acima dos limites preestabelecidos como aceitveis, uma
nova higienizao do ponto amostrado deve ser iniciada imediatamente.
O uso da anlise de ATP para monitorar nveis de higienizao no deve
substituir as tcnicas tradicionais, que so utilizadas para detectar microrganismos
especficos, podendo servir como anlise complementar nesse tipo de monitoramento (COLQUHOUN et al., 1998).
A determinao de ATP microbiano depende da eficincia da separao entre
bactria e os resduos orgnicos. Aps a separao, seguem-se a extrao e a medida do ATP microbiano. Pode-se usar tambm a extrao seletiva e a destruio enzimtica do ATP no-microbiano, seguida pela extrao e medida do ATP microbiano.
Esses tipos de reagentes, disponveis comercialmente, podem ser encontrados sob
as seguintes denominaes: NRS, Lumac e NAS (STANNARD; WOOD, 1983;
KENNEDY; OBLINGER, 1985; GIESE, 1995; TYDRICH, 1996). Alguns pesquisadores
tm aplicado filtrao ou centrifugao para separar os microrganismos da amostra
do alimento, medindo, assim, apenas o ATP microbiano.

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

A principal vantagem do monitoramento dos nveis de ATP sobre as tcnicas

Green et al. (1999) avaliaram o efeito de nove agentes qumicos de limpeza e


sanitizantes comerciais na medida de ATP-bioluminescncia, usando ATP de duas
diferentes fontes: ATP puro, conseguido diretamente do fabricante do equipamento

365

de leitura; e ATP de fonte orgnica, obtido de exsudato de carcaas de frango. Os


agentes qumicos foram preparados nas seguintes concentraes: 10% da concentrao recomendada pelo fabricante; de acordo com a recomendada e duas vezes
essa concentrao. Os resultados de cada agente qumico foram apresentados em
porcentagem, considerando-se o valor do logaritmo decimal das unidades relativas
de luz (URL) do controle como 100%. Excetuando-se o teste com quaternrio de
amnio, todos os outros agentes qumicos reduziram os valores de URL. Para o
quaternrio de amnio, o efeito foi inverso, ou seja, os resultados da leitura foram
maiores que o controle nas duas fontes de ATP. O perxido de hidrognio acidificado causou maior reduo na medida de URL para o ATP de fonte orgnica do que
para o ATP puro. Para acidificar esse agente, utilizou-se o cido actico, e a ao
deste com a matria orgnica, protenas e lipdeos talvez tenha sido a responsvel
pela reduo nos valores de URL. Esses autores concluram que a exposio dos
componentes da reao de bioluminescncia, como a enzima luciferase, o co-fator
luciferina ou o substrato ATP, aos sanitizantes e agentes de limpeza pode acarretar

cap.09

alteraes nas medidas de URL.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Velazquez e Feirtag (1997) avaliaram alteraes na medida de URL causadas


pelas seguintes solues sanitizantes: i) hipoclorito de sdio comercial nas concentraes de 100 a 50.000 mg.L-1 de cloro residual livre (CRL), com pH variando de
7,2 a 12,1; e ii) 5 a 800 mg.L-1 de um composto quaternrio de amnia com pH entre
5,8 e 6,3. Essas solues foram adicionadas em amostras contendo 108 UFC.mL-1
de Escherichia coli O157:H7. Os resduos da concentrao de 100 mg.L-1 de CRL
causaram ligeiro aumento na medida de URL, no sendo, no entanto, detectadas
diferenas significativas (p>0,05) entre as medidas de URL obtidas das amostras
que continham 500 e 1.000 mg.L-1 de CRL e as medidas determinadas para o controle. Os resduos das concentraes de 10.000 a 50.000 mg.L-1 de CRL fizeram que a
medida de URL fosse reduzida. J as solues sanitizantes de quaternrio de amnia
provocaram aumento de 10 % nessa medida.
Demonstrou-se, em um ensaio microbiolgico utilizando a tcnica de
ATP-bioluminescncia, o potencial de uso dessa metodologia como forma de
detectar contaminao fecal em carcaas bovinas e para medir a efetividade do
processo de descontaminao. Assim, a tcnica pode ser usada para monitorar
pontos crticos de controle em um programa de Anlises de Perigos e Pontos Crticos de Controle (APPCC) em uma planta de processamento de carnes bovinas
(SIRAGUSA; CUTTER, 1995). A combinao de programas de APPCC e mtodos
microbiolgicos rpidos como o ATP-bioluminescncia pode ajudar as indstrias
a encontrar novos caminhos para processar alimentos de forma mais eficiente e
com maior segurana.

366

Vrias pesquisas tm sido realizadas com a tcnica de ATP-bioluminescncia, e


snteses de algumas delas so apresentadas subseqentemente.

2. Uso de ATP-Bioluminescncia para Avaliar a Qualidade da gua


Inicialmente, amostras de gua:i) de manancial; ii) floculada; iii) decantada;
iv) filtrada, coletadas de uma Estao de Tratamento de gua (ETA); v) gua
destilada; vi) gua industrial; vii) gua gelada pasteurizada; viii) gua de resfriamento de amnia; e ix) vapor condensado, coletadas de uma indstria de
laticnios, foram avaliadas por Costa (2001, 2006) quanto aos seus aspectos
fsicos, qumicos e microbiolgicos.
Avaliado o conjunto de caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas
das diversas amostras, decidiu-se pelo uso das seguintes guas: de manancial,
de resfriamento de amnia e da industrial para realizao dos testes com a tcnica da bioluminescncia, por serem as que apresentaram maiores diferenas
nas caractersticas avaliadas. Posteriormente, as amostras selecionadas foram

tcnica de ATP-bioluminescncia, usando-se o Kit Aquatest Total (BIOTRACE,


2000), para determinao, do ATP livre mais o microbiano; e Kit Aquatest Free,
para determinao, do ATP livre, ou seja, de origem no-microbiana. Os resultados dessas anlises so apresentados nos Quadros 2 e 3.
Quadro 2 - Anlises fsico-qumicas de guas originrias do tratamento convencional de
Estao de Tratamento de gua e de uso em indstria de laticnios

Quadro 3 - Anlises microbiolgicas de guas originrias do tratamento convencional de


Estao de Tratamento de gua e de uso em indstria de laticnios

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

novamente submetidas s anlises fsico-qumicas e microbiolgicas e tambm

367

Os resultados das anlises para as amostras de gua de manancial foram comparados aos padres exigidos pela Resoluo n 357, de 17 de maro de 2005, do
Conselho Nacional do Meio Ambiente (BRASIL, 2005), podendo afirmar que os parmetros avaliados se encontram dentro da legislao vigente. Da mesma forma,
puderam-se comparar os resultados das anlises da gua industrial j tratada da
ETA/UFV com os padres estabelecidos pela Portaria n 518 do Ministrio da Sade,
de 25 de maro de 2004 (BRASIL, 2004), que trata da qualidade de gua potvel,
constatando-se que a gua se encontrava dentro do padro legal vigente para os
parmetros avaliados: aerbios mesfilos e coliformes totais. No entanto, deve-se
salientar que h exigncia da anlise de cerca de 90 parmetros diferentes para
determinar se um manancial se encontra em condies de potabilizao (Resoluo
n 357, do Conselho Nacional do Meio Ambiente) ou se a gua potvel (Portaria n

cap.09

518, do Ministrio da Sade).

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


368

A seleo das amostras fundamentou-se no fato de que se procuraram selecionar aquelas que apresentassem diferenas bem caracterizadas em seus aspectos
fsicos, qumicos e, ou, microbiolgicos. A gua de manancial mostrou valores elevados de turbidez e de contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais. J na
gua de resfriamento de amnia, notaram-se concentraes elevadas em todos os
parmetros avaliados. A gua industrial pode ser considerada uma amostra-controle, em razo de suas boas caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas.
Para a avaliao da qualidade microbiolgica da gua, o experimento foi conduzido em delineamento inteiramente casualizado (DIC), com trs repeties e trs
tratamentos, e, a partir das anlises de varincia do log10 de URL e UFC.cm-2 , foram
comparadas as mdias pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
Observa-se, pela anlise de varincia da quantidade de ATP total, livre e microbiano e tambm das contagens de aerbios mesfilos e de coliformes totais das
amostras de gua avaliadas (Quadro 4) que houve diferena significativa (p< 0,05).
Quadro 4 - Resumo das anlises de varincia dos logaritmos decimais (log10) da concentrao de Unidades Relativas de Luz (URL) do ATP total, livre e microbiano, de UFC.mL-1 de
mesfilos aerbios e de NMP.100 mL-1 de coliformes totais de amostras de gua de manancial, resfriamento de amnia e industrial

Verifica-se, conforme o Quadro 5, que as amostras de gua de manancial e de


resfriamento de amnia no apresentaram diferena significativa (p >0,05), pelo
teste de Tukey, para as quantidades de ATP total e livre e tambm para as contagens
microbianas. Verifica-se, ainda, como esperado, que a amostra de gua industrial foi
aquela que apresentou a menor concentrao dos diferentes tipos de ATP avaliados
e as menores contagens microbianas.
Quadro 5 - Mdia da concentrao dos logaritmos decimais (Log10) de Unidades Relativas de Luz
(URL) para ATP total, livre e microbiano, de UFC.mL-1 de mesfilos aerbios e de NMP.100 mL-1 de
coliformes totais de amostras de gua de manancial e resfriamento de amnia e industrial. Mdia
de trs repeties

que 150 URL, cujo log10 corresponde a 2,18, para que a gua seja considerada em
condies higinicas satisfatrias. Independentemente da origem do ATP, os valores
se encontravam abaixo do recomendado. Deve-se ressaltar, entretanto, que essa
tcnica no diferencia as espcies microbianas contaminantes. Os resultados das
anlises microbiolgicas de aerbios mesfilos e coliformes totais esto dentro dos
padres legais vigentes (BRASIL, 1990, 2005).
No que se refere gua do manancial, observou-se que as concentraes de
ATP total e livre eram mais elevadas do que as obtidas na gua utilizada na indstria. J as caractersticas microbiolgicas, de turbidez e de cor diferenciaram essas
amostras. Comparando-se as trs amostras avaliadas, as concentraes de ATP total e microbiano foram as mais elevadas na gua de manancial e consistentes com
os resultados das contagens de aerbios mesfilos e coliformes totais. Os resultados das anlises pela tcnica de ATP-bioluminescncia sugeriram que a gua do
manancial encontrava-se em condies insatisfatrias, acima de 300 URL para ATP
total, e em condies de alerta entre 150 e 300 URL, para o ATP livre e microbiano.
De acordo com os resultados, a determinao do ATP total a recomendada para
avaliar a qualidade microbiolgica da gua de manancial e, nesse caso, no um
problema considervel o fato de a tcnica no diferenciar espcies microbianas, j
que a gua receber tratamentos, como sedimentao com coagulantes, floculao,

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

Em relao gua industrial, houve a concordncia entre os mtodos de bioluminescncia e de contagem de aerbios mesfilos e coliformes totais. Para a tcnica
da bioluminescncia, o fabricante (BIOTRACE, 2000) recomenda valores menores

filtrao e clorao, para o controle da turbidez e o controle microbiolgico.


Conforme a Resoluo n 357 do Conselho Nacional do Meio Ambiente (BRASIL,
2005), apesar da concentrao relativamente elevada de coliformes totais, os valores

369

encontrados esto dentro dos padres legais exigidos para gua a ser potabilizada.
A gua de resfriamento de amnia foi selecionada em razo das diferenas considerveis em suas caractersticas fsico-qumicas e microbiolgicas, em relao s
outras amostras. Essa gua foi considerada em situao de alerta para a determinao
de ATP total e livre e em boas condies de higiene para determinao do ATP microbiano. Tambm, nesse caso, os resultados indicaram que a determinao de ATP total
foi a mais recomendada. Talvez a qualidade fsico-qumica da gua tenha influenciado
a determinao da bioluminescncia, diminuindo a formao de luz. Essa gua apresentou valores elevados de turbidez, pH, alcalinidade, cloretos e dureza.
Pesquisas mostram que diversas substncias detergentes e sanitizantes afetam

cap.09

a tcnica da bioluminescncia. De acordo com a literatura, os sanitizantes causam


redues nas medidas de ATP quando entram em contato direto com os reagentes
da bioluminescncia, podendo levar a uma falsa concluso de que os equipamentos
de processamento esto corretamente sanitizados, quando na verdade o sanitizante
pode ter reduzido a leitura de URL.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

3. Adeso Bacteriana em Superfcies de Ao Inoxidvel Avaliada


pela Tcnica de ATP-bioluminescncia
No Quadro 6 sintetizado outro experimento de Costa (2001), que trata da
avaliao e adeso microbiana em superfcies de ao inoxidvel e polietileno pela
tcnica da bioluminescncia.
Quadro 6 - Sntese de pesquisa sobre adeso microbiana em superfcies avaliadas pela
tcnica de ATP-bioluminescncia

A relao entre as avaliaes do processo de adeso de esporos de Bacillus


sporothermodurans pelos processos de contagem em placas e a tcnica de bioluminescncia, em superfcies de ao inoxidvel e de polietileno de baixa densidade
(PEBD), mostrada no Quadro 7.
Quadro 7 - Logaritmo decimal (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total e UFC.cm-2
em superfcies de ao inoxidvel e polietileno aderidas com esporos de Bacillus sporothermodurans

370

De acordo com a tcnica da bioluminescncia, as superfcies poderiam ser


consideradas, em condies higinicas satisfatrias, pois todos os resultados se
encontravam abaixo de 150 URL (log10<2,18). Porm, quando avaliadas pela contagem-padro em placas, as superfcies foram classificadas como inadequadas para
o processamento de alimentos. Considerando que para a APHA (DOWNES; ITO,
2001) uma superfcie higienizada deve apresentar at 2 UFC.cm-2 (log10 de 0,3) e que
outras instituies como a OMS e OPAS sugerem at 5,0x101 UFC.cm-2 (log10 de
1,7), os resultados da avaliao pela microbiologia tradicional indicaram superfcies
inadequadas para o processamento de alimentos.
Nas condies deste experimento, a tcnica da bioluminescncia no foi apropriada para avaliar a presena de esporos de B. sporothermodurans em ambas as
superfcies. Esses resultados so compatveis com vrias pesquisas disponveis na
literatura, sendo uma provvel explicao o fato de os esporos bacterianos no apresentarem metabolismo, quantidade de ATP ou transporte de eltrons detectveis, no

expostos ao complexo enzimtico luciferina/luciferase, produzem muito menos luz,


expressa em URL, quando comparado com o resultado observado em clulas vegetativas (BAKER et al., 1992).
Em relao quantidade de esporos aderidos, constatou-se que houve maior
adeso em polietileno que no ao inoxidvel. A adeso microbiana em superfcies
est associada a diversos fatores, que inter-relacionados determinam a quantidade
de microrganismos aderidos (ZOTTOLA, 1997), incluindo entre eles a carga eltrica
e a hidrofobicidade, que poderiam estar influenciando essa maior adeso ao polietileno. Os processos de adeso tambm podem ter influenciado a quantidade de esporos aderidos; no caso de cupons de ao inoxidvel, a tcnica consistiu na imerso
em suspenso de esporos, enquanto no de cupons de polietileno a suspenso foi
adicionada no interior de uma embalagem feita com o polmero.
Observou-se, pelos resultados, que os esporos de B. sporothermodurans tm
a capacidade de aderir s superfcies avaliadas, e essa adeso afetada pelo nmero inicial de esporos na suspenso. No ao inoxidvel, a adeso foi de 2,42 % e 3,57
% quando os nmeros de esporos na suspenso eram da ordem de 104 UFC.mL-1 e 106
UFC.ml-1, respectivamente. No polietileno, a adeso dos esporos atingiu 9,9 % e 17,4 %,
respectivamente, considerando-se os mesmos nmeros de esporos nas suspenses
usadas no processo de adeso. Constatou-se, como esperado, que o nmero de
esporos aderidos aumentou com a concentrao destes nas suspenses.

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

tendo, portanto, energia suficiente para a reao da formao de luz. Assim, quando

Observa-se, pelo Quadro 8, que a determinao das URL afetada pelas condies de adeso de E. coli. Constatou-se que a suspenso microbiana centrifugada
associada ao tempo de repicagem do microrganismo interferiu na avaliao pela

371

tcnica da bioluminescncia e tambm na quantidade de clulas aderidas. Determinaram-se os valores de 113 URL para ATP total e 5,9x102 UFC.cm-2 de clulas
aderidas ao ao inoxidvel, quando a suspenso foi centrifugada e o tempo de repicagem, de 24 h. Sem a centrifugao e com 12 h de repicagem, os valores foram de
2397 URL e 1,1x104 UFC.cm-2.

cap.09

Quadro 8 - Logaritmo decimal (log10) de Unidades Relativas de Luz (URL) para ATP total,
livre e microbiano e UFC.cm-2 presentes em superfcies de ao inoxidvel com suspenso
de Escherichia coli K12

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

A literatura apresenta possveis explicaes para esse resultado. Crombrugge


e Waes (1991a) mostraram que ocorre diminuio na quantidade de ATP durante o
crescimento celular, havendo baixo contedo dele na fase estacionria, em relao
s outras fases do desenvolvimento microbiano. Mudanas na taxa metablica afetam o nvel de ATP celular, e, conseqentemente, situaes subtimas e de estresse
podem alterar o contedo de ATP. Alm disso, as formas diferentes de extrao, usadas neste experimento, ou seja, a filtrao e a centrifugao, podem levar situao
de estresse e, logicamente, a uma diminuio no nvel do ATP celular. provvel,
ainda, que o estado fisiolgico das clulas microbianas repicadas aps intervalos de
12 h de incubao fosse diferente daquelas clulas repicadas aps intervalos de 24 h
de incubao, e no intervalo de repicagem menor as clulas estavam na fase logartmica de crescimento e no maior, no. Esse fato, associado presena de nutrientes
nas clulas no-centrifugadas, aumentou o nmero de clulas aderidas na superfcie
aps 24 h, o que pode ser observado pelos resultados do ATP microbiano, que atingiu 1.500 URL. A quantidade de ATP microbiano foi cerca de 13 vezes maior que o
ATP total para clulas centrifugadas e com repicagens de 24 h (Quadro 8).
Observou-se pelos resultados que nas clulas centrifugadas a quantidade de
ATP total determinada pela tcnica da bioluminescncia atingiu apenas 113 URL, o
que sugere que a superfcie est em condies higinicas adequadas. J a tcnica
de contagem em placas revelou condies higinicas insatisfatrias, pois o log10
do nmero de clulas aderidas por cm2 atingiu 2,77. Nas clulas no-centrifugadas,

372

os mtodos apresentam respostas semelhantes para o ATP total, ambos sugerindo


que a superfcie est em condies higinicas insatisfatrias, com 2.397 URL e log10
do nmero de clulas aderidas por cm2 igual a 4,0. Concluiu-se, assim, que na interpretao dos resultados da tcnica da bioluminescncia para avaliar a adeso
microbiana devem ser consideradas, dentre outros fatores, as diferentes condies
experimentais e a populao microbiana.
A maior adeso s clulas no-centrifugadas se deveu, provavelmente, ao fato
de os nutrientes do meio de cultura auxiliarem nesse processo, alm de facilitarem
o crescimento microbiano, com provvel produo de exopolissacardeos, aps o
perodo de 24 h, partindo de uma cultura com intervalos de 12 h entre repicagens.
As porcentagens de adeso das clulas de E. coli K12 foram de 0,0012% e 0,068%,
respectivamente nas clulas centrifugadas e no-centrifugadas.

A tcnica do ATP bioluminescncia como alternativa contagem microbiana


para avaliar o procedimento de higienizao de superfcies de ao inoxidvel de
equipamentos de uma indstria de laticnios foi estudada.
O Quadro 9 apresenta a sntese de uma pesquisa acerca do procedimento de
higienizao de equipamentos de uma linha de pasteurizao de leite pelas tcnicas
da bioluminescncia e contagem de aerbios mesfilos.
Quadro 9 - Sntese de pesquisa sobre procedimento de higienizao em linha de pasteurizao
de leite pelas tcnicas da bioluminescncia e contagem-padro em placas

Tanto a quantidade de ATP quanto o nmero de microrganismos foram diferentes

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

4. Condies Higinicas de Equipamentos para a Produo de


Leite Pasteurizado Avaliadas por ATP-bioluminescncia

373

(p<0,05) quando se compararam os resultado antes (9772 URL e 1,20 x103 UFC.cm-2) e
depois (2511 URL e 1, 10x101 UFC.cm-2) do procedimento de higienizao.

cap.09

Os resultados indicaram que no h uma concordncia entre os mtodos de contagem microbiana e ATP-bioluminescncia na classificao das condies higinicas
dos equipamentos avaliados para o processamento de leite (Quadros 10 e 11). Observa-se, nesses quadros, que para ambas as tcnicas de avaliao do procedimento
de higienizao, as superfcies da DES e do TRC foram aquelas que se apresentaram
em piores condies higinicas. No entanto, no houve uma concordncia entre as
duas tcnicas na classificao das condies higinicas das demais superfcies. Podese dizer que no houve relao direta entre URL e UFC.cm-2. Portanto, a tcnica de
ATP-bioluminescncia apenas pode ser usada como indicadora das condies higinicas associadas s quantidades de matria orgnica nas superfcies, ou seja, se o
procedimento de higienizao foi efetuado corretamente ou no. Essa informao
importante, pois a presena de resduo de alimentos nas superfcies pode originar
processos de adeso microbiana e formao de biofilmes (ZOTTOLA, 1997). No expe-

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

rimento, o nmero de microrganismos aderidos indicou que ocorreu adeso bacteriana, atingindo cerca de 104 UFC.cm-2, e no formao de biofilmes.
Quadro 10 - Log10 de Unidades Relativas de Luz (URL) em diferentes superfcies de uma indstria de alimentos antes e depois do procedimento de higienizao. Mdia de trs repeties

Quadro 11 - Log10 de mesfilos aerbios (UFC.cm-2) em diferentes superfcies de uma linha de


circulao de leite

374

Os resultados evidenciaram, ainda, que o nmero mdio de aerbios mesfilos


nas superfcies encontrava-se acima de 2 UFC.cm-2 ( log10>0,3), conforme recomendao da APHA (DOWNES; ITO, 2001), mas que algumas superfcies atendiam
recomendao de outros rgos, como OMS e OPAS, que sugerem que superfcies
contendo at 50 UFC.cm-2 (log10<0,7) podem ser consideradas adequadamente higienizadas. Assim, pode-se concluir que as superfcies aps a higienizao estavam
em condies higinicas adequadas, se for usada uma especificao menos rgida
do que a proposta pela APHA. No entanto, as superfcies estavam em condies
higinicas insatisfatrias quando a avaliao foi pela tcnica do ATP total, que determinou a concentrao de 2.511 URL, muito acima de 150 URL (log10 > 2,17) recomendados pela BIOTRACE (2000), fabricante do equipamento de ATP-bioluminescncia usado neste experimento.
Outra maneira de comparar as tcnicas de contagem de aerbios mesfilos e
a de bioluminescncia pela porcentagem de superfcies higienizadas que atendem
s recomendaes da APHA, da OMS em relao contagem de aerbios mesfilos
e que satisfazem a recomendao da tcnica de ATP-bioluminescncia.

superfcies foram consideradas em condies higinicas insatisfatrias, depois de


realizada a higienizao. A contagem microbiana detectou 50 % de superfcies em
condies higinicas insatisfatrias, considerando-se a recomendao da APHA e a
da OMS, 28 %.
Verificou-se, pelos resultados, que a tcnica de ATP-bioluminescncia apresenta resultados diferentes dos mtodos de contagem bacteriana, sugerindo a
influncia de resduos, oriundos da m higienizao sobre a medida da quantidade
de ATP total nas superfcies.
Quadro 12 - Porcentagem de superfcies de processamento de leite em boas condies de
higiene, conforme especificaes propostas por entidades internacionais ou pelo fabricante do
equipamento Unilite (ATP-bioluminescncia)

5. Adeso de Esporos de Bacillus sporothermodurans em Ao


Inoxidvel avaliada pela Tcnica do ATP-bioluminescncia

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

Verifica-se, pelo Quadro 12, que pela tcnica da bioluminescncia 100 % das

A higienizao de cupons de prova de ao inoxidvel do simulador de uma


linha de circulao de leite foi avaliada pela tcnica da ATP-bioluminescncia, con-

375

forme sntese do Quadro 13.

cap.09

Quadro 13 - Sntese da pesquisa que avaliou a higienizao de cupons de prova de ao inoxidvel


do simulador de uma linha de circulao de leite, pela tcnica da ATP-bioluminescncia

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

De acordo com o Quadro 14, os cupons avaliados aps a sanitizao e esterilizao apresentaram resultados inferiores a 150 URL, ou seja, estavam limpos,
livres de contaminao microbiana ou de resduos orgnicos, com base na interpretao proposta pelo fabricante.
Quadro 14 - Avaliao dos cupons de prova pela tcnica de ATP-bioluminescncia em diferentes situaes. Valores expressos em Unidade Relativa de Luz (URL)

Aps a adeso dos esporos, verificaram-se, em mdia, valores abaixo de


150 URL nos diferentes tipos de cupons de prova (Quadro 14); no entanto, os
resultados da enumerao dos esporos pela tcnica da contagem-padro em
placas mostraram valores em torno de 1,0 x 104 UFC.cm-2. Assim, pelo mtodo tradicional de contagem microbiana, as superfcies dos cupons encon376

travam-se em condies higinicas insatisfatrias, quando comparadas com a


recomendao da APHA, que sugere o mximo de 2 UFC.cm-2 para superfcies
adequadamente higienizadas.
As informaes obtidas pelos mtodos ora apresentados foram inconsistentes. Conforme mencionado anteriormente, os esporos bacterianos no mostram
metabolismo, nveis de ATP ou transporte de eltrons detectveis, no tendo,
portanto, energia suficiente para realizarem a reao de formao de luz (BAKER
et al., 1992). Ao serem expostos ao complexo enzimtico luciferina/luciferase,
produziram menos luz, expressa em URL, do que as clulas vegetativas. Outra
possvel explicao, menos provvel, mas que poderia contribuir para os resultados obtidos, seria o fato de a superfcie no ser lisa, possuindo fissuras e ranhuras que podem dificultar a remoo do esporo aderido pelo Swab.
Os resultados das anlises de ATP, ao se avaliarem os cupons depois da
circulao da soluo a 60 mg.L-1 de cido peractico e pr-enxge com gua
temperatura entre 20 e 25 C por 3 min, evidenciaram que todos os tipos de
cupons encontravam-se bem higienizados.

tra adequada para detectar a presena de esporos bacterianos aderidos em razo


provavelmente do baixo nvel de ATP detectvel destes.

6. Interferncia de Substncias Orgnicas e de Microrganismos


na Medida de ATP-Bioluminescncia
6.1. Interferncia de Substncias Orgnicas No-Aderidas a Superfcies
No Brasil, esta tcnica tem sido aplicada e com tendncia de ampliao de
seu uso; no entanto, a interpretao do que se avalia nem sempre realizada de
forma adequada. Conforme mencionado, alguns fatores podem influenciar os resultados obtidos com a tcnica ATP-bioluminescncia, de forma a contribuir negativamente para o seu potencial de utilizao como ferramenta no monitoramento de
procedimentos de higienizao. Dentre esses fatores, um que pouco estudado e,
conseqentemente, pouco relatado em literatura o efeito que resduos orgnicos
como protena, lipdeos e carboidratos, oriundos do processamento de alimentos de
origem animal e vegetal, pode causar na medida de ATP pela tcnica de bioluminescncia. Em razo dessa considerao, Simm (2004) avaliou o efeito de substncias
orgnicas em suspenso ou aderidas ao ao inoxidvel na medida de ATP-biolumi-

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

De acordo com os resultados, a tcnica de ATP-bioluminescncia no se mos-

nescncia, conforme sntese do Quadro 15.


377

cap.09

Quadro 15 - Sntese de pesquisa que avaliou a interferncia de resduos orgnicos e microrganismos na medida do ATP-bioluminescncia

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

As suspenses de substncias orgnicas foram preparadas de forma que a


alquota de 0,1 mL coletada pelo kit possusse concentrao de casena, ou de
gordura e ou de sacarose igual daquelas mencionadas no Quadro 17.
Quanto aos microrganismos, foram avaliadas suspenses contendo 5,4x104
CDM.mL-1 para S. carnosus e de 2,9x103 CDM.mL-1 a 2,9x107 CDM.mL-1 para esporos
de B. subtilis. A alquota coletada com o kit correspondeu a uma diluio de 1:10
em relao s suspenses-teste. Essas foram preparadas de forma assptica em
tubos plsticos com tampa, com capacidade para 50 mL, utilizando-se as suspenses e
solues temperatura de 30 C.
As amostras foram coletadas, e procedeu-se ao contato com complexo enzimtico luciferina/luciferase, para promover a reao de emisso de luz. O kit foi
introduzido no luminmetro, onde foi realizada a leitura do nmero de URL aps,
aproximadamente, 10 seg.
Para o delineamento experimental e anlise dos resultados, foram empregados
diferentes procedimentos do programa Statistical Analysis System (SAS/2004):
a) Os ensaios para avaliao: i) dos trs tipos e trs concentraes de substncias orgnicas em suspenso/soluo; e ii) dos trs tipos e trs concentraes de substncias
orgnicas em suspenso/soluo adicionada de S. carnosus seguiram um modelo de delineamento aninhado com concentrao por substncia. O experimento foi realizado em
trs repeties, e as determinaes do nmero de URL foram feitas em duplicatas.
b) As mdias de todos os tratamentos foram comparadas pelo teste de Duncan, a de 5 %

378

de probabilidade.
c) A avaliao das combinaes de substncias orgnicas em suspenso/soluo seguiu
modelo de delineamento inteiramente casualizado com sete tratamentos, em trs repeties. As determinaes do nmero de URL foram feitas em duplicatas. As comparaes
de interesse, testadas pelo teste F, esto representadas a seguir (Quadro 16 ):
d) A avaliao da combinao de duas e trs substncias orgnicas em suspenso/soluo adicionada de S. carnosus ou esporos de B. subtilis seguiu modelo de delineamento
inteiramente casualizado com cinco tratamentos, em trs repeties. As determinaes
do nmero de URL foram feitas em duplicatas. As comparaes de interesse, testadas
pelo teste F, esto representadas no Quadro 16.

6.1.1. Interferncia de Substncias Orgnicas no Aderidas Superfcie


Constatou-se diferena significativa (p<0,05) no nmero de URL entre casena e banha de porco e a sacarose (Quadro 17). A sacarose apresentou o menor
nmero de URL quando comparada com a casena e a banha de porco, e as duas
ltimas no apresentaram diferena significativa entre si, a 5% de probabilidade,
pelo teste de Duncan. As concentraes diferentes em cada uma das substncias
no apresentaram diferena significativa (p>0,05) na medida de URL. Quando as

porco e sacarose apresenta uma mdia de log de URL menor (p<0,05) do que a das
demais combinaes (Quadro 17).
Quadro 16 - Comparaes de interesse avaliadas pelo Teste F

Quadro 17 - Mdia e desvio-padro dos logaritmos decimais do nmero de Unidades Relativas de


Luz (log de URL) das suspenses e solues de substncias orgnicas . Mdia de trs repeties

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

substncias orgnicas esto combinadas, observa-se que a associao banha de

379

6.1.2. Interferncia de Microrganismos em Substncias Orgnicas no Aderidas


Superfcie
Em relao s suspenses contendo concentraes semelhantes de microrganis-

cap.09

mos e avaliadas isoladamente, o nmero mdio de URL para de S. carnosus foi maior

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

(p<0,05) do que aquele obtido nas suspenses com esporos de B. subtilis, conforme
o teste t, de Student. O logaritmo do nmero de URL foi 3,79 nas clulas vegetativas
e 1,95 nos esporos bacterianos (Quadro 18), o que corresponde a 69 vezes a mais na
medida da bioluminescncia. Em relao aos esporos, no houve diferena (p>0,05)
no nmero de URL nas contagens de 2,9X103 UFC.mL-1, 2,9x104 UFC.mL-1, 2,9x105
UFC.mL-1, com mdia de 1,93 log de URL. Porm, nas contagens de 2,9x107 UFC.
mL-1, o log de URL atingiu 2,6.
Quadro 18 - Mdia e desvio-padro dos logaritmos decimais do nmero de Unidades Relativas
de Luz das suspenses e solues de substncias orgnicas adicionadas de microrganismos

380

6.1.3. Interferncia de Combinaes entre Substncias Orgnicas e Microrganismos


O nmero de URL foi menor (p<0,05) nas combinaes de substncias orgnicas
contendo 11,0 e 7,0 mg.mL-1 de casena e 14 mg.mL-1 de banha de porco adicionadas
de 5,4x104 CDM.mL-1 de S. carnosus (Quadro 18). O nmero mdio de URL obtido na
combinao contendo 7,0 mg.L-1 de casena, 14 mg.L-1 de banha de porco e 1,2 mg.L-1
de sacarose ( log de URL = 2,03) foi menor ( p<0,5) do que o encontrado na mesma
combinao adicionada de S. carnosus (log de URL= 3,13), portanto um aumento de

contendo de 5,4x104 CDM.mL-1 de S. carnosus (log de URL = 3,79), a combinao


contendo 7,0 mg.L-1 de casena, 14 mg.L-1 de banha de porco e 1,2 mg.L-1 de sacarose
apresentou um log URL cerca de 57 vezes menor ( 2,03).
Nas suspenses de esporos de B. subtilis adicionadas de substncias orgnicas,
no se observou diferena significativa (p<0,05) na medida de URL (log = 2,09), em
comparao com a combinao contendo 7,0 mg.L-1 de casena, 14 mg.L-1 de banha
de porco e 1,2 mg.L-1 de sacarose (log = 2,03) (Tabela 5).

6.1.4. Substncias Orgnicas versus Tcnica do ATP-bioluminescncia


Pode-se afirmar que, em termos objetivos e prticos, a interferncia das substncias orgnicas na medida de ATP-bioluminescncia para determinar as condies
higinicas de superfcies de processamento pouco relevante. Essa afirmativa
verdadeira desde que, de acordo com as proposies do fabricante do equipamento
de bioluminescncia, caso as amostras analisadas fossem oriundas de coletas realizadas em superfcies de processamento de alimentos, os resultados indicariam que
as superfcies estariam em condies higinicas satisfatrias, com valores de log de
URL abaixo de 2,18.

6.1.5. Microrganismos versus Tcnica do ATP-bioluminescncia

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

aproximadamente 12 vezes na medida de bioluminescncia. Comparada suspenso

Apesar de as suspenses de microrganismos estarem em concentraes microbianas prximas (5,4x104 UFC.mL-1 de S. carnosus e 2,9x104 UFC.mL-1 de esporos
de B. subtilis), a diferena na medida de URL pode ser explicada, levando-se em

381

considerao o contedo intracelular de ATP das clulas vegetativas e dos esporos


bacterianos. Os esporos, por estarem em um estado criptobitico, no apresentam
metabolismo e, por isso, tm baixos nveis de ATP e ausncia de transporte de
eltrons. Esses fatores levam a uma reduzida leitura na medida de URL. Kodaka et
al. (1996) determinaram uma concentrao 10-17mol de ATP por clula vegetativa e
de 10-21 mol de ATP por esporo. Isso significa que a concentrao de ATP do esporo
bacteriano 10.000 vezes menor. Dessa forma, os valores do LURL acima de 2,48
(300 URL) na suspenso de S. carnosus indicariam condies higinicas insatisfatrias, se as amostras analisadas fossem oriundas de coletas realizadas nas superfcies
de processamento. J os log dos valores de URL nas suspenses de esporos de B.
subtilis foram abaixo de 2,18 (<150 URL), significando, seguindo o mesmo raciocnio, que se as amostras fossem de uma superfcie para processamento, elas estariam em condies higinicas satisfatrias. Assim, uma superfcie com contagem
elevada de esporos seria aprovada para o processamento de alimentos pela tcnica

cap.09

do ATP-bioluminescncia.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

6.1.6. Substncias Orgnicas Adicionadas de Microrganismos versus a Tcnica do


ATP bioluminescncia
Observando os valores do LURL dos testes com uma substncia orgnica combinada ou no com os microrganismos, constatam-se possveis interaes entre a
bactria e as substncias afetando a leitura da bioluminescncia. Richardson et al.
(1980), estudando a distribuio desses nucleotdeos no leite bovino, constataram
a possibilidade de associao de molculas de ATP com a casena, impedindo-o de
reagir com o complexo luciferina/luciferase. Nesse experimento, observou-se que
a menor concentrao de casena apresentou maior nmero de URL. Na banha de
porco, o resultado foi inconsistente, pois o nmero de URL foi menor na concentrao intermediria (14 mg.L-1 de banha de porco). No se observou interferncia nas
suspenses de sacarose e no microrganismo, que no apresentaram alteraes no
nmero de URL nas diferentes concentraes da substncia.
A interferncia da amostra na medida de bioluminescncia foi relatada por Webster et al. (1988), quando determinaram a concentrao de ATP microbiano em
amostras de leite cru. Segundo esses autores, a medida de URL foi afetada devido
absoro e disperso da luz formada na reao do ATP com o sistema enzimtico luciferase/luciferina pelo material coloidal da amostra. Isso poderia acontecer em um
sistema semelhante, como o usado neste estudo, que consistiu em combinaes de
gordura, protena, carboidrato e microrganismos. Tambm, Baker et al. (1992) citaram que a leitura da luz emitida aps a reao de bioluminescncia pode ser afetada
pela turbidez e cor da amostra.

382

O nmero de URL na suspenso contendo apenas clula vegetativa foi sempre


maior do que qualquer suspenso/soluo contendo apenas substncias orgnicas,
isoladas ou em combinaes, sendo os valores do log de URL, em alguns casos,
duas vezes maiores. A presena do microrganismo na combinao com as substncias orgnicas acrescentou uma quantidade grande de ATP suspenso/soluo,
nivelando a concentrao do nucleotdeo em uma faixa de valores elevados, proporcionando a deteco do nmero de URL similar. Isso mostra, mais uma vez, a
pouca interferncia das substncias orgnicas na bioluminescncia das suspenses
avaliadas. A presena destas em suspenses contendo uma fonte grande de ATP
no foi suficiente para que fosse detectada qualquer diferena no nmero de URL.
Considerando o valor de log de URL de 2,18, proposto pelo fabricante do equipamento usado no experimento, tm-se as seguintes concluses:
As suspenses contendo as substncias orgnicas isoladas ou em associao
ou, ainda, adicionadas de esporos de Bacillus subtilis, caso fossem oriundas de superfcies de processamento de alimentos, indicariam que elas estariam em condies
higinicas satisfatrias, podendo, assim, originar resultados falsos negativos.

sacarose, isoladamente ou em combinaes, caso fossem oriundas de superfcies


de processamento de alimentos indicariam que elas estariam em condies higinicas insatisfatrias.
A tcnica pode ser usada como ferramenta auxiliar no monitoramento de procedimentos de higienizao desde que seja associada a outros mtodos, como contagem
microbiana. Essa tcnica deve ser usada com cuidado, e o significado dos resultados
das anlises deve ser corretamente entendido pelos profissionais que utilizam essa
metodologia na avaliao das superfcies que entram em contato com alimentos.

6.2. Interferncia de Substncias e Microrganismos Aderidos ao Ao


Inoxidvel AISI 304, n4
6.2.1. Substncias Orgnicas Aderidas Superfcie
No Quadro 19 so apresentados a mdia e o desvio-padro dos logaritmos
decimais do nmero de URL das combinaes avaliadas.
Quadro 19 - Mdia e desvio-padro dos logaritmos decimais do nmero
de Unidades Relativas de Luz de substncias orgnicas aderidas ao ao
inoxidvel. Mdia de trs repeties

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

As suspenses de S. carnosus adicionadas de casena, banha de porco ou

383

Segundo as recomendaes do fabricante do luminmetro, superfcies de processamento de alimentos so consideradas em condies higinicas insatisfatrias
quando o log10URL for maior que 2,48. Quando esse valor estiver abaixo de 2,18
significa que as condies so satisfatrias. Porm, quando o logaritmo do nmero
de URL estiver entre esses dois valores significa condio de alerta.
Nas condies deste experimento, todas as superfcies seriam consideradas
em condies higinicas satisfatrias, estando aptas ao processamento de alimentos, uma vez que os resultados com a tcnica de ATP-bioluminescncia ficaram abaixo do limite de URL de 2,18.

6.2.2. Microrganismos e a Medida de ATP-bioluminescncia


No Quadro 20, tem-se uma sntese da pesquisa que avaliou a interferncia de

cap.09

microrganismos aderidos ao ao inoxidvel na medida do ATP-bioluminescncia.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


384

Quadro 20 - Sntese da pesquisa que avaliou a interferncia de microrganismos ssseis na


medida do ATP-bioluminescncia

As medidas de URL para suspenses de S. carnosus foram maiores (p<0,01)


que aquelas obtidas nas suspenses com esporos de B. subtilis, conforme o teste t
de Student. Os valores do logaritmo de URL atingiram 3,79 nas clulas vegetativas e
1,95 nos esporos bacterianos. Apesar de as suspenses estarem em concentraes
prximas, essa diferena pode ser explicada, levando-se em considerao a diferena no contedo intracelular de ATP entre clulas vegetativas e esporos bacterianos.
Os esporos bacterianos, por estarem em um estado criptobitico, no apresentam
metabolismo, o que acarreta baixos nveis de ATP e ausncia de transporte de eltrons (BAKER et al., 1992; AKUTSU, 2001), fatores que levam a uma reduzida leitura
na medida de URL.
Kodaka et al. (1996) determinaram uma concentrao 10-17mol de ATP por clula
vegetativa e de 10-21 mol de ATP por esporo, significando que a concentrao de
ATP do esporo bacteriano 10.000 vezes menor. Essa explicao tambm pode
ser aplicada diferena (p<0,01) da medida de URL entre suspenses contendo
casena, lipdeo e sacarose adicionadas de 5,4 x 104 CDM.mL-1 de S. carnosus, cujo
logaritmo de URL atingiu o valor de 3,23 log10URL e adicionada de 2,9 x 104 CDM.
mL-1 de esporos de B. subtilis, com logaritmo de URL de 2,09 .
Observa-se, na Figura 4, que h aumento na medida de URL quando se
eleva a concentrao de microrganismos para as suspenses de S. carnosus ou
esporos de B. subtilis, aderidas ao ao inoxidvel, resultado que foi confirmado
com o teste de Duncan, realizado com as mdias de cada um dos tratamentos,
a 5% de probabilidade. Observa-se ainda, nessa figura, que as medidas de URL
foram maiores nas suspenses contendo clulas vegetativas do que nas que
possuam esporos bacterianos, assim como j havia sido verificado para as suspenses no aderidas. A diferena no contedo intracelular de ATP entre clulas
vegetativas e esporos bacterianos pode ser a explicao para as menores medidas de URL determinadas nos esporos.
Em concluso, constatou-se maior medida de URL na suspenso contendo
5,4x104 CDM.mL-1 de Staphylococcus carnosus, com logaritmo de URL de 3,79, em
relao quela que continha 2,9x104 CDM.mL-1 de esporos de Bacillus subtilis, cujo

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

logaritmo de URL foi de 1,95. No que se refere s suspenses de clulas vegetativas ou esporo bacteriano aderidas ao ao inoxidvel, adicionadas ou no das trs
substncias orgnicas, pode-se fazer a mesma constatao para qualquer uma das
concentraes microbianas analisadas, ou seja, as medidas de URL nas clulas vegetativas foram sempre maiores que nos esporos bacterianos.

385

Figura 4 - Logaritmo decimal do nmero de Unidades Relativas de Luz de suspenses


de microrganismos, adicionadas ou no de trs substncias orgnicas, aderidas ao ao.

Concluso
A tcnica do ATP-bioluminescncia no estgio atual pode ser usada como ferramenta auxiliar no monitoramento de procedimentos de higienizao desde que
seja associada a outros mtodos, como contagem microbiana. Esta tcnica deve
ser usada com cuidado, e o significado dos resultados das anlises deve ser corretamente entendido pelos profissionais que utilizam essa metodologia na avaliao
cap.09

das superfcies que entram contato com alimentos.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Referncias
ADAMS, M. R.; HOPE, C. F. A. Rapid methods in food microbiology. Holanda: Elservier, 1989. 330
p., 26 v.
AKUTSU, C.K. Adeso de esporos de Bacillus sporothermodurans ao ao inoxidvel e sua resistncia a sanificantes qumicos em condies de uso simulado. Viosa, MG: UFV. 2001. 65 f. Dissertao
(Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade Federal de Viosa. Viosa.
BAKER, J. M.; GRIFFITHS, M. W.; COLLINS-THOMPSON, D. L. Bacterial bioluminescence: applications
in food microbiology. Journal Food Protection, Des Moines, v. 55, n. 1, p. 62-70, 1992.
BARRICHELLO, A.; ALLIL, M. C. A. Bioluminescncia: uma nova ferramenta para tornar o controle
microbiolgico mais rpido, fcil e preciso. Rev. Inst. Lat. Cndido Tostes, Juiz de Fora, v. 52, n. 300,
p. 71-79, 1997.
BIOTRACE. BIOTRACE Xcel. [S.I]. 2000. 140p (Manual tcnico).
BRASIL. Leis, Decretos etc. Portaria n36, de 19 de janeiro de 1990, Normas e padro de potabilidade
da gua destinada ao consumo humano. Dirio Oficial (da Repblica Federativa do Brasil), Braslia,
v. 18, n.16, p.1651-1654, 23 jan. 1990. Seo 1.
BRASIL, Leis, Decretos, etc. Portaria n 518 de 25 de maro de 2004, Procedimentos e responsabilidades relativos ao controle e vigilncia da qualidade da gua para consumo humano e seu padro de
potabilidade. Dirio Oficial (da Repblica Federativa do Brasil), Braslia, v. 59, p. 266 - 270, 26 mar.
2004.Seo 1.
BRASIL. Leis, Decretos, etc... Resoluo CONAMA n357, de 17 de maro de 2005, Classificao
dos corpos de gua e diretrizes ambientais para o seu enquadramento, bem como estabelece as
condies e padres de lanamento de efluentes. Dirio Oficial (da Repblica Federativa do Brasil),
Braslia, n. 53, p. 58- 63, 18 mar. 2005. Seo 1.
COLQUHOUN, K. O.; TIMMS, S.; FRICKER, C. R. A Simple method for the comparison of commercially available ATP hygiene-monitoring systems. Journal of Food Protection. Des Moines, v. 61, n.
4, 1998.p.499-501.

386

CORBITT, A. J.; BENNION, N.; FORSYTHE, S. J. Adenylate kinase amplification of ATP bioluminescence for higiene monitoring in the food and beverage industry. Letters in Applied Microbiology, v.
30, p. 443-447, 2000.
COSTA, P. D. Avaliao da tcnica de ATP-bioluminescncia no controle do procedimento de higienizao na indstria de laticnios. Viosa, MG: UFV, 2001. 63 f. Dissertao (Mestrado em Cincia
e Tecnologia de Alimentos) Departamento de Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal de
Viosa, Viosa.
COSTA P. D.; ANDRADE, N. J.; SOARES, N. F.; BRANDO, S. C. C. ATP-bioluminescence assay as
an alternative for hygiene-monitoring procedures of stainless steel milk contact surfaces. Brazilian
Journal of Microbiology, v. 37 p. 345-349, 2006.
CROMBRUGGE, V.; WAES, G. Methods for assessing the bacteriological quality raw milk from the
farm. ATP method. Bulletin of the International Dairy Federation, n. 256, p. 53-60, 1991a.
CROMBRUGGE, V.; WAES, G. Methods for assessing the bacteriological quality raw milk from the
farm. Impedance method. Bulletin of the International Dairy Federation, n. 256, p. 41-44, 1991b.
DOUGLAS, C. W. I.; ROTHWELL, P. S. Evaluation of a hygiene monitor for detection of contamination
in dental surgeries. British Dental Journal, v. 170, p. 331-335, 1991.
DOWNES, F. P.; ITO, K. (Eds.). Compendium methods for the microbiological examination of foods.
4. ed. APHA, 2001. 676 p.
GIESE, J. H. Sanitation: the Key to food safety and public health. Food Technology, v. 45, n. 12, p.
74-80, 1991.
GMEZ, J. M. R. Applications of bioluminescence in the food industry. Alimentacin Equipos y Tecnologa, v. 62, p. 86-90, 1999.

GRIFFITHS, C. J.; COOPER, R. A.; GILMORE, J.; DAVIES, C.; LEWIS, M. An evaluation of hospital
cleaning regimes and standards. Journal of Hospital Infection, v. 45, p. 19-28, 2000.
GRIFFITHS, M. W. Applications of bioluminescence in the dairy industry. Journal Dairy Science, v. 76,
p. 3118-3125, 1993.
HAWRONSKYJ, J. M.; HOLAH, J. ATP universal hygiene monitor. Trends in Food Science and Technology, v. 8, p. 79-84, 1997.
KENNEDY Jr., J. E.; OBLINGER, J. L. Application of bioluminescence to rapid determination of microbial levels in ground beef. Journal of Food Protection, v. 48, n. 4, p. 334-340, 1985.
KODAKA, H.; FUKUDA, K.; MIZUOCHI, S.; HORIGOME, K. Adenosine triphosphate content of microrganisms related with food spoilage. Japanese Journal of Food Microbiology, v. 13, p. 29-34, 1996.
LILIEVELD, H. L.M..; MOSTERT, M. A.; HOLAH, J. Handbook of hygiene control in the food industry.
CRC Press, Cambrige, England, 720p, 2005
MURPHY, S. C.; KOZLOWSKI, S. M.; BLANDER, D. K.; BANDLER, D. K.; BOOR, K. J. Evaluation of
adenosine triphosphate-bioluminescence hygiene monitoring for trouble-shooting fluid milk shelf-life
problems. Journal of Food Science, v. 81, n. 3, p. 817-820, 1998.
RICHARDSON, T.; McGANN, T. C. A. ; KEARNEY, R. D. Levels and locations of adenosine 5-triphosphate in bovine milk. Journal of Dairy Research, 47:91-96, 1980
SIRAGUSA, G. R.; CUTTER, C. N. Microbial ATP bioluminescence as a means to detect contamination
on artificially contaminated beef carcass tissue. Journal of Food Protection, v. 58, p. 764-769, 1995.
SIMM, E. M. Interferncia de substncias orgnicas e microrganismos na tcnica de ATP-Bioluminescncia. Viosa, MG: UFV, 2004. 64 f. Dissertao (Mestrado em Cincia e Tecnologia de Alimentos) Universidade Federal de Viosa, Viosa.

A Tcnica de ATP-bioluminescncia na Avaliao e no Controle de Processos de


Adeso Microbiana na Indstria de Alimentos

GREEN, T. A.; RUSSEL, S. M.; FLETCHER, D. L. Effect of chemical cleaning agents and commercial sanitizers on ATP-bioluminescence measurements. Journal of Food Protection, v. 62, p. 86-90, 1999.

STANNARD, C. J.; WOOD, J. M. The rapid estimation of microbiology contamination of raw meat by
measurement of adenosine triphosphate. Jounal of Applied Bacteriology, v. 55, p. 429-438, 1983.
TYDRICH, L. New applications for ATP bioluminescence methods. Cereal Foods World. v. 41, n. 6, p.
463-465, 1996.

387

VELAZQUEZ, M.; FEIRTAG, J. M. Quenching and enhancement effects of ATP extractants, cleansers,
and sanitizers on the detection of the ATP bioluminescence signal. Journal of Food Protection. v. 60,
n. 7, p. 799-803, 1997.
ZOTTOLA, E. A. Special techiniques for studying microbial biofilms in food systems.In: TORTORELLO,
M. L.; GENDEL, S. M. Food microbiological anaysis- New technologies - Dekker, IFT Basic Symposia,

cap.09

Marcell , 1997. p. 315-346.

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10

1.

Introduo
1.1. Teste da Diluio de Uso
1.2. Teste de Suspenso
1.3. Teste do Coeficiente Fenlico
1.4. Teste de Capacidade
1.5 Teste de Ao Esporicida

2.

Avaliao da Resistncia de Enterococcus faecium Isolado de Leite


Cru aos Agentes Qumicos Sanitizantes
2.1. Avaliao pelo teste da diluio de uso
2.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso

3.

Eficincia do cido peractico Sobre Esporos de Bacillus sporothermodurans Avaliada pelos Testes de Diluio de Uso e de Suspenso
3.1. Avaliao pelo Teste da Diluio de Uso
3.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso
3.3. O teste de Suspenso versus o Teste da Diluio de Uso

4.

Modelagem Matemtica na Relao Tempo e Concentrao de cido


Peractico na Ao Esporicida Sobre Bacillus sporothermodurans

5.

Registro de Sanitizantes em rgos Governamentais


5.1. Informaes para Registro
5.2. Informaes para Avaliao dos Princpios Ativos
5.3. Rotulagem
5.4. Classificao de Riscos dos Sanitizantes

6.
7.
8.

Sanitizantes Aprovados no Brasil


Concluso
Referncias

Nlio Jos de Andrade


Roberta Torres Careli
Aurlia D. Oliveira Martins

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


390

Os testes laboratoriais padronizados so teis para a comparao da atividade


sanitizante de produtos, concentraes, tempos e temperaturas de contato,
entre outras variaes e condies.

1. Introduo
A avaliao da eficincia dos sanitizantes bastante complexa, principalmente em
razo dos inmeros fatores que podero afet-la. Assim, a natureza e tipo de superfcies
tratadas, a concentrao e natureza dos resduos a elas aderidos, o tipo de microbiota
contaminante na superfcie, a concentrao e o perodo de contato do sanitizante com
a superfcie so apenas algumas das variveis que podero afetar, em menor ou maior
grau, a eficincia dos sanitizantes. Dessa forma, evidente a importncia da realizao de
alguns testes que permitam a seleo de um produto ideal para as condies especficas
de uso na indstria de alimentos.
As comprovaes da eficincia microbiolgica dos sanitizantes qumicos so necessrias, e uma das formas de se confirmar isso por meio de testes laboratoriais, como os
de diluio de uso, de capacidade, de coeficiente fenlico, teste esporicida e de suspenso. Deve-se frisar que, na maioria das vezes, apenas a determinao do princpio ativo
dos produtos sanitizantes comerciais ou de suas solues diludas para uso rotineiro no
procedimento de higienizao no suficiente para definir a atividade antimicrobiana.
Produtos comerciais que originam solues sanitizantes com mesma concentrao do
princpio ativo podero apresentar eficincias diferentes sobre os microrganismos, mostrando necessidade de se avaliar a ao desses agentes diretamente sobre os microrganismos, usando-se metodologias adequadas.
No Quadro 1 so apresentadas as propriedades e aplicaes de substncias qumicas antimicrobianas na indstria de alimentos que causam injrias aos microrganismos.
Quadro 1. Propriedades e usos de substncias qumicas antimicrobianas de uso na indstria de
alimentos que causam injria em membranas celulares

cap.10

391

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


392

Os testes laboratoriais padronizados so teis para comparar a atividade de sanitizantes em vrios produtos e diluies, tempo de contato e temperatura, entre outras
variaes e condies. So esses os fatores que afetam a eficincia de sanitizantes
qumicos usados na indstria de alimentos: concentrao de uso; tipo e concentrao
de microrganismos; tipos e rugosidade das superfcies; concentrao e natureza dos
resduos; tempo de contato e temperatura de aplicao; e mtodo de higienizao.

1.1. Teste da Diluio de Uso


A diluio de uso, um teste laboratorial amplamente aceito, reconhecido como
rigoroso e bem padronizado, tem como principais objetivos determinar a maior diluio do sanitizante que ainda apresenta eficincia bactericida e avaliar as concentraes de sanitizantes recomendadas pelos fabricantes. Esse tipo de teste tem sido
recomendado nos Estados Unidos pela Environmental Protection Agency (EPA),
para registro e especificaes comerciais de sanitizantes.
Esse teste consiste em submeter clulas de Salmonella choleraesuis ATCC
10708, de Staphylococcus aureus ATCC 6538 e de Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442, aderidas s superfcies de cilindros de ao inoxidvel, ao de solues de
sanitizantes, sendo aprovadas aquelas que destrurem o organismo-teste aderido
em 59 cilindros de 60 avaliados, aps 10 min de contato temperatura de 20 C.
Como adaptao deste teste para a indstria de alimentos, sugere-se a aprovao
de sanitizantes que conseguirem destruir os microrganismos aderidos a 10 cilindros, nas mesmas condies de temperatura e tempo de contato.
No Quadro 2 esto sintetizadas as aplicaes, fundamentos e limitaes do
teste de diluio de uso.
Quadro 2 - Aplicaes, fundamentos e limitaes do teste de diluio de uso

Apesar de amplamente aceito, ainda so realizadas pesquisas com o objetivo


de melhorar a eficincia desse teste, na tentativa de padronizar o nmero de bactrias na superfcie do cilindro e usar outros cilindros alm do ao inoxidvel, como a
porcelana, o vidro, o alumnio e o polipropileno.

O teste de suspenso avalia a eficincia de sanitizantes na reduo de uma


populao microbiana em suspenso, sob condies prticas de uso, e recomendado pela AOAC para avaliar sanitizantes empregados em superfcies no porosas,
previamente limpas, que entram em contato com os alimentos.
Os resultados dos testes so apresentados na forma de nmero de redues
decimais (RD) na populao microbiana de Escherichia coli ATCC 11229 e de Staphylococcus aureus ATCC 6538, levando-se em conta o tempo de exposio e a
concentrao do sanitizante. O nmero de redues decimais a diferena entre
o logaritmo decimal do total de microrganismos na suspenso microbiana e o
logaritmo decimal de sobreviventes aps o contato com a soluo sanitizante.

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

1.2. Teste de Suspenso

Ser aprovado o sanitizante que assegurar reduo decimal superior ou igual a


5, que corresponde a uma reduo de cinco ciclos logartmicos ou 99,999 %, na
populao microbiana, aps 30 seg de exposio, a 20 C (Quadro 3). Os Quadros
4 e 5 indicam exemplos de resultados de testes de suspenso.
Quadro 3 - Fundamento, interpretao e limitao do teste de suspenso

393

cap.10

Quadro 4 - Exemplo de resultado do teste de suspenso

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Quadro 5 - Nmero de redues decimais na populao de esporos de Bacillus subtilis ATCC


16569

O uso de neutralizantes nos meios de subcultivos, aps o contato do microrganismo com o agente sanitizante, particularmente na metodologia do teste de suspenso, fundamental. A diluio e a neutralizao geralmente so as tcnicas preferidas para inativar os sanitizantes, podendo ser usados individualmente ou de forma
simultnea. Outra tcnica, embora menos usada, para inativar agentes qumicos
a lavagem das clulas microbianas, consistindo na inativao dos sanitizantes por
meio da centrifugao ou filtrao em membrana.
Em muitos mtodos, dilui-se a mistura dos sanitizantes mais o microrganismo
em soluo de agentes neutralizantes Considera-se que somente a diluio no

394

suficiente para suprimir a atividade residual da maioria dos agentes qumicos. Por
exemplo, os compostos de amnio quaternrio podem ter uma atividade bacteriosttica contra certas espcies mesmo em altas diluies.
A neutralizao corresponde a uma reao complexa ou simples. Por exemplo, ocorre uma neutralizao puramente qumica quando se usa tiossulfato de
sdio para controle residual de compostos iodados. No entanto, ocorrem reaes
mais complexas, quando os vrios neutralizantes reagem com partes lipoflicas
dos sanitizantes, inativando-os.
Dependendo das condies de teste, pode-se usar apenas um neutralizante
ou, s vezes, sugerida uma mistura de substncias. Para compostos clorados e
iodados, geralmente indicado o tiossulfato de sdio. Para compostos de quaternrio de amnio e clorohexidina, recomenda-se lecitina de ovo e Tween 80. Na
literatura recomendada uma soluo contendo vrios agentes neutralizantes, por
exemplo bissulfito de sdio, tiossulfato de sdio, tioglicolato de sdio, Tween 80 e
lecitina de soja, que poderia ser aplicada na maioria dos testes usados para avaliar
a eficincia do sanitizante.

O teste de coeficiente fenlico foi, praticamente, o primeiro a ser desenvolvido com o propsito de avaliar a eficincia dos sanitizantes. A metodologia
deste teste tem recebido vrias propostas de modificaes ao longo do tempo,
permanecendo em todos eles o fundamento bsico original: a comparao da
eficincia de sanitizante contra uma soluo-padro de fenol, ambas atuando
sobre clulas vegetativas de bactrias. um mtodo oficial preconizado pela
Association of Official Analitycal Chemists (AOAC).
O teste realizado sob condies rigidamente definidas. A AOAC recomenda como organismos de teste as culturas-teste de Pseudomonas aeruginosa ATCC
15442, Salmonella typhi ATCC 6539 e Staphylococcus aureus ATCC 6538. No Quadro 6, encontram-se resumidos o fundamento, a interpretao dos resultados e as

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1.3. Teste do Coeficiente Fenlico

limitaes do teste do coeficiente fenlico, enquanto no Quadro 7 mostrado um


exemplo de clculo de Coeficiente Fenlico (CF).
Quadro 6 - Fundamento, interpretao dos resultados e limitaes do teste do coeficiente
fenlico

395

cap.10

Quadro 7 - Exemplo de clculo do coeficiente fenlico

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Nesse exemplo, o coeficiente fenlico igual a 5, que determinado dividindo-se


o inverso da maior diluio do sanitizante que inativa o microrganismo em 10 min em
vez de 5 min pelo inverso da maior diluio do fenol, que conseguiu o mesmo resultado. Normalmente, aceita-se que a diluio de uso do sanitizante avaliado seja correspondente a 20 vezes o coeficiente fnolico determinado para Salmonella tiphy, sob as
condies do teste. Nesse caso, a diluio de uso proposta seria uma parte do sanitizante para 100 partes de gua, que corresponde a 100 mg.L-1 do produto comercial. Essa
diluio deve ser confirmada por outro teste, geralmente o de diluio de uso.

1.4. Teste de Capacidade


O teste de capacidade recomendado principalmente para avaliar a possibilidade de reutilizao de sanitizantes ou detergentes-sanitizantes, aps consecutivos contatos com microrganismos e matria orgnica. Consiste em adicionar determinada
quantidade de inculo soluo sanitizante a ser testado e, aps o contato desejado,
normalmente 1 min, transferir para o meio de subcultivo com inativador do agente
qumico. Depois de 30 seg da primeira exposio, adicionar outra quantidade de inculo na mesma soluo sanitizante, inativando-se aps o tempo de contato desejado,
por exemplo 1 min. O processo se repete, atingindo-se 10 adies consecutivas. Ser
aprovada no teste a diluio que apresentar crescimento microbiano em no mximo
quatro tubos de subcultivo. No exemplo dos Quadros 8 e 9 mostrada uma soluo
sanitizante aprovada, contendo 40 mg.L-1.
Quadro 8 - Descrio de um teste de capacidade

396

Quadro 9 - Exemplo de resultado do teste de capacidade

O teste esporicida aplicvel a substncias qumicas lquidas e gasosas,


por meio do qual se constata ausncia ou a presena da atividade esporicida.
Consiste em submeter esporos de Bacillus subtilis ATCC 19659 e Clostridium
sporogenes ATCC 1584, previamente secos e aderidos a cilindros de porcelana
com 8 + 1 mm de dimetro externo, 6 + 1 mm de dimetro interno e 10 + 1 mm
de comprimento, s solues dos agentes qumicos. Para ser classificado como
esporicida, o agente qumico na concentrao, no tempo de contato recomendado e em outras condies avaliadas, deve eliminar os esporos em 118 dos 120
cilindros testados, metade deles com Bacillus subtilis e outra metade com Clostridium sporogenes. Quando o agente qumico consegue eliminar os esporos em
todos os cilindros, classificado como esterilizante.
Vrias pesquisas tm sido realizadas para avaliar a resistncia de microrganismos a agentes qumicos sanitizantes, sendo algumas delas sintetizadas a seguir.

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

1.5 Teste de Ao Esporicida

2. Avaliao da Resistncia de Enterococcus faecium Isolado de


Leite Cru aos Agentes Qumicos Sanitizantes
No Quadro 10 mostrada uma sntese de pesquisa em que se estudou a resistncia de Enterococcus faecium a agentes sanitizantes.
Quadro 10 - Sntese de pesquisa que avaliou a resistncia de Enterococcus faecium a agentes
sanitizantes (Fonte: OVIEDO, 1996).
397

2.1. Avaliao pelo teste da diluio de uso

cap.10

Com base no fundamento do teste de diluio de uso, os resultados desse


experimento mostraram que somente o hipoclorito de sdio e o quaternrio de
amnio alcalino foram aprovados nas condies avaliadas, conforme mostrado na
Figura 1.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

Figura 1 - Porcentual de tubos negativos no teste da diluio de uso para Enterococcus faecium, pela ao
de agentes sanitizantes.

Verificou-se que o hipoclorito de sdio foi mais eficiente do que o dicloroisocianurato de sdio e existe explicao para essa diferena de ao bactericida.
Sabe-se que o cido hipocloroso (HClO), forma no dissociada, liberado em soluo
aquosa, o responsvel pela ao bactericida de ambos os compostos, conforme as
equaes qumicas 1 e 2. No entanto, o hipoclorito de sdio, por ser um composto
inorgnico, hidrolisa-se mais rapidamente em soluo aquosa do que o dicloroisocianurato de sdio. Este ltimo pertence classe dos compostos clorados orgni-

398

cos, sendo quimicamente uma cloramina, cujo uso est em expanso no Brasil.

O cido dicloroisocianrico apresenta uma estrutura qumica em que a liberao do HClO dependente da inter-relao da concentrao e do pH da soluo
sanitizante e do pKa do cido hipocloroso (Eq. 3). Nesse experimento, foram usadas solues de hipoclorito de sdio contendo 100 mg.L-1 de cloro residual livre
(CRL), em pH 8,0, e sal do cido dicloroisocianrico (dicloroisocianurato de sdio)
contendo 150 mg.L-1 de CRL em pH 8,4. Usando a equao 3, determinam-se as
concentraes de 24 mg.L-1 e 19 mg.L-1 de HClO nas solues de hipoclorito e de
diclorocianurato. Assim, a liberao mais rpida e a maior concentrao de HClO na
soluo preparada a partir do hipoclorito de sdio explicam sua maior eficincia.

compostos clorados na indstria de alimentos. Dentre outros aspectos, necessrio


saber se trata de composto orgnico ou inorgnico; conhecer a concentrao do
princpio ativo, facilmente determinado por titulao iodomtrica, associada aos valores de pH; e armazenar os produtos comerciais sob condies adequadas, isto ,
em recipientes escuros, bem fechados, em locais bem ventilados e de temperatura
baixa, sendo os clorados inorgnicos mais instveis ao armazenamento.
Formulaes que tm cido peractico como princpio ativo so constitudas
de uma mistura estabilizada, contendo, ainda, perxido de hidrognio e cido acti-

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

Esse resultado indica a importncia dos cuidados que se deve ter no uso de

co, alm de um veculo estabilizante em equilbrio, conforme equao 4.

Essas formulaes so instveis ao armazenamento, txicas aos manipuladores e corrosivas a diversas superfcies. Portanto, para assegurar eficincia do uso
desse sanitizante nas indstrias de alimentos necessrio o controle da concentrao do princpio ativo, assim como cuidados na manipulao e no armazenamento,
sendo fundamental avaliar sua atividade microbicida.

399

No experimento, pode-se considerar que o produto comercial de extrato de


semente de grape fruit no apresentou eficincia contra o Enterococcus faecium.
No entanto, nessa concentrao esse produto tem sido preconizado em diversas
aplicaes nas indstrias de alimentos. Sugere-se seu uso na sanitizao de equipamentos, utenslios, ambientes e tambm na reduo da microbiota das mos de
manipuladores de alimentos. Segundo os responsveis pela comercializao desse
extrato vegetal, um produto com atividade antimicrobiana excelente e registrado
no Food and Drug Administration/USA (FDA) e no Ministrio da Sade no Brasil.
Deve-se ressaltar que os resultados obtidos com os iodforos foram inesperados, em comparao com os da literatura. Normalmente, as informaes disponveis
sugerem que os compostos iodados so eficientes contra bactrias Gram-positivas
e Gram-negativas. No entanto, so relativamente eficientes contra fungos filamento-

cap.10

sos e leveduras e de baixa eficincia contra bacterifagos e esporos bacterianos.

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2.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso


A Figura 2 apresenta resultados da avaliao de diversos sanitizantes pelo
teste de suspenso, realizada por Oviedo (1996). Verifica-se que as solues de
hipoclorito de sdio e cido peractico que obtiveram 7,4 RD e a de dicloroisocianurato de sdio, que obteve 6,5 RD, foram aprovadas, considerando-se que esse
teste laboratorial preconiza valores iguais ou superior a 5 RD em 30 seg de contato
para aprovao.

Figura 2 - Nmeros de redues decimais obtidos no teste de suspenso do Enterococcus faecium.


400

3. Eficincia do cido Peractico sobre Esporos de


Bacillus sporothermodurans Avaliada pelos Testes de Diluio
de Uso e de Suspenso
O Quadro 11 sintetiza a pesquisa que avaliou a eficincia do cido peractico
sobre esporos de Bacillus sporothermodurans.
Quadro 11 - Sntese de pesquisa que avaliou a eficincia do cido peractico sobre esporos de
Bacillus sporothermodurans (Fonte: Martins, 2001)

Neste experimento, verificou-se que a adeso dos esporos de Bacillus sporothermodurans nos cilindros de ao inoxidvel, utilizados para o teste de diluio
de uso, aumentou com o tempo (Quadro 12). Aps 30 min de contato, o nmero
de esporos aderidos foi de 4,3x103 UFC.cilindro-1. Esses valores atingiram 5,1x104
e 9,1x104 UFC.cilindro-1 nos tempos de adeso de 12 h a 24 h, e em funo desses
resultados foi definido o tempo de adeso de 24 h, para efetuar os experimentos
relativos ao esporicida do cido peractico.
Quadro 12 - Nmero de esporos de Bacillus sporothermodurans (UFC) aderidos a cilindros de
ao inoxidvel, temperatura de 25 C, em funo do tempo de contato

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

3.1. Avaliao pelo Teste da Diluio de Uso

Pode-se considerar que o nmero de esporos aderidos aps 24 h satisfatrio


para a realizao do teste de diluio de uso. Nesse tempo, foi obtido maior nmero
de esporos aderidos ao ao inoxidvel, melhorando a resposta sobre a avaliao
esporicida do cido peractico. Embora no tenha ocorrido um processo de formao de um biofilme, o nmero encontrado no cilindro caracteriza um processo de
adeso bem estabelecido.
Avaliou-se tambm a eficincia de concentraes diferentes de cido peractico a determinadas temperaturas sobre os esporos de Bacillus sporothermodurans em funo do tempo de contato. O Quadro 13 mostra os valores experimentais das concentraes de cido peractico em mg.L-1, em que se obtm
aprovao pelo teste de diluio de uso.

401

cap.10

Quadro 13 - Concentraes de cido peractico e tempos de contato aprovados a diferentes


temperaturas no teste de diluio de uso sobre esporos de Bacillus sporothermodurans

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos


402

Conforme esperado, houve diminuio na concentrao do agente esporicida


com o aumento do tempo de contato, para aprovao no teste de diluio de uso.
No entanto, os valores encontrados estavam acima daqueles recomendados pelo
fabricante, que se situam entre 50 e 60 mg.L-1 de cido peractico.
Esses dados indicam a importncia de se determinar o princpio ativo nas solues comerciais e nas solues diludas de cido peractico, determinao de fcil
execuo e de grande importncia para o controle da higienizao numa indstria
de alimentos. Uma vez determinado de forma inadequada, o sanitizante pode ser
utilizado em concentraes abaixo das recomendadas, acarretando sanitizao ineficiente e possvel contaminao do produto alimentcio durante o processamento,
podendo reduzir a vida de prateleira do produto e, ou, colocar em risco a sade do
consumidor. Em contrapartida, sanitizantes usados em concentraes acima das recomendadas podem causar danos, como corroso, nos equipamentos e tubulaes
de uma indstria, alm de tornar o procedimento de sanitizao antieconmico.

3.2. Avaliao pelo Teste de Suspenso


Para o teste de suspenso, utilizou-se uma metodologia adaptada, em que os
esporos foram aderidos a cupons de ao inoxidvel. Verificou-se que a soluo sanitizante contendo 60 mg.L-1 de cido peractico, em pH 3,3, temperatura de 25 C e
tempo de contato de 10 min, apresentou atividade esporicida nas suspenses de B.
sporothermodurans em todos os tempos de adeso avaliados em seu experimento
de acordo com o Quadro 14. Por exemplo, para 24 h de adeso, a soluo sanitizante em 10 min de contato obteve 4,18 RD, ou seja, uma reduo de 4,18 ciclos
logartmicos na populao do esporo.
Quadro 14 - Redues decimais nos esporos de Bacillus sporothermodurans aderidos a cupons
de ao inoxidvel, AISI 304, aps ao de 60 mg.L-1 de cido peractico, pH 3,3 a 25 C, em 10
min de contato com o sanitizante e aps diferentes tempos de adeso

H controvrsias quanto ao nmero de redues decimais na populao de


esporos que define se uma soluo sanitizante eficiente ou no quando avaliado
pelo teste de suspenso. Esse nmero somente bem-estabelecido para clulas
vegetativas de Escherichia coli ATCC 11229 e de Staphylococcus aureus ATCC 6538,
em que se recomendam 5 RD na populao desses microrganismos aps a ao do
sanitizante, em 30 seg de contato a 20 C, para clulas planctnicas, ou seja, no aderidas a superfcies. Sugere-se que um sanitizante seja considerado esporicida, se atingir 3
RD em 30 min de contato, a 20 C, quando os microrganismos esto aderidos.

3.3. O teste de Suspenso versus o Teste da Diluio de Uso


As informaes sobre os experimentos realizados com testes de diluio de
uso e de suspenso sugerem que os resultados desses testes laboratoriais devem
ser usados com cuidado. Esses testes so recomendados e utilizados para avaliar
a eficincia microbiolgica dos sanitizantes qumicos, no entanto so metodologias
cujos fundamentos bsicos so bastante diferentes. Por exemplo, no teste da diluio de uso exige-se eliminao completa dos microrganismos aderidos a cilindros
de ao inoxidvel, quando se sabe que as suspenses usadas nos processos de
adeso geralmente podem ter microrganismos com resistncias qumicas diferentes, podendo interferir nos resultados. Deve se ressaltar que essa metodologia
recomendada pela Agncia de Proteo Ambiental (EPA) dos Estados Unidos e pela
Portaria 15/88 do Ministrio da Sade para avaliao da atividade antimicrobiana de
sanitizantes para fins de registro.

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

Constatou-se que, medida que aumentou o nmero de esporos aderidos, a eficincia do sanitizante foi mais elevada, o que pode ser explicado pela microtopografia
da superfcie de ao inoxidvel, que observada pela microscopia eletrnica de varredura, por exemplo, apresenta fendas e ranhuras. Assim, a capacidade de proteo da
superfcie ser maior quando o nmero de esporos for menor, considerando-se que
essa capacidade ser limitada.

No teste da suspenso, enumeram-se os sobreviventes, no exigindo,


portanto, a eliminao completa dos microrganismos que no esto aderidos a
nenhum suporte, sendo um teste amplamente aceito nos pases europeus.
Apesar de apresentarem metodologias bem-estabelecidas, a execuo
desses testes no simples, havendo possibilidade de ocorrerem erros em
razo das diversas etapas de execuo, como no preparo das solues sanitizantes e das suspenses dos microrganismos, nos processos de adeso dos
microrganismos no teste da diluio de uso e de neutralizao no teste da
suspenso nos meios de cultura usados, dentre outros.

403

Os resultados desses testes para aplicao na indstria de alimentos devem ser


avaliados com precauo, sendo, no entanto, teis para orientar quanto eficincia
bactericida dos sanitizantes usados nos procedimentos de higienizao.

4. Modelagem Matemtica na Relao Tempo e Concentrao


de cido Peractico na Ao Esporicida sobre Bacillus
sporothermodurans

cap.10

A aplicao de um modelo matemtico para relacionar o tempo e a concentrao na ao esporicida do cido peractico mostrada a seguir.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

No Quadro 15, encontram-se as equaes de regresso linear do logaritmo do


tempo em funo da concentrao de cido peractico nas temperaturas de 4 C, 25
C e 40 C, em que no h esporos sobreviventes.
Quadro 15 - Regresso linear do logaritmo do tempo de contato (min) em funo da concentrao de cido peractico nas temperaturas de 4 C, 25 C e 40 C, em que no h esporos
sobreviventes, determinada pelo teste da diluio de uso

A Figura 3 apresenta a relao entre o log10 do tempo de contato em funo


da concentrao de cido peractico, estimada pelas equaes apresentadas no
Quadro 15, nas temperaturas de 4 C, 25 C e 40 C.

404

Figura 3 - Logaritmo do tempo de contato (min) em funo da concentrao de cido peractico, em que no
h esporos sobreviventes, determinada pelo teste da diluio de uso nas temperaturas de 4 C, 25 C e 40 C.

Dessas equaes foram obtidos os valores de Z, de acordo com o modelo


T = Tr . 10Cr-C/Z, sendo Z a variao na concentrao de cido peractico necessria
para reduzir em 90% o valor do tempo de contato, sob as condies testadas.
De acordo com o modelo apresentado, Z ser o inverso da inclinao da curva, ou:

cido peractico, nas temperaturas de 4 C, 25 C e 40 C, respectivamente.


A partir dos valores de Z, podem-se determinar equaes que associam
tempo de contato e concentrao, nas temperaturas utilizadas no experimento
(Quadro 16).
Quadro 16 - Relao tempo de contato de 10 min e concentrao na ao esporicida de cido
peractico (APA)

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

Desse modo, foram determinados os valores Z iguais a 256, 263 e 149 mg.L-1 de

Por exemplo, para um tempo de contato de 20 min a 4 C, a concentrao de


cido peractico determinada pela equao de 363 mg.L-1, para que no haja esporos sobreviventes. No entanto, se a concentrao utilizada do sanitizante for de 110
mg.L-1 de cido peractico, o tempo de contato a 40 C determinado pela equao
ser de 13 min.
A determinao dessas equaes de importncia para o monitoramento do
binmio tempo/concentrao para sanitizao na indstria de alimentos. Se houver,
por exemplo, alguma falha em relao concentrao na etapa de sanitizao, com

405

equaes desse tipo possvel determinar o tempo necessrio para se obter higienizao adequada.

5 . Registro de Sanitizantes em rgos Governamentais


No Brasil, o Instituto Nacional de Qualidade em Sade (INCQS), da Fundao
Oswaldo Cruz, do Ministrio da Sade, a rede de laboratrios do Ministrio da Agricultura (MAPA) e alguns outros laboratrios credenciados para esse fim so responsveis pela avaliao laboratorial da eficincia microbiolgica de sanitizantes. Os
produtos aprovados so liberados para comercializao, aps registro na Diviso
de Saneantes Dominissanitrios (DISAD). O INCQS segue as metodologias utilizadas pela Environmental Protection Agency (EPA/USA) e propostas pela AOAC. Os
sanitizantes so registrados e autorizados para uso, mediante a comprovao de
sua eficcia aos fins propostos, atravs de anlise prvia realizada com o produto
cap.10

acabado e nas diluies de uso indicadas pelo fabricante.

Nlio Jos de Andrade Higiene na indstria de alimentos

5.1. Informaes para Registro


Para registro no Ministrio da Sade, uma srie de informaes sobre dados
gerais do produto, produo e controle, dados fsicos e qumicos e dados complementares deve ser fornecida s autoridades competentes. Entre os dados gerais,
so exigidos: i) marca do produto, ii) classe de uso, iii) estado fsico, iv) embalagem,
v) finalidade e instrues de uso, vi) limitaes de uso e incompatibilidades, vii)
prazo de validade e viii) cuidados para a conservao.
Com relao produo e controle, h necessidade de se informar a frmula
completa, indicando os princpios ativos e demais componentes, relacionados pelos
nomes tcnicos ou qumicos, em porcentagem peso/peso, peso/volume ou volume/
volume. Alm disso, devem-se descrever o processo de fabricao, o mtodo para
controle qumico dos princpios ativos e adjuvantes relevantes no produto acabado
e laudo de anlise prvia.
obrigatria tambm a informao sobre dados qumicos e fsicos do
produto, como a frmula estrutural dos princpios ativos, a densidade da formulao ou peso especfico, o pH da formulao e da soluo de uso proposta,
a inflamabilidade e a corrosividade. Ainda, devem ser fornecidos s autoridades,
para fins de registro, vrios dados complementares, como inscrio dos componentes da frmula em compndios oficiais ou publicaes de valor cientfico, finalidade
de cada componente da frmula e dados toxicolgicos. E tambm dados sobre
compatibilidade qumica entre embalagem e a formulao, condies ideais para
transporte e armazenamento e outros elementos, inclusive os de causa e efeito,

406

quando julgados necessrios para a correta avaliao do pedido de registro.

5.2. Informaes para Avaliao dos Princpios Ativos


Para avaliao, pela autoridade competente, dos princpios ativos dos produtos sanitizantes a serem registrados devem ser informados:
1. Os nomes qumico e tcnico que devem ser aprovados por entidade internacional.
2. A frmula estrutural, a frmula bruta.
3. A classe de uso.
4. O grau de pureza, a identidade e o teor de impurezas, a toxicidade das impurezas.
5. A densidade e o peso especfico.
6. O ponto de fuso ou ebulio.
7. A presso de vapor.
8. Solubilidade em gua e solventes orgnicos.
9. O pH do produto tcnico ou de soluo a 1%.
10. O estado fsico.

12. A descrio do mtodo de identificao e qualificao qumica.


13. A inflamabilidade.
14. O grupo qumico.
15. O mtodo para destruio e inativao, em casos de acidentes com o meio ambiente.
16. As condies ideais de transporte e armazenagem.
17. Os dados toxicolgicos.
18. A degradao no meio ambiente, relacionada a biodegradao, fotoacumulao e
termoacumulao, meia-vida no ambiente e bioacumulao na cadeia alimentar e eficcia alimentar.

5.3 Rotulagem

Avaliao Laboratorial de Sanitizantes Qumicos

11. As caractersticas sensoriais, como cor e odor.

A informaes contidas nos rtulos dos produtos sanitizantes de grande importncia para o uso correto na indstria de alimentos. Essa rotulagem definida
pela legislao, conforme Portaria n 15/88 do MS. No painel principal da embalagem, deve constar:
1. O nome do produto.
2. A classificao.
3. As frases relacionadas com a classe de risco, restries de uso, se hospitalar, veterinrio, indstria de alimentos ou profissional.
4. Modo de usar, diluio de uso, tempo de contato, sendo, por exemplo para a indstria
de alimentos, esse tempo geralmente de 10 min.
5. As limitaes de uso.

407

6. Os cuidados para a conservao - sensibilidade ao calor, umidade e luz solar.


7. Os princpio ativo, incluindo nomes qumicos ou tcnicos e os respectivos teores.
8. As frases de advertncia e de primeiro socorros. obrigatrio que conste do rtulo a
frase Antes de usar, leia as instrues do rtulo.
9. O nmero de lote, data de fabricao e prazo de validade.
10. O nmero de registro com a si