FUNCIN DE REACTIVOS

Medio de Sypher y Strauss

Medio mnimo y sinttico.

Regulador de fosfatos 50mM de pH 7.3

Ayuda a mantener un pH ptimo para medir la actividad de la Succinato Deshidrogenasa.

2,6-diclorofenol indofenol (DCFIF) 1.53mM en regulador de fosfatos

Indicador de reaccin xido- reduccin que va a actuar como aceptor artificial final de electrones al
trmino de la cadena artificial creada por medio del mtodo de Ells.
Oxidado (azul)
Reducido (incoloro)

Metosulfato de fenazina 0.6mg/mL en regulador de fosfatos

Es utilizado como transportador de electrones, ya que se acoplar a la cadena transportadora de
electrones entre la reduccin de nucletidos de piridina y 2,6-diclorofenol indofenol.

NADH 0.3mM en regulador de fosfatos 0.3mM

Nicotin adenin dinucletido
Para la determinacin del efecto del amital o quinacrina en la actividad de la NADH DH

KCN 0.1M (pH 3, disuelto en KH2PO4 mM)

Inhibidor de la enzima oxidasa terminal (complejo IV) que permite que el 2,6-diclorofenol
indofenol sea el aceptor final de electrones.

Amital o quinacrina 45mM en regulador de fosfatos

Inhibidor de la cadena de transporte de electrones, bloquean la cadena de transporte de
electrones entre la NADH deshidrogenasa (Complejo I) y la CoQ.

Glucosa al 50%
Fuente de carbono adicionada para la solucin de trabajo del medio de Sypher y Strauss.

Succinato de sodio al 25%

Fuente de carbono adicionada para la solucin de trabajo del medio de Sypher y Strauss.

Succinato de sodio 120mM

Donador de electrones para llevar a cabo la cadena artificial de transporte por el mtodo de Ells.

a) Obtencin de la 1suspensin celular

50 mL Sypher y Strauss
con succinato 0.5%
Inocular

50 mL Sypher y Strauss
con Glc 1.0%

Lavar 2 veces
con regulador de
2 fosfatos estril

Resuspender a 10 mL
con el mismo regulador

Incubar a 37C
agitacin por 12 hrs

Cosechar clulas
por centrifugacin

a) Obtencin de la suspensin celular

1
1
Inocular
1 mL

E. coli y succinato 0.5%

2
Inocular
1 mL
E. coli y Glc 1.0%

50 mL de
succinato 0.5%

Con alcuotas
de 4 mL leer
600 de lo
50 mL de
matarces 1,2,3
Glc 1.0%
y 4 Usando
como blanco
medio de
cultivo sin
inoculo
50 mL de
(succinato 0.5%
succinato 0.5%
y Glc 1.0%)
50 mL de
Glc 1.0%

A) OBTENCIN DE LA SUSPENSIN CELULAR

1

Incubar a
37C, 5 hrs
y volver a
leer en el
espectrofo
tmetro

Cosechar clulas
por centrifugacin

Lavar 2 veces con regulador de

fosfatos y ajustar a una 600
de 0.8

B) EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE LA

ACTIVIDAD DE LA SUCCINATO DESHIDROGENASA
Agregar

0.25 mL de 2,6-diclorofenol indofenol.

0.6 mL de KCN.
3.25 mL de regulador de
fosfatos.
1 mL de succinato de sodio.
0.4 mL de metosulfato de fenazina.
0.5 mL de suspensin celular.

Registrar lecturas
cada 30 seg por
5 min.

Sellar con parafilm

y mezclar por inversin
lo mas rpido posible.

Leer el %T a 600 nm
con un blanco de
regulador
de
fosfatos.

C)EFECTO DEL AMITAL O QUINACRINA SOBRE

LA ACTIVIDAD DEL SUCCINATO DH Y NADH DH
1

Trasferir 10mL

Aadir cantidad
Pequea de lisozima

Incubar
T 37C
15 min

TRATAMIENTO TRMICO
Repetir hasta obtener suspensin altamente viscosa

Adicionar pequea porcin de DNasa

Congelacin
Hielo seco-etanol

Descongelacin
Bao Mara
37C

Homogeneizar por agitacin

Hasta desaparicin de
viscosidad

MANTENER EN BAO DE HIELOS!

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

SERIE 1

0.5 mL en c/tubo
del extracto de
Clula crecida en
SUCCINATO

+1 mL de amital
o quinacrina

Succinato DHasa

2
Preincubar
T amb

5 min

+1 mL de amital
o quinacrina

NADH DHasa

4
+1mL de regulador
de fosfatos

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

SERIE 2

0.5 mL en c/tubo
del extracto de
Clula crecida en
GLUCOSA

5
+1 mL de amital
o quinacrina

Succinato DHasa

6
Preincubar
T amb

5 min

+1 mL de amital
o quinacrina
NADH DHasa

8
+1mL de regulador
de fosfatos

MEDICIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA

1

0.5 mL de DCFIF
0.6 mL KCN
1.6 mL de regulador de
Fosfatos.
0.8 mL de metosulfato
de Fenazina

+1 mL de
Succinato
de sodio

+1 mL de
NADH + H+

Medicin de actividad enzimtica

Sellar con parafilm

y mezclar por inversin
lo mas rpido posible

Leer el %T a 600 nm con un blanco

de regulador de fosfatos

Registrar lecturas
cada 30 seg por
5 min

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES

CADENA DE TRANSPORTE DE ELECTRONES

PARA ENTEROBACTERIAS

Tomada de: Cadena respiratoria terminal, Captulo 8. Documento pdf, pgina 7.

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/termodinamica_biologica/cadenarespiratoriaterminal.pdf