I.

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan perhitungan langsung maupun
tidak langsung. Perhitungan secara langsung dapat mengetahui beberapa jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan, pada suatu saat tertentu tanpa memberikan
perlakuann terlebih dahulu, sedangkan jumlah mikroorganisme yang diketahui dari
cara tidak langsung terlebih dahulu harus memberikan perlakuan tertentu sebelum
dilakukan perhitungan. Perhitungan secara langsung dapat dilakukan dengan
beberapa cara antara lain adalah membuat preparat dari suatu bahan (preparat
sederhana di warnai atau tidak di warnai) dan penggunaan ruang hitung (counting
chamber), sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui
jumlah mikroorganisme dalam suatu bahan yang masih hidup saja.
Metode Most Probable Number (MPN) memungkinkan kita untuk menduga populasi
mikroorganisme tanpa menghitung jumlah sel atau koloni. Jumlah populasi diduga
berdasarkan pengenceran tertinggi di mana pertumbuhan diamati pada pengenceran
10-4 dan tidak pada pengenceran 10-5 ,maka jumlah sel yang hidup antara 104 dan
105. Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Metode cawan
agar merupakan metode yang paling sering dipakai untuk menghitung jumlah

mikroorganisme. Pendugaan mikroorganisme yang terdapat di dalam tanah yang

terbawa erosi, air, air limbah, hasil pertanian, dan makanan juga menggunakan
metode ini.
Jumlah total mikroorganisme yang terdapat di dalam tanah digunakan sebagai indeks
kesuburan tanah tanpa mempertimbangkan hal-hal lain. Tanah yang subur
mengandung banyak mikroorganisme karena populasi yang tinggi menggambarkan
adanya suplai makanan dan energy yang cukup, serta kondisi ekologi lain yang
mendukung perkembangan mikroorganisme tanah tersebut. Namun demikian, pada
dua jenis tanah yang mempunyai jumlah dan aktivitas mikroorganisme yang sama
dan sebanding belum tentu menggambarkan produktivitas tanah yang sama. Hal ini
dapat disebabkan karena pada tanah yang satu, unsure hara makro dan mikro yang
dibutuhkan tanaman hanya dapat mencukupi keperluan mikroorganisme tanah dan
tidak cukup untuk mendukung pertumbuhan tanaman secara maksimal. Oleh karena
itu, jumlah mikroorganisme dalam tanah harus dipertimbangkan sebagai deskripsi
dan tidak untuk indeks kesuburan tanah semata.

B. Tujuan Praktikum
Adapun tujuan dari pelaksanaan praktikum ini adalah
1.

Untuk mengetahui proses atau cara kerja metode Most Probable Number (MPN)

2.

Untuk mengetahui cara menghitung nitrosomonas dengan metode MPN

3.

Untuk mengetahui ada tidaknya mikroorganisme

II. TINJAUAN PUSTAKA

Perhitungan jumlah suatu bakteri dapat melalui berbagai macam uji seperti uji
kualitatif koliform yang secara lengkap terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji
kuantitatif, bisa dengan metode MPN), uji penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu
sampel, biaya, tujuan analisis merupakan beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif
koliform. Bakteri koliform dapat dihitung dengan menggunakan metode cawan petri
(metode perhitungan secara tidak langsung yang didasarkan pada anggapan bahwa
setiap sel yang dapat hidup akan berkembang menjadi satu koloni yang merupakan
suatu indeks bagi jumlah organisme yang dapat hidup yang terdapat pada sampel)
(Penn, 1991).
Ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah
jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa
kelompok yaitu :
A. Perhitungan jumlah sel
1. Hitungan mikroskopik
2. Hitungan cawan
3. MPN (Most Probable Number)
B. Perhitungan massa sel secara langsung
1. Volumetrik
2. Gravimetrik
3. Kekeruhan (turbidimetri)
C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung
1. Analisis komponen sel
2. Analisis produk katabolisme
3. Analisis konsumsi nutrient

Dari metode-metode tersebut, metode hitungan cawan paling banyak digunakan. Hal
ini disebabkan metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif untuk
menghitung jumlah mikroba karena:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung
2. Beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang
terbentuk mungkin berasal dari satu sel dengan penampakan pertumbuhan yang
spesifik (Fardiaz 1989)
Metode perhitungan MPN sering digunakan dalam pengamatan untuk menghitung
jumlah bakteri yang terdapat di dalam tanah seperti Nitrosomonas dan Nitrobacter.
Kedua jenis bakteri ini memegang peranan penting dalam meningkatkan
pertumbuhan dan produksi tanaman, sehubungan dengan kemampuannya dalam
mengikat N2 dari udara dan mengubah amonium menjadi nitrat (Sutedjo, 1991).
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai
macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung
jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara
langsung dan secara tidak langsung. Ada beberapa cara perhitungan secara langsung,
antara lain adalah dengan membuat preparat dari suatu bahan (preparat sederhana
diwarnai atau tidak diwarnai) dan penggunaan ruang hitung (counting chamber).
Sedangkan perhitungan cara tidak langsung hanya untuk mengetahui jumlah
mikroorganisme pada suatu bahan yang masih hidup saja (viabel count). Dalam
pelaksanaannya, ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate
count/TPC), perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau
terdekat (MPN methode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri) (Sopiah.
2007)

MPN (most Probable Number). Metode hitungan cawan dengan menggunakan

medium padat, tetapi pada metode MPN dengan menggunakan medium cair di dalam
tabung reaksi. Perhitungan MPN berdasarkan pada jumlah tabung reaksi yang positif,
yakni yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya
kekeruhan atau terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang
diletakkan pada posisi terbalik, yaitu untuk jasad renik yang membentuk gas. Untuk
setiap pengenceran pada umumnya dengan menggunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih
banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat
gelas (tabung reaksi) yang digunakan juga lebih banyak (Dwidjosepuutro, 2005).
Perhitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara seri pengenceran. Cara ini secara
luas digunakan untuk menghitung bakteri hidup dalam berbagai cairan seperti air,
susu, biakan cair dan sebagainya. Serentetan pengenceran dibuat untuk kemudian
ditanam dalam medium pembiakan bulyon agar dan setelah inkubasi jumlah koloni
dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan pengencerannya, akan diketahui jumlah
bakteri per milliliter. Karena pengenceran dikerjakan secara lipat ganda atau secara
desimal, maka angka yang diperoleh hanya angka perkiraan, yang biasa disebut Most
Probable Number (MPN) (Irianto, 2006).
Prinsip untama dari metode MPN ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat
tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika
ditanam dalam tabung menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif kadangkadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin
rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang
muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran
yang dilakukan) maka semakin jarang tabung reaksi positif yang muncul. Jumlah
sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif kadang-

kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung
dari probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media.
Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif
(ya) atau negative (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada
sampel sebelum diencerkan (Dwidjoseputro, 2005).
Dalam metode MPN pengenceran sampel harus lebih tinggi daripada pengenceran
pada hitungan cawan, sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang
diinokulasikan dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung 1 jasad renik,
beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari 1 sel, sedangkan tabung yang lain
mengandung sel sama sekali. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi
pertumbuhan pada beberapa tabung, yang dinyatakan sebagai tabung positifm
sedangkan tabung lainnya negatif (Waluyo, 2004).
Metode MPN biasanya digunakan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam
sampel yang berbentuk cair, meskipun dapat juga digunakan untuk sampel yang
berbentuk padat dengan terlebih dahulu membuat suspense 1:10 dari sampel tersebut.
Kelompok jasad renik yang dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi
tergantung dari medium yang digunakan untuk pertumbuhan (Dwidjoseputro, 2005).

III. METODOLOGI PERCOBAAN

A. Alat dan Bahan

Adapun alat yang digunakan saat pelaksanaan praktikum yaitu
Cawan agar
Tabung reaksi
Kapas
Autoclave
Label
Sedangkan bahan yang digunakan saat pelaksanaan praktikum yaitu
Sample tanah
Medium
(NH4)2SO4
KH2PO4
CaCl2.2H2O
MgSO4
Fe-sitrat
Phenol red
Akuades
0,1 N HCl
0,1 N NaOH
1 ml larutan tanah
Nitrosomonas

B. Prosedur Kerja
Diambil 20 g sample tanah
Disiapkan seri pengenceran 10-1 10-8
Disiapkan medium untuk penetapan nitrosomonas

Dicocokkan pH medium menjadi 7.4 dengan menambahkan 0,1 N HCl atau NaOH

Ditambahkan akuades sehingga volumenya 1000 ml

Dimasukkan larutan medium tersebut sebanyak 9 ml ke dalam tabung reaksi
Ditutup tabung dengan kapas

Diautklaf selama 20 menit pada temperature 121C

Didinginkan medium
Dimasukkan 1 ml larutan tanah dari seri pengenceran 10-8 10-4, masing-masing
sebanyak 5 tabung reaksi dan 5 ulangan
Diberi label dan disiapkan control

Diinkubasi selama 3-4 minggu

IV. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Pengamatan
Seri Pengenceran
10-4

10-5

10-6

10-7

10-8

Jumlah Tabung yang Positif

B. Pembahasan
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari
hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung
yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel
atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah
mikroorganisme yang diuji dalam MPN/satuan volume atau massa sampel. Prinsip
utama metode ini adalah mengencerkan sample sampai tingkat tertentu sehingga

didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai dan jika ditanam dalam tabung
menghasilkan frekuensi pertumbuhan tabung positif. Semakin besar jumlah sampel
yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin
sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sample yang dimasukkan
(semakin tinggi pengenceran) maka semakin jarang tabung positif yang muncul.
Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang
terambil oleh pipet saat memasukkannya kedalam media.
Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai
MPN,terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Krisna,
2005).Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji
konfirmasi(confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap
pertama,keberadaan Nitrosomonas masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih
dalam dugaan. Ujiini mendeteksi sifat fermentatif Nitrosomonas dalam sampel.
Prosedur perhitungan adalahdengan penumbuhan dalam agar. Sampel suspensi sel
diinokulasi ke dalam media agar nutrien dan diinkubasi. Lantas jumlah koloni yang
terbentuk dihitung. Satu koloni yangterbentuk dari satu sel, maka jumlah koloni
menunjukkan jumlah sel dalam larutanasalnya.
Prosedur ini hanya menghitung sel-sel yang hidup. Bakteri Nitrosomonas adalah
bakteri yang mampu menambat nitrogen dari udara. Perhitungan jumlah suatu bakteri
dapat melalui berbagai macam uji seperti uji kualitatif koliform yang secara lengkap
terdiri dari tiga tahap yaitu uji penduga (uji kuantitatif, bisadengan metode MPN), uji
penguat dan uji pelengkap. Waktu, mutu sampel, biaya, tujuananalisis merupakan
beberapa faktor penentu dalam uji kualitatif Nitrosomonas.Jumlah masing-masing
cawan diamati setelah inkubasi, cawan yang dipilih untuk penghitungan koloni ialah
yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni, karena jumlahmikroorganisme dalam
sampel tidak diketahui sebelumnya, maka untuk memperolehsekurang-kurangnya

satu cawan yang mengandung koloni dalam jumlah yang memenuhisyarat tersebut
maka harus dilakukan sederetan pengenceran dan pencawanan. Jumlahorganisme
yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloniyang
terbentuk dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan.
Pada table diatas didapat nilai P1= 2, P2= 1, dan P3= 0, sehingga jika digabungkan
P1, P2, dan P3 mendapatkan nilai perhitungan sebesar 0.068 x 104. pada 10-6, 10-7,
dan 10-8 tidak terdapat bakteri karena tabung tidak mengalami perubahan ke warna
kuning (positif), tetapi bewarna agak keruh dan kemerahan.
Bakteri Nitrosomonas merupakan bakteri penitrifikasi. Bakteri ini dapat
mengoksidasiamonium (NH4+) menjadi nitrit. Bakteri ini tergolong gram negative
yang memeiliki bentuk sel batang (panjang 0.6 0.4 mikrometer), spiral, sferikal,
ellipsoid. Bakteri ini mempunyai sel yang tidak motil dan motil dengan flagella polar
sampai sub polar atau peritrik.
Bakteri nitrosomonas adalah bakteri aerob khemolitotrof obligat yang memeperoleh
energi dari oksidasi ammonium, menggunakan CO2 untuk sumber utama karbon.
Bentuk bakteri ini yaitu batang (basil), pendek, kadamg-kadang berbentuk elips,
motil, dan non motil. Bakteri ini dapat tumbuh optimum pada temperature 5-30C dan
pH optimum berkisar antara 5.8 sampai 8.5, serta hidup pada habitat air laut, air
tawar, dan tanah.
Adapun factor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan bakteri nitrosomonas yaitu :
1.

DO (Dissolvid Oxygen) = Oksigen terlarut, sebagai penyeimbang electron dari

substrat bernitrogen sehingga memerlukan kurang lebih 4.5 mg oksihen

2.

Suhu (T) = bakteri ini dapat tumbuh optimal antara suhu 20-30C, jika

temperature menurun, maka aktivitas bakteri itu sendiri menurun. Jika suhu lebih dari
35C, bakteri ini akan mengalami stress, sehingga enzim dapat rusak karena suhu

tinggi itu
3.

pH = pH optimum yaitu antara 7.5-8.5. pH yang baik yaitu apabila dapat

dipertahankan stabil.
4.

Cahaya = bakteri ini sensitive terhadap kehadiran cahaya yang mendekati

spectrum ultraviolet, karena terdapat hubungan superoksida radikal yang diproduksi

menghambat membrane oksigen.
5.

Konsentrasi nitrit nitrogen = bakteri ini dapat tumbuh jika kebutuhan sumber

nitrogen terendah menunjukkan angka 0,1 mg/L.

V. KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang dapat diambil setelah melakukan percobaan ini yaitu
1.

Semakin rendah seri pengenceran, maka tidak terdapat bakteri nitrosomonas

2.

Hasil perhitungan atau analisis yang didapatkan pada P1, P2, dan P3 yaitu 0.068x

104
3.

Bakteri Nitrosomonas dapat tumbuh dengan factor-faktor seperti oksigen, suhu,

pH, cahaya, dan konsentrasi nitrit nitrogen.

4.

Nitrosomonas dapat tumbuh dan berkembang dalam media yang telah dibuat

DAFTAR PUSTAKA

Fardiaz. 1996.Menentukan Jumlah dan Ukuran Mikroba.

Irianto. 2006. Isolasi dan Seleksi Bakteri Penitrifikasi. IPB : Bogor
Nida Sopiah. 2007. Teknik Biofilter Untuk Pengolahan Limbah Ammonia. Jurnal
BPPT : Jakarta
Penn, C. 1991.Handling Laboratory Microorganism. Open University. Milton
Sutedjo, M. M., A. G. Kartasapoetra dan RD. S. Sastroatmodjo. 1996. Mikrobiologi
Tanah. PT. Rineka Cipta. Jakarta. 447 hal.
Sutedjo, Mul Mulyani, dkk. 1996. Mikrobiologi Tanah. Rineka Cipta, Jakarta. Tim

lab. 2006. Penuntun Praktikum Purwokerto Prodi Ilmu Tanah. Faperta UNSOED,
Purwokerto.
Waluyo. 2004.. Mikrobiologi Tanah. CV Rajawali : Jakarta.

NB : JANGAN LUPA KASIH KOMENTAR SAMA JOIN KE SITE INI YAAAA :D

MAKASIHHH