Mtodos de Deteccin virus y viroides en ctricas

Las ctricas son afectadas durante su ciclo de crecimiento y produccin

por numerosas enfermedades causadas por microorganismos como
hongos, bacterias, nematodos, partculas de virus y viroides. Las
enfermedades ms importantes son aquellas causadas por los virus y
los viroides ya que ocasionan una reduccin considerable en la
produccin y muerte de las plantas. En Venezuela se ha sealado la
presencia de los virus causantes de la Tristeza, la psorosis y
petrificacin y los viroides causantes de la Xilosporosis y Exocortis. De
los mtodos empleados en la deteccin de los virus en las plantas,
comnmente se utilizan las plantas indicadoras para estos cinco
patgenos y los mtodos serolgicos slo han sido utilizados con el
virus de la Tristeza. (CTV)
Eduardo Ortega Cartaya
FONAIAP-Campo Exp. Caripe

Los virus son partculas muy pequeas que slo pueden verse con la
ayuda de un microscopio electrnico, se multiplican en clulas vivas y
son transmitidas a plantas sanas por medio de insectos, nemtodos,
hongos o contacto mecnico. Generalmente tienen dos componentes
bsicos: cido nuclico (cido ribonuclico, RNA; o cido
desoxirribonuclico, DNA) y protenas.

Planta de
Tangelo
Orlando injerta
sobre Citrus
volkameriana, a
la cual se la
injertan chapas
de corteza de la
planta
sospechosa con
el viroide causal
de Xiloporosis.
Ntese el
oscurecimiento
de las hojas y
las dos podas
realizadas, bajo
la axila de las
cuales se
forman bolsas
de goma.

El cido nuclico contiene la informacin que determina las

propiedades de los virus como: forma y tamao de la partcula,
propiedades generales de la cubierta proteica y probablemente las
relaciones con sus vectores.
La protena es el componente que se halla en mayor concentracin y su
funcin es la encapsidacin del cido nuclico. Las propiedades
inmunolgicas dependen de la protena y posiblemente en el caso de
algunos virus es necesaria para iniciar la infeccin y tiene una funcin
importante en la transmisin por vectores.
Los viroides son los agentes causantes de enfermedades ms
pequeas que se conocen, y se componen bsicamente de un cido
nucleico, RNA, sin cubierta proteica.

Son varios los efectos de los virus y los viroides en las plantas: en el

caso de las ctricas estos patgenos causan los siguientes sntomas:

Enfermedad

Planta

V I

Sntomas

R U S

Aclaramiento
de nervaduras.

Amarillamiento
de hojas.
Tristeza

Naranja dulce
A Muerte de
plantas.

Reduccin de
la produccin.

Escamas en
corteza de
tronco y/o
ramas
principales.
Psorosis

Naranja dulce

Clorosis de
hojas.

Reduccin de
la produccin.

Petrificacin Naranja Harnlin Bolsas de

gomas en el
albedo del
fruto.

Protuberancias
en relieve,
duras al tacto,

en los frutos.

Disminucin de
la produccin

Cada de
frutos.

VIROIDES

Exudados
gomosos

Exocortis

Lima Tahiti

Rajaduras
longitudinales

Reduccin de
la produccin

Depresiones en
el leo del
tronco.

Bolsas de
goma.
Xilosporosis Mandarina criolla
Amarillamiento
de hojas.

A Reduccin de
la produccin.

Mtodos de Deteccin
Para la deteccin e identificacin de los virus y viroides de ctricas se
utilizan diversos mtodos, de los cuales son los ms importantes:

a. Planta Indicadoras

Patgeno

Indicador

Tristeza

Limn criollo

Psorosis

Naranja dulce Hamlin,

mandarina comn o
naranja agria

Petrificacin

Grapefruit, proveniente
de semilla

Exocortis

Cidra Ethrog Arizona

861-5-1 injertado
sobre Citrus
volkameriana Gynura
aurantiaca, Petunia
spp.

Tangelo Orlando o
Mandarina Parson
Xilosporosis
Special injertada sobre
C. volkameriana.

b. Pruebas serolgicas.
Se han utilizado para la deteccin del virus de la Tristeza. Estas
pruebas se denominan: a) anticuerpos fluorescentes; b)
inmunodifusin con SDS, c) ELISA y d) microprecipitacin. Estas
pruebas u otras no se utilizan para la deteccin de Psorosis, dado que
no se ha podido preparar un antisuero contra este virus. En el caso de
los viroides de la Xilosporosis y Exocortis no ha sido posible el uso de
las pruebas serolgicas, dado que estos patgenos carecen de cubierta
proteica. Actualmente, la prueba serolgica ms difundida es la de
ELISA.
c. Electroforesis
Esta tcnica se ha utilizado en la deteccin de Exocortis, mediante
geles de poliacrilamida, por ser este viroide un RNA de peso molecular
bajo.

Geles de poliacrilamida de la prueba de

electroforesis para la deteccin de
viroides. Ntese la columna 1 que
muestra la lnea del marcador 9 y por
encima, la del viroide; y la columna H,
que muestra slo la lnea del marcador
(Cortesa del Centro Nacional de la
Papa).

d. Microscopa electrnica
Esta tcnica se ha utilizado en la deteccin de Tristeza, utilizando
preparaciones parcialmente purificadas. Es un mtodo que requiere un
equipo de costo muy alto y es de baja sensibilidad en el diagnstico del
virus en ciertos cultivares.

PRINCIPIOS BSICOS DE SEROLOGA

Si un animal de sangre caliente es infectado con un agente que causa
enfermedad, tal como una bacteria o un virus, aparecen en su sangre,
como respuesta a la infeccin, protenas del tipo de las globulinas.
Estas protenas son denominadas anticuerpos y el agente estimulador
de su produccin, que es combinado con ellos "in vitro" se denomina
antgeno.
Un animal puede producir anticuerpos no solamente en respuesta a la
infeccin con un agente causante de enfermedad, sino tambin con
una gran cantidad de materiales extraos, generalmente protenas y
polisacridos. El suero que contiene anticuerpos puede ser separado
del animal y se le denomina antisuero, mientras que al suero
proveniente de un animal, al que nunca se le ha inyectado un material
antignico, se le denomina suero normal. Cuando el antisuero es
apropiadamente preparado, es tan especfico que slo reacciona con el
virus (antgeno) que indujo la produccin de anticuerpos. Con el fin de
producir antisueros especficos para un determinado virus, ste debe
ser inyectado al animal (generalmente un conejo) que se inmuniza en
forma pura y no alterada, para lo cual el virus debe ser purificado por
cualquier mtodo que demuestre ser eficiente.
La va (intramuscular, subcutnea, etc.) y el nmero de inyecciones, el
intervalo entre las mismas y la cantidad de virus que debe inyectarse a
un animal, con el fin de obtener antisueros con alta concentracin de
anticuerpos (ttulos altos) vara con el virus, el animal que se ha de
inyectar, etc.

Cuando los anticuerpos y el antgeno se juntan in vitro ocurre una

reaccin. Esta reaccin puede ser observada de diferentes formas
dependiendo del mtodo empleado y constituye la base de las pruebas
serolgicas.

Planta de Cidra
Ethrog 861-5-1
injertada
sobreCitrus
volkameriana,
a la cual se le
injertan
chapas de
corteza de la
planta
sospechosa
con el viroide
causal de
Exocortis.
Ntese el
enrollamiento
de las hojas de
la Cidra y el
cambio de
insercin de
los pecolos
(epinastia).

USOS DE LAS TCNICAS SEROLGICAS

Las pruebas serolgicas para los virus de plantas se realizan con varios
propsitos, de los cuales los siguientes son los ms importantes:

a. Para chequear presencia de virus en plantas, como por ejemplo

en estudios de diagnstico y deteccin de los mismos en
programas de semillas.

b. Para determinar el grado de relacin antignica entre las

partculas de diferentes virus o aislamientos de los mismos.

c. Para determinar la cantidad de nucleoprotenas de los virus o de

protenas en una preparacin.

d. Para localizar virus en tejidos o clulas.

e. Para proporcionar informacin sobre la estructura de las
partculas de los virus.

ELISA
El trmino ELISA es un acrnimo formado de Enzyme-LinkedInmunosorbent Assay. Es el mtodo aerolgico ms difundido
actualmente, dado su alta sensibilidad, rapidez y permite estimar
cuantitativamente al virus.
Esta tcnica consiste bsicamente en la retencin de partculas de virus
por anticuerpos absorbidos a placas plsticas de microtitulacin y la
revelacin colorimtrica de la presencia de esas partculas por
anticuerpos conjugados a una enzima. Puesto que una pequea
cantidad de enzima puede hidrolizar una cantidad mayor de substrato,
la reaccin se ve as amplificada y por ello aumenta la sensibilidad de
la tcnica. La hidrlisis del substrato da lugar a un cambio de color de
la solucin y esto permite determinar los resultados visualmente o
cuantificarlos por medio de un colormetro (Fig. 1). Existen varias
modificaciones de ELISA, el utilizado en la deteccin de Tristeza es el
mtodo original (directo) el cual fue denominado de doble anticuerpo o
"Sandwich".

Placa de microtitulacin para

ELISA ilustrando hoyos de color
oscuro que representan
muestras infectadas (I) con el
virus causal de la tristeza y
hoyos transparentes, que
representan muestras sanas (H).

I. INTRODUCCION
Los mtodos utilizados para reconocer las infecciones por
virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e
INDIRECTOS, segn persigan demostrar la presencia del
virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma
viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte
del husped en el curso de la infeccin.

Gran parte de las tcnicas utilizadas en el diagnstico clnico

se basan en pruebas serolgicas que identifican anticuerpos
especficos frente a diversas protenas antignicas. Sin
embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias
pruebas que detecten precozmente la infeccin viral
(tratamientos especficos, medidas profilcticas, etc.).
En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia
de antgenos virales previamente al desarrollo de la
seroconversin, siendo esta prueba la nica evidencia de la
exposicin al virus cuando no existe aumento de los niveles
de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).
Igualmente la deteccin del genoma viral puede favorecer la
precocidad del diagnstico viral y su confirmacin. En la
ltima dcada se han desarrollado una serie de tcnicas para
el diagnstico viral basadas en la deteccin de cidos
nucleicos. De ellas la Reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) es la ms utilizada.
En el momento actual, la tendencia en el diagnstico
virolgico consiste en emplear nuevas y ms sensibles
tecnologas de deteccin de antgenos y de investigacin de
cidos nucleicos con el propsito de lograr un diagnstico
viral ms rpido. El desarrollo de quimioterapia antiviral
efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la
identificacin rpida, sensible y especfica de los virus, una
necesidad.
PRINCIPALES TCNICAS
METODOS DIRECTOS
Son aquellos que detectan:
1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).
2. La presencia de antgenos virales (tcnicas inmunolgicas):
Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanlisis (EIA), Test de
Aglutinacin.
3.La presencia de cidos nucleicos virales (PCR, etc.).
4.El virus como partcula viral (microscopa electrnica).

1. Aislamiento Viral - Cultivos Celulares

La base del diagnstico viral es la deteccin del virus o de sus

componentes. El aislamiento del virus era la tcnica standard
de oro sobre la cual se medan todas las otras pruebas de
diagnstico viral, pero hoy en da con el desarrollo de las
nuevas tcnicas de Biologa Molecular ya no es la ms
sensible. De igual forma el aislamiento de virus tiene una
sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que slo
se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir
la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en
el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que
demanda das a semanas para la identificacin, y en
consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir
en la atencin del paciente. Adems, es un proceso laborioso
y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos
adecuados, por ejemplo, se necesitan varias lneas celulares
para la deteccin ptima de virus.
Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos ms
corrientemente empleados para la propagacin de los virus.
Un cultivo celular es obtenido, de explantes de rganos o de
embriones de animales.
Estas clulas obtenidas aspticamente se disocian tratndolas
con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular.
La suspencin de celulas libres as obtenidas se coloca en la
superficie plana de un recipiente de vidrio o plstico en donde
las clulas se adhieren y multiplican formando una fina capa
de clulas que se llama MONOCAPA CELULAR.
Esta monocapa de clulas crece en un medio de cultivo
complejo que contiene albmina, vitaminas, sales, glucosa,
etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminacin
bacteriana adicionndole al medio antibiticos adecuados.
Los cultivos celulares en monocapa son los ms usados,
aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensin, explantos,
cultivos de rganos, cultivos en microcarriers, etc.).
Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de clulas, tejidos u

rganos tomados directamente del organismo y pueden
subcultivarse una o dos veces.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en
pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y
que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de
subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha
logrado establecer una lnea continua, esta debe de haber
sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las lneas celulares
continuas ofrecen las siguientes ventajas:
Disponibilidad para todos los investigadores de stocks de clulas
idnticas, ya sea congeladas en ampollas o en monocapa de botella
de cultivos, con la posibilidad de reconstituirlas cuando sea
necesario.
Facilidad relativa del pasaje y mantenimiento en todos los
laboratorios.
Libre de contaminacin con agentes extraos.

Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su

susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una
relacin especfica husped-virus, y es en funcin de los datos
clnicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para
inocular el material.
Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por
un perodo de hasta 14 das promedio, esperando la aparicin
de efecto citoptico, toxicidad o degeneracin celular,
observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y
luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no
inoculados para control y comparacin con cualquier cambio
morfolgico observado en los cultivos inoculados. El efecto
citoptico es la visualizacin de cambios morfolgicos ms o
menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas
por la accin del virus sobre el cultivo celular.

Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede

recurrir a tcnicas que ponen en evidencia la presencia de
aquel en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin,
hemaglutinacin y tinciones con anticuerpos monoclonales.
(Ver 2)
Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin
intracelular, expresan en la membrana de la clula husped
elementos estructurales virales llamados hemaglutininas,
glicoprotenas capaces de unirse a receptores especficos en
la membrana de glbulos rojos de diferentes especies
animales. De modo que si se agregan glbulos rojos a un
cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infeccin de
esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la
superficie celular.
Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en
evidencia en el sobrenadante de los cultivos utilizando el
mismo fundamento que para la hemadsorcin.
2. Deteccin de Antgenos - Tcnicas Inmunolgicas

Las siguientes tcnicas inmunolgicas pueden utilizarse tanto

para la deteccin de antgenos (mtodos directos), como de
anticuerpos (mtodos indirectos). En el caso de deteccin de
antgenos, se utiliza un anticuerpo especfico antiviral (por lo
general IgG) a cuya fraccin Fc se ha conjugado una molcula
marcada, que puede ser isotiocianato de fluorescena
(Inmunofluorecencia), un istopo radioactivo 125I o 131I
(RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, o biotinaavidina (EIA), para objetivar la reaccin.
Para el procedimiento indirecto (deteccin de anticuerpos), se
emplea un anti-anticuerpo marcado y la reaccin se realiza
sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio.
INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA (ID)
Es una de las tcnicas ms antiguas y de uso ms difundido
en el laboratorio clnico. El principio bsico de la
inmunofluorescencia directa . Muestras clnicas apropiadas
son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se
dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos
marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a

travs de la membrana celular y se combinan con los

antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin
antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de
fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde
manzana.
Esta tcnica se puede utilizar para una identificacin rpida
del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: clulas
eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofarngeo), o
se la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico
observado en cultivos celulares.
Sin embargo la realizacin de la reaccin es laboriosa,
depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un
microscopio de fluorescencia y de una persona con
experiencia para llegar a un diagnstico certero, as como una
recoleccin y preparacin de la muestra adecuada.
Aun as, el mtodo, en manos de una persona con experiencia
resulta til para la identificacin rpida de ciertos virus como
los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnstico
etiolgico en el curso de una jornada de trabajo. Adems
puede estudiar varias muestras simultneamente.
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha
incrementado la especificidad y en algunos casos la
sensibilidad de estos ensayos. Esta tcnica requiere slo 24hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 %
comparada con cultivos celulares para la identificacin de
virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza
A.
La tincin con inmunoperoxidasa es similar a la de la
inmunofluorescencia y es la tcnica de eleccin en algunos
laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos
adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal esta
marcado con una enzima que requiere la adicin de un
substrato para evidenciar la reaccin por un cambio de color
que es visible micro y macroscpicamente.
TEST DE AGLUTINACION
El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso,
que a veces se usa para la deteccin de antgenos virales en

muestras clnicas. Los ensayos de aglutinacin, dependen de

la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre
eritrocitos o partculas de ltex. Luego este reactivo se incuba
con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las
partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra
presente. Estas pruebas en general se complementan o se
confirman por medio de otros ensayos debido al elevado
porcentaje de reacciones inespecficas.
El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno
de Rotavirus en heces (el ms importante) mostrando una
buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para
Rotavirus. Adems es una tcnica rpida y barata. Tambin se
la ha usado para detectar antgenos de Adenovirus.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Fue originalmente aplicado para identificar el antgeno de
superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo antiHBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y
especificidad, pero la aparicin de un mtodo como el ensayo
inmunoenzimtico (EIA) con su mayor tiempo de conservacin
de los reactivos, su costo relativamente ms bajo y la
ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las
tcnicas de RIA en la mayor parte de los casos de deteccin
de antgeno viral.
ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)
Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente
en la captura del antgeno por anticuerpos especficos unidos
a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o
una pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en
la muestra clnica se combina con el anticuerpo fijado a la
fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin
de otro anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La
enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El
substrato para esas enzimas vara. En la reaccin con la
peroxidasa el substrato es un perxido capaz de oxidar un
compuesto qumico incoloro que en su forma oxidada tiene un
color caracterstico.
En el caso de la fosfatasa la desfosforilizacin es la
responsable directa de la aparicin del color. Por esta tcnica
se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida

y automatizada, no requiriendo de un observador

experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen
por medio de espectrofotmetros especialmente diseados,
siendo entonces una tcnica ms objetiva. Fig. 2.
3. Tcnicas de Biologa Molecular

Investigacin de cidos nucleicos virales

Las tcnicas de estudio y diagnstico que a continuacin se
presentan, constituyen una herramienta ingeniosa
desarrolladas a partir de los estudios de la Biologa Molecular.
SONDAS DE ACIDOS NUCLEICOS
Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un
fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de
restriccin. Luego estas secuencias extradas, se pueden
desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un
istopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen
una secuencia conocida se llaman sondas de cidos nucleicos.
Hoy en da se estn produciendo sondas de cidos nucleicos
sintticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucletidos
de muy alta especificidad que estn disponibles
comercialmente y son las ms usadas en los laboratorios.
DETERMINACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES POR
SONDA SINTETICA
Es un ensayo de hibridacin molecular con una sonda
marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y
RNA-DNA.
Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y
desnaturalizan los cidos nucleicos. Posteriormente se aade
un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se
incuba en condiciones para que se produzca la hibridacin. La
muestra se pasa entonces por una columna que contiene un
gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no
hibridada.
Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la
hibridacin: Si est marcada con un istopo radiactivo se
puede hacer una lectura en un contador gamma de manera

que la cantidad de radiacin medida en la columna es

directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente
en el suero problema o tambin se puede realizar la
electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel
de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la
sonda mediante la aplicacin de una placa de rayos X
(Autoradiografa). Si esta marcada con una enzima se detecta
por una simple evaluacin colorimtrica.
AMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS VIRALES
MEDIANTE UNA REACCION EN CADENA DE LA
POLIMERASA (PCR)
Una nueva tcnica, llamada Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para
incrementar el nmero de molculas de DNA blanco en las
muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede
amplificar una nica molcula de DNA y una sola copia de
genes puede ser extrada, de mezclas complejas de
secuencias genmicas y visualizada como bandas diferentes
en geles de agarosa.
La PCR es, por tanto, una amplificacin de secuencias
especficas del DNA. Se basa en la utilizacin de secuencias
cortas de nucletidos sintticos llamados primers o
cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una
de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas,
llamadas moldes o templados. Para que la reaccin tenga
lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa
termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y
deoxinucletidos trifosfatos. La funcin natural de la DNA
polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los
deoxinucletidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para
la construccin. El nucletido al cual se una la polimerasa
ser complementario de la base en la posicin
correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza as una
cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada
"primer ".
Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto
por 3 pasos bsicos:
a. Desnaturalizacin del ADN doble cadena por la elevada
temperatura (95C).

b. Acoplamiento de los primers, desciende la temperatura

(entre 55C-72C).
c. Elongacin del primers, aqu se eleva la temperatura a
72C permitiendo la incorporacin de los deoxinucletidos.
Mientras tanto se van deplecionando los primers y los
deoxinucletidos, y se van sintetizando nuevas cadenas de
DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del
fragmento de DNA limitado por los "primers ". Los fragmentos
de DNA as obtenidos se pueden identificar por varias
tcnicas: visualizacin en geles de agarosa o poliacrilamida
mediante tincin con bromuro de etidio y examen con luz
ultravioleta, o hibridacin con una sonda marcada. La
combinacin de la PCR y las sondas de cidos nucleicos
marcadas promete ser el mtodo ms sensible para la
deteccin e identificacin de los virus.
4. Microscopa Electrnica

Mediante el microscopio electrnico es posible observar la

morfologa de los viriones presentes en muestras clnicas. La
limitacin del mtodo adems del costo del microscopio, es
que necesita de una alta concentracin de viriones
(aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del
virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto
hace que sea una tcnica poco utilizada, ms an con el
desarrollo de tcnicas alternativas de utilidad similar.
Si la concentracin de virus en la muestra clnica es baja, y
por tanto no visible directamente por microscopio electrnico,
se pueden utilizar tcnicas que aumenten la visualizacin, por
ejemplo, la inmunoelectromicroscopa, que consiste en el
agregado de anticuerpos especficos antivirales y la formacin
de agregados de partculas que son ms fcilmente visibles
que las partculas solas. Fig. 5.
METODOS INDIRECTOS
Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o
celular) por parte del husped: . Deteccin de anticuerpos
especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas (EIA, IFI,
WB, etc.). Produccin de anticuerpos in vitro.

En el curso de una infeccin varan las poblaciones de

anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase
la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el
transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o
quedar a baja concentracin residual y, en cambio, aumentan
las IgG. La bsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad
para hacer diagnstico de infeccin reciente en una sola
muestra de suero extrada en el perodo agudo de la
enfermedad. Este mtodo se emplea para el diagnstico de
enfermedades como: Rubola, Citomegalovirus, Hepatitis a
virus A, etc.
La bsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se
utiliza como tcnica de tamizaje, por ejemplo, para el
diagnstico de la infeccin por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos
positivos son confirmados en la misma muestra de suero por
otra metodologa.
La seroconversin es el aumento del ttulo de anticuerpos
cuatro veces o ms observado en dos muestras pareadas de
suero. La primera muestra se obtendr en el perodo agudo
de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 das despus de la
primera, en el perodo de convalesencia.
La seroconversin es til para establecer el diagnstico
retrospectivo, pero no para el diagnstico temprano de una
infeccin, puesto que debemos esperar al perodo de
convalecencia para obtener la segunda muestra del suero.
Este tipo de diagnstico es til para estudios epidemiolgicos.
Las diferencias de ttulos deben ser mayores de cuatro veces
para tener valor estadstico y se debera estudiar ambas
muestras simultneamente.
Las determinaciones serolgicas tambin nos pueden
informar sobre el estado inmune del paciente frente a muchas
infecciones virales, como paperas, sarampin y rubola,
donde la presencia de anticuerpos especficos indica que el
individuo ha estado expuesto previamente al virus y que es
inmune para una nueva infeccin.
A veces el diagnstico serolgico tiene dificultades, por
ejemplo: cuando se realiza en recin nacidos para identificar

la causa de una infeccin congnita. La evaluacin de los

resultados en este caso es difcil porque los ensayos
serolgicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG
presente en el suero del nio provino de la madre por va
transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del nio de
la IgG de la madre.
Tradicionalmente, el diagnstico de las enfermedades virales
congnitas se realiza mediante determinaciones seriadas de
IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica
que los anticuerpos eran maternos y que el nio no est
infectado. El aumento en el ttulo de anticuerpos indica que el
nio esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta
infectado. Sin embargo, hoy en da el diagnstico serolgico
viral se ha simplificado con las nuevas tcnicas que detectan
IgM, ya que la deteccin de IgM especfica en el suero del nio
confirma que el nio est infectado, porque la IgM no
atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen
materno.
A continuacin, se describirn los mtodos serolgicos ms
comnmente usados en el diagnstico viral.
Los mtodos tradicionales para el diagnstico serolgico de
las infecciones virales incluyen: la neutralizacin, la inhibicin
de la hemaglutinacin (IHA) y la hemaglutinacin indirecta
(HAI). La confirmacin serolgica de una infeccin aguda por
cualquiera de estas tcnicas tradicionales esta dada por un
aumento de cuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos
cuando se emplean diluciones al doble seriadas.
En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos para
la deteccin de anticuerpos virales, y en muchos casos han
demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en
trminos de economa, sensibilidad, especificidad y rapidez.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)
La IFI, es un mtodo rpido y confiable para la determinacin
de anticuerpos antivirales en el suero del paciente. Se basa
en la unin de anticuerpos antivirales presentes en el suero
del paciente a los antgenos virales expresados en la
superficie y citoplasma de clulas infectadas, que han sido

fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de

especificidad se usan clulas no infectadas.
El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del
paciente con las clulas infectadas y no infectadas. Luego se
realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente
anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de
fluorescena. El isotiocianato de fluorescena es una sustancia
que se vuelve fluorescente a la exposicin de la luz
ultravioleta y emite una luz verde caracterstica. El conjugado
se unir a los anticuerpos del paciente si la reaccin es
positiva, leyndose la prueba en un microscopio de
fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparicin
de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las clulas
infectadas, mientras que las clulas control no fluorescen.
ENZIMOINMUNOANALISIS INDIRECTO (EIA)
Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los
ltimos aos al diagnstico de anticuerpos virales.
Tiene las ventajas de ser un mtodo verstil, relativamente
econmico, sensible y de lectura objetiva (instrumental).
La metodologa es la siguiente: Los antgenos virales se
inmovilizan sobre una fase slida (esferita, policubetas para
microtitulacin u otros elementos de plstico) y se agregan
los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la
reaccin Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina
antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el
substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer
con un espectrofotmetro y en algunos casos de forma visual.
TEST DE AGLUTINACION
El fundamento y el procedimiento de esta tcnica ya fue
descripto para el estudio de Ag viral (mtodo directo).
Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales,
por eso se usan partculas de ltex recubiertas con Ag viral.
Fig. 8.
WESTERN BLOT (WB)

Las tcnicas inmunolgicas de Inmunoblot estn encontrando

amplias aplicaciones en el diagnstico virolgico. Son
particularmente tiles para el diagnstico del HIV.
La tcnica de WB se basa en la separacin electrofortica de
protenas virales que son posteriormente inmovilizadas en
papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la
presencia de anticuerpos especficos contra cada una de esas
protenas.
Esta tcnica se realiza esquemticamente en 3 pasos:
1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de
virus que luego son tratados qumicamente para su
disgregacin e inactivacin. Los antgenos resultantes del
lisado viral se separan por electroforesis en gel de
Poliacrilamida.
2. Se realiza una transferencia (blotting o
electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de
nitrocelulosa.
3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de
nitrocelulosa. Posteriormente se aaden anticuerpos antiinmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o
fosfatasa alcalina) y, por ltimo, se agrega el substrato
enzimtico para la visualizacin de las bandas reactivas con
un producto final coloreado.
La tcnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero ms
especfica que esta.
En la prctica slo el 3er paso es el que se realiza en los
laboratorios de diagnstico, ya que los equipos comerciales
proveen de las tirillas con los antgenos. (Esto facilita la
estandarizacin de las determinaciones).
PRODUCCION DE ANTICUERPOS IN VITRO
Se trata de una tcnica nueva que ha sido aplicada para el
diagnstico de la infeccin perinatal. Este procedimiento
revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in
vitro a partir de los linfocitos B extrados de sangre total, lo

que indicara que el sistema inmune del paciente ha sido

estimulado por el virus.
La produccin de Ac antivirales in vitro promete ser de gran
valor en el diagnstico temprano de nios infectados por VIH.