MICROBIOLOGIA DE LA LECHE ANLISIS MICROBIOLOGICO

BACTERIAS MESOFILAS VIABLE, STREPTOCOCUS AUREUS, HONGOS Y

LEVADURAS Y COLIFORMES TOTALES
I.

OBJETIVOS

II.

Determinar cuantitativamente los microorganismos aerobios mesfilos.

Estudiar el procedimiento e importancia de la del recuento de bacterias
aerobias mesfilas viables.
Conocer el nmero de microorganismos aerobios mesfilos que contiene el
alimento.
Determinar
el
NMP
de
coliformes
totales,
numeracin
de
staphylococcusaureus en la muestra.
Determinar la numeracin de coliformes mediante el mtodo de recuento
en placa.
Determinar en NMP de coliformes fecales en la muestra.
Diferenciar dentro del gnero de staphylococcus las especies no patgenas
y la patgena.
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de recuento en placa, la
numeracin de hongos y levaduras viables presentes en el producto
alimenticio destinado al consumo humano.

FUNDAMENTO TERICO
1. RECUENTO
TOTAL
DE
VIABLES(

BACTERIAS

AEROBIAS

MESFILAS
RTBAMV)

Los microorganismos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo

que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente
en aquellos que favorecen de algn modo su sobrevivencia o desarrollo.
Los alimentos por su produccin primaria, generalmente tienen un importante
micro biota normal, segn la regin y condiciones en que se producen;
adems, su composicin tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le
proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los
microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia
de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus
atributos.
Adems de la micro biota normal, los alimentos son susceptibles de
contaminacin durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna
nociva, o por contaminacin cruzada; algunos de los microorganismos
contaminantes pueden ser patgenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su
mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de
higiene y seguridad, hasta la aparicin de enfermedades transmitidas por
alimentos (ETAs).

Dado el tamao de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes

en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de clulas
por gramo, su determinacin cuantitativa requiere la preparacin de diluciones
conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar
los clculos. En esta prctica se establece la forma general de preparar dichas
diluciones.
En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de
sus caractersticas, algunos pueden requerir modificaciones o mtodos
especficos pero, en todos los casos donde sea posible, se recomienda
apegarse a estas guas y modificarlas nicamente cuando sea necesario.
MATERIALES Y EQUIPOS
Matraz
Tubos de ensayo
Agua peptonada 0.01% esterilizada
Placa Petri
Pipeta
Balanza analtica
Probeta
Papel filtro o Algodn
Hornos de esterilizacin o autoclave
Estufa
Gradilla
PROCEDIMIENTO
Se esteriliza todo material a usar,
luego iluir la muestra y
preparar en un mortero.
Esterilizar el matraz previamente con tampn.
Pesar 10gramos de muestra en una balanza.
Agregar al matraz esterilizado la muestra ms 90ml de agua peptonada
(la medicin se puede hacer en probeta o pipeta).
Agitar y filtrar (debe llegar ser asptica o estril), colocar el tampn una
vez realizado este paso.

Calentar a bao mara a 43 -45 C cada vez que se agrega a la placa Petri,
agitar empezar del final al principio.
Luego colocar a la estufa donde se incuba a 29- 30 -31 C, en un tiempo
de 48horas.
El resultado se expresara en ufc/gr o ufc/ml.

2. NUMERACIN DE COLIFORMES, DETERMINACIN

PROBABLE (NMP)

DEL NMERO MS

COLIFORMES
Las coliformes son una familia de bacterias que se encuentran comnmente
en las plantas, el suelo y los animales, incluyendo a los humanos. La presencia
de bacterias coliformes en el suministro de agua es un indicador de que el
suministro de agua puede estar contaminado con aguas negras u otro tipo de
desechos en descomposicin. Generalmente, las bacterias coliformes se

encuentran en mayor abundancia en la capa superficial del agua o en los

sedimentos del fondo. Los coliformes se introducen en gran nmero al medio
ambiente por las heces de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse
que la mayora de los coliformes que se encuentran en el ambiente son de
origen fecal. Sin embargo, existen muchos coliformes de vida libre.
La denominacin genrica coliformes designa a un grupo de especies
bacterianas que tienen ciertas caractersticas bioqumicas en comn e
importancia relevante como indicadores de contaminacin del agua y los
alimentos.
Coliformes significa con forma de Coli, refirindose a la bacteria principal del
grupo, la Escherichia Coli, descubierta por el bacterilogo alemn THEODOR
VON ESCHERICH en 1860.
Caracteres bioqumicos:
El grupo agrupa a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener
las siguientes propiedades bioqumicas:
ser aerobias o anaerobias facultativas
ser bacilosGram negativos;
no ser esporgenas
fermentar la lactosa a 35 C en 48 horas, produciendo cido lctico y gas.
Las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el intestino de
los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos,
pero tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en
suelos, semillas y vegetales.
Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces
de humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse que la mayora de los
coliformes que se encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo,
existen muchos coliformes de vida libre.
A. NUMERO MS PROBABLE DE COLIFORMES TOTALES
Preparar las muestras de alimento de acuerdo al
recomendado.
Pipetear 1ml de c/u de las diluciones del
homogenizado de alimento en tubos de caldo
verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA)
utilizando tres tubos por dilucin.
Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas
Anotar los tubos que muestren produccin de gas
(prueba presuntiva)
De cada tubo que contiene gas, aislar sobre
placas con agar-violeta cristal-rojo neutro-bilis
(VRBA) o agar ENDO.
Incubar los tubos a 35C 37C por 24- 48 horas

procedimiento

Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:

a. la formacin de colonias, rojo oscuro con dimetro mayor de 5mm en
agar VRBA.
b. La formacin de colonias rojas rodeadas halo en agar ENDO.
Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP para
expresar el resultado.

B. NUMERACIN DE COLIFORMES DE ORGEN FECAL

EQUIPOS Y MATERIALES
Asa de inoculacin.
Bao de agua, regulado a 44 (+/- 0.1C)
Pipetas bacteriolgicas de 5ml
Caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA), volmenes de 10ml en
tubos de 150x15mm. Conteniendo tubos de fermentacin invertidos
(75x10mm).
Caldo triptosa, volmenes de 1ml en tubos de 150x15mm.
Reactivo de KOVACS.
PROCEDIMIENTO:

Seleccionar los tubos de caldo verde brillante bilis lactosa (caldo BRILA)
que muestren formacin de gas en prueba presuntiva.
Inocular una azada de cada tubo gas positivo a un tubo de caldo BRILA y
un tubo de caldo triptosado.
Incubar los tubos a 44 (+/- 0.1C)
Despus de 24 horas de incubacin, efectuar la prueba de indol en los
tubos con caldo triptosa.
Controlar la formacin de gas en los tubos con caldo BRILA despus de
24 y 48 horas de incubacin.
Los cultivos que muestran produccin de gas en caldo BRILA y
formacin del indol en caldo triptosa son positivos para coliformes
fecales.
Referirse a la tabla de NMP para expresar el resultado.

C. NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES POR EL MTODO DE

RECUENTO EN PLACA
MATERIALES:
Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra.
Incubadora a 45-37C.
Pipetas bacteriolgicas de 1ml.
Bao de agua regulada a 44- 46C, para temperar el agar.
Agar Violeta Cristal Rojo Negro Bilis (VRBA)
PROCEDIMIENTO
Prepara la muestra por el procedimiento recomendado para la
preparacin de dilucin de muestra.

Transferir 1ml de cada dilucin de la muestra a una placa de Petri

estril.
Adicionar a cada placa de Petri, 10-15ml de agar violeta cristal rojo bilis
temperado a 44- 46C.
Mezclar el contenido de las placas mediante movimientos de vaivn y
rotacin de cada placa. Dejar solidificar la mezcla 5 a 10 minutos, luego
distribuir un adicional de 10ml de medio de plaqueado como doble capa,
cubriendo completamente la superficie de medio solidificado e que
inhibir la formacin de colonias en la superficie.
Invertir e incubar las placas durante 24 horas a 35-37C. nicamente las
colonias rojo oscuro que midan 0.5mm o ms de dimetro en la placa,
que tengan entre 20 y 200 colonias, se consideran bacterias coliformes.
Si es posible seleccionar para el recuento solamente aquellas placas no
con ms de 150 colonias de estas colonias. Multiplicar el nmero de
colonias por dilucin para obtener el nmero de bacterias coliformes por
gramo o ml de muestra.
- Calculados a partir de los datos de Man (1975).
- En cada nivel de dilucin, inocular 1ml en cada uno de tres tubos
de medio.
- Para calcular en NMP de las diluciones mayores que las que se
sealan multiplicar el NMP por el factor de dilucin apropiado de
10,100,1000 , etc. Por ejemplo , si se han seleccionado tubos
provenientes de las diluciones 10-2,10-3, 10-4, multiplicar por 10 ,
si de las diluciones 10-3, 10-4, 10-5 multiplicar por 100 .

3. NUMERACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO

Staphylococcus aureus es un microorganismo de forma coccea que se
agrupa en adoptando una disposicin de racimos irregulares. Son anaerobios
facultativos, aunque crecen mejor en aerobiosis. Muestran un buen desarrollo
a concentraciones de NaCl superiores al 10%, caracterstica que se aprovecha
para su aislamiento.
S. aureus produce intoxicacin alimentaria de carcter toxignico. Estos
microorganismos producen entero toxinas que actan a nivel del tubo
digestivo produciendo nuseas, vmitos y diarreas. Estos sntomas aparecen a
las pocas horas de ingerido el alimento contaminado.
La principal fuente de contaminacin de los alimentos se encuentra en los
manipuladores. Este microorganismo se localiza en la nariz, piel, pelo o en
lesiones. El 50% de las personas sanas albergan S. aureus en su nasofaringe y
al menos un 20% pueden producir toxinas. Estas personas contaminan el
alimento mediante secreciones nasales, saliva, escoriaciones, partculas de
heridas infectadas o al tocar con la mano contaminada el alimento. Los

principales alimentos implicados en la intoxicacin estafiloccica son leche,

carne y productos crnicos, pescados, huevos, pasteles y ensaladillas.
Morfologa
El S. aureus es un coco inmvil, de 0.8 a 1 micrmetro de dimetro, que se
divide en tres planos para formar grupos
de clulas irregulares semejantes a
racimos de uvas. En extendidos de pus
los cocos aparecen solos, en pares, en
racimos o en cadenas cortas. Los racimos
irregulares
son
caractersticos
de
extendidos tomados de cultivos que se
desarrollan en medios slidos, mientras
que en otros cultivos son frecuentes las
formas de diplococos y en cadenas
cortas. Unas pocas cepas producen una
capsula o capa de baba que incrementa
la virulencia del microorganismo.
El S. aureus es un microorganismo
Grampositivo pero las clulas viejas y los
microorganismos fagocitados se tien
como gramnegativos.
EQUIPOS Y MATERIALES:
Los requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de la muestra de
alimento
Placas de Petri de vidrio (100x 15mm) o de plstico de 90 x 15mm.
Pipetas de1ml graduadas al 0.1
Extensores de vidrio
Bao de agua regulado a 44-46C
Incubadora regulada a 35-37C
AGAR SAIR- PARKER
Caldo de cerebro-corazn
Tubos de 75 x 10mm contenido 0.3ml de plasma de conejo.
PROCEDIMIENTO

101 ,102 , 103 , y 104

Preparar diluciones

Pipetear 0. 1ml del homogenizado y las diluciones por duplicado en la

superficie de las placas de Agar BAIRD PARKER previamente secadas y,
distribuir cada inoculo con un extensor de vidrio hasta que la superficie del
medio aparezca seca.

ABP

ABP

ABP

ABP

ABP

Incubar las placas en posicin invertida a 371C durante 30-48horas.

Despus de 30 horas de incubacin seleccionar las placas que representan
entre 20 y 200 colonias y contar todas aquellas colonias negras y brillantes
con borde blanco angosto rodeadas de zonas claras que contrastan con el
medio opaco. Estas colonias corresponden a Staphylococcus aureus.
Marcar la posicin de las colonias a incubar las placas durante 18 horas
adicionales.
Al final del periodo de incubacin (48horas) contar todas las colonias con las
caractersticas descritas anteriormente y adems aquellas colonias negras
brillantes con o sin borde blanco y sin zonas claras. Someter un nmero
significativo de colonias sospechosas (no menor a 5) la prueba de la
coagulasa. Algunas cepas de S. aureus pueden aparecer rodeadas de zona
opaca despus de 30 horas de incubacin de 35-37C, para un gran nmero
de cepas a veces no muestra esta apariencia despus de 48 horas y
someter a un nmero equivalente de ellas a la prueba de la coagulasa.
Esta prueba servir
para distinguir aquellos
cultivos de S. aureus
(coagulasa positivo) de S. epidermidis (coagulasa negativa) que puedan dar
una apariencia similar
A. PRUEBA DE LA COAGULASA
- Sembrar las colonias seleccionadas en Caldo de cerebro corazn e
incubar a 35-37C. durante 20 a 24 horas.
- Adicionar 0.1ml del cultivo a tubos de 75x10mm que contenga 0.3ml de
plasma de conejo incubar a 35-37C.

Examinar despus de 4 horas de incubacin si el plasma ha perdido su

fluidez o se encuentra un cogulo ms o menos grande. Si la reaccin
es negativa, incubar los tubos a temperatura de laboratorio y reexaminar despus de 24 horas. Las diferentes reacciones de coagulasa
se observan en la tabla de puntuacin.
Calcular del total de colonias caractersticas, la proporcin de la
colonias positivas a las prueba de la coagulasa teniendo en cuenta la
dilucin empleada y expresar el nmero de Staphylococcus coagulasa
positivo por gramo o mililitro de muestra.

4. NUMERACIN DE HONGOS Y LEVADURAS

Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el
ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como
contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y
levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos, sin embargo
tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros alimentos.
Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y
levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es
menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja
humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de
almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la
irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos
lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos,
cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las
mermeladas, especias, etc.
Realizar adecuadamente mediante el mtodo de recuento en placa, la
numeracin de hongos y levaduras viables presentes en productos
alimenticios destinados al consumo humano.
EQUIPOS Y MATERIALES:
Los requisitos para la preparacin de dilucin de las muestras de
alimentos.
Placas de Petri de vidrio 100 y 15mm
Pipetas bacteriolgicas de 1.5 y 10ml
Bao Mara o incubadora para temperar el agar a 44 46C
Incubadora regulada a 20 24C
Contador de colonias
Oxitetraciclina extracto de levadura glucosa agar (OGA),o Agar patata
glucosa o Agar suero de naranja.
PROCEDIMIENTO
Preparar el alimento por uno de los tres procedimientos recomendados en
la seccin sobre preparacin y dilucin de las muestras de alimentos.

Pipetear por duplicado a las placas de Petri estriles, alcuotas de 1ml de

las diluciones

101 102 103 104 105

las diluciones preparadas y

sembradas pueden variar de acuerdo al nmero de colonias sospechosas.

Agregar de 10 a 15ml de medio de cultivo, temperado a 44 46C.

Mezclar inmediatamente, la alcuota con el agar por:

- Movimiento de la placa de arriba hacia abajo, por 5 veces.
- Rotacin de las placas en sentido de las agujas del reloj, 5 veces.
- Movimiento de la placa 5 veces en la direccin que haga ngulo recto
del usado en el primer tiempo.
- Rotacin de la placa 5 veces en sentido inverso de las agujas del
reloj.
Despus de solidificado el agar, invertir las placas Petri e incubarlas a 20
24C por 3 a 5 das.
Usando el contador de colonias, contar todas las colonias, contar todas
las colonias de las placas que contengan de 20 100 colonias, efectuar
el examen microscpico cuando se requiera identificar las colonias.
Reportar el nmero de ufc de hongos y de levaduras por g o ml de
alimento.

III.

RESULTADOS

COLIFORMES

IV.

CONCLUSIONES
RECUENTO
TOTAL
DE
BACTERIAS
AEROBIAS
MESFILAS
VIABLES( RTBAMV
Recuentos altos en ALIMENTOS ESTABLES a menudo indican materias

primas contaminadas o tratamientos no satisfactorios desde el punto

de vista sanitario.
En los PRODUCTOS PERECEDEROS pueden indicar tambin
condiciones inadecuadas de tiempo/temperatura durante su
almacenamiento

La presencia de un nmero elevado de bacterias aerobias mesfilas

que crecen bien a temperatura corporal o prxima a ella, significa
que pueden haberse dado condiciones favorables a la multiplicacin
de los microorganismos patgenos de origen humano o animal.
Todas las BACTERIAS PATOGENAS conocidas vehiculadas por los
alimentos son mesfilas y en algunos casos contribuyen con su
presencia a los recuentos en placa encontrados.
Los recuentos de bacterias mesfilas no explican la vida til en un
alimento
conservado
en
refrigeracin,
ya
que
muchos
microorganismos mesfilos no crecen a temperaturas por debajo de
los 5C.
Para esta finalidad es preferible el recuento de bacterias viables
psicrotrficas con temperaturas de incubacin entre 0 y 5 C durante
10 das.

NUMERACIN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS COAGULASA POSITIVO

Las enterotoxinas A y D son las ms frecuentemente asociadas con las

intoxicaciones alimentarias, y el tipo B se detecta con mayor regularidad en
infecciones intrahospitalarias.
Se logro el recuento de Staphylococcusaureus en alimentos en este caso
fue el queso fresco molida donde encontramos gran cantidad de esta
bacteria que seguramente fue contaminada primero por el modo de
obtencin y luego cabe la posibilidad que no se haya aplicado muy bien las
BPM.

NUMERACIN DE COLIFORMES, DETERMINACIN

PROBABLE (NMP)

DEL NMERO MS

Estas bacterias se elimina con tratamiento trmico a 60 65C aunque es

muy bajo y se puede aumentar la temperatura.

Coliforme lactosa positiva ocurre la fermentacin y se obtiene CO 2 es decir
el medio de cultivo esta dentro y va a salir en forma de gases quiere decir

que la reaccin es positiva y si no ocurre nada la reaccin es negativa.

Cuando hablamos de coliformes totales nos referimos a casi todas su
familia como lactosa positivo se le denomina con el nombre de coliforme.

NUMERACIN DE HONGOS Y LEVADURAS

La identificacin de levaduras y mohos en alimentos tiene un inters desde

el punto de vista esttico de la carne, pero a nivel de salud pblica no

V.

RECOMENDACIONES
COLIFORMES
Se recomienda trabajar con 3 muestras consecutivas y con esos valores se
encuentra el resultado.
Tener buena limpieza en los baos especialmente ya que estos se
dispersen rpidamente, produciendo diarrea, es la bacteria con la que
constantemente estamos tratando en todo sentido.
Esterilizar el ambiente.
Se necesario trabajar con MERCK es ms HOMOGENEA en caldo caldo brilla.
HONGOS Y LEVADURAS

VI.

representa inters alguno ya que conforman menos del 25 % de

lasespecies identificadas y de stas, un nmero muy bajo son de forma
daina.
Por otro lado es de gran de inters la determinacin de bacterias entre ellas
Clostridium ssp. Ya que esta relacionada con diferentes sndromes
queafectan a nivel gastrointestinal llegando a comprometer la vida de
losconsumidores. Por tal razn ha sido de gran importancia la realizacin de
este informe quenos ha dado a conocer la importancia de la determinacin
demicroorganismos en alimentos y el mtodo para poder evaluar y
cuantificarla presencia de estos, aprendiendo a su vez los parmetros
microbiolgicospermisibles para cada alimento.

El tiempo de incubacin y la temperatura varan segn el mtodo. Los

mtodos comnmente aprobados son: AOAC mtodo oficial 997.02 (en
alimentos) Incubar 5 das entre 21C 25C.
Las muestras o diluciones no requiere ajustar su pH, sin embargo si este
proceso ya ha sido realizado puede igual usarlo en la Placa Petri.
No utilice buffer que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato de sodio, por
que pueden inhibir el crecimiento.

BIBLIOGRAFA
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Frazier ,W.C. Microbiologa de los alimentos .Ed. Acribia . Espaa 2000.
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LUNA CORTES, Gilma Yaneth, Manual operativo de anlisis

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Mossel.D.Microbiologa de los alimentos. Ed. Acribia. Espaa 2000.

DIFCO Manual de medios de cultivo. Ed. Difco.
MERCK. Manual de medios de cultivo Ed. Merck, Alemania.

VII.

ANEXO