Anda di halaman 1dari 8

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI : ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE

TUJUAN
1.

Memahami dan melakukan teknik pemisahan senyawa dengan metode elektroforesis.


2.

Mengetahui cara mengukur fragmen DNA.

ALAT DAN BAHAN


ALAT
1. Satu set alat elektroforesis
2. Mikropipet dan tip
3. Gel Doc
4. Power Supply
5. Parafilm
BAHAN
1. DNA Marker
2. Produk DNA
3. Ethidium Bromide (EtBr)
4. dd H2O
5. Gel Agarose
6. Loading Buffer (Loading dye)
7. Buffer Tri-Asetat-EDTA (TAE)
8. Akuades

CARA KERJA

Pembuatan Gel Agarose

0,4 gram bubuk agarose dilarutkan pada 50 ml Buffer TAE.

Campuran tersebut dilarutkan dengan cara dipanaskan.

Setelah semua terlarut kemudian didiamkan pada suhu 50C.

Gel Comb dipasang pada tangki elektroforesis.

Larutan agarose dituangkan pada tangki elektroforesis dan didinginkan hingga


mengeras.

Setelah gel tersebut mengeras, gel comb dapat diambil dan gel agarose siap untuk
digunakan.

Elektroforesis

Gel Agarose direndam dengan Buffer TAE.


1l loading dye dicampur dengan 3l produk DNA pada parafilm yang telah tersedia
dengan bantuan mikropipet.

Campuran tersebut dituangkan ke sumur/well pada gel agarose.

Sedangkan untuk 3l DNA marker 1kb dituangkan pada sumur/well yang berada
pada paling tepi atas dan bawah.

Tangki elektroforesis kemudian ditutup dan dihubungkan ke power supply.

Power Supply ( 400mA, 90V) dinyalakan selama 30 menit.

Dokumentasi

Gel agarose hasil elektroforesis direndam pada larutan EtBr selama 15 menit.

Dilanjutkan dengan direndam dalam akuades selama 15 menit.

Divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc dan kemudian diambil gambarnya.

PEMBAHASAN
Tujuan dari praktikum kali ini adalah agar mahasiswa dapat memahami secara baik dan mampu
untuk melakukan salah satu teknik/metode pemisahan senyawa (DNA dan Protein), yaitu metode
elektroforesis. Selain itu diharapkan mahasiswa juga dapat mengetahui bagaimana cara
mengukur fragmen DNA pada praktikum ini.
Secara singkat, elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul selular berdasarkan
ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan
listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif (Yuwono, 2005).
Prinsip kerjanya adalah jika molekul yang bermuatan negatif (DNA) dilewatkan melalui suatu
medium, misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya (positif), maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke
kutub positif (Elektroforesis) melalui membran matriks gel agarose tersebut (Yuwono, 2005).
Terdapat dua macam teknik elektroforesis yang telah berkembang yaitu, elektroforesis horizontal
maupun vertikal (Lisdiyanti, 1997). Berdasarkan jenisnya ada dua macam elektroforesis yaitu:
1.Elektroforesis bebas (free electrophoresis): molekul atau partikel yang akan dipisahkan
tersebar di seluruh larutan. Pemberian arus listrik pada larutan yang mengandung partikel
tersebut akan menyebabkan terbentuknya batas di antara dua larutan.
2.Elektroforesis zona: merupakan jenis elektroforesis yang paling banyak digunakan,
mempergunakan media penunjang, seperti kertas, selulosa asetat, agarose atau poliakrilamid
(Biosciences, 1999).

Dalam praktikum ini jenis elektroforesis yang digunakan adalah elektroforesis zona dan
menggunakan teknik elektroforesis horizontal karena menggunakan gel agarose yang diletakkan
pada alat elektroforesis secara horizontal dan teknik ini difungsikan untuk analisais DNA.
Kelebihan metode ini adalah mudahnya mengamati reaksi kimia selama proses berlangsung,
sampel dapat ditangani dengan baik dan cepat, gel dari hasil percobaan dapat disimpan dalam
kantong plastik dan didinginkan setelah percobaan, sehingga dapat dipakai untuk dokumentasi
penting yang dapat dipelajari lebih lanjut di lain waktu, dan beberapa kelebihan lainnya. Selain
kelebihan, metode ini juga memiliki kekurangan, yaitu rawan terjadi kesalahan pada proses
pemindahan campuran sampel ke dalam slot gel, karena slot gel ukurannya sangat kecil (Boffey,
1984).
Praktikum elektroforesis gel ini dimulai dengan pembuatan gel agarose 0,8%. Praktikan tidak
melakukan pembuatan gel agarose 0,8% karena dilakukan oleh asisten praktikum. Secara
umum, proses pembuatan gel agarose 0,8% dilakukan dengan cara mencampurkan bubuk
agarosa dengan larutan buffer TAE, yang kemudian dipanaskan di dalam microwave, selanjutnya
dituangkan ke dalam cetakan yang telah disiapkan dengan comb-nya dan tunggu sampai
mengeras. Bubuk agarose yang digunakan sebanyak 0,4 gr dan larutan running buffer TAE
(Trisasetat-EDTA) sebanyak 50 mL yang berperan untuk memudahkan migrasi dari fragmen
DNA berdasarkan perbedaan kekuatan ionik (Magdeldin, 2012). Setelah gel mengeras, gel
dimasukkan ke dalam ruang elektroforesis dan dilakukan penambahan running buffer.
Penambahan running buffer dilakukan dengan tujuan mempermudah pengerasan gel saat
dilakukan pemanasan (Gardner dkk, 1991).
Tahap selanjutnya adalah mencampurkan DNA dengan loading buffer yang memiliki fungsi
membantu sampel turun ke dalam well dan membantu memonitor berapa lama proses
elektroforesis telah berlangsung karena memiliki pewarna bromofenol biru (Magdeldin, 2012).
Selanjutnya dilakukan penuangan campuran loading buffer dengan produk DNA sebanyak 4l
dan juga larutan marker 1kb sebanyak 3l pada sumur/well yang telah dibentuk pada gel.
Sedangkan untuk marker 1kb dituang pada dua sisi ujung (atas dan bawah) well yang ada. Proses

pemindahan dilakukan dengan memakai mikropipet dan harus dilakukan secara hati-hati agar
campuran DNA dengan loading buffer tidak meluber ke bagian well yang lain. DNA memiliki
muatan negatif (DNA mengandung gugus PO4) sehingga diharapkan akan bergerak menuju
kutub positif (Martin, 1996).
Marker adalah segmen DNA yang spesifik dan telah diketahui ukurannya. Marker berfungsi
sebagai acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil ampifikasi. Marker DNA yang terdapat di
dalam ruang elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi pasangan basa dari molekul DNA
yang bermigrasi. Marker-marker DNA tersebut merupakan marker yang telah dibuat oleh pabrik
sehingga tanda pasangan basanya jelas. Salah satu contoh marker DNA adalah lambda HindIII.
Marker tersebut memiliki delapan fragmen DNA dengan kisaran 125 pb hingga 23.130 pb
(Birren and Lai, 1993; Martin, 1996).
Praktikum dilanjutkan dengan memasang penutup ruang elektroforesis dan diberikan arus listrik
untuk tahap running. Running elektroforesis dilakukan pada tegangan 90 Volt dan dengan arus
sebesar 400 mA selama 30 menit. Kecepatan migrasi DNA sangat dipengaruhi oleh tegangan
listrik dan arus listrik yang di berikan oleh power supply ke tangki elektroforesis. Fragmen DNA
yang besar akan bergerak lebih cepat dibandingkan dengan fragmen DNA yang kecil
(Magdeldin, 2012). Gel agarose nantinya akan dikeluarkan dari ruang elektroforesis setelah
mengalami perubahan warna. Dokumentasi dilakukan dengan gel doc (Davis dkk, 1994).
Pada tahap dokumentasi hal yang pertama dilakukan adalah merendam gel agarose hasil
elektroforesis pada larutan EtBr kurang lebih selama 15 menit. Larutan ini berfungsi untuk
meningkatkan daya fluoresensi DNA saat disinari sinar UV dalam Gel Doc. Setelah itu dilakukan
pembilasan dengan menggunakan Aquades selama kurang lebih 15 menit juga. Setelah tahaptahap tersebut barulah divisualisasi dengan menggunakan Gel Doc.
Gel doc adalah alat yang digunakan untuk mengamati dan mendokumentasikan hasil
elektroforesis. Komponen gel doc terdiri dari lampu UV, kamera dan komputer. Lampu UV
berfungsi menerangi bagian dalam dalam dari gel doc, kamera berfungsi memotret hasil

elektroforesis dan komputer berfungsi menjalankan proses dokumentasi lewat bantuan software
(Davis dkk, 1994).
Dalam proses elektoforesis terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi laju pergerakan dari
molekul DNA, yaitu:
1.

Ukuran Molekul DNA

Molekul yang berukuran lebih kecil akan cepat bergerak melewati gel karena hambatan yang
akan dihadapi tidak lebih banyak dibandingkan molekul berukuran besar.
2.

Konsentrasi gel

Semakin tinggi konsentrasi agarosa, semakin kaku gel yang dibuat sehingga sukar untuk dilewati
molekul-molekul DNA. Konsentrasi agarosa yang lebih tinggi memudahkan pemisahan DNA
yang berukuran kecil, konsentasi agarosa yang lebih rendah memudahkan pemisahan DNA
dengan ukuran yang lebih besar.
3.

Bentuk molekul

Molekul yang memiliki bentuk elips atau fibril akan lebih cepat bergerak dibandingkan dengan
yang berbentuk bulat.
4.

Densitas muatan

Densitas muatan yaitu muatan per unit volume molekul. Molekul dengan densitas muatan tinggi
akan bergerak lebih cepat dibandingkan molekul dengan densitas muatan yang rendah.
5.

Pori-pori gel

Semakin kecil pori-pori gel yang digunakan, semakin lambat pergerakan molekul DNA.
6.

Voltase

Semakin tinggi tegangan listrik yang diberikan, semakin cepat pergerakan molekul DNA.
7.

Larutan buffer elektroforesis

Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga mempercepat
migrasi DNA
(Wolfe, 1993).
Pada hasil praktikum ini terlihat bahwa pita fragmen DNA yang tersinari UV tidak menunjukkan
adanya pergerakan atau migrasi sama sekali, yang terlihat hanyalah migrasi dari marker DNA
pada sisi tepi gel agarose. Hal yang semacam ini kemungkinan disebabkan oleh terlalu lamanya
penyimpanan untai DNA setelah di isolasi pada praktikum yang sebelumnya, atau terdapat
sedikit kesalahan dalam penyimpanan. Tetapi, jika dilihat dari faktor-faktor yang mempengaruhi
proses elektroforesis dengan kondisi-kondisi yang sudah dicek secara baik dirasa tidak mungkin
untuk tidak bermigrasi sama sekali untai DNA tersebut. Jadi ada kemungkinan faktor yang lain
yang dapat mempengaruhi keberhasilan pada proses ini, yaitu untai DNA itu sendiri. Kenapa bisa
begitu, dimungkinkan karena dalam proses penyimpanan sebelumnya yang kurang baik, yaitu
dari suhu penyimpanan.
Jika pita fragmen DNA dapat terlihat maka dapat dihitung panjang fragmen dari suatu produk
DNA. Pita fragmen DNA dapat diukur dengan menggunakan suatu kurva regresi linier.
KESIMPULAN
1.

Teknik pemisahan senyawa dengan elektroforesis gel agarose termasuk dalam jenis

elektroforesis zona dengan menggunakan teknik elektroforesis horizontal.


2.

Elektroforesis memiliki prinsip kerja bahwa suatu molekul (DNA) yang bermuatan

negatif jika dialiri listrik akan bergerak menuju kutub positif milik elektroforesis melalui matriks
membran gel agarose.
3.

Panjang fragmen DNA dapat terlihat dengan menggunakan gel doc yang pada saat

didalamnya disinari dengan menggunakan sinar UV, setelah sebelumnya dilakukan tahap
elektroforesis. Setelah itu panjang fragmen DNA dapat diukur menggunakan kurva regresi linier.
4.

Faktor yang mempengaruhi laju migrasi dari fragmen DNA pada elektroforesis gel

adalah ukuran molekul DNA, konsentrasi, bentuk molekul, densitas muatan, pori-pori gel,
voltase, dan larutan buffer elektroforesis. Selain itu ada faktor lain yang dapat muncul sebagai
yang mempengaruhi laju migrasi fragmen itu sendiri, yaitu ukuran fragmen DNA dan faktor

ketelitian serta kehati-hatian dalam proses penyimpanan produk DNA jika produk tersebut
sebelumnya disimpan.
Biosciences, Amersham. 1999. Protein Electrophoresis. Amersham Biosciences : USA.
Gardner, E.J., M.J. Simmons, & D.P Snustad. 1991. Principles of genetics 8th ed. John Wiley & Sons
Inc., New York.
Lisdiyanti. 1997. Polymerase Chain Reaction: Cara Mudah Memperbanyak DNA. Warta Biotek : Bogor.
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers Ltd., Oxford.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing Company,
Belmont.