Princpios das principais provas bioqumicas

bacteriolgicas
A investigao das atividades metablicas das bactrias in vitro chamada
de Provas Bioqumicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar
grupos ou espcies de bactrias atravs da verificao das transformaes
qumicas, que ocorrem num determinado substrato, pela ao das enzimas de
um dado microrganismo.
Como muitas vezes um determinado microrganismo possui um sistema
enzimtico especfico, promovendo transformao bioqumica especfica, as
provas bioqumicas podem ser utilizadas na prtica para a sua caracterizao,
como voc acompanhou nas postagens anteriores sobre Identificao de
Cocos Gram +, Identificao de Enterobactrias e Bacilos Gram negativos no
fermentadores.
Veremos agora qual o princpio e as principais reaes qumicas que
acontecem nos principais testes bioqumicos.
Produo de catalase
Esta enzima atua sobre a gua oxigenada (perxido de hidrognio 3 a 5%)
transformando-a em oxignio e gua. A prova feita colocando uma gota de
soluo aquosa de perxido de hidrognio a 3-5% numa lmina e, em seguida,
com uma ala de platina, colocar uma poro do crescimento bacteriano sobre
a gota. Ou de outra forma, adicionando-se 0,5 ml da mesma soluo a uma
cultura em meio lquido ou em gar inclinado. A prova considerada positiva
quando h borbulhamento ou efervescncia devido liberao do oxignio. A
catalase produzida por muitos microrganismos e usualmente empregada
para diferenciar Staphylococcus, que so catalase positivos de Streptococcus,
catalase negativos, ou os bacilos Gram positivos catalase
negativosLactobacillus e Erysipelothrix de Listeria e a maioria
dos Corynebacterium catalase positivos.

Prova da citocromo-oxidase
Este sistema enzimtico est relacionado com os citocromos da cadeia
respiratria de alguns microrganismos. A prova consiste em colocar uma gota
do reagente incolor tetrametil p-fenileno de amina, recm preparado e
protegido da luz, em um papel de filtro. Em seguida, vrias colnias do
microrganismo em estudo so espalhadas sobre a rea do papel de filtro
contendo o reagente, utilizando uma ala de platina ou um basto de vidro. A
prova considerada positiva quando na mistura do reagente com a massa
bacteriana desenvolve-se a cor prpura em at 1 minuto (ou de acordo com as
instrues do fabricante da tira de papel filtro). Na reao negativa no h
desenvolvimento de cor prpura. As enterobactrias so oxidase negativas e

podem ser diferenciadas de outros bacilos Gram negativos. A prova pode ser
feita tambm em culturas em meios slidos, adicionando-se o reagente oxalato
de p-aminodimetilanilina. A reao inicia-se com o desenvolvimento de cor
rsea, marrom e finalmente uma colorao negra na superfcie das colnias
indicativa da produo de citocromo-oxidase, representando um teste positivo.
O teste negativo se no ocorrer alterao da cor ou houver o
desenvolvimento de uma cor rsea plida

Utilizao do citrato como nica fonte de carbono

Alguns microrganismos como a E. coli no possuem a permease do citrato, que
faz o transporte do citrato para o interior da clula, no conseguindo portanto
crescer no meio contendo como nica fonte de carbono o citrato, embora
possuam as enzimas, intracelulares, que degradam o citrato. A prova feita
semeando-se a bactria no meio slido inclinado de citrato de Simmons,
contendo azul de bromotimol como indicador, o qual em pH 6,8 a 7,0
apresenta-se verde. A prova positiva resulta no transporte do citrato pela
permease e a sua utilizao pela enzima citratase resulta na formao de
oxaloacetato e acetato. O consumo do citrato induz a clivagem do fosfato de
amnia, alcalinizando o meio. Tambm, com o metabolismo do citrato h
formao de carbonatos que alcalinizam o meio, de modo que a cor do
indicador vira para azul. Na prova negativa o meio no se altera pois no h
crescimento microbiano. Por esse motivo a inoculao deve ser feita com
agulha e em linha reta para no haver influncia de ingrediente do meio de
onde se originou a cultura, dando resultados falso-positivos.

Prova da produo de urease

A urease uma enzima que degrada a uria em duas molculas de amnia e
uma de anidrido carbnico. A prova consiste em transferir uma poro do
crescimento bacteriano com uma ala para o meio contendo uria, pH neutro e
um indicador de pH, o vermelho fenol. Aps o crescimento a prova revelada
positiva quando a urease ataca a uria alcalinizando o meio que toma a
colorao rosa choque. Na prova negativa no h alterao da cor do meio. Os
organismos do gnero Proteus so urease positivos, diferentemente da maioria
das enterobactrias.

Prova da produo de indol

O indol resultante da degradao do aminocido triptofano pela enzima
triptofanase. A prova realizada inoculando-se o meio contendo excesso de
triptofano. Aps a incubao colocar 0,5 ml do reagente de Kovac ou o reativo
de Ehrlich (soluo aquosa ou alcolica de p-dimetil aminobenzaldedo,
respectivamente) atravs da parede interna do tubo. A prova positiva quando
na poro superior, i.e. na interface da cultura e o reagente, desenvolve-se um
anel de cor rsea dentro de no mximo 5 minutos. Este resultado devido
complexao do indol com o aldedo, em meio cido, formando o composto
colorido. A prova negativa com qualquer outra tonalidade de cor (original do
meio ou marrom).

Prova da produo de gs sulfdrico ou sulfeto de hidrognio

Existem duas vias fermentativas principais atravs das quais alguns
microrganismos podem produzir sulfeto de hidrognio. Pela primeira via, o gs
sulfdrico produzido por reduo do enxofre orgnico presente no aminocido
cistena (reao de hidrogenao), o qual um componente das peptonas
contidas no meio. Essas peptonas so degradadas pelas enzimas microbianas
a aminocidos. Atravs da ao da enzima desulfurase da cistena o
aminocido cistena perde o tomo de enxofre, que por sua vez reduzido pela
adio de hidrognio da gua para formar o gs sulfeto de hidrognio,
conforme ilustrado abaixo. Uma tira de papel de filtro impregnada com soluo
saturada de acetato de chumbo colocada suspensa sobre o meio contendo o
aminocido sulfurado. Esteriliza-se o meio, inocula-se com a cultura teste e
incuba-se apropriadamente. Na prova positiva, o H2S produzido voltil e
incolor, mas ao reagir com o acetato de chumbo forma-se sulfeto de chumbo,
que enegrece a extremidade do papel de filtro. Na prova negativa a fita
permanece branca.
Pela segunda via, o gs sulfdrico tambm pode ser produzido pela reduo de
compostos inorgnicos de enxofre tais como o tiossulfato, sulfato ou sulfito. Os
microrganismos capazes de produzir a enzima redutase do tiossulfato
convertem o tiossulfato em sulfito com liberao de sulfeto de hidrognio. Os
tomos de enxofre atuam como aceptores de hidrognio durante a oxidao do
composto inorgnico conforme abaixo. Para esse teste pode ser empregado o
meio de TSI (trplice sugar and iron) ou o de meio de SIM (sulfito, indol e
motilidade). Utilizando o meio de SIM, que tem o tiossulfato como fonte de
enxofre e o sulfato ferroso como indicador da produo de sulfeto de
hidrognio. O meio semi-slido para permitir a respirao anaerbia. Nesse
caso, inocula-se o meio por punctura e incuba-se em aerobiose por 24h a 35 oC.

Prova da fermentao de carboidratos: gar TSI (Triplice Sugar and Iron)

Envolve a utilizao de um meio com glicose e outros acares (lactose e
sacarose) e um indicador de pH.
Enterobactrias produzem cido e gs da fermentao da glicose
(exceto Shigella, que s produz cido).

O meio de TSI fornece uma srie de reaes bioqumicas que do uma viso
geral do metabolismo bacteriano. Por esse motivo, vamos apresentar esse
meio e as transformaes que ocorrem. O TSI ou trplice acar e ferro um
meio slido distribudo de tal sorte que apresenta uma base e uma inclinao.
constitudo de glicose (0,1%), lactose (1,0%) e sacarose (1,0%), peptonas,
aminocidos, incluindo sulfurados, tiossulfato de sdio e citrato frrico
amoniacal (indicador da produo de H 2S), com pH neutro e um indicador de
pH, o vermelho de fenol. O meio semeado com agulha por punctura na base
e estrias na superfcie. Aps o crescimento da bactria pode-se observar os
seguintes resultados: A bactria no fermenta qualquer dos acares,
ficando inalterado o meio, ou at mesmo utiliza os aminoidos respirandoos com produo de aminas que alcalinizam o meio; fermenta somente a
glicose de tal sorte que os cidos formados mudam o pH do meio apenas
na base, que se torna amarela e a inclinao vermelha por utilizao dos
aminocidos (por respirao), alcalinizando a mesma e neutralizando a
pequena quantidade de cidos, pois a concentrao de glicose baixa - assim
o resultado expresso como K/A (inclinao alcalina e base cida); fermenta a
lactose ou a sacarose com viragem do indicador de todo o meio para
amarelo, tanto a base como a inclinao permanecem cidas, pois os
lcalis produzidos na inclinao so facilmente neutralizados pela grande
quantidade de cidos produzidos na base, tendo em vista que a
concentrao desses acares dez vezes maior que a da glicose - o
resultado expresso como A/A (inclinao e base cidas). Nos dois ltimos
casos, existe a possibilidade de detectar gases resultantes da degradao do
cido frmico em hidrognio e anidrido carbnico, se a bactria possuir o
sistema hidrognio frmico liase - os gases so indicados ou visualizados
indiretamente por levantar ou fragmentar o meio - o resultado representado
como A/A com gs. H tambm a possibilidade da bactria produzir H2S por
respirar anaerobiamente o tiossulfato, captando eltrons atravs da tiossulfato
redutase, resultando em gs sufdrico e sulfito. O sulfeto de hidrognio na
presena de sais de ferro forma sulfeto ferroso, originando um precipitado
negro insolvel - dessa forma o resultado dado como A/A com gs e H 2S.
Desse modo, pode-se observar num nico meio os processos fermentativos,
respirao aerbia e anaerbia. A utilizao dos acares e aminocidos na
inclinao se d apenas por respirao aerbia, enquanto que na base os
processos so realizados por fermentao (incluindo tambm putrefao,
quando da utilizao dos aminocidos bsicos, sulfurados, triptofano, com
produo de gs sulfdrico, mercaptanas, aminas, dentre outras). J a
utilizao do tiossulfato ocorre por respirao anaerbia, gerando tambm
gs sulfdrico.
As Pseudomonas (assim como todos os BGNNF) no fermentam carboidratos,
logo, no alteram a colorao original do TSI.
As diversas variaes do TSI aps a devida incubao pode evidenciar
produo de H2S, no-fermentao de glicose, fermentao de 1, 2 ou 3
acares, produo de gs carbnico, etc.
As interpretaes seguem conforme:

a) Fundo alcalino (vermelho) e pico alcalino (vermelho) - ausncia de

fermentao dos carboidratos;
b) Fundo cido (amarelo) e pico alcalino (vermelho) - fermentao apenas de
glicose;
c) Fundo cido (amarelo) e pico cido (amarelo) - fermentao de glicose e
lactose; ou glicose, lactose e sacarose.
d) Presena de espaos vazios incolores - produo de gases.
e) Presena de substncias negras - produo de H2S.
f) Ausncia
de
alteraes
bactria
no-fermentadora.
OBS.: Caso a bactria produza H2S e dificulte a visualizao do fundo do tubo,
o mesmo deve ser consideradocido (amarelo) , indicando que houve
fermentao de pelo menos um carboidrato, visto que isso seria necessrio
para que a bactria promovesse a produo do gs.

Prova da Motilidade
A prova da motilidade indica indiretamente a produo de flagelos. No uma
prova bioqumica e sim fisiolgica, mas auxilia a identificar bactrias. A prova
efetuada inoculando-se em linha reta, atravs da tcnica da punctura (com
agulha), 2/3 de um meio semi-slido (por exemplo o SIM). A prova indica
motilidade quando os microrganismos crescem deslocando-se da linha de
inoculao, turvando o meio. A prova negativa quando os microrganismos
ficam restritos ao local da inoculao sem, contudo, turvar o meio.

Bioneogenios
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