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DIFERENCIAS ENTRE LA PARED CELULAR DE DE UNA BACTERIA GRAM NEGATIVA Y

UNA GRAM POSITIVA

PARED CELULAR DE Mycobacterium (BAAR)

TIPOS DE TINCIONES BACTERIANAS:


A. TINCION SIMPLE
1. TINCIN SIMPLE POSITIVA:
Basada en la afinidad electrnica de los colorantes a los distintos componentes
celulares, ya que las clulas bacterianas en medios con pH neutros suelen presentar
una dbil carga negativa. As pues, la bacteria cargada negativamente se combinara
con los iones positivos de los colorantes bsicos, como por ejemplo, el azul de
metileno, de tal forma que la bacteria queda coloreada. Esto explica porque en las
tinciones simples los colorantes usados suelen ser de tipo bsico. Se caracteriza por:
Necesita una fijacin previa
Se utiliza un solo colorante (Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina, etc.)
Permite nicamente la visualizacin de la morfologa bacteriana.
Las tinciones simples se pueden realizar con colorantes bsicos, cidos o neutros.
2. TINCION SIMPLE NEGATIVA: Consiste en la aplicacin de un colorante acido
(cargado negativamente). Por ello los microorganismos, que tambin estn cargados
negativamente, no van a captar el colorante, quedando claros y brillantes sobre un
fondo teido oscuro, es decir, en realidad no tie las bacterias sino que tie su
entorno, aumenta el contraste entre este y las clulas y facilita su observacin.
Se consigue una imagen ms real de su forma y tamao, adems de permitirnos
observar si presentan o no capsulas. Se caracteriza por:
Es un tipo de tincin simple (Se utiliza un solo colorante: Nigrosina o Tinta
china).
No necesita fijacin previa
Nos permite visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria, adems
de, alguna otra caracterstica estructural como la presencia de capsulas.

(1)

(2)

1. Colocar una gota de nigrosina sobre una lmina portaobjetos y mezclar con
una gota del cultivo en medio lquido; colocar el extremo de otra lmina
portaobjetos delante de la gota, permitiendo que sta discurra de manera

uniforme por el borde de ella y luego realizar el extendido. Dejar secar y


observar al microscopio.

B. TINCIN COMPUESTA (DIFERENCIAL)


TINCIN DIFERENCIAL DE GRAM
PREPARACIN DE FROTIS PARA COLORACIN DE GRAM
Primer paso: Extensin

Segundo paso: Fijacin

Al calor

Qumica: Metanol

TCNICA DE COLORACIN DE GRAM


1. Colocar el frotis sobre una varilla de coloraciones.
2. Agregar cristal violeta de Hucker por 1 minuto (colorante primario)
3. Eliminar el colorante y lavar con agua corriente.
4. Agregar solucin de Lugol por 1 minuto (mordiente)
5. Decolorar con alcohol acetona por 30 segundos (decolorante)

6. Lava con agua corriente.


7. Agregar colorante de Safranina por 1 minuto (colorante de contraste)
8. Lava con agua corriente.
9. Secar al medio ambiente en plano inclinado sobre papel secante (sin frotar).
10. Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy pequea de aceite
de inmersin y observar al microscopio con el objetivo 100X (inmersin).
PREPARACIN DE FROTIS PARA COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN
Identificacin de muestras y lminas.
Numerar los envases. Numerar las lminas portaobjetos empleando un lpiz graso, en forma
correlativa. Deber trazarse una lnea en cada lmina portaobjeto empleando el lpiz graso.
Realizacin del extendido.
Destapar cuidadosamente el envase de la muestra que se va
a procesar, manteniendo la boca del envase cerca del
mechero encendido.

Dividir un aplicador de madera (baja lengua) en dos o tres


partes y tomarlo entre el pulgar y el ndice de la mano, para
luego seleccionar y extraer la partcula til, que es la
porcin muco-purulenta de color amarillo verdoso del
esputo, enrollndola en el aplicador.

Colocar la partcula til sobre el portaobjeto y extenderla,


haciendo movimientos de vaivn, hasta lograr que el
extendido sea homogneo (ni muy fino ni muy grueso), que
no llegue a los bordes de la lmina. Por ningn motivo
debe calentarse la lmina mientras se haga el
extendido.

Fijacin del extendido.


Fijar cada lmina, una vez seca, mediante dos o tres pasajes
rpidos sobre la llama del mechero con el extendido hacia
arriba.

TCNICA DE COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN


TENER EN CUENTA:
La tcnica ms recomendada es la tincin de Ziehl Neelsen. Antes de su uso, todos los
colorantes y soluciones a emplearse deben ser previamente filtrados.
Las lminas portaobjetos con los extendidos debern estar previamente fijadas al
calor y correctamente identificadas.
Primer Paso: Coloracin

Colocar sobre el soporte las lminas fijadas


conservando el orden numrico con el extendido
hacia arriba y manteniendo una separacin de al
menos 1 cm entre ellas.

Cubrir totalmente la superficie del extendido con


fucsina bsica fenicada recin filtrada. Dispensar el
colorante con suavidad, con el gotero sobre los
extendidos.

Con la llama de un hisopo embebido en alcohol


calentar suavemente por debajo de los extendidos,
con movimientos de vaivn, hasta que observe que
se desprenden los primeros vapores blancos (no
hervir). En caso de prdida de volumen, agregar
fucsina para no dejar secar el preparado.

En el trmino de la eliminacin de los 3 vapores


dejar colorear por 5 minutos.

Eliminar la fucsina tomando la lmina por el


extremo numerado, con una pinza, inclinndola
hacia adelante y enjuagar con agua corriente a baja
presin.

Segundo Paso: Decoloracin

Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con


la solucin de alcohol cido durante 45 segundos.

Una vez eliminado el alcohol cido lavar nuevamente la lmina con agua a baja
presin.

Tercer Paso: Coloracin de fondo

Cubrir la superficie del extendido con el colorante


azul de metileno, previamente filtrado, durante 2
minutos.

Eliminar el azul de metileno y lavar cada lmina con


agua a baja presin, por ambos lados (el que tiene el extendido, como el otro lado).

Dejar secar las lminas a temperatura ambiente, apoyndolas en posicin vertical


en un soporte sobre un papel absorbente. Verificar la numeracin de la lmina.

Llevar a observacin al microscopio con objetivo de 100X (Inmersin).

Profesor. Manuel Farcio Villarreal