FACULTAD DE FARMACIA Y
BIOQUIMICA
MANUAL DE PRCTICAS
BIOQUIMICA
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FUENTE: http://quimicoupagu.blogspot.com/
REACTIVOS:
1.- Reactivo de Bial. Disolver 1.5 g de orcinol en 500 ml. De HCl concentrado.
Agregar a esta solucion 20 gotas de FeCl3. Guardar en frasco ambar.
2.- Solucion de carbohidratos:
Glucosa: 1g/100ml
Xilosa: 1g/100ml
TECNICA:
1.- Rotular los tubos de ensaye de 15 x 150 con el nombre del carbohidrato a
probar y el nombre de la prueba (Bial).
2.- Pipetear 1ml de la muestra (sol. de carbohidrato) al tubo de ensaye
correspondiente, y 2.5 ml de reactivo de Bial.
3.- Colocar en bao de agua hirviente hasta la aparicion de color, y sacar
inmediatamente.
RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
PRUEBA DE SELIWANOFF
FUNMDAMENTO:
Las cetosas se deshidratan mas rapidamente que las aldosas dando derivados de
furfural que se condensan con resorcinol para formar un compuesto coloreado, por
lo tanto debe evitarse un calentamiento prolongado que ocasionaria la
deshidratacin de las aldosas.
GENERALIDADES:
-Explique que es una aldosa y una cetosa
-Escriba la formula de Fisher y de Haworth de una aldosa y una cetosa con
nombres.
REACTIVOS:
1.- Reactivop de Seliwanoff. Disolver 0.7 g de resorcinol en 100 ml de HCl
concentrado. Agregar agitando 100 ml de agua destilada. Guardar en frasco
ambar.
2.- Solucion de fructosa y glucosa 1g/100ml cada uno.
TECNICA:
1.- Rotular los tubos de endsaye con el nombre del carbohidrato y el nombre de la
prueba (Seliwanoff).
2.- Pipetear 2 ml del reactivo de Seliwanoff a cada tubo y aadir 2 gotas del
carbohidrato al tubo de ensaye correspondiente. Calentar en un bao de agua
hirviente hasta la aparicion de color.
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RESULTADOS:
OBSERVACIONES:
Practica no. 2.
IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS II.
REACCIN DE TOLLENS.
FUNDAMENTO: LA PRUEBA DE T0LLENS ES UNA REACCIN
CARACTERSTICA PARA AZUCARES REDUCTORES DANDONOS
COMPUESTOS COLOREADOS (NEGROS) CUANDOSE TRATE DE ELLOS.
REACTIVOS:
GLUCOSA 2%
ARABNOSA 2%
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OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
FUNDAMENTO: LA REACCIN DE FEHLING ESTA BASADA EN LA ACCIN
REDUCTORA QUE TIENEN LOS AZUCARES SOBRE LOS IONES CPRICOS
EN MEDIO ALCALINO
REACTIVOS:
GLUCOSA 2%
ARABINOSA2%
MALTOSA 2%
SACAROSA 2%
FRUCTOSA 2/o
ALMIDN 2%
AGUA DESTILADA.
REACTIVO DE FEHLING:
SOLUCIN A: PESAR 34.65 g DE SULFATO DE COBREY DISOLVER EN 300 ml
DE AGUA DESTILADA, LLEVAR A 500 ml CON AGUA Y CONSERVAR EN
FRASCO CON TAPN DE HULE.
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CONCLUSIONES:
REACCION DE LA ANTRONA.
FUNDAMENTO:
LOS
ACIDOS
CONCENTRADOS
ORIGINAN
UNA
DESIDRATACION DE LOS MONOSACARIDOS PARA RENDIR FURFURALES
QUE SON DERIVADOS ALDEHIDICOS DEL FURANO, POR EJEMPLO: LA DGLUCOSA CON ACIDO CLORHIDRICO CONCENTRADO (HCl) PRODUCE 5
HIDROXI METIL FURFURAL.
ESTOS PRODUCTOS SE COMBINAN LUEGO CON ANTRONA PARA DAR UN
COMPLEJO COLOREADO.
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REACTIVOS:
1.- SOLUCION DE ANTRONA 2 GR/LT EN HCl CONCENTRADO.
2.- SOLUCION DE GLUCOSA 1 GR/100 ML
3.- FRUCTOSA 1 GR/1OO ML.
TECNICA:
1.- APROXIMADAMENTE A 2 ML DE ANTRONA AGREGUE 5 GOTAS DE LA
SOLUCION PROBLEMA, MEZCLAR FUERTEMENTE Y OBSERVAR EL CAMBIO
DE COLOR.
RESULTADO:
OBSERVACIONES:
CONCLUSIONES:
PRACTICA NO. 3.
REACCIN DE BENEDICT PARA AZUCARES REDUCTORES
Fundamento:
Esta prueba se basa en la reaccin de reduccin del cobre de Benedict. La
glucosa y otras sustancias reductoras reducen los iones cpricos a iones cuprosos
y forman un oxido cuproso rojo. El color azul de Cu++ es negativo para sustancias
reductoras.
Generalidades:
Escriba las frmulas de la glucosa, la sacarosa y un segmento del almidn (en
forma de alfa amilasa).
Reaccin de Fehling.
Consiste en:
1 ml de la solucin problema (Hidrolizado)
+
0.5 ml de Fehling A
+
0.5 ml de Fehling B
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Reactivo de Benedict
solucin de almidn 2%
solucin de sacarosa 2%
Solucin de glucosa a diferentes concentraciones indentificadas como:
Glucosa 1, 2,3 y 4.
Tcnica:
Pipetee 0.5ml de la solucin problema en un tubo de ensayo de 15 x 150 y
agregue 1 ml de reactivo de Benedict, mezclar y colocar en un bao de agua
hirviendo por 3 min.
Auxliese de la tabla siguiente para determinar la cantidad aproximada de glucosa
presente en las soluciones de glucosa 1, 2,3 y 4.
color
Azul
Azul verdoso
0.3 g/100ml
Verde oliva
1.0 g/100 ml
Azul caf
1.5 g/100 ml
Rojo ladrillo
2.0 g/100 ml o ms
Hidrlisis de la Sacarosa
5 ml de sacarosa 2%
+
6 gotas de HCl concentrado
Mezclar y calentar 5 minutos en agua hirviente
Enfriar
Agregar 15 gotas de NaOH 5% para neutralizar
Efectuar una prueba de Fehling al hidrolizado
Reaccin de Fehling
1 ml de la solucin problema (Hidrolizado)
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CALCULOS Y RESULTADOS
La glucosa se expresa en mg/dL o mmol/Litros
Glucosa mg/Dl= A X concentracin del estndar
A s
A= absorbancia del problema
As = absorbancia del estndar
ESTANDAR = 90mg. /dL (
) X (90 ) =
(
VALORES ESPERADOS
70-105mg. / dL
Estos valores son sugeridos. Se recomienda que cada laboratorio establezca el
rango para el rea en que esta localizado.
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X 90 =
90
mg/dl
83 mg/dl
RESULTADOS:
CONCLUCIN:
PRACTICA NO. 6.
CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.
FUNDAMENTO:
CURVA DE TOLERANCIA A LA GLUCOSA.
Son pruebas que miden la capacidad para metabolizar la glucosa. Las personas
que padecen de diabetes mellitus tienen altos niveles de glucosa en la sangre y
las pruebas de tolerancia a la glucosa son una de las herramientas para
diagnosticarla.
Este examen tambin se realiza para diagnosticar diabetes mellitus en estudios
investigativos que involucren a los diabticos y en casos en los que se sospeche
la presencia de esta enfermedad, a pesar de haber realizado un examen en
ayunas de glucosa en sangre, con resultados normales, as como para el
diagnstico de hiperinsulinismo (elevacin de los niveles de insulina).
Los mtodos ms utilizados ms comnmente para evaluar la tolerancia a una
sobrecarga de glucosa pueden ser:
1. Pruebas de tolerancia utilizando una dosis nica oral de glucosa.
2. Pruebas de tolerancia con una dosis intravenosa de glucosa.
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DIBUJOS:
CALCULOS Y RESULTADOS:
CONCLUSIONES:
PRACTICA NO. 7.
DETERMINACIN DE GLUCOSA SERIADA.
ANTECEDENTES:
La determinacin de la glucosa en fluidos biolgicos asido bien documentadas. La
prueba de glucosa pude ser diagnostica mente significativa en diabetes e
hipoglucemia.
MATERIAL:
4 tubo de ensaye de 13/100
1pipeta de 20 microlitros
1 pipeta de 5ml.
REACTIVOS:
Reactivo de color:
Una solucin conteniendo despus de reconstitucin 0.5125 mml. / L de
4-antipirina, 10mmol /L de p- hidrixibenzoato, > 20 000 U/L de glucosa oxidasa,
>1000 U/L peroxidasa (Rbano Picante), buffer y preservativo.
Estndar de glucosa
Una solucin acuosa conteniendo 90 ml/dL la glucosa y perceptivos
PROCEDIMIENTOS:
1.-prepare el reactivo de trabajo de glucosa
2.-en tubos separados pipetee 20 microlitros del estndar o del suero a ensayar
3.-aada 2 ml. De reactivo y mezcla.
4.- incube por 10 minutos a 37C, y determine la absorbancia del estndar
(A s) y de cada cero (A) a 505 nm. Contra blanco de reactivo.
CALCULOS Y RESULTADOS
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VALORES ESPERADOS
70-105mg. / dL
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
CONCLUCIN:
PRACTICA NO.8.
Determinacin de protenas totales.
Historia del Mtodo
La reaccin de color de las molculas de protenas con iones cpricos, es
conocida como la reaccin de color de Biuret, y es conocida desde 1878, desde
las publicaciones de Riegler en 1914 se han hecho varios intentos para estabilizar
los iones cpricos en ractivos alcalino. Kingsley modific el procedimiento en 1939
y en 1942 para incluir el uso de sodio como agente complejo. Este procedimiento
fue modificado ms tarde por Weichselbaum y Gornall. El presente mtodo est
basado en estas modificaciones.
Principio
++
Protena + Cu
lcali
complejo de color
Procedimiento (Manual)
Etiquetar los tubos para blanco, estndar, paciente, etc.
Pipetee 1.0 ml del reactivo de trabajo a cada tubo.
Aadir 20 Ul de la muestra a los tubos respectivos, mezclar por
inversin,
Incubar 5 minutos a temperatura ambiente.
Ajustar el espectrofotmetro a cero con el blanco a 540 nm.
Leer y anotar las absorbancias de todos los tubos.
Calibracin
Use estndar acuoso de protena (8g/dL) o suero calibrador. Se debe calibrar de
acuerdo a las instrucciones de calibracin del instrumento. Si el resultado de los
controles se encuentra en el rango, la prueba debe ser recalibrada.
Clculos
Abs = Absorbancia
Abs (Paciente)
-------------------Abs (Estndar)
Valores esperados
6.2 8.5 g/dl
Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES:
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CONCLUCIN:
PRACTICA NO. 9.
PROTEINAS TOTALES Y ALBUMINA
OBJETIVO
Cuantificacin de las protenas totales y albmina en el suero.
FUNDAMENTO
Proteina:
La protena presente en la muestra reacciona con los iones cobre (II) en medio
alcalino, originando un complejo coloreado que se cuantifica por
espectrofotometra.
Albumina:
La determinacin colorimetrica de albumina humana en suero se realiza en un
medio amortiguado, lo cual permite su union por puentes de hidrogeno a
colorantes o indicadores como el verde de bromocresol, tiene la propiedad de
enlazarse especficamente con la albmina produciendo un cambio de color de
intensidad proporcional a su concentracin.
GENERALIDADES
Las protenas sricas estn separadas aproximadamente en albminas y
globulinas; en otras palabras, la protena total = albmina + globulina. La albmina
es la protena de mayor concentracin en el suero que sirve para trasportar
muchas molculas pequeas, pero tambin juega un papel decisivo en el
mantenimiento de la presin onctica de la sangre, es decir, impedir que el lquido
se filtre a los tejidos.
Las globulinas se dividen a grandes rasgos en globulinas alfa-1, alfa-2, beta y
gammaglobulinas, las cuales se pueden separar y cuantificar en el laboratorio
mediante la electroforesis y la densitometra.
La fraccin alfa-1 incluye la alfa-1 antitripsina (ver Alpha-1 antitripsina ) y la
globulina fijadora de tiroxina (ver T3, T4, RT3U ). La fraccin alfa-2 contiene la
haptoglobina, ceruloplasmina, HDL y alfa-2 macroglobulina.
En general, los niveles de protenas alfa-1 y alfa-2 aumentan en presencia de
inflamacin. La fraccin beta incluye la transferrina (ver hierro srico ), el
plasmingeno (ver anlisis del factor VIII ) y las beta lipoprotenas (ver LDL). La
fraccin gamma incluye los diferentes tipos de anticuerpos (inmunoglobulinas M, G
y A).
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METODOLOGIA:
BIURET
VERDE DE BROMOCRESOL
REACTIVOS
Verde de bromocresol (BCG) 0.15 g/L. Buffer pH 4.56- 4.76; Surfactante,
ingredientes no reactivos y estabilizadores.
Reactivo de proteinas (biuret)
Patron para proteinas totales.
Patron para albumina.
El reactivo esta listo para usarse
El reactivo es estable a la fecha de caducidad, guardado a temperatura
ambiente.
El reactivo debe ser una solucin verde-amarilla, clara. Si presentan
turbidez o precipitado el reactivo es insatisfactorio y debe ser descartado.
PRECAUCIONES:
Los reactivos causan irritacion. Evite el contacto con piel, ojos y ropa. En caso de
contacto, lavese con abundante agua.
CONSERVACIN
Almacenados a temperatura ambiente, los reactivos son estables hasta su fecha
de caducidad.
INSTRUMENTOS
Use un espectrofotometro o fotocolorimetro calibrado a 540 y 630nm y un bao
capaz de mantener la temperatura a 37C.
MUESTRA
Suero unicamente
MATERIAL
Pipetas automatizadas
Tubos de ensayo
Cronometr
Espectrofotmetro para leer a 630 nm
PROCEDIMIENTO
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BLANCO
de 2.5ml
ESTANDAR
2.5ml
Suero
MUESTRA
2.5ml
0.05ml
patron
0.05ml
2.- Agitar bien y dejar los tubos durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3.- Leer la absorbancia (A) del Patrn y de la muestras frente al Blanco a 540 nm.
El color es estable durante al menos 2 horas.
Albmina
Etiquete los tubos para blanco, control, estndar, paciente, etc.
Pipetee 1.0 mL del reactivo de trabajo en cada tubo.
Aada 10L de la muestra a los tubos respectivos y mezclar.
Incube por un minuto.
Ajuste el espectrofotmetro a cero con el blanco a 630 nm.
Lea y anote las absorbancia de todos los tubos.
BLANCO
ESTANDAR
MUESTRA
Reactivo
de 2.5ml
2.5ml
2.5ml
albumina
Suero patron
0.01ml
Suero problema
0.01ml
OBSERVACIONES Y RESULTADOS:
CONCLUCIN:
Cuestionario.
1.- Cul es la protena plasmtica ms abundante?
2.- donde es sintetizada la albmina?
3.- Cuntas cadenas polipetida y cuantos aminoacidos constituyen la albmina?
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lipasa
GK
GliceroL-1-fosfato + O2
DAP + H2O2
PROCEDIMIENTO MANUAL:
1. Identificar los tubos: blanco, estandar control, etc.
2. Pipetear 1 mL de reactivo en cada tubo.
3. Agregar 10 uL de suero a sus respectivos tubos. Mezclar suavemente.
4. Incubar todos los tubos por 5 minutos.
5. Ajustar el espectrofotometro a 0 con el blanco (500-520 nm)
6. Leer y anotar absorbancias. El color final es estable por 60 minutos.
VALORES ESPERADOS:
44-148 mg/dL. Se recomienda que cada laboratorio establezca sus propios valores
de referencia.
CALCULOS:
NOTA.- Los trigliceridos se expresan en mg/dL o mmol/L
mg/dL= Abs. (desconocido)/ Abs. (estandar) x concentracion std trigliceridos
mg/dL.
Para convertir el valor a mmol/L, se debe multiplicar el resultado por 0.0113.
OBSERVACIONES Y RESULTADOS:
CONCLUCIN:
PRACTICA NO. 11.
COLESTEROL
PRINCIPIO.
col. esterasa
steres de colesterol.
Colesterol + H2O
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POD
quinoneimina + 4H2O
abs. (Desconocido)
Abs. (Estndar)
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OBSERVACIONES Y RESULTADOS:
CONCLUCIN:
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