Anda di halaman 1dari 12

METODE DETEKSI ASAM NUKLEAT

oleh: Arif Hendrawan/1406531763

Abstrak
Asam nukleat dalam intisel terbagi menjadi dua jenis yaitu DNA (deoxyribonucleic acid)
atau asam deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid ) atau asam ribonukleat. Deteksi asam
nukleat diartikan sebagai cara atau teknik untuk menganalisis asam nukleat pada suatu sampel.
Analisis ini bisa ditinjau dari dua sisi, yaitu dari segi kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif ini
bertujuan untuk mengetahui berat molekul dan urutan kode dari asam nukelat. Beberapa macam
metode yang termasuk analisis kualitatif adalah pewarnaan, elektroforesis gel, blotting, RFLP,
hibridisasi in situ, dan DNA/RNA sequencing. Sedangkan analisis kuantitatif bertujuan untuk
mengetahui konsentrasi atau kadar asam nukleat pada sampel. Metode-metode yang tergolong
dalam analisis kuantitatif adalah spektrofotometri UV-Vis, PCR, microarray, dan SAGE.
Pendeteksian dari asam nukleat banyak sekali dimanfaatkan dalam bidang kedokteran dan
biokimia, umumnya analisis gen-gen sel abnormal.

Kata Kunci: deteksi, asam nukleat, analisis kualitatif, analisis kuantitatif, staining, elektroforesis
gel, blotting, hibridisasi in-situ, RFLP, DNA/RNA sequencing, SAGE, spektrofotometri
UV-Vis, microarray, PCR

A. Analisis Kualitatif
Secara sederhana metode ini bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen tertentu di
dalam asam nukleat, di berat molekul dari DNA/RNA, dan urutan kode genetic dari DNA/RNA.
Metode ini terdiri dari pewarnaan (staining), elektroforesis gel, blotting, RFLP, hibridisasi in situ,
dan DNA/RNA sequencing.
A.1. Pewarnaan (staining)
Metode staining ini menggunakan tambahan pewarna ke dalam sampel yang ingin diamati
untuk mendeteksi keberadaan DNA atau RNA sehingga mempermudah pengamatan visualisasi
dibawah mikroskop. Jenis pewarna yang digunakan untuk DNA/RNA ini pun khusus, berikut
beberapa contohnya:
1. Acridine Orange
Jenis pewarna ini akan memberikan warna hijau (526 nm) bila berikatan dengan DNA, dan
akan memberikan warna merah (650 nm) bila berikatan dengan RNA.

2. Hoechst
Jenis pewarna ini akan memberikan warna biru (461 nm) bila berikatan dengan DNA.

Acridine Orange

Ethidium Bromide

Tujuan dilakukannya metode ini adalah untuk:


1. Mengetahui apakah sampel termasuk sel hidup atau tidak dengan mendeteksi
keberadaan DNA
2. Mengetahui apakah sampel berada dalam siklus proses sintesis protein dengan
mendeteksi keberadaan RNA
3. Untuk mengetahui letak nucleus (warna pendar) & siklus sel (letak DNA/RNA)
Prosedur percobaannya yaitu :
1) Fixation. Tujuannya untuk menghentikan proses metabolisme dan mencegah
degradasi struktur sel. Dapat menggunakan bahan kimia ataupun pembekuan;
2) Permeabilization. Tujuannya untuk merawat membran (surfaktan ringan) dan
memungkinkan molekul dye yang lebih besar masuk ke bagian dalam sel;
3) Mounting. Meletakkan sampel ke preparat mikroskop (microtom); dan
4) Stainning. Menyisipkan dye pada sampel sehingga sampel berwarna (mordant).
Dapat dilakukan sebelum atau sesudah fixation dan mounting.
Tipe staining yaitu :
1) Basic stain (positive stain). Bersifat kationik. Dye mengikat sampel;
2) Acidic stain (negative stain). Bersifat anionic. Dye mengelilingi sampel;
3) In vivo stain. Pewarnaan jaringan hidup; dan
4) In vitro stain. Pewarnaan jaringan yang sudah dipisahkan dari hubungan biologinya.

A.2. Elektroforesis Gel


Metode ini bertujuan untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas perbedaan
berat molekul dan struktur fisiknya. Berat molekul dari suatu fragmen DNA dapat
diperkirakan dengan membandingkan laju migrasinya dengan dengan laju migrasi
fragmen DNA yang sudah diketahui berat molekulnya. Makin besar berat molekulnya,
maka semakin rendah laju migrasinya.
Prosedur percobaan elektroforesis gel yaitu :
DNA akan dipotong menjadi beberapa fragmen oleh enzim restriksi. Kemudian
larutan yang mengandung potongan DNA ini diletakan di dalam gel. Lalu gel ini
dihubungkan dengan arus listrik sehingga salah satu sisi gel akan bermuatan

positif, sedangkan sisi lainnya bermuatan negatif.


Fragmen DNA akan bergerak dari sisi negatif ke sisi positif.

Elektroforesis. Mengalirkan listrik sehingga DNA/RNA yang bermuatan negatif akan

bergerak ke katoda (elektroda positif); dan


Kemudian sampel diberi warna agar dapat terlihat jelas

Gambar 1. Prosedur percobaan elektroforesis gel

Tipe elektroforesis gel :


1) Agarose (DNA/RNA); dan
2) Poliakrilamidan(protein).
Elektroforesis Gel Agarosa
Dituangkan secara horizontal
Memisahkan molekul yang besar
Non-toxic
Kebanyakan digunakan untuk pemisahan

Elektroforesis Gel Poliakrilamida


Dituangkan secara vertical
Memisahkan molekul yang kecil
Neurotoxic
Digunakan untuk pemisahan DNA atau

DNA
Tahap pewarnaan sebelum dan sesudah

protein
Tahap pewarnaan setelah penuangan gel

penuangan gel
Mempunyai laju pemisahan yang lebih cepat

Pembuatannya lebih sulit, karena


menggunakan poliakrilamida dengan
resolusi tinggi

A.3. Blotting
Metode ini digunakan untuk mengetahui ekspresi gen atau urutan kode dari suatu
RNA/DNA. Metode blotting ini ada 2 jenis yaitu northern blotting untuk mengetahui ekspresi gen
dengan cara mendeteksi RNA, dan southern blotting untuk mengetahui urutan kode dari suatu
sampel DNA.
Prosedur percobaan blotting secara umum :
1)
2)
3)
4)

DNA/RNA genom dipotong dengan enzim restriksi endonuclease;


DNA/RNA dipisahkan dengan metode elektroforesis gel;
Denaturasi (untuk DNA);
Sampel DNA/RNA diletakkan pada membran nilon dengan proses transfer vakum,
kapiler, ataupun listrik;

5) Pelabelan DNA probe;


6) Hibridisasi dengan DNA/RNA probe; dan
7) Visualisasi dan deteksi (radioaktif atau non-radioaktif).

Gambar 2. Langkah-langkah Southern/Northern Blotting

A.4. Hibridisasi Insitu


Metode ini merupakan suatu cara untuk mengidentifikasi atau mengetahui suatu letak gen
dari spesies dengan cara menghubungkan DNA/RNA sampel dengan DNA/RNA probe (masingmasing DNA/RNA berantai tunggal) sehingga berkemungkinan menghasilkan pasangan DNADNA, DNA-RNA, atau RNA-RNA. Probe ini diartikan sebagai asam nukleat berantai tunggal yang
telah diberi label atau penanda sehingga dapat digunakan untuk mendeteksi sekuens dari sampel.
Probe dapat digunakan untuk mendeteksi sekuens dari sampel karena memiliki urutan
basa nitrogen yang komplementer. Selain itu metode ini juga ada 2 jenis, yaitu fluorescent in situ
hybridization (FISH) dan genomic in situ hybridization (GISH). Perbedaan dari kedua jenis metode
ini adalah pada jenis probe yang digunakan. Pada FISH, probe yang digunakan ber-fluorescent
yang dapat berpendar jika dikenakan sinar UV dan hanya berupa potongan asam nukleat pendek.
Sedangkan pada GISH probe yang digunakan adalah keseluruhan genom DNA dari suatu species.
Prinsip kerja baik dari FISH maupun GISH sama dengan hibridisasi in situ secara keseluruhan.
Tahapan kerja hibridisasi in situ:
1. Pengikatan DNA berantai tunggal (sampel) pada membrane
2. Penambahan DNA probe ke dalam membrane agar terjadi pasangan antara DNA
sampel dan DNA probe

3. Melakukan pencucian untuk menghilangkan sisa-sisa DNA probe yang tidak


berpasangan dengan DNA sampel
4. Deteksi adanya hybrid dari pasangan DNA sampel dan DNA probe

Gambar 3. Tahapan kerja hibridisasi in-situ

A.5. Restriction Fragmen Length Polymorphism (RFLP)


Dalam dunia biologi molecular RFLP merupakan suatu cara yang digunakan untuk
mengeksploitasi beberapa variasi sekuens DNA yang homolog. Aplikasi dari RFLP adalah untuk
menganalisis suatu penyakit turunan di dalam keluarga. Misalkan dengan metode ini kita ingin
mengetahui asal gen pembawa suatu penyakit. Maka langkah pertama adalah menganalisis DNA
tiap anggota keluarga yang terjangkit penyakit dan mencocokan alelnya. Dengan begitu asal
muasal pembawa penyakit tersebut bisa diketahui. Selain itu dengan RFLP ini kita juga bisa
mengetahui kemungkinan anggota keluarga lainnya untuk terjangkit penyakit.
Tahapan kera RFLP:
1. DNA yang telah diisolasi dari sampel dipotong menjadi beberapa fragmen oleh enzim
restriksi
2. Hasil fragmen DNA ini dipisahkan dengan metode elektroforesis gel
3. Fragmen DNA yang telah terpisah dipindahkan ke dalam membrane melalui proses
southern blotting
4. Proses hibridisasi yang terjadi pada membrane akan menentukan panjang tiap-tiap
fragmen yang berkomplemen dengan DNA probe
5. Tiap panjang fragmen ini disebut alel dan bisa digunakan untuk analitik genetic

Gambar 4. Tahapan proses deteksi RFLP

A.6. DNA/RNA Sequencing


DNA sequencing merupakan suatu metode untuk mengetahui secara tepat urutan
nukleotida yang ada di dalam DNA. DNA sequencing ini terbagi menjadi 2 metode, yaitu metode
Sanger dan metode Maxam-Gilbert. Pada metode Sanger proses sequencing memanfaatkan
enzim DNA polymerase, sedangkan pada metode Maxam-Gilbert proses sequencing berdasar
pada reaksi peluruhan kimia.
Tahapan kerja metode Sanger:
1) Denaturasi isolat DNA sehingga menjadi rantai tunggal dengan panas atau enzim
restriksi;
2) Perlekattan primer dan pemanjangan basa. Terbentuk empat pasang potongan
rantai primer yang terputus akibat bantuan DNA polymerase dan dideoxynukelotida;
3) Terminasi. Pemutusan rantai primer dari DNA sampel menggunakan panas dan
formamida;
4) Elektroforesis gel. Pemisahan potongan rantai primer; dan
5) Analisis urutan basa nukleotida pada DNA sampel dari urutan dideoxinukleotida
pada potongan rantai primer
Prinsip kerja metode Maxam-Gilbert:
1) Penandaan isolat rantai DNA dengan radioisotop 32P pada ujung 5;
2) Denaturasi isolat DNA, sehingga keduanya menjadi rantai tunggal yang dapat
disequence secara terpisah;
3) Penambahan dimetil sulfat dan hidrazin. Dimetil sulfat bereaksi dengan purin dan
hidrazin bereaksi dengan pirimidin untuk mematahkan ikatan glikosida antara gula
ribosa dengan basa;
4) Piperidin menjadi katalis untuk ikatan fosfodiester (tempat basa pada ikatan
glikosida sebelumnya digantikan);
5) Elektroforesis fel. Pemisahan fragmen rantai tunggal hasil reaksi; dan

6) Pembacaan autoradiogram untuk menentukan sekuens DNA sampel.


Pada RNA sequencing dengan metode Sanger ada sedikit perbedaan dengan yang sudah
dijelaskan sebelumnya. Sifat RNA kurang stabil bila dibandingkan dengan DNA, oleh karena itu
RNA ini harus diubah terlebih dahulu menjadi cDNA dengan menambahkan enzim transcriptase.
Setelah berubah menjadi cDNA maka proses selanjutnya adalah sama mulai dari tahap awal.

B. Analisis Kuantitatif
Secara umum metode ini bertujuan untuk menentukan kadar/konsentrasi DNA/RNA yang
ada di dalam suatu sampel. Metode ini terdiri dari spektrofotometri UV-Vis, PCR, Mircroarray, dan
SAGE.
B.1. Spektrofotometri UV-Vis
Merupakan metode analisis yang digunakan untuk menentukan konsentrasi dan
kemurnian DNA/RNA suatu sampel berdasarkan kemampuan basa nukleotida (purin
dan pirimidin) menyerap cayaha.
Pita ganda DNA/RNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan
kontaminan protein atau fenol pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan kemampuan
menyerap sinar UV, maka dapat ditentukan kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA.
Prosedur percobaan spektroskopi yaitu :
1) Isolasi DNA/RNA sampel;
2) Pelarutan sampel dan peletakannya ke dalam kuvet;
3) Peletakkan kuvet berisi sampel ke dalam spektrofotometer;
4) Penembakan kuvet berisi sampel dengan panjang gelombang 260 nm dan 280
nm; dan
5) Analisis hasil absorbansi.
Terdapat 2 jenis spektroskopi yang sering digunakan, yaitu :
Spektroskopi Sinar Tampak
Sinar tampak
Panjang gelombang 380-750

Spektroskopi UV-Vis
UV dan sinar tampak
Panjang gelombang 190-380 nm

nm
Sampel harus berwarna
Sampel tidak harus berwarna
Menghitung kemurnian DNA/RNA menggunakan rumus :

kemurnian=

260
280

Dalam hal ini, kemurnian DNA berkisar Antara 1.8 2.0 sehingga :

kemurnian<1.8 isolasi belum murni


kemurnian> 2.0 nilai dd H 2 O yang diambil lebih banyak dari DNA /RNA
Menghitung konsentrasi DNA menggunakan rumus :

[ DNA ]= 260 50 faktor pengenceran

Dalam hal ini, 50 adalah larutan dengan nilai absorbnsi 1.0 sebanding dengan 50g
untai ganda DNA per ml atau 50g/ml untai ganda DNA (dsDNA);
Menghitung konsentrasi RNA menggunakan rumus :

[ RNA ] = 260 50 faktor pengenceran


Dalam hal ini, 40 adalah larutan dengan nilai absorbnsi 1.0 sebanding dengan 40g
untai tunggal RNA per ml atau 40g/ml untai tunggal RNA (ssRNA);

B.2. PCR (Polymerase Chain Reaction)


Metode ini digunakan untuk membuat salinan suatu segmen tertentu dalam jumlah yang
banyak dari DNA sampel. Umumnya metode ini digunakan untuk mendiagnosa penyakit,
mengidentifikasi bakteri atau virus, membantu kepolisian dalam mengungkap kasus criminal, dan
lain-lain.
Tahapan kerja PCR:
1. Tahap inisialisasi: pemanasan DNA template pada suhu 94-96oC selama 1-9 menit
2. Tahap denaturasi: pemanasan kembali DNA template pada suhu 94-98oC selama 2030 detik. Pada tahap ini DNA akan memisah dan menjadi rantai tunggal
3. Tahap annealing: suhu pemanasan diturunkan sampai 50-65oC selama 20-40 detik.
Pada tahap ini primer akan menempel pada DNA template
4. Tahap ekstensi/elongasi: suhu pada tahap ini tergantung dari DNA polymerase yang
digunakan, namun pada umumnya berkisar 72oC. Pada tahap ini DNA polymerase
mulai mensintesis rantai DNA baru yang komplemen dengan cara menambahkan
dNTP yang sesuai ke DNA template
5. Tahap akhir elongasi: suhu pemanasan pada tahap ini berkisar 70-74oC selama 5-15
menit. Pada tahap ini dipastikan bahwa tiap rantai tunggal DNA telah mengalami
proses elongasi

Gambar 5. Skema PCR

B.3. Microarray
Mircroarray ini merupakan suatu metode yang digunakan untuk melihat dan mempelajari
gen mana saja yang aktif di dalam sel tubuh manusia. Kenyataannya tiap gen yang identik belum
tentu selalu aktif di tiap sel tubuh manusia. Dengan mengetahui karakteristik ini, sekarang para
ilmuwan sudah bisa mengetahui efek negatif yang ditimbulkan apabila gen yang berada di dalam
sel tubuh manusia tidak bekerja secara normal. Dengan teknologi ini ilmuwan sudah mulai lebih
memahami beberapa jenis penyakit dan infeksi yang bisa terjadi pada tubuh manusia.
Tahapan kerja microarray:
1. Mengisolasi mRNA yang ada di dalam sel tubuh
2. Menandai tiap mRNA yang telah diisolasi dengan enzim transcriptase, yang nantinya
akan merubah mRNA menjadi cDNA
3. Memberi pewarna yang berbeda pada tiap cDNA (misal sel normal diberi warna hijau,
dan sel kanker diberi warna merah)
4. Lalu meletakan kedua jenis cDNA pada alat microarray
5. Pada alat ini cDNA tadi akan mengalami hibridisasi, dan pola warna yang
sebelumnya diberikan pada masing-masing cDNA akan bercampur
6. Untuk melihat pola warna yang terbentuk diperlukan alat pindai khusus

Gambar 6. Proses deteksi dengan microarray

Misalkan menggunakan gambar contoh diatas, sel normal diberi pewarna hijau dan sel
kanker diberi pewarna merah. Apabila pada hasil pindai lebih banyak menghasilkan pola berwarna
hijau maka sel normal lebih aktif daripada sel kanker. Namun apabila lebih banyak menghasilkan
pola berwarna merah berarti sel kanker lebih aktif daripada sel normal. Lalu apabila pola yang
muncul berwarna kuning (bukan kedua warna awal yang telah kita berikan) ini artinya sel normal
dan sel kanker memiliki tingkat keaktifan yang sama. Dengan kata lain berdasarkan contoh
gambar diatas, pasien yang diuji melalui metode microarray ini memiliki kemungkinan untuk
terkena kanker.
B.4. SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)
SAGE merupakan metode yang digunakan untuk analisis secara keseluruhan dari pola
ekspresi gen, menggambarkan populasi mRNA yang ada dalam sampel, dan melihat aktivitas gen
dalam sel secara keseluruhan. Dalam bidang biologi molekular metode ini biasa dipakai untuk
memahami karakteristik sel yang sehat dan yang terkena penyakit dengan cara membandingkan
kedua sel yang berbeda. Secara sederhana berikut tahapan kerja dari SAGE:
1. Mengisolasi mRNA dari sel sampel (misal sel tumor/kanker)
2. Mengekstraksi sebagian sekuens pada bagian tertentu dari tiap mRNA
3. Concatamer : menghubungkan tiap-tiap sekuens yang telah dipisahkan membentuk
rangkaian yang lebih panjang, atau biasa disebut concatamer
4. Mengklon rangkaian sekuens tersebut
5. Mengurutkan rangkaian yang telah diklon dengan DNA sequencers
6. Analisi data yang didapat dengan computer untuk menghitung label sekuenssekuens yang lebih kecil

Gambar 7. Langkah kerja SAGE

C. Summary
Setelah semua pembahasan dijabarkan satu-persatu dapat disimpulkan bahwa
Secara garis besar terdapat 6 metode analisis kualitatif asam nukleat, yaitu :
1. Staining atau pewarnaan untuk meningkatan hasil visualisasi DNA/RNA;
2. Elektroforesis gel untuk memisahkan fragmen DNA/RNA;
3. Hibridisasi untuk mengetahui urutan basa nukleotida dengan memasangkan DNA
probe;
4. Blotting untuk mengetahui urutan basa nukleotida dengan transfer DNA/RNA;
5. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) untuk membandingkan perbedaan
dengan DNA homolog dari hasil potongan fragmen enzim restriksi; dan
6. DNA/RNA sequencing untuk mengetahui urutan basa nukleotida DNA/RNA
Pada metode analisis kuantitatif asam nukleat terdapat 4 metode yang dapat digunakan,
yaitu :
1. Spektroskopi untuk mengukur kemurnian dan konsentrasi DNA/RNA;
2. Polymerase Chain Reaction (PCR) untuk memperbanyak DNA/RNA dan menghitung
jumlah yang dihasilkan;
3. Microarray untuk analisis gen aktif; dan
4. Serial Analysis of Gene Expression (SAGE) untuk analisis ekspresi gen secara
keseluruhan.

DAFTAR PUSTAKA

Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J. Raff, M., Roberts, K., Walter, P. (2008). Molecular
Biology of the Cell, 5th ed. Garland Science, Taylor & Francis Group, NY

http://web.unair.ac.id/admin/file/f_35969_PCR.pdf

http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/H1399

https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/nucleicacid-gel-electrophoresis/southern-blotting.html

http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout%20Kuliah/Analisis%20Senyawa
%20Aktif/Elektroforesis.pdf

http://www.uvm.edu/~cgep/Education/RFLP.html

http://www.cs.indiana.edu/~predrag/classes/2004falli400/lecture_notes_4.pdf

http://www.bio-rad.com/en-us/applications-technologies/introduction-pcr-analysis

https://www.genome.gov/10000533/dna-microarray-technology/

http://www.bioaliment.ugal.ro/revista/1/Paper1pp.pdf

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11251221