Anda di halaman 1dari 10

LAPORAN PRAKTIKUM DASAR-DASAR GENETIKA

ACARA VI
EKSTRAKSI DNA

Nama Mahasiswa

: Edwin Pradana

No Mahaiswa

: 15/379663/PN/14117

Golongan

: A2

Asisten

: 1. Ahmad Khoirudin S.N.


2. Kamila Khoirin N.

Laboratorium Pemuliaan Tanaman


Depertemen Budidaya Pertanian
Fakultas Pertanian
Universitas Gadjah Mada
2016
I.

PENDAHULUAN

I. 1. Latar Belakang
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan persenyawaan kimia yang paling penting
pada makhluk hidup yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari
makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi selanjutnya. Molekul DNA
terdapat pada nukleus, mitokondria, plastid, sentriol dan kloropas (pada tanaman) (Suryo,
2012). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan membentuk genom. Genom meliputi bagian
gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam sel organisme (Campbell, 2002).
Menurut Jusuf (2001), DNA prokariot dan eukariot mempunyai perbedaan bentuk.
Organisme prokariot memiliki DNA berbentuk sirkular, sedang organisme eukariuot
mempunyai DNA berbentuk linear.Struktur DNA pertama kali dijelaskan oleh James Watson
dan Francis Crick.Watson dan Crick menyimpulkan bahwa struktur DNA merupakan rantai
ganda (double helix). Terdiri dari gugus fosfat, basa nitrogen, gula ribosa, dan adanya ikatan
hidrogen yang menghubungkan kedua basa nitrogen.
Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup
dapat dilakukan suatu teknik yang disebut isolasi DNA. Pengisolasian DNA secara sederhana
dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti, baik
secara mekanik maupun secara kimiawi. Prinsipnya ada dua yaitu sentrifungsi dan
presipitasi.Sentrifungsi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat
molekulnya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas.Hasil sentrifungsi akan
menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet
pada bagian bawah . Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan
suatu komponen dari campuran.
Isolasi DNA pada tanaman seringkali terkontaminasi oleh polisakarida serta beberapa
molekul pengotor. Salah satu kesulitan pada isolasi DNA dari tanaman tinggi adalah proses
destruksi dinding sel untuk melepaskan organel sel. Hal ini disebabkan karena tanaman
memiliki dinding sel yang kuat serta pada beberapa tanaman kontaminasi sulit dipisahkan
dari ekstrak asam nukleat. Kehadiran kontaminasi diatas dapat menghambat aktivitas enzim,
contohnya DNA menjadi bersifat tidak sensitif terhadap enzim restriksi serta mengganggu
proses amplifikasi DNA dengan PCR.
I. 2. Tujuan
1. Mengetahui proses isolasi DNA dengan menggunakan metode CTAB dan konvensional.
II.

HASIL DAN PEMBAHASAN

II. 1. Hasil Percobaan


Tabel 1. Hasil Ekstraksi dengan Metode Konvensional
No

Sampel

Kemurnian Gen

Konsentrasi Gen
1299 ng/ l

Strawberry

1,182

Pepaya

1,188

1898 ng/

Mangga

1,200

599 ng/

Tabel 2. Hasil Ekstraksi dengan Metode CTAB


No

Sampel

Kemurnian Gen

Konsentrasi Gen

Daun Cabai

1,688

2697 ng/

Daun Jagung

1,760

4396 ng/

Daun Bunga Kertas

2,167

1299 ng/ l

Buah Mangga

0,50

100 ng/

Buah Stroberi

1,00

200 ng/

Buah Pepaya

1,33

799 ng/

II. 2. Pembahasan
Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk hidup
dapat dilakukan suatu tekhnik yang disebut isolasi DNA.DNA pada makhluk hidup dapat
diisolasikan secara sederhana.Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan
memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti, baik secara mekanik maupun
secara kimiawi.Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh
DNA murni yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. (Suryo,2012).
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.Prinsipnya ada dua
yaitu sentrifungsi dan presipitasi.Sentrifungsi merupakan teknik untuk memisahkan
campuran berdasarkan berat molekulnya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan
berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas.
Hasil sentrifungsi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah yaitu supernatan
pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell, 2002). Presipitasi merupakan
langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. (Albert, 1994)

Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Hal ini bertujuan untuk
memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Proses ini harus dilakukan
dengan hati-hati sehingga tidak menyebabkan kerusakan DNA. Adapun tiga langkah utama
dalam ekstraksi DNA secara umum yaitu, perusakan dinding sel (lisis), pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Secara umum, untuk mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan
dinding sel, membran plasma, dan membran inti dengan cara konvensional maupun CTAB.
a. Konvensional
Dilakukan dengan pemblenderan atau penggerusan menggunakan mortar dan
pestel dan pemberian larutan lisis buffer yang terbuat dari garam dan sabun
dengan perbandingan 1:2
b. CTAB(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)
Dilakukan dengan pemberian senyawa kimia buffer Cetyl Trimethyl Ammonium
Bromide(CTAB) untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan DNA.
Pada praktikum Dasar-Dasar Genetika Acara VI yang berjudul Ekstraksi DNA yang
dilaksanakan pada hari Selasa, 20 September 2016 di Laboratorium Pemuliaan Tanaman,
Departemen Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian, Universitas Gadjah Mada diperlukan
beberapa alat dan bahan dalam melakukan percobaan. Adapun alat yang diperlukan adalah
spektrofotometer, microtip, microtube, micropipet, centrifuge, freezer, mortar, pestel, vorteks,
plastik dengan klem, kertas saringdan gelas beker. Sedangkan bahan-bahan yang diperlukan
adalah sampel buah (mangga, pepaya, stroberi) 0,1 gr, sampel daun (cabe, bunga kertas,
jagung) 0,1 gr, buffer CTAB, garam, sabun, aquadest, alkohol (etanol atau isopropanol),
CIAA (isoamil alkohol), kloroform.
Dalam percobaan ini, isolasi DNA dilakukan melalui dua metode yakni metode
konvensional dan metode CTAB. Pada metode konvensional, disediakan pepaya, stroberi dan
mangga sebagai sampel. Pada langkah pertama, sampel dimasukkan ke dalam plastik berklem
(secukupnya). Selanjutnya buah dihaluskan dengan cara memukul melalui luar plastik dan
dilakukan dengan hati-hati agar tidak menyobek plastik. Adanya penghalusan ini bertujuan
untuk memacu lisis pada sel sehingga DNA dapat keluar dengan lebih mudah. Berikutnya,
dibuatnya larutan buffer lisis dengan mencampurkan garam dan sabun dengan perbandingan
1 : 2 dan dilarutkan ke dalam aquadest 100 ml aquadest. Kemudian larutan lisis yang telah

dibuat dimasukkan ke dalam plastik yang telah berisi buah yang telah dihaluskan dan
dicampurkan dengan buah agar homogen dan diupayakan agar tidak terjadi pembentukan
busa. Selanjutnya, isi plastik disaring dan dimasukkan ke dalam gelas beker lalu hasil saring
ditambah dengan etanol dingin untuk mengendapkan DNA. Berikutnya akan terlihat DNA
menggumpal di atas permukaan gelas beker. Setelah itu, DNA diambil melalui mikropipet
dan dipindahkan ke mikrotube kemudian disentrifuse. Setelah kering, sampel DNA
ditambahkan buffer TE/ Double Distilated H20( DDH20).
Berikutnya pada ekstraksi DNA dengan metode CTAB, disediakan sampel daun
( cabe, bunga kertas, jagung) dan sampel buah (mangga,pepaya,stroberi). Kemudian buffer
CTAB dipanaskan dahulu pada waterbath 65 C selama 30 menit. Berikutnya sampel daun
digerus dengan mortar dan pestel hingga lembut dan ditambahkan buffer sebanyak
1500 l

dimasukan setengah-setengah agar larutan dapat terbuat dengan sempurna dan

dicampur hingga merata. Kemudian dimasukkan ke dalam microtube. Hasil campuran


gerusan dan larutan buffer yang diperoleh selanjutnya diinkubasi pada suhu 65 derajat C
selama 60 menit dengan catatan setiap 10 menit dibolak-balik. Setelah diinkubasi campuran
diambil dari waterbath didiamkan selama 2 menit dan ditambahkan pada setiap sampel 500
l

campuran 24 chloroform : 1 isoamil alkohol (CIAA). Berikutnya dicampur dan

divorteks selama 5 menit. Berikutnya campuran disentrifuse selama 15 menit pada 12.000
rpm. Kemudian supernatan yang telah terbentuk diambil secara hati-hati dan dipindahkan ke
microtube yang baru dan dicatat volumenya. Selanjutnya ditambahkan sodium asetat 3 M
sebanyak 1/10 dari volume supernatan yang diperoleh dan dicampur dengan baik. Berikutnya
ditambahkan isopropanol dingin sebanyak 2/3 volume total dan dicampur dengan baik dan
tabung dibolak-balikkan. Berikutnya campuran didiamkan dalam freezer selama 24 jam.
Kemudian disentrifuse dengan 12.000 rpm selama 10 menit. Berikutnya cairan dibuang dan
endapan DNA dicuci dan ditambahkan 500

l etanol 70% selanjutnya microtube dibolak-

balik. Kemudia sentrifuse 5 menit pada 12.000 rpm. Cairan dibuang dan endapan DNA
dikering-keringkan. Berikutnya setelah kering endapan DNA dilarutkan kembali dengan 50100

l TE buffer + 1% RNAse dan diinkubasi pada waterbath dengan suhu 37 C selama

60 menit. Kemudian larutan DNA disimpan pada suhu 4 C.

Pada penentuan kemurnian gen dan konsentrasi gen sampel dapat dilihat melalui
spektrofotometer. Adapun spektrofotometer adalah alat untuk mengukur tingkat kemurnian
dan konsentrasi DNA hasil isolasi dengan menggunakan sinar UV. Pada percobaan ini, nilai
kemurnian DNA ditentukan dengan rasio 260/280, dimana absorbansi panjang gelombang
260 nm digunakan untuk mendeteksi komponen asam nukleotida (DNA/RNA), sedangkan
untuk mendeteksi komponen protein menggunakan absorbansi panjang gelombang UV
dengan panjang gelombang 280 nm. Dalam penentuan nilai kemurnian DNA, DNA murni
yang bebas kontaminasi protein akan mendekati 1,8, sedangkan jika kurang 1,8 menandakan
bahwa DNA terdapat kontaminasi fenol atau protein, jika lebih dari 1,8 menandakan bahwa
DNA terkontaminasi RNA.
Berdasarkan hasil ekstraksi DNA dengan metode konvensional yang diperoleh, pada
sampel strawberry memiliki DNA yang berjumlah sedikit dan menempel di dinding-dinding
microtube serta berwarna putih. Sedangkan kemurnian gen didapat hasil 1,182 yang
menandakan bahwa belum murninya gen yang diisolasi, hal ini dapat disebabkan karena
adanya kontaminasi dari fenol ataupun protein. Adapun konsentrasi gen stroberi adalah
senilai 1299 ng/ l

dimana kualitas DNA yang diuji pada strawberry memiliki kualitas

yang cukup baik dan jumlah DNA yang diuji cukup banyak. Berikutnya pada sampel pepaya
diperoleh deskripsi DNA mengendap di bawah microtube dan berwarna kuning. Sedangkan
diperoleh kemurnian gen 1,188 dan konsentrasi gen 1898 ng/ l

yang menandakan bahwa

masih belum murninya gen dan DNA sampel pepaya memiliki kualitas yang cukup baik dan
berjumlah cukup banyak. Kemudian sampel DNA mangga memiliki deskripsi berjumlah
sedikit dan

menempel di dinding-dinding microtube serta memiliki warna kuning.

Sedangkan pada pengukuran kemurnian gen diperoleh nilai 1,200 yang menandakan masih
adanya kontaminasi protein ataupun fenol dalam DNA, sedangkan konsentrasi gen diperoleh
599 ng/ l

yang menandakan jumlah sampel DNA yang diuji lebih sedikit dibandingkan

sampel lainnya yang diuji pada metode yang sama.


Pada ekstraksi DNA dengan metode CTAB diperoleh hasil pada sampel daun cabai
memiliki deskripsi DNA hijau kekuningan ada endapan. Sampel daun cabai ini memiliki
kemurnian gen 1,688 sehingga sampel yang diuji menandakan mengandung kontaminasi dari
fenol atau protein dikarenakan nilai kemurnian gen lebih kecil daripada 1,800. Adapun
konsentrasi gen adalah senilai 2697 ng/ l

yang menandakan sampel yang diuji berjumlah

cukup banyak. Berikutnya pada sampel daun jagung diperoleh deskripsi DNA berwarna hijau
keruh dan mengendap di bawah microtube. Pada pengujian kualitas, daun jagung memiliki
kemurnian gen 1,760 yang menandakan sampel memiliki kemurnian yang cukup baik
(hampir bebas dari kontaminasi) karena mendekati 1,800 dan konsentrasi gen senilai 4396
ng/ l

dimana sampel yang diuji berjumlah sangat banyak. Kemudian daun bunga kertas

memiliki DNA berwarna hijau bening dan mengendap di bawah microtube. Pada pengujian
kemurnian daun bunga kertas diperoleh nilai 2,167 yang menandakan sampel DNA
terkontaminasi adanya RNA dan konsentrasi gen diperoleh nilai 1299 ng/ l

yang

menandakan bahwa jumlah sampel yang diuji cukup banyak. Selanjutnya pada sampel buah
mangga diperoleh hasil DNA berwarna bening dan terdapat endapan serta memiliki
kemurnian gen 0,50 yang menandakan cukup banyak kontaminasi dari fenol maupun protein.
Adapun konsentrasi gen yang diperoleh 200 ng/ l

yang menandakan jumlah sampel yang

diuji hanya sedikit. Pada sampel buah stroberi diperoleh hasil warna DNA keruh dan terdapat
endapan. Pada pengukuran kemurnian gen diperoleh nilai 0,50 yang menandakan juga cukup
banyak kontaminasi dari fenol maupun protein dan konsentrasi gen 200 ng/ l

yang

menjelaskan bahwa sampel yang diuji cukup sedikit. Berikutnya pada sampel buah pepaya
memiliki deskripsi DNA berwarna putih kekuningan dan memiliki endapan. Sedangkan pada
pengukuran kemurnian gen diperoleh nilai 1,33 dimana gen yang diuji masih terdapat
kontaminasi fenol atau protein dan pada pengukuran konsentrasi gen diperoleh nilai 200 ng/
l dimana gen yang diuji memiliki jumlah yang sedikit.

III.

PENUTUPAN

Kesimpulan

Pada pengujian ekstraksi DNA dengan metode konvensional, diperoleh hasil:


Kemurnian gen yang didapat berdasar ketiga sampel DNA isolasi menunjukkan
bahwa gen memiliki kemurnian di bawah 1,800 sehingga ketiganya terdapat
kontaminasi fenol dan protein.

Pada pengujian ekstraksi DNA dengan metode CTAB, diperoleh hasil:


Kemurnian gen yang didapat pada keenam sampel DNA isolasi menunjukkan
bahwa hanya gen isolasi daun jagung yang memiliki kemurnian mendekati 1,800
yaitu 1,760 yang berarti hampir memiliki kemurnian paling baik tanpa adanya
kontaminasi dari fenol atau protein maupun RNA. Sedangkan juga hanya daun
bunga kertas yang didapat mengandung adanya kontaminasi RNA karena nilai
kemurnian gen yang lebih dari 1,800 yaitu 2,167.

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B .1994. Biologi Molekuler Sel Edisi Kedua. PT. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.

Campbell, Neil A. dkk. 2002. Biologi Jilid 1 Edisi 3.Erlangga, Jakarta.


Jusuf, M. 2001. Genetika 1 Struktur dan Ekspresi Gen. Sagung Seto, Jakarta.
Suryo. 2012. Genetika Strata 1. UGM Press, Yogyakarta.

LAMPIRAN