Anda di halaman 1dari 11

Nama

: Ni Putu Puri Artini

NIM

: P07134014014

Semester

:V
PEMERIKSAAN TPHA
(Treponema Pallidum Hemagglutination Assay)

Tempat praktikum

: Lab Imunoserologi JAK

Hari, tanggal praktikum

: Rabu, 14 September 2016

I.

TUJUAN
Untuk deteksi antibody terhadap Treponema pallidum secara kualitatif dan

semi kuantitatif dalam serum atau plasma manusia.


II.
METODE
Indirect hemagglutination.
III.

PRINSIP
Berdasarkan reaksi hemaglutinasi antara antibodi spesifik Treponema

pallidum dalam serum atau plasma manusia dengan antigen Treponema pallidum
(Nichol Strain) dalam Plasmathec TPHA Reagents yang terbuat dari awetan eritrosit
unggas.
IV.

DASAR TEORI
Sifilis merupakan penyakit yang disebabkan oleh spirochaeta Treponema

pallidum. Bakteri ini ditularkan melalui aktivitas seksual dari lesi pada kulit kelamin
(IA, Yakasai, dkk. 2012). Treponema pallidum adalah spiroketa mikroaerofilik yang
memiliki 4 subspesies yaitu, subspesies pallidum (sifilis kelamin), subspesies
endemicum (sifilis endemic), subspesies pertenue (frambusia), dan subspesies
caratium (pinta). T. pallidum satu-satunya subspesies di Amerika Serikat yang
ditularkan secara seksual. Meskipun T. pallidum merupakan subspesies berbeda tapi
sangat patogen (C. Sena, Arlene. 2010)

Tanda-tanda dan gejala sifilis berbeda-beda pada setiap empat tahapan


(Primer, Sekunder, Laten, dan tersier). Tahap primer ditandai dengan chancre
tunggal (tanpa rasa sakit, kulit gatal, Ulserasi), sifilis sekunder ditandai dengan ruam
yang sering terlihat pada telapak tangan dan telapak kaki, sifilis laten biasanya tanpa
gejala, dan sifilis tersier ditandai dengan gumma, neurologis, atau kardiovaskuler.
Diagnosis biasanya dibuat dengan menggunakan tes laboratorium (Adisesh,
Mangala. 2015).
Ada tiga metode dasar yang digunakan dalam skrining sifilis, yaitu
pengamatan langsung dari spiroketa dengan mikroskop medan gelap, tes serologi
non-treponemal dan tes serologis treponema. Tes non-treponemal ini, contohnya
pemeriksaan Rapid Plasma Reagin (RPR) dan VDRL pemeriksaan ini digunakan
untuk skrining awal, sedangkan tes treponemal spesifik seperti Fluorescent
Treponemal

Antibody

Absorption

(FTA-ABS),

Treponema

Pallidum

Hemagglutination Assay (TPHA) yang digunakan untuk mengkonfirmasi diagnosis


(Surajit Nayak dan Basanti Acharjya. 2012). Tes nontreponemal digunakan pada
tahap awal. Namun, karena tes ini kadang-kadang menghasilkan reaksi positif palsu,
maka dari itu perlu dilakukan test konfirmasi dengan tes treponemal, seperti
Treponema Pallidum Haemagglutination Assay (TPHA) (Adisesh, Mangala. 2015).
TPHA merupakan tes hemaglutinasi langsung di mana antigen permukaan
diekstraksi dari sel T. pallidum yang dilapisi oleh sel darah merah unggas kemudian
dicampur dengan sampel serum. Serum yang mengandung antibodi T. pallidum
tertentu akan bereaksi dengan antigen (sel darah merah), yang menyebabkan
aglutinasi (G.Morshed, Muhammad. 2015).
V.

ALAT DAN BAHAN


a. Alat
1.
Mikropipet (10 l, 100 l, 500 l)
2.
Yellow dan Blue tip
3.
Mikroplate U
4.
Beaker glass
b. Bahan
1.
Serum dan plasma pasien

2.
3.
4.
5.
VI.

Kontrol positif dan control negative


Control Cell
Test Cell
Diluent
PROSEDUR KERJA
a. Secara Kualitatif:
1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan
2. Semua reagen dan sampel didiamkan pada suhu ruang terlebih dahulu
30 menit
3. Diambil 190 l diluent pada tempat well.
4. Ditambahkan 10 l sampel ke dalam tempat well tersebut.
5. Kemudian dihomogenkan.
6. Pipet 25 l specimen diluent yang dibuat ke test well dan control well.
7. Pipet 25 l control positif dan control negative ke control positif well dan
control negative well.
8. Tambahkan 75 l test cell ke test well, control positif dan control negative
dan 75 l control test ke control well (Masing-masing campuran pada well
dihomogenkan)
9. Inkubasi 15-300 C selama 45-30 menit.
10. Dibaca hasilnya, bandingkan dengan kontrol negative dan control positif
NB : Jika hasilnya positif, maka harus dilanjutkan dengan uji semikuantitatif
untuk mengetahui titer TPHA pada sampel

b. Secara Semi Kuantitatif:


1. Disiapkan alat, bahan dan reagen yang akan digunakan
2. Semua reagen dan sampel didiamkan pada suhu ruang terlebih dahulu 30
menit
3. Diambil 190 l diluent pada tempat well.
4. Ditambahkan 10 l sampel kedalam tempat well tersebut.
5. Kemudian dihomogenkan.
6. Disiapkan sumus mikroplate dan diberi label no 1-8.
7. Untuk sumur 1 dikosongkan, sedangkan sumur 2-8 ditambahkan 25 l
diluent.
8. Untuk sumur 1 ditambahkan 25 l campuran diluent specimen diluent.
9. Pipet 25 l campuran diluent spesiment ke sumur 2 lalu dihomogenkan.
10. Ambil 25 l campuran dari sumur 2 ke sumur 3 dan seterusnya. Pada sumur
8 dibuang 25 l campuran tersebut.
11. Ditambahkan 75 l test cell ke sumur 1-8.
12. Inkubasi 15-300 C selama 45-30 menit.
13. Dibaca aglutinasi yang terbentuk dan tentukan titernya.
Sumur kePengenceran Serum (titer)
1
1 : 80
2
1 : 160
3
1 : 320
4
1 : 640
5
1 : 1280
6
1 : 2560
7
1 : 5120
8
1 : 10.240

VII.

INTEPRETASI HASIL
a. Kualitatif
Positif (+)

: Ditandai dengan adanya hemaglutinasi yang menyebar pada


permukaan sumur, hal ini menandakan terdapat antibodi
spesifik terhadap bakteri Treponema pallidum.

Negatif (-)

: Tidak terbentuk hemaglutinasi atau awetan eritrosit


mengendap didasar sumur membentuk titik merah, hal ini
menandakan tidak terdapat antibodi spesifik terhadap
bakteri Treponema pallidum.

Gambar

Positif (+)

Negatif (-)

Jika hasil pada tes kualitatif positif (+), maka harus dilakukan tes semikuantitatif untuk mengetahui jumlah titer antibodi dalam sampel.
b. Semi kuantitatif
Titer ditentukan berdasarkan tingkat pengenceran tertinggi yang masih
menunjukkan reaksi positif (+) hemaglutinasi.

Kontrol sel

VIII. HASIL PENGAMATAN


Kode sampel : TP
Test sel

Dilluent
Sampel serum kode TP
-

Kontrol (-) dan


(+)

Reagen-reagen yang diguakan

Kualitatif

Sampel
diluents

Kontrol
negatif

Kontrol

Test sel

Kontrol
sel

positif

Hasil : Negatif (-)


Karena tidak terbentuk hemaglutinasi (sel mengelompok/mengendap di
tengah berupa titik merah)
-

Semi kuantitatif

Sampel

Dilluen

Hasil : Negatif (-)


t

Karena tidak terbentuk hemaglutinasi (sel mengelompok/mengendap di


IX.

tengah berupa titik merah)


PEMBAHASAN

Praktikum pemeriksaan imunoserologis kali ini, yaitu Treponema pallidum


Hemagglutination Assay (TPHA) test dilakukan berdasarkan metode hemaglutinasi
tidak langsung untuk deteksi antibodi spesifik terhadap T. pallidum pada sampel
serum atau plasma manusia secara kualitatif dan semikuantitatif.
Tes serologi merupakan tes laboratorium andalan untuk penyakit sifilis,
kecuali pada tahap awal infeksi yaitu ketika deteksi langsung Treponema pallidum
dari lesi dapat menggunakan mikroskop medan gelap atau fluorescent. Prinsip dari tes
serologi sifilis adalah deteksi antibodi treponema dengan tes skrining, kemudian
apabila tes skrining reaktif akan dikonfirmasi dengan pengujian lebih lanjut. Tes
konfirmasi idealnya harus memiliki kepekaan setara dan spesifisitas lebih besar dari
tes skrining, sehingga dapat mengurangi kemungkinan reaksi positif palsu. World
Health Organization (WHO) merekomendasikan penggunaan kombinasi tes nontreponemal dan tes treponemal untuk tujuan skrining dan diagnosis (Bala, Manju dkk.
2012).
Salah satu test treponemal adalah TPHA, prinsip pada pemeriksaan ini adalah
uji hemaglutinasi tidak langsung untuk mendeteksi antibodi spesifik T. pallidum
dalam serum atau plasma manusia. Reagen TPHA merupakan suspensi eritrosit ayam
yang dilapisi dengan antigen P15, P17 dan P47 T. pallidum yang diperoleh dari
budidaya seluler rekombinan Escherichia coli dan pemurnian berikutnya. (Pahuja,
Sangeeta. 2014)
Sebelum dilakukan pemeriksaan, sampel atau reagen sebaiknya dibiarkan
mencapai suhu ruang. Terdapat lima reagen yang digunakan dalam kit, yakni
1. Reagen 1 atau test Cell mengandung awetan eritrosit ayam yang dilapisi dengan
antigen Treponemal pallidum.
2. Regen 2 atau Control Cell mengandung awetan eitrosit ayam yang tidak dilapisi
antigen Treponemal pallidum.
3. Reagen 3 atau Dilluent mengandung larutan garam yang mengandung
penyerap/absorben
4. Reagen 4 atau Positive Control mengandung serum manusia dengan titer 1280
5. Reagen 5 atau negative Control mengandung serum manusia dengan titer < 80.

Adapun syarat sampel yang harus diperhatikan adalah sampel serum atau
plasma harus bebas dari sel-sel darah dan kontaminasi mikroba, sampel dapat
disimpan pada suhu 2-80 C sampai 7 hari sebelum pengujian. Apabila sampel ingin
disimpan pada waktu yang lebih lama maka harus dibekukan pada suhu 20 0 C.
Seluruh reagen yang akan digunakan harus dihomogenkan terlebih dahulu, perhatikan
tanggal kadaluarsa pada reagen.
Pemeriksaan TPHA ini terbagi menjadi dua test, yaitu kualitatif dan
semikuantitatif. Prosedur uji kualitatif dilakukan dengan cara diluent ditambahkan
sebanyak 190 l dan sampel ditambahkan sebanyak 10 l ke sumur 1 kemudian
dihomogenkan. Tahap ini disebut tahap pengenceran yakni 1 : 20, pengenceran
sampel ini sangat berguna, terutama apabila praktikan menerima volume serum yang
sedikit serta untuk mencegah terjadinya negative palsu akibat prozone efek.
Selanjutnya teteskan 25 l serum dari campuran tersebut ke sumur 2 dan sumur 3,
pada sumur 2 ditambahkan 75 l control cell dan sumur 3 ditambahkan 75 l test cell
kemudian dihomogenkan. Selanjutnya diinkubasi dalam suhu 15-300 C selama 45
menit, dalam proses pemeriksaan harus bebas dari getaran dan dilakukan pada meja
yang datar.
Prosedur uji semikuantitatif hampir sama dengan kualitatif hanya pada
semikuantitatif menggunakan 9 sumur, 1 sumur untuk pengenceran serum dan 8
sumur untuk titrasi. Proses titrasi dilakukan dengan cara memipet 25 l serum yang
telah diencerkan dari sumur 1 ke sumur 2 begitu seterusnya sampai sumur 8, 25 l
serum dari sumur 8 dibuang. Selanjutnya diinkubasi dalam suhu 15-30 0 C selama 45
menit, dalam proses pemeriksaan harus bebas dari getaran dan dilakukan pada meja
yang datar. Pada setiap pengujian harus disertakan kontrol positif dan negatif,
dilakukan dengan cara pipet 25 l control positif dan negative pada sumur yang
berbeda selanjutnya diteteskan 75 l tes sel. Kontrol digunakan sebagai pembanding
untuk membantu interpretasi hasil. Berdasarkan praktikum, hasil control positif sudah
sesuai yakni menghasilkan hemaglutinasi dengan titer 640-2560 sedangkan untuk
control negative menunjukan hasil yang sesuai yakni tidak terbentuk hemaglutinasi
melainkan terjadi pengendapan sel pada dasar sumur.

Berdasarkan hasil pemeriksaan TPHA, serum kode TP didapatkan hasil


negatif karena tidak membentuk hemaglutinasi melainkan terjadi pengendapan pada
dasar sumur. Sampel dinyatakan positif memiliki antibodi terhadap T. Pallidum
apabila terjadi aglutinasi pada tes sel dan tidak terjadi aglutinasi pada control sel.
Sedangkan apabila pada control sel terjadi aglutinasi maka harus dilakukan reaksi
non spesifik dengan prosedur sesuai insert kit. Kontrol sel harus menghasilkan hasil
negatif, hal tersebut dikarenakan pada control test tidak mengandung antigen T.
Pallidum.
Treponemal test dikembangkan menggunakan Nichols strain T. pallidum dan
memanfaatkan seluruh sel atau antigen yang berasal dari sel-sel T. pallidum.
Treponemal Test dapat mendeteksi antibodi baik IgM atau IgG, tergantung pada
masing-masing insert kit (G. Morshed, Muhammad. 2015).
Pemeriksaan treponemal seperti FTA-ABS dianggap metode yang paling
sensitif untuk mengkonfirmasi adanya antibodi di awal infeksi, tetapi keseluruhan tes
treponemal memiliki kepekaan lebih rendah pada sifilis primer dibandingkan dengan
sifilis tahap selanjutnya. Hasil positif palsu jarang terjadi, namun dapat terjadi pada
pasien dengan penyakit kolagen, lupus eritematosus sistemik, dan infeksi lainnya.
Meskipun telah menerima terapi pengobatan, tes treponemal tetap reaktif selama
seumur hidup kecuali pada pasien yang telah diobati lebih dini untuk sifilis primer C.
Sen, Arlene. 2010)
Reaksi negatif palsu dapat terjadi pada fenomena Pro-zona atau Reaksi
Prozone yang terjadi karena konsentrasi yang tinggi dari antibodi target dalam
spesimen. Untuk menghindari hal tersebut perlu dilakukannya penipisan pada serum
penderita sehingga konsentrasi antibodinya masuk dalam zona proporsional (Nayak,
Surajit dkk. 2012).
Dalam

pemeriksaan

imunologin

TPHA

(Treponema

Pallidum

Hemagglutination Assay), terdapat beberapa hal-hal yang dapat mempengaruhi hasil:


1. Kondisi reagen dan sampel, reagen yang digunakan tidak boleh kadaluarsa.
Sampel yang digunakan harus berupa serum yang sudah memenuhi persyaratan
(tidak lisis, tidak lipemik, tidak ikterik, dan tidak terkontaminasi bakteri).

2. Teknik pemeriksaan, pemipetan yang tidak sesuai dengan volume atau


penghomogenan yang kurang, serta beberapa factor lain seperti penyakit
autoimun dan BFP (Biology False Positif). Sehingga, akan terjadi hasil yang
positif palsu.
3. Kontrol positif dan negative harap selalu digunakan agar mengindari interpretasi
yang salah. Dalam praktikum ini tidak digunakan karena terbatasnya reagen.
X.

SIMPULAN
Dari praktikum pemeriksaan TPHA pada serum kode TP didapatkan hasil

negative yang menunjukkan probandus tidak memiliki antibody spesifik terhadap


Treponema pallidum.

XI.

DAFTAR PUSTAKA

Adisesh, Mangala. 2015. SIGNIFICANCE OF TPHA TEST. [online] tersedia :


http://jermm.com/latest-articles.php?at_id=6 (Diakses 19 September 2016,
17 : 11 WITA)
Bala, Manju dkk. 2012. Evaluation of the usefulness of Treponema pallidum
hemagglutination test in the diagnosis of syphilis in weak reactive Venereal
Disease

Research

Laboratory

sera.

[online]

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3505284/

tersedia:

(Diakses

17

September 2016 pukul 19.01 WITA)


C. Sena, Arlene. 2010. Novel Treponema pallidum Serologic Tests: A Paradigm Shift
in

Syphilis

Screeningfor

the

21st

Century.

[online]

http://cid.oxfordjournals.org/content/51/6/700.full.pdf+html

tersedia

.(Diakses

:
20

September 2016, 05 : 11 WITA)


G. Morshed, Muhammad. 2015. Recent Trends in the Serologic Diagnosis of
Syphilis.

[online]

tersedia

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4308867/.
September 2016, 11 : 21 WITA)

:
(Diakses

17

Pahuja, Sangeeta. 2014. Treponema pallidum hemagglutination assay seroreactivity among


healthy Indian donors and its association with other transfusion transmitted diseases.
[online] tersedia : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4140052/ .(Diakses
18 September 2016, 14 : 01 WITA)
Surajit Nayak dan Basanti Acharjya. 2012. VDRL Test and its Interpretation. [online]
tersedia : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3312652/ .(Diakses 13 April
2016, 14 : 01 WITA)