1

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Faculdade de Farmcia
Departamento de Tecnologia Farmacutica

ROTEIRO DE AULAS PRTICAS

Enzimologia e Tecnologia das Fermentaes
Tecnologia Enzimtica e das Fermentaes

Prof Dr Yanina Madalena de Arruda Calvette

Prof Dr Sorele Batista Fiaux

Niteri - RJ
2010

Sumrio
Normas para redao do relatrio de aulas prticas das disciplinas MTC04004 e
MTC00018 .........................................................................................................................................3
Curva Padro ..........................................................................................................................4
Procedimento Prtico ..........................................................................................................5
Questionrio....................................................................... Erro! Indicador no definido.
Curva de Crescimento ............................................................................................................7
Procedimento Prtico Curva de Crescimento ..................................................................9
Construo da Curva de Crescimento ..............................................................................10
Questionrio para discusso dos dados no relatrio .........................................................11
Questionrio para estudos .................................................. Erro! Indicador no definido.
Exerccios de Fixao ........................................................ Erro! Indicador no definido.

NORMAS PARA REDAO DO RELATRIO DE AULAS

PRTICAS DAS DISCIPLINAS MTC04004 E MTC00018
A forma para se redigir o relatrio deve ser respeitada, uma vez que a avaliao do mesmo
feita de acordo com esta orientao. Assim todo relatrio devera conter os seguintes itens:
CAPA

Devera ter:
Nome da UFF. Depto de Tecnologia Farmacutica
Relatrio de aulas prticas de Enzimologia e Tecnologia das Fermentaes Ou
Relatrio de Tecnologia Enzimtica e das Fermentaes
Ttulo da aula
Nome e turma prtica do aluno
Data (d/m/a)

OBJETIVOS
Inteno a ser alcanada com a complementao do grupo de aulas e experimentos
realizados
INTRODUO e REVISO DE LITERATURA
Comentrio da aula, incluindo comparativamente os fundamentos da metodologia
empregada. Aspectos tericos e informativos do assunto da aula prtica encontrados na literatura.
Deve conter informaes complementares s da Apostila de Aulas Prticas.
Preferencialmente at duas pginas.
MATERIAL E MTODOS (PROCEDIMENTOS)
Descrever os procedimentos executados em aula, inclusive as modificaes propostas pelo
professor. Identificar o experimento descrito.
RESULTADOS
Colocar em tabelas os resultados obtidos, grficos, etc., mostrando o Grupo e a Turma
onde os resultados foram obtidos.
As tabelas e resultados listados devem referenciar os grficos construdos a partir dos
dados.
DISCUSSO e CONCLUSO
Comentar os resultados comparando-os com os da literatura. Comentar quais as
concluses da aula pratica. Ser claro e objetivo nas concluses. Algumas poucas linhas so
suficientes. Esclarecer se os objetivos propostos foram atingidos ou no.
Usar as seguintes perguntas para completar este item:

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
Citar livros, revistas e sites da internet usados para compor o relatrio.

CURVA PADRO
A razo de ser de um laboratrio produzir resultados confiveis. O pesquisador ou o
analista, no seu dia a dia, preocupa-se em obter resultados que afastem qualquer dvida razovel
com respeito a sua exatido e que possuam uma preciso adequada para a finalidade a que se
destinam. Isto se aplica a qualquer anlise, inclusive a da concentrao de clulas.
A concentrao celular pode ser determinada atravs de vrios e diferentes mtodos,
escolhidos de acordo com o caso em questo. Um dos mtodos mais utilizados para a medida da
concentrao de clulas de bactrias e leveduras o mtodo da turbidimetria associada ao peso
seco.
A turbidimetria um mtodo simples de seguir o crescimento e, com os instrumentos finos
agora existentes, provavelmente o processo mais preciso. Esse mtodo baseado na disperso da
luz ao passar por uma amostra. As clulas em suspenso absorvem e disperso a luz que passa
atravs delas, fazendo com que uma cultura parea turva observao visual. De fato, a
quantidade e luz absorvida e dispersada proporcional massa de clulas no trajeto luminoso;
uma clula grande interfere com a luz mais que uma clula pequena. Para as medidas
turbidimtricas da massa celular podem ser usados aparelhos sensveis como um
espectrofotmetro ou um fotocolormetro. A cultura a ser avaliada, porm, deve ter uma densidade
capaz de registrar alguma turvao no instrumento, e pode no ser possvel a medida de culturas
intensamente coradas ou que contm outros materiais em suspenso, alm das clulas. preciso
mencionar, tambm, que tanto as clulas vivas quanto as clulas mortas contribuem para a
turvao.

Filtro
prisma

ou

Amostra
clulas

contendo

Fotoclula
mede a luz

Registro
(unidades)

O mtodo da turbidimetria um mtodo indireto de medida do crescimento celular. A

determinao da turbidez (densidade tica) por si s no suficiente para que se conhea a
concentrao da suspenso em anlise. necessrio conhecer a relao existente entre a turbidez
e a concentrao celular. Isso pode ser obtido atravs de uma curva padro ou curva de calibrao,
construda utilizando como parmetro um mtodo direto de medida de concentrao de clulas.
Em geral, associa-se a turbidez ao peso seco de clulas. Essa curva segue a lei de Lambert-Beer.
Alguns analistas julgam que elaborar uma curva de calibrao (ou curva padro) uma das
etapas mais simples de uma anlise. No entanto, a exatido dos resultados repousa na
confiabilidade da curva elaborada. Preparao e diluio das solues padro e das amostras so
geralmente as maiores causas de erros. Durante a calibrao podem aparecer: erros sistemticos
(determinados); erros aleatrios (indeterminados); erros devidos ao uso de uma matriz para o
padro diferente da matriz das amostras (erros determinados ou indeterminados).
Um ponto freqentemente discutido o numero de pontos necessrios em uma curva de
calibrao. Esta dvida foi resolvida por um par de estatsticos dedicados a problemas analticos
que demonstraram ser desnecessrio um nmero maior que 6 pontos1. Isto porque a faixa de
confiabilidade ou invlucro de segurana ao nvel de 95% de confiana de uma curva de
calibrao no diminui de maneira vantajosa para o analista quando este toma mais que seis
pontos. No entanto, o alargamento do invlucro de confiana aumenta acentuadamente quando
menos de seis pontos so usados para a curva de calibrao.

Caulcutt, R.; Boddy, R. Statistics for analytical chemists, 1a edio, Londres: Chapman and Hall; 1983, 253 p.

PROCEDIMENTO PRTICO

Objetivos

Construir a curva de densidade tica x peso seco para padronizar um mtodo de dosagem da
concentrao celular em uma amostra.
Executar tcnicas de turbidimetria usando fotmetro.

Microrganismo
Levedura Saccharomyces cerevisiae.
Meio de Cultivo
Componente
Acar cristal
Sulfato de amnio
Fosfato dicido de potssio
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio 7.H2O
gua destilada q.s.p
pH

(g/L)
10,0
5,0
1,5
5,0
0,5
1000mL
6,0

Obteno da Suspenso de Clulas

Cultivo crescido de 18 a 20 horas em 100mL de meio de cultivo sob agitao a 30C em
estufa microbiolgica ou Shaker oscilatrio com banho-maria com temperatura controlada.
Procedimento

Preparo da suspenso-me: centrifugar a suspenso (10min 3.000rpm); lavar as clulas duas

vezes por suspenso em gua destilada seguida de centrifugao; ressuspender as clulas com
gua destilada, transferir para um balo volumtrico de 100mL e avolumar.
Obteno da concentrao celular da suspenso-me (mtodo do peso seco): retirar 10mL da
suspenso-me (em duplicata), transferir para pesa-filtros previamente secos e tarados e secar
em estufa a 80C por 24h. Aps 24h, esfriar os pesa-filtros em dessecador e, depois, pes-los.
Obter o peso seco celular por diferena e express-los em g/L ou mg/mL.
Diluio: transferir alquotas da suspenso-me para bales volumtricos e avolumar com gua
destilada.
Leitura: fazer a leitura em duplicata da densidade ptica de cada diluio utilizando
espectrofotmetro a 540nm.

Tratamento de Dados
1. Calcular o peso seco da suspenso-me de acordo com a equao abaixo e fazer a mdia
aritmtica dos pesos secos encontrados para as duas alquotas da suspenso-me (duplicatas):

2. Calcular o peso seco de cada amostra diluda, de acordo com a equao abaixo:

3. Construir uma tabela com os dados de cada diluio obtidos na prtica de acordo com o
exemplo abaixo:

6
Densidade ptica
Diluio
A

Mdia

Fator de
Diluio

Peso Seco
(g/L)

1
2
3
4
5
6
7
8

Construo da Curva Padro

Construir um grfico os valores do peso seco no eixo X e das densidades pticas mdias no
eixo Y, obtendo uma curva DO X PS. Levar em considerao o ponto (0,0).

Se o grfico for feito usando o Microsoft Excel, pedir para adicionar linha de tendncia do
tipo regresso linear e selecionar as opes definir interseo = 0, exibir equao no
grfico e exibir valor de R-quadrado no grfico.

Caso contrrio, calcular manualmente o coeficiente angular da reta (a): a = y / x, lembrando

de definir a interseo na origem.
A equao ser do tipo: y = a.x
onde x = PS , y = DO e a = coeficiente angular da reta;
ou seja, a equao ser: DO = a.PS
logo, PS = DO/a (essa informao ser usada na determinao da curva de crescimento).
O PS dado como concentrao celular em g/L.

UK

PARA PENSAR:
Compare
os
mtodos
de
determinao da concentrao celular
pelo peso seco e pela leitura da
densidade tica e discuta as aplicaes
em nvel industrial. Considere o tempo de
anlise e o tipo de microrganismo
utilizado, por exemplo.

PS (g/L)

CURVA DE CRESCIMENTO
Quando os microrganismos so inoculados em meio adequado e incubados sob
condies apropriadas, ocorre um aumento do nmero de clulas, em um tempo
relativamente curto. Com algumas espcies, a populao mxima atingida dentro de
24 horas, mas outras exigem tempos muito mais longos de incubao para alcanarem o
crescimento mximo. O termo crescimento, tal como comumente aplicado aos
microrganismos, refere-se, usualmente, s alteraes que ocorrem na cultura e no s
alteraes de um organismo isolado. Mais freqentemente, o crescimento denota o
aumento do nmero de microrganismos alm do que estava presente no inculo original.
A determinao do crescimento requer, portanto, a medida quantitativa da populao
celular no momento da inoculao e em intervalos regulares durante a incubao.
O tempo necessrio para que a massa celular duplique conhecido como tempo
de gerao (tg), que no o mesmo para todos os microrganismos. Da mesma maneira,
o tempo de gerao varia, para um microrganismo em particular, dependendo das
condies ambientais. O tempo de gerao, e conseqentemente o crescimento,
depende fortemente dos nutrientes existentes no meio e das condies fsicas de
incubao.
Quando se inocula um meio de cultura com um dado numero de clulas e se
determina a populao intermitentemente durante o perodo de incubao, obtm-se
uma curva chamada Curva de Crescimento. Nesta curva observa-se que h um perodo
inicial no qual parece no ocorrer crescimento, seguido por um rpido aumento da
populao que se nivela posteriormente e declina quanto ao numero de clulas viveis.
As fases como esto sendo descritas, ocorrem em um cultivo descontnuo ou em
batelada. Essas fases so:

Fase Lag fase em que a populao permanece temporariamente inalterada, em

relao ao crescimento. Mas isso no significa que as clulas esto em repouso; ao
contrrio, durante essa etapa as clulas aumentam de tamanho, so fisiologicamente
muito ativas e esto sintetizando novas enzimas para se adaptarem ao novo meio e
conseguirem utilizar os nutrientes. Ao fim dessa fase, as clulas se dividem; mas
como nem toda clula completa essa etapa simultaneamente, ocorre um aumento
gradual da populao (acelerao) at o trmino da fase lag.

Fase Exponencial fase em que as clulas se dividem firmemente e num ritmo

constante, onde o numero de clulas relacionado com o tempo resulta numa curva
exponencial. Nas condies dadas, o ritmo de crescimento mximo nessa fase.
Modificando-se as condies o ritmo de crescimento pode se alterar para mais ou
para menos.

Fase Estacionria fase em que o crescimento tende a diminuir at chegar ao seu

fim. Essa tendncia se deve exausto de nutrientes e, s vezes, ao acmulo de
produtos txicos proveniente do metabolismo celular. A populao permanece
constante durante algum tempo, talvez como resultado da completa cessao do
crescimento ou do resultado do equilbrio entre o ritmo de reproduo e o de morte.

Fase de Declnio ou de Morte fase em que aumenta o numero de morte das

clulas, em relao ao crescimento. Isso ocorre devido depleo dos nutrientes
essenciais e ao acmulo de substncias inibidoras.

O crescimento microbiano pode ser mensurado comparando-se a concentrao

celular de amostras retiradas do cultivo a intervalos regulares. A concentrao celular
pode ser determinada por diferentes tcnicas baseadas num dos seguintes tipos de
medidas:

Contagem celular contagem direta ao microscpio, por plaqueamento ou em

contador eletrnico de partculas.
Determinao da massa celular diretamente por pesagem ou indiretamente por
turbidimetria ou aferio de constituintes celulares.
Avaliao da atividade celular indiretamente pela reao entre o grau de atividade
bioqumica e o tamanho da populao.

PROCEDIMENTO PRTICO CURVA DE CRESCIMENTO

Objetivos
Observar o perfil de crescimento de um microrganismo.
Executar tcnicas de turbidimetria usando fotomtro.
Desenvolver e interpretar uma curva de crescimento

Microrganismo
A Levedura Saccharomyces cerevisiae

Meio de Cultivo
Componente

(g/L)

Acar cristal
Sulfato de amnio
Fosfato dicido de potssio
Extrato de lvedo
Sulfato de magnsio 7.H2O
gua destilada q.s.p
pH

10,0
5,0
1,5
5,0
0,5
1000mL
6,0

Inculo
Cultivo crescido por 18 a 20 horas em 100mL de meio de
cultivo sob agitao a 32C.

Equipamento
Balo de fundo chato de 2000mL contendo 1000mL de
meio de cultivo estril, adaptado a um filtro e um compressor
de ar, e com tubo de exausto (sada de ar) e tubo de coleta
(retirada de amostras).
Procedimento
1. Amostragem: retirar assepticamente aproximadamente 5mL de amostra (em duplicata) pelo
tubo de coleta atravs da obstruo do tubo de exausto em intervalos regulares de tempo.
2. Centrifugao: marcar o volume de amostra no tubo e centrifugar (10min 3.000rpm); lavar as
clulas duas vezes por suspenso em gua destilada seguida de centrifugao; ressuspender as
clulas com gua destilada para o mesmo volume (marcao feita anteriormente).
3. Leitura: fazer a leitura da densidade ptica no Espectrofotmetro utilizando comprimento de
onda apropiado para avaliao da absoro de luz pelas clulas de levedura.
4. Diluio: caso necessrio, diluir a amostra em gua destilada.

10
Tratamento dos Dados
Construir uma tabela com os dados de cada amostragem obtidos na prtica de acordo com o
exemplo abaixo:
Hora
Coleta
(h)

Ponto

12:30
13:00
13:30
...

Densidade ptica

Tempo
Cultivo
(h)

Diluio
usada

Concentr. X
(g/L)

Logartimo
de X
(ln X)

Mdia

1
2
3

0
0,5
1,0

0,22
0,39
0,54

0,24
0,39
0,53

0,23
0,39
0,535

0
2x
3x

0,036
0,092
0,180

- 3.324
- 2,386
-1,715

...

...

...

...

...

...

...

...

OBS: os valores usados nesta tabela so apenas ilustrativos, no correspondem a uma situao real.

O tempo de cultivo deve ser calculado a partir da hora inicial (inoculao) e da hora de coleta,
sendo que os minutos devem ser expressos em fraes de horas (5 min = 0,083 h e 10 min =
0,167 h).
Se a amostra estiver muita concentrada, se estiver fora da linearidade da curva (ver na curva
padro), a mesma deve ser diluda at que possa ser medida (at estar dentro da linearidade)
Lei de Lambert-Beer.
Para o clculo da concentrao celular (X) utilizar a equao da reta da curva padro e a
densidade tica (DO), da seguinte forma:
para a curva padro, tem-se que y = a.x + b , onde:
y = densidade ptica (D.O.)
x = peso seco (P.S.) dado como concentrao celular em g/L
a = coeficiente angular da reta
b=0, pois a reta passa pela origem
Logo, (D.O.) = a.(P.S.)
Para saber a concentrao celular de cada amostra lida, deve-se aplicar a equao acima
descrita aos dados obtidos experimentalmente, onde a D.O. ser o lido na prtica e o
coeficiente angular ser o valor obtido na equao da reta da curva padro. No esquecer de
considerar a diluio, quando for o caso, multiplicar o P.S. obtido na equao acima pela
diluio realizada: P.S. da amostra = P.S. calculado x diluio.

CONSTRUO DA CURVA DE CRESCIMENTO

Plotar em um grfico com os valores de concentrao celular (X) no eixo y e os tempos de

cultivo no eixo x, obtendo uma curva X vs t.
Na fase exponencial da curva de crescimento, a equao da reta pode ser descrita como:
X = Xo.et
Linearizando essa equao, temos: ln x = ln xo + .t
(essa regra s vlida na fase exponencial)
Plotar uma segunda curva com os valores dos tempos de cultivo no eixo x e os valores do ln
X no eixo y; obtendo uma reta na fase exponencial, da qual o coeficiente angular
corresponde taxa especfica de crescimento.
Para calcular a velocidade especfica de crescimento (), usar a equao do coeficiente
angular: = y / x ; onde = , y= ln X e x= t ;
ou seja: = ln X / t .
Para saber o tempo de gerao, basta usar o valor de encontrado na equao
correspondente: tg = ln 2 / .

Construo da Curva de Crescimento Usando o Microsoft ExcelPlotar o grfico de X vs T

(Concentrao Celular vs Tempo de Cultivo).

Identificar visualmente os pontos que esto na fase exponencial e plotar um outro grfico
apenas com esses pontos.
Neste segundo grfico, pedir para adicionar linha de tendncia do tipo regresso
exponencial e selecionar as opes, exibir equao no grfico e exibir valor de R-quadrado
no grfico

11

A equao ser do tipo:

ser: X = Xo . e t .

y = b . e a.x ,

onde y=X, b=Xo, x=t e a=; ou seja, a equao

Orientaes para confeco do relatrio referente s prticas de Curva Padro e Curva de

Crescimento
O relatrio deve ser feito em grupo, apresentado impresso na data acordada e deve conter os itens
descritos no manual de relatrio de aulas prticas

QUESTIONRIO PARA DISCUSSO DOS DADOS NO RELATRIO

1. Qual a finalidade de construir uma Curva Padro de uma espcie microbiana?
2. Justifique a construo das Curvas Padro e Crescimento em uma indstria que emprega
processo fermentativo para obteno do seu produto final.
3. Explique porque necessrio construir uma Curva Padro para cada microrganismo e
justifique a necessidade de construir diferentes Curvas Padres para o mesmo microrganismo.
4. A medida da turbidez em qualquer concentrao ser sempre um dado confivel? Explique.
5. Calcule a concentrao celular do inculo empregado no experimento executado objetivando a
coleta de dados usados para construir a Curva de Crescimento?
6. A curva de crescimento resultante do trabalho corresponde a uma curva de crescimento tpica,
com todas as suas fases? Justifique a sua resposta.