PRCTICA # 1

DETERMINACIN DE INHIBIDORES MICROBIANOS EN LECHE

M.C. MARIO REAL NAVARRO
Profesor de Toxicologa
Departamento de Salud Publica
Centro Universitario de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias
Universidad de Guadalajara

OBJETIVO
El alumno desarrollara en el laboratorio la tcnica cualitativa para determinar
la presencia de inhibidores microbianos en leche fluida.
INTRODUCCION.
Los antibiticos son sustancias de accin antimicrobiana producidas por
microorganismos o plantas superiores en el curso de su metabolismo normal, son
sustancias que inhiben de otros microorganismos en concentraciones mnimas.
De este modo, ciertas patologas que afectan exclusivamente a los animales y
por tanto no son consideradas zoonosis, pueden llegar a serlo de forma indirecta,
puesto que su presencia incrementa el riesgo potencial para la salud pblica debido
a la presencia significativa de inhibidores microbianos en alimentos para consumo
humano, como consecuencia del uso masivo de antibiticos para promover el
crecimiento, curar y prevenir enfermedades y promotor del crecimiento y el no
respeto de los periodos de supresin. Existen inhibidores naturales de
microorganismos en la leche aunque el combate se haga principalmente en base al
uso de antibiticos.
INHIBIDORES NATURALES DE LA LECHE
NOMBRE
Lactenina
Inmunoglobulinas
Pseudoglobulinas
Hormonas
cidos grasos libres
Leucocitos

PROPIEDADES
Dos tipos, especialmente en calostro (poco activa en
anaerobiosis); efecto menor en la leche
Factor especfico contra ciertos coliformes
Inhibicin de propionibacterias en suero
Inhibicin lactobacilos
Fagocitosis

La cantidad de antibiticos que llega a la leche depende del tipo de preparado

(componente activo y vehculo), dosis y forma de aplicacin, produccin de leche del
animal tratado, tipo y grado de afeccin mamaria y tiempo que media entre el
tratamiento y el ordeo.

CAUSAS DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PENICILINA EN LOS

SUMINISTROS DE LECHE.
Errores de orientacin y prcticas inadecuadas
incorrecta aplicacin de recomendaciones
recomendaciones equivocadas
uso de ungentos y substancias que contengan penicilina.
limpieza insuficiente de la mquina de ordeo

42 %
22 %
6%
7%
7%

Comunicacin y difusin insuficiente en el predio

42%

Partos prematuros en el perodo seco

8%

Adquisicin de vacas tratadas con penicilina

3%

Causas desconocidas

5%

Total

100%

La administracin ya sea oral, intramuscular o intravenosa, tiene menos

importancia, desde el punto de vista de higiene de leche, que la aplicacin por va
intramamaria. Esta ltima es la ms usada para el tratamiento de la mastitis,
dependiendo la cantidad de antibiticos eliminada por la leche del tipo de preparado,
dosis, intervalos entre tratamiento y ordeo, nmero de ordeos, produccin de leche
y factores individuales.
Los preparados con base hidrofobia, presentan un tiempo de eliminacin ms
prolongado que aquellos con base acuosa.
PUNTOS CRTICOS
Cuando se introduce un antibitico en la ubre, ste se distribuye en el tejido
mamario por los conductos galactforos y es transferido al torrente sanguneo por un
mecanismo fisicoqumico que depende del valor de pKa (valor de disociacin) del
preparado, valor de pH del plasma sanguneo, protena ligada al antibitico y valor de
pH de la leche. Debido a esto, la reabsorcin del producto es muy variable de
acuerdo al preparado y al animal.
De la dosis administrada a la glndula mamaria, una parte es absorbida
pasando al torrente sanguneo, otra es inactivada por la leche y los productos
generados por la infeccin y el resto, que es la mayor parte, es excreta da a la leche
durante los ordeas posteriores.
Existe una correlacin negativa entre el tiempo de eliminacin del antibitico y
el volumen de leche producido por el animal. Los animales de baja produccin

demoran en excretar el preparado, principalmente por la mala absorcin y secrecin

de los cuartos afectados. El ordeo frecuente aumenta el efecto de dilucin y por lo
tanto acorta el tiempo de eliminacin del antibitico.
Por otra parte, no slo la leche de los cuartos tratados es la que se contamina.
Se ha podido comprobar, en algunos casos, actividad antibitica en los cuartos
vecinos no tratados, actividad que permanece, por lo general, durante un perodo de
tiempo igual a la mitad del observado para los tratados. Es posible que esta situacin
se produzca por difusin pasiva entre la sangre y la leche y tambin por difusin
directa entre los tejidos mamarios.
Debido a que los antibiticos de aplicacin intramamaria son de fcil
aplicacin y generalmente baratos, dado que usualmente no se consulta al mdico
veterinario para su aplicacin, se han hecho muy populares en las explotaciones
lecheras y la consecuencia inmediata de esto es su reconocimiento como la principal
causa de aparicin de residuos de antibiticos en la leche.
IMPORTANCIA EN SALUD PBLICA
En la actualidad no se conocen informes sobre intoxicaciones provocadas por
antibiticos de uso comn ingeridos a travs de la leche y se explica porque sus
concentraciones resultan ser muy bajas como para provocar un efecto txico, con la
excepcin, posiblemente, del cloranfenicol, que es capaz de producir, de acuerdo a
algunos investigadores, anemia plstica por depresin de la mdula sea, al
suministrarse dosis bajas por perodos cortos de tiempo. No obstante lo anterior,
subsiste la duda de si el consumo de antibiticos por el hombre, a travs de
alimentos contaminados, puede alcanzar niveles que determinen una toxicidad de
tipo crnico, motivo ms que suficiente para prohibir la presencia de stos en los
alimentos.
Otro de los problemas que ocasiona en el ser humano el antibitico presente
en la leche, lo constituyen las reacciones de tipo alrgico que se producen luego de
un perodo de sensibilizacin, en el cual se generan en el sistema retculo endotelial
anticuerpos contra la droga administrada que acta como antgeno. El contacto con
los antgenos, continuado o peridico, provoca la reaccin alrgica que resulta
desproporcionada con la dosis ingerida.
Adems del problema de las reacciones alrgicas, los antibiticos presentes
en la leche pueden provocar los siguientes efectos en el consumidor:
alteracin de la flora intestinal,
estimulacin de bacterias antibitico-resistentes,
desarrollo de microorganismos patgenos, y . reduccin de la sntesis de
vitaminas.

Desde el punto de vista de la salud pblica, el establecer lmites mximos

permisibles en cuanto a contenido de antibiticos en la leche resulta muy difcil y
el uso de un lmite inferior slo debe considerarse como solucin transitoria,
siendo imperioso llevar a cabo mayores investigaciones en el tema.
Por lo anterior, la tendencia debe inclinarse hacia la limitacin en el uso de
estos preparados, por la va de una adecuada seleccin gentica, buen manejo del
ganado, control sobre su utilizacin y principalmente, toda medida que contribuya a
disminuir la incidencia de mastitis.
PROBLEMAS TECNOLOGICOS.
La produccin de productos fermentados es la ms afectada en la industria
cuando en la leche recibida estn presentes residuos de antibiticos, provocando
grandes prdidas en calidad y, por ende, econmicas.
Por ejemplo, las bacterias empleadas en la fabricacin de yoghurt,
Lactobacillus vulgaricus y Streptococcus termophillus resultan ser unas de las ms
sensibles a los antibiticos. Las bacterias, por efecto de los antibiticos, presentan
cambios morfolgicos y pueden darse situaciones en que los cultivos iniciadores
sean reemplazados por microorganismos indeseables, provocando la inutilizacin del
producto o que se convierta en peligroso para su consumo.
Adems de los efectos en los productos lcteos fermentados, la industria se
ve perjudicada en pruebas de control de calidad a la que es sometida la leche a nivel
de recepcin. Tal es el caso del test de tiempo de reduccin del azul de metileno,
TRAM, que aumenta cuando la leche est contaminada con antibiticos, lo que trae
como consecuencia un error en la clasificacin de la leche.
Por otra parte, an persiste la creencia errnea de que los tratamientos
trmicos a que se somete la leche destruyen las sustancias inhibidoras y, en forma
particular, los antibiticos. Sin embargo, un informe de 1967 de la Federacin
Internacional de la Lechera seala que la penicilina pierde solamente un 8% de su
actividad luego de la pasteurizacin.
Un tratamiento trmico ms exigente (90C por 30 minutos), destruye el 20% de la
actividad de la penicilina y la esterilizacin un 50%.
En el cuadro siguiente, se muestra un resumen con respecto a la termo
estabilidad de los antibiticos frente a diferentes tratamientos.
TERMOESTABILIDAD DE ANTIBIOTICOS
Antibitico
Penicilina
Estreptomicina

% de destruccin segn el tratamiento trmico

Pasteurizacin
90C / 30 min
100C / 30min
8%
20%
50%
66

Neomicina
Clorotetraciclina
Oxitetraciclina
Cloranfenicol

PRINCIPALES EFECTOS PROVOCADOS POR

ANTIBITICOS EN LOS PROCESOS INDUSTRIALES

66
90
90
LA

PRESENCIA

DE

Queso y productos fermentados

Demora en la acidificacin
Demora en la coagulacin
Coagulacin deficiente
Disminucin de la retencin de agua
Desarrollo de microorganismos indeseables
Alteracin de las caractersticas normales del producto:
o cuerpo dbil
o textura blanda
o sabor amargo (excesiva accin del cuajo)
o consistencia arenosa (yogurt)
Interferencia en la formacin de aroma en mantequilla fermentada.
En el siguiente cuadro se identifican algunos microorganismos lcticos y su
sensibilidad a la penicilina, estreptomicina y clortetraciclina:
CULTIVO

Strptococcus
cremoris
Strtococcus. lactis
Streptococcus.
thermophilus
Lactobacillus
acidophilus
Lactobacillus
casei
Lactobacillus
helveticus
Lactobacillus
lactis
Cultivo

Inhibicin por Antibiticos

Penicilina
Estreptomicina
Clortetraciclina
U.I. / ml
Gamas / ml
Gamas / ml
parcial
total
parcial
total
parcial
Total
0.05
0.1
0.17
0.5
0.5
0.0017
0.025
0.5
0.001
0.3
0.17
0.05
5.0
0.01
0.3
0.1
0.3 0.5
0.6
0.3
0.3
0.05
0.05
0.6
5.0
0.1
0.3
0.5
0.05
0.3 3.0
0.3
0.017
0.1
0.01
-

Mantequilla
Cultivo inicial para
quesos

0.17
0.20
0.05

0.2
0.2
0.50

0.04

0.1
0.02
0.025

MATERIAL
Equipo:
Bortex.
Bao mario a 80C
Estufa bacteriologica a 34C
Mechero
Pinzas de punta fina
Cristaleria:
Pipetas de 1 ml
Tubos de ensayo de 6 mL
Cajas petri
Consumibles:
Marcador indeleble
Discos de papel whatman de 6mm
Sensidiscos con penicilina a 0.01 UI p/disco
Solucin buffer # 1
Medio de cultivo para antibitico # 1
Biolgico:
Bacilo Subtilis
PROCEDIMIENTO POR MUESTRA DE LECHE
1. Marcar dos tubos de ensayo F (Fri) y C (Caliente).
2. Colocar en cada uno de los tubos 1 mL de leche y 2 mL de solucin Buffer.
3. Agitan en el bortex por 5 segundos.
4. EI tubo marcado con la C se lleva a bao Mara (80C) por 3 minutos
posteriormente se deja enfriar a temperatura ambiente y se agitan nuevamente en
el bortex.
5. EI tubo F se mantiene a temperatura ambiente.
6. En la caja petri con el medio de cultivo para antibitico # 1 con Bacilo subtilis se
colocan discos de papel whatman # 4 de 6mm humedecidos en el contenido de los
tubos marcados con F y C respectivamente y en el centro de la caja se coloca el
sensidisco con penicilina como referencia.
7. Introducir la caja de petri a la estufa bacteriana (34C) por 24 horas para su
cultivo.

RESULTADOS
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DISCUSION
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CONCLUCIN
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Nombre
del
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alumno:

Fecha:
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Firma:
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