ANLISIS DE DIVERSIDAD MICROBIANA Y DINMICA DURANTE LA

FERMENTACIN DE LA VARIEDAD UVA GARNACHA

POR LA SECUENCIA DE CDIGO DE BARRAS DE ALTO RENDIMIENTO
Entender la diversidad y evolucin de microorganismos durante la fermentacin es esencial
para controlar su produccin. Estudios anteriores han sido principalmente basados en
mtodos dependientes de cultura pero la reciente incorporacin de mtodos moleculares
independientes est mostrando una visin muy diferente de composicin microbiana y
diversidad durante el proceso de fabricacin del vino. En esto hemos aplicado la tecnologa
de pirosecuenciacin con cdigo de barras para controlar la dinmica de bacterias y
levaduras durante la fermentacin espontnea del vino a escala de laboratorio de la
variedad Garnacha. Los miembros de las bacterias de cido actico (AAB) y bacterias del
cido lctico (LAB) fueron los ms abundantes, que representa el orden Lactobacillus y
Rhodospirillales ms de 70% de la poblacin bacteriana. Otros gneros bacterianos, no
detectadas previamente al final de la fermentacin, estaban presentes en baja proporcin y
su posible papel sigue siendo desconocido. Dentro de la comunidad de levadura, los
gneros Hanseniaspora y Candida fueron dominantes durante la fermentacin inicial y
media, mientras que la fermentacin final fue dominado principalmente por Candida y
Saccharomyces. Este estudio contribuye al conocimiento de la dinmica microbiana a
travs de la fermentacin espontnea del vino y presenta secuenciacin de alto rendimiento
como una herramienta til para monitorear y evaluar la diversidad de bacterias y la
levadura y la dinmica durante la fermentacin del vino
INTRODUCCIN
La conversin del mosto de la uva al vino es un proceso bioqumico complejo que implica
interacciones entre levaduras y bacterias. Es esencial comprender la composicin y el
comportamiento de estos microorganismos durante la fermentacin con el fin de ampliar
nuestra comprensin de los problemas de fermentacin, para mejorar el control de la
fermentacin y para obtener productos finales con las caractersticas organolpticas
deseadas. Sin embargo, la mayora de los anlisis de diversidad microbiana durante la
fermentacin del vino se han basado en los mtodos de cultivo dependiente que se bas en
el aislamiento de colonias para una caracterizacin adicional. El uso de mtodos de cultivo

dependiente, existe un alto riesgo de identificacin errnea de la ecologa de los

ecosistemas microbianos complejos (Amann, Ludwig, y Schleifer, 1995; Rantsiou et al.,
2005). Recientemente, varios mtodos independientes del cultivo a partir de los cidos
nucleicos se han utilizado para analizar la diversidad microbiana de uvas y vinos (revisado
en Cocolin, Campolongo, Alessandria, Dolci, y Rantsiou, 2011), y estos mtodos han
complementado las tcnicas clsicas fisiolgicas. Por ejemplo , la tcnica de PCR - DGGE
se ha utilizado ampliamente para estudiar la ecologa microbiana de las uvas y la
fermentacin del vino (Andorra , Landi , Mas , Esteve - Zarzoso , y Guillamn , 2010 ;
Cocolin , Bisson , y Mills , 2000 ; Prieto , Jara , Mas, y Romero, 2007 ; Renouf , Strehaiano
, y Lonvaud - FUNEL , 2007) , y se han desarrollado ensayos para detectar y enumerar las
bacterias y levaduras en el vino ( Andorr , Landi , Mas, Esteve - Zarzoso , y Guillamn ,
2010; Gonzlez , Hierro , Poblet , Mas, y Guillamon , 2006; Hierro , Esteve- Zarzoso , Mas,
y Guillamn , 2007). El uso de mtodos de biologa molecular ha apoyado en general los
resultados tradicionales sino que, adems, estas nuevas tcnicas han identificado una
diversidad microbiana mucho ms alta de lo esperado (Navarro, Mateo, Torija, y Mas ,
2013). Por lo tanto, la visin actual de las especies bacterianas y eucariotas asociados con
las uvas , mostos y vinos es mucho ms compleja de lo que se ha descrito previamente.
Sin embargo, la deteccin por DGGE es difcil para especies presentes en densidades de
poblacin inferiores a 103 UFC / ml o dos rdenes de magnitud inferior a los miembros ms
abundantes de estas comunidades (Muyzer y Smalla, 1998; Prakitchaiwattana, flota, y
Heard, 2004) y la deteccin por PCR se limita a la cuantificacin de las pocas especies
objetivo. Hoy en da , las tecnologas de alto rendimiento de secuenciacin ( HTS ), tales
como el 454 pirosecuenciacin de amplicones , se puede utilizar para caracterizar con ms
precisin la diversidad microbiana de los ecosistemas ambientales complejos , incluyendo
muestras de alimentos ( Ercolini , 2013 ; Solieri , Dakal , y Giudici , 2013 ; Galimberti et
al , 2015). Por ejemplo , las tcnicas HTS se han utilizado recientemente para determinar la
diversidad bacteriana de los vinos botritizadas ( Bokulich , Jos, Allen , Benson , y Mills ,
2012 ) y la masa madre tradicional china ( Liu et al . , 2016) , para monitorear los cambios
estacionales en la bodega microbiana residente ( Bokulich , Ohta , Richardson , y Mills ,
2013) o para analizar la biogeografa microbiana de las uvas de una regin californiana
( Bokulich , Thorngate , Richardson , y Mills , 2014) .

El objetivo de este estudio fue analizar la estructura de la comunidad bacteriana y la

levadura y la dinmica durante la fermentacin del vino de la variedad Garnacha mediante
pirosecuenciacin con cdigo de barras que elimina los lmites impuestos por tcnicas tales
como el cultivo de la especie primaria , la deteccin limitada de DGGE -PCR y la
cuantificacin de tan slo especies objetivo por PCR.
2. Materiales y mtodos
2.1 . La fermentacin alcohlica y la recogida de muestras
Tres kg de uvas sanas de la variedad garnacha ( Vitis vinifera L. ) se obtuvieron de Ferrer
Bobet viedo de la DOC Priorat (Catalua , Espaa ) y fueron desgranadas aspticamente y
se apret a mano en el laboratorio . La fermentacin se realiz por duplicado , 1,8 kg de
mosto de uva y luego se pusieron en botellas de 2 litros. La fermentacin alcohlica se
realiza a temperatura ambiente (controlado a 23 1 C ) con agitacin suave ( 120 rpm ) .
El mosto inicial tena una densidad de 1,100 g / l , 4,8 g / l de acidez total ( expresada en
cido tartrico ) y pH de 3,2. La fermentacin se ha sulfitado ( 30 ppm de SO2 como
metabisulfito ), El consumo de azcar se control a diario midiendo la densidad (g / L) del
mosto de fermentacin y por ensayo enzimtico ( Roche Applied Science ; Alemania).
Ambas fermentaciones se les permiti continuar sin la inoculacin de levaduras y
terminaron con xito en 10 das . Las fermentaciones fueron consideradas terminadas
cuando el nivel de azcares reductores estaba por debajo de 2 g / L y la densidad de mosto
fue por debajo de 1.000 g / L . Las concentraciones de cido actico y glicerol en las
muestras se ensayaron por una Miura Multianalyzer (TDI , Barcelona, Espaa) usando el
kit enzimtico de Applied S. A. (Barcelona, Espaa); y los de la glucosa , la fructosa y el
etanol por kit enzimtico de Roche Diagnostics (Darmstadt, Alemania) al final de la
fermentacin . Muestras de 10 ml cada una se tomaron aspticamente de ambas
fermentaciones en los das 0 , 1, 2 , 3 y 10 , que corresponden con iniciales ( das 0 y 1 ) ,
medio (das 2 y 3) y fermentacin final (da 10 ) ( Fig . 1 ) . Las muestras se centrifugaron a
4000 x g y los sedimentos se almacenaron inmediatamente a -80C .

2.2 . Extraccin de ADN y pirosecuenciacin de los genes 16S y 18S de ARNr

Se extrajo muestras de ADN usando el protocolo estndar para el kit QIAamp DNA Mini
(Qiagen , Hilden , Alemania), que incluye tres pasos de batidos durante 3 min en un cordn
batidor FastPrep - 24 ( MP Bio , Solon , OH) para homogeneizar la muestras. El ADN
extrado fue enviado a Lifesequencing S.L. (Valencia , Espaa ) para la amplificacin y
anlisis de pirosecuenciacin . En pocas palabras , los genes parciales 16S y 18S ARNr
fueron amplificados utilizando la Roche 454 FLS GS titanio secuenciador en
Lifesequencing S.L. con los cebadores proporcionados por la empresa. Una biblioteca con
cdigo de barras con una etiqueta de identificacin molecular diferente ( Roche ) fue
construido por muestra . El ADN amplificado se cuantific usando el kit Quant -IT
PicoGreen ( Invitrogen ) para generar una piscina equimolecular para su posterior
secuenciacin . datos de secuencias de genes 16S y 18S ARNr generadas a partir de
pirosecuenciacin se procesaron en QIIME ( Caporaso et al., 2010 ) . En pocas palabras ,
las lecturas fueron descartados si la puntuacin media de la calidad de la lectura era < 25 ,
si la longitud de la lectura era < 200 y cualquier lectura que contiene uno o ms de las
llamadas ambiguos. unidades taxonmicas operacionales ( Otus ) fueron asignados
utilizando el flujo de trabajo de referencia abierto OTU- picking ( Edgar , 2010) basada en
uclust de QIIME , con un umbral de 97 % de identidad de dos a dos . la taxonoma se
determin utilizando el clasificador RDP al 97 % de similitud (Wang et al., 2007 ) y nueva
formacin hacia los genes de la flora bacteriana de datos base de 16S ARNr ( liberacin
13_8 ) para secuencias de 16S ( DeSantis et al., 2006 ) y hacia la liberacin Silva 111 para
secuencias 18S ( Quast et al . , 2013) . Se identificaron y eliminaron secuencias quimricas
usando ChimeraSlayer ( Haas et al . , 2011) . Una tabla OTU fue creado al final , con
exclusin de toneladas unicas ( secuencias observadas slo una vez ) , y secuencias que
emparejan las mitocondrias de las plantas o del cloroplasto . Para evitar sesgos generados
por las diferencias en la profundidad de secuenciacin , las lecturas eran a una profundidad
uniforme de 300 secuencias por muestra. Se descartaron las muestras por debajo de ese
umbral siguiendo todos los pasos de filtrado de calidad . La diversidad alfa (dentro de la
riqueza de especies de la muestra ) las estimaciones se calcularon mediante el anlisis de
las especies observadas y los ndices Chao y la cobertura Good's .

3. Resultados y discusin
Las fermentaciones replicados de Garnacha les permiti continuar sin la inoculacin de
levaduras y terminaron con xito en 10 das (Fig.1) . Los valores de los principales
parmetros de los vinos finales fueron idnticos con 14 % de etanol (v / v) , 12.6 g / L de
glicerol y 1,2 g / l de azcares residuales (slo fructosa) y la densidad de 997g / L . Estos
valores fueron consistentes con las fermentaciones alcohlicas anteriores de los mostos de
uva naturales realizados por nuestro laboratorio y se procedi sin paradas de fermentacin.
Se obtuvieron un total de 132,354 secuencias despus de la filtracin de calidad con una
longitud media de 531 nt . En el nivel de 97% de identidad , la mesa final contena 134
OTU bacteriana y 238 eucariota de distinta UOT . Los valores de cobertura Good's estaban
por encima de 90 % para bacterias y entre 81 y 100 % para las secuencias de eucariotas
(Tabla 1) . Estos resultados indican que el esfuerzo de muestreo seleccionado fue apropiada
para revelar ms diversidad de bacterias y eucariotas en estas muestras. La excepcin fue
representada por las secuencias obtenidas a partir de muestras de fermentacin del vino en
el da 0 que se estima que cubre solo el 58% de la diversidad total de bacterias . De acuerdo
con el nmero de especies observadas y el Chao1 estimado, la diversidad bacteriana era
fluctuante a travs de la fermentacin mientras que la diversidad eucaritica claramente
tendi a aumentar hasta el final de la fermentacin (tabla 1 ) .
El grupo taxonmico bacteriana ms abundantes durante toda la fermentacin fue el
Acetobacteraceae que representa hasta el 92 % de las secuencias (Fig. 2A) . Dentro de
Acetobacteraceae , el gnero dominante era Gluconobacter que representa 41 a 81 % de las
bacterias y alcanz su punto mximo en la mitad de la fermentacin (Tabla 2 ) . Esto es
algo inesperado, porque aunque Gluconobacter han sido descritos como comn en las uvas,
que por lo general son sensibles a alcohol, y por lo tanto normalmente disminuyen durante
la fermentacin alcohlica (Du Toit y Pretorius , 2002 ; Joyeux , Lafon - Lafourcade , y
Ribereau - Gayon , 1984 ; Gonzlez , Hierro , Poblet , Mas, y Guillamon , 2005) .
du Toit Y Lambrechts ( 2002 ) observ una disminucin en AAB de 106 -107 Ufc / ml antes
de la levadura la inoculacin a 10 3 -104 y 102 -103 Ufc / ml en el medio y al final de la
fermentacin , respectivamente. Sin embargo , el uso de mtodos de cultivo independiente

inform que la poblacin AAB permaneci elevada ( entre 104 -105 Clulas / mL ) a lo largo
de la fermentacin (Andorra , Landi , Mas , Esteve - Zarzoso , y Guillamn , 2010) , lo que
estara de acuerdo con nuestros resultados actuales . Por otra parte , un estudio previo sobre
la base de pirosecuenciacin inform alta abundancia de AAB en el vino botritizado en el
rango de 40-80 % de Rhodospirillales , principalmente pertenecientes a Gluconobacter
( Bokulich , Jos, Allen , Benson , y Mills , 2012) . Estos autores atribuyeron la gran
abundancia de bacterias de cido actico a la naturaleza de vino botritizadas. Sin embargo ,
en un estudio ms reciente tambin mediante secuenciacin masiva para controlar el efecto
de la adicin de sulfito sobre las comunidades microbianas presentes en la fermentacin del
vino de variedad Chardonnay , LAB y Gluconobacter florecido durante la fermentacin con
concentraciones por debajo de 25 mg / l de SO2 ( Bokulich , Swadener , Sakamoto , Mills ,
y Bisson , 2014) , que es compatible con nuestros resultados en la variedad de uva
Garnacha . En conjunto , estos resultados sugieren que AAB son ms abundantes que lo que
se haba pensado durante fermentaciones de poca sulfatacin del vino , independientemente
de la variedad de uva , pero nuevos estudios sobre la variedad de uva adicionales deben ser
necesarios para confirmar si esto es un hecho generalizado . Detectamos baja proporcin de
Acetobacter (de 6 a 2% ) y su disminucin de la abundancia a travs de la fermentacin .
Este resultado tambin fue inesperado porque Acetobacter es moderadamente resistente al
alcohol y se ha descrito en las ltimas etapas de la fermentacin alcohlica ( Du Toit y
Lamberchts , 2002; Joyeux , Lafon - Lafourcade , y Ribereau- Gayon , 1984; . Gonzlez et
al, 2004 ) . En los vinos , Acetobacter aceti ha sido considerado el principal AAB en alterar
y estudios posteriores indicaron que A. pasteurianus estaba presente en los vinos
embotellados en mal estado ( Bartowsky y Henschke , 2008 ) . Estudios anteriores de HTS
no detectaron Acetobacter en absoluto

durante la fermentacin del vino Chardonnay

( Bokulich , Swadener , Sakamoto , Mills , y Bisson , 2014) , lo cual es una clara diferencia
con nuestros resultados Garnacha de fermentacin del vino Garnacha . Las secuencias que
pertenecen a los gneros Gluconacetobacter o Asaia tambin eran poco frecuentes en
nuestro anlisis (Tabla 2 ) . Varias especies previamente clasificadas en Gluconacetobacter
han sido reclasificadas como miembros del nuevo gnero Komagataeibacter ( Yamada et
al . , 2012) , y algunos de ellos se han observado en algunas fermentaciones alcohlicas ,
aunque en proporciones bajas ( Gonzlez et al . , 2004) . Otros Acetobacteraceae tambin

estuvieron presentes en porcentajes muy bajos , aunque no podan asignarse sin

ambigedad a gneros especficos (Tabla 2 ) .
Al final de la fermentacin, se observ una disminucin en las secuencias de AAB (Tabla
2 ; Fig . 2A) , al mismo tiempo que un aumento de LAB de la orden Lactobacillales (Fig
2A. ) . Andorr , Landi , Mas, Guillamn , y Esteve - Zarzoso (2008 ) describen un aumento
de la poblacin LAB cerca de 104 clulas / ml al final de la fermentacin del vino
mediante la tcnica de PCR cuantitativa y Bokulich , Swadener , Sakamoto , Mills , y
Bisson (2014 ) inform que ms del 60 % de las secuencias obtenidas por HTS
relacionados con Lactobacillaceae en el 10 da de la fermentacin del vino Chardonnay ,
ambos resultados para fermentaciones no inoculadas y SO2 libre . El aumento observado de
LAB al final de la fermentacin alcohlica en nuestro vino Garnacha se poda esperar para
generar las condiciones adecuadas para la fermentacin malolctica posterior ( aunque,
como en fermentaciones ms espontneas , no ha procedido ). Hemos podido detectar otros
grupos taxonmicos bacterianas menores durante las fermentaciones ( Fig. 2A ), algunos de
ellos, como gneros Orbus y Wolbachia , se detectaron hasta el final de la fermentacin
alcohlica aunque su papel sigue siendo desconocida y no se han detectado en estudios
anteriores . Los gneros ms abundantes fueron eucariotas Hanseniaspora , Candida y
Saccharomyces , con una sucesin clara durante la fermentacin ( Fig . 2B ) .

la

Issatchenkia era relevante en el mosto tambin. Estos gneros han sido frecuentemente
aislados en las fermentaciones espontneas ( Clemente - Jimenez , Mingorance - Cazorla ,
Martnez Rodrguez , Las Heras - Vzquez , y Rodrguez - Vico , 2004). En la fermentacin
inicial, Hanseniaspora y Issatchenkia eran dominantes , aunque su abundancia disminuy
drsticamente a travs de la fermentacin y Candida represent el gnero ms abundante a
partir de las 24 h hasta mediados de fermentacin ( 52-87 % ) . Al final de la fermentacin ,
Saccharomyces fue el gnero dominante junto con Candida ( 48 y 40 % respectivamente).
Estos resultados estaban de acuerdo con los estudios previos de nuestro grupo usando PCRDGGE y qPCR en fermentaciones espontneas y que describe la abundancia de
Hanseniaspora al comienzo de la fermentacin y Candida y Saccharomyces al final de la
fermentacin alcohlica ( Andorr , Landi , Mas, Guillamn , y Esteve - Zarzoso , 2008;
Andorr , Landi , Mas, Esteve - Zarzoso , y Guillamn , 2010). Sin embargo , Bokulich ,
Swadener , Sakamoto , Mills , y Bisson (2014 ) describen mediante tcnicas HTS a

Kluyveromyces como la levadura dominante en la etapa temprana de fermentacin de la

uva Chardonnay antes de ser desplazado por Hanseniaspora y luego S. cerevisiae , que se
diferencia claramente de nuestros resultados para Garnacha variedad. Aunque
Kluyveromyces a menudo se aisl en la fermentacin de mostos , en nuestros estudios
anteriores sobre la ecologa de garnacha y otras variedades de uva de la regin vincola del
Priorat , su presencia era muy marginal ( Constant , Poblet , Arola , Mas, y Guillamn ,
1997; Torija , Rozs , Poblet , Guillamn , y Mas , 2001). Nuestros resultados seran algo
comparable a los resultados parciales de David et al. (2014 ) , quien monitoreado por
tcnica de la diversidad a travs de la levadura de fermentacin del vino a partir de uvas
Chardonnay cultivadas bajo diferentes tratamientos . Este autor encontr Hanseniaspora
como la levadura ms abundante en el comienzo de la fermentacin en el tratamiento
convencional y Candida fue predominante en la mitad de la fermentacin. Sin embargo ,
nuestros resultados contribuyen an ms a la dinmica de la levadura durante la
fermentacin del vino porque David et al . ( 2014 ) no analiz la etapa final de la
fermentacin en el que podra haber Saccharomyces finalmente dominado .
El presente estudio analiz el ADN microbiano, detectando as tanto vivos como clulas y
otros mtodos muertos se deben utilizar para detectar slo las clulas vivas. Sin embargo ,
la sucesin de las levaduras observadas en todas las fermentaciones y la aparicin de
microorganismos bacterianos de baja abundancia a finales de la fermentacin sugiere un
crecimiento microbiano dinamico.
Somos plenamente conscientes de que estos resultados se basan en un nmero limitado de
anlisis y como las fermentaciones fueron espontneas , procedieron sin un control externo
de la microbiota presente durante el proceso . Estudios anteriores han descrito la alta
sensibilidad de LAB a la adicin de SO2 ( Andorr , Landi , Mas, Guillamn , y EsteveZarzoso , 2008) y que AAB floreci al final de la fermentacin del vino Chardonnay de
bajas concentraciones de sulfito ( Bokulich , Swadener , Sakamoto , Mills , y Bisson ,
2014) . Sin embargo , los datos obtenidos en relacin con la sucesin de levadura ( de
Saccharomyces seguido de Saccharomyces cerevisiae a partir de mediados de fermentacin
) y el buen comportamiento de la fermentacin (fermentacin alcohlica terminado en 10
das con bajos niveles de azcares residuales) nos hace considerar la presente fermentacin

como representante de fermentaciones espontneas de uva Garnacha . Por lo tanto ,

nuestros resultados muestran que , en la fermentacin espontnea de la variedad Garnacha ,
los AAB son dominantes hasta el final de la fermentacin cuando la poblacin se vuelve
abundante en LAB . Adems, la poblacin inicial de levadura en mosto estaba compuesto
principalmente por Hanseniaspora y Issatchenkia aunque fueron desplazados rpidamente
por Candida y Saccharomyces. Las tcnicas utilizadas en este estudio reflejan muy bien la
dinmica de comunidades bacterianas y de levaduras durante la fermentacin del vino de la
variedad Garnacha con ms detalle que las tcnicas moleculares usadas anteriores y estos
resultados confirman la capacidad de las comunidades microbianas de autorregularse a las
especies involucradas en el proceso de elaboracin del vino.
4. Conclusiones
La secuenciacin de prxima generacin se utiliz para revelar la dinmica de poblaciones
microbianas durante la fermentacin espontnea de uvas Garnacha . Hemos descrito la
persistencia de las especies de Gluconobacter durante la fermentacin alcohlica lo que
sugiere que las poblaciones AAB y LAB presentes durante la fermentacin del vino
espontnea son ms abundantes que se pensaba anteriormente . los generos Candida y
Saccharomyces se impusieron al final de la fermentacin y terminaron con xito , que es
diferente de lo que un estudio anterior HTS han descrito para Chardonnay varietal . El
trabajo adicional podra ser necesario analizar ms variedades de uva y comparar los
resultados obtenidos . Nuestros datos sugieren que las tcnicas HTS son tiles para evaluar
los cambios microbianos en fermentaciones de vino de diferentes variedades de uva o bajo
diferentes tratamientos y esta informacin podra ser utilizado por los productores de vino
para conducir los procesos de fermentacin y para establecer las condiciones ambientales
ms adecuadas para mejorar las caractersticas del vino .
Expresiones de gratitud

El presente trabajo fue apoyado por el proyecto de la UE Wildwine ( acuerdo de

subvencin 315065 ) . M. C. Portillo es el beneficiario de una beca Beatriu de Pins con el
apoyo del Ministerio de Universidades e Investigacin del Departamento de Economa y

Conocimiento de la Generalitat de Catalua y el programa COFUND Marie Curie acciones

del 7 Programa Marco de I + D de la UE .