PCR & ELEKTROFORESIS

PENDAHULUAN
PCR adalah suatu metode untuk mengamplifikasi sekwens gen target secara
eksponensial in vitro. Pada reaksi ini dibutuhkan: DNA target, sepasang primer,
polimerase DNA yang termostabil, buffer reaksi dan alat thermal cycler.
Ukuran target untuk amplifikasi biasanya kurang dari 700-1000 pasang basa (bp),
tetapi target dari spesimen klinik yang efisien untuk diamplifikasi antara 100-400 bp.
Walaupun target panjang dapat juga diamplifikasi namun prosesnya kurang efisien,
karena produknya yang panjang lebih rentan terhadap inhibitor yang mempengaruhi kerja
enzim polimerase, di samping itu waktu untuk amplifikasi jadi lebih panjang.
Dalam memilih target yang akan diamplifikasi, yang paling penting diperhatikan
adalah stabilitas genetik dari target. Perubahan atau hilangnya sekwens target akan
berakibat hilangnya reaktivitas. Bagian dari plasmid atau transposon yang membawa sifat
virulensi suatu bakteri adalah salah satu contoh elemen genetik yang potensial tidak
stabil. Padahal deteksi sekwens target yang berhubungan dengan virulensi tersebut
penting untuk membedakan antara organisme patogen dan non patogen. Elemen genetik
ini bisa hilang waktu isolasi primer atau pemindahan serial. Dalam hal ini, amplifikasi
sebaiknya dilakukan segera setelah isolasi atau langsung dari sampelnya.
Alat thermal cycler (mesin PCR) yang secara tepat meregulasi temperatur dan
siklus waktu dibutuhkan untuk menjamin reprodusebilitas dan keakuratan dari reaksi
amplifikasi. Perbedaan antara temperatur yang telah di-set dan temperatur yang
sebenarnya didalam semua sumuran mesin PCR tidak boleh lebih dari 1C. Seperti
diketahui, siklus terdiri dari denaturasi (94C, selama 30-60 detik), annealing/hibridisasi
(45-60C, 60-120 detik) dan perpanjangan rantai (72C, 60-120 detik). Siklus kemudian
diulang 20-35 kali. Biasanya dibutuhkan denaturasi awal pada 94C selama 4-5 menit
sebelum siklus dimulai.
Teknik hot-start dilakukan untuk menghindari pembentukan produk non spesifik,
dengan cara tidak mencampurkan dahulu salah satu komponen esensial dari reaksi
misalnya enzim polimerase. Hal ini untuk mencegah supaya tidak terjadi polemerisasi
pada temperatur rendah (nonsringent). Setelah temperaturnya meningkat, barulah enzim
tersebut ditambahkan.
Elekroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas
ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang
mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada makromolekul, misalnya DNA yang
bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu
medium, misalnya gel agarosa, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke ketub yang
berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub
positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap
massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya.

Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun

protein. Elektroforesis DNA dilakukan misalnya untuk manganalisis fragmen - fragmen
DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen molekul DNA yang telah
dipotong-potong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa, yaitu
suatu bahan semi-padat berupa polisakarida yang di ekstraksi dari rumput laut. Gel
agarosa dibuat dengan melarutkannya dalam suatu buffer. Agar dapat larut dengan baik,
pelarutannya dibantu dengan pemanasan, misalnya menggunakan oven gelombang mikro
(microwave oven). Dalam keadaan panas, gel akan berupa cairan sehingga mudah
dituang ke atas suatu lempeng (plate) yang biasanya terbuat dari Perspex. Sebelum
mendingin dan memadat, pada ujung gel tersebut dibuat lubang - lubang dengan
menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut
ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan demikian, pada waktu gel
memadat dan sisirnya diambil terbentuklah lubang - lubang kecil. Ke dalam lubang lubang kecil itulah sampel molekul DNA dimasukkan. Gel agarosa yang sudah terbentuk
kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi buffer yang sama dengan yang
digunakan untuk membuat gel. Buffer dapat dibuat misalnya dengan Tris-asetat-EDTA
(TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).
Setelah DNA dimasukkan kedalam lubang sampel, arus listrik dialirkan. Kutub yang
sejajar dengan lubang sampel DNA berupa kutub negatif, sedangkan kutub lainnya
positif. Oleh karena DNA bermuatan negatif maka molekul - molekul DNA akan
bergerak kearah kutub positif. Setelah beberapa waktu gel kemudian direndam dalam
larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan menginterkalasi
(menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromida dimasudkan untuk membantu
visualisasi karena etidium kromida akan memendarkan sinar ultraviolet. Jika gel disinari
dengan ultraviolet dari bawah, maka akan tampak citra berupa pita - pita pada gel. Pita pita tersebut adalah molekul - molekul DNA yang bergerak sepanjang gel setelah di
elektroforesis. Molekul RNA dapat dianalisis dengan prinsip yang sama, yaitu
menggunakan gel agarosa, namun dengan menggunakan buffer yang berbeda yaitu yang
mengandung formaldehid.

METODE
-

ALAT (PCR)
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.

Rak tabung
Tabung PCR 0,2 l
Micropipettor (10-100 l dan 100-1000 l)
Pipet tip untuk 1000 l dan 100 l
Alat vortex (Stuart Scientific Autovortex SA6)
Tabung eppendorf 1,5 ml
Alat untuk spin (Beckman icrofuge E)
Mesin PCR (i-cycler)
Kertas absorban atau tissue & Handscoon

ALAT (Elektroforesis)

1. Rak tabung
2. Timbangan (Sartorius 2402)
3. Gelas Ukur
4. Backer Glass
5. Microwave untuk melarutkan del agarose
6. Micropipettor 0,5-10 l
7. Pipet tip untuk 20 l
8. Kertas parafilm
9. Bak Elektroforesis beserta sisir
10. Mesin elektroforesis beserta power supply (BIO-RAD Model 200/2,0 Power
supply)
11. Cahaya ultraviolet (Spectrolite Longlife1027 filter)
12. Kamera Polaroid (Direct Screen Instant Camera DS 34)
13. Film Polaroid (667 ISO 3000/DIN, 8,5x10,8 cm Black and White Instant Pack
Film) atau Geldoc (Biorad)

Tabung PCR 0,2 l

Alat Vorteks

Rak Tabung

Mesin
elektroforesis
beserta power
supply

Micropipettor

Mesin PCR

Pipet tip

Cahaya
ultraviolet,
Kamera
Polaroid,
Film Polaroid

Bak
Elektroforesis

Handscoon, &
tissue

BAHAN (PCR)
1.
2.
3.
4.

Mix kit PCR

Buffer 10x MgCl2-Free
Larutan MgCl2 25mM
PCR Nucleotide Mix (dNTP) 10 mM
Taq DNA Polymerase yang tergabung dalam PCR mix green GoTaq
(Promega)
- 45 l ddH2O
- 50 l enzyme
- 2,5 l Primer oligonukleotida forward
- 2,5 l Primer oligonukleotida reverse
- 5 l DNA

CARA KERJA (PCR)

1. Buat campuran GoTag dengan komposisi 45 l ddH2O, 50 l enzyme, 2,5 l
Primer oligonukleotida forward, 2,5 l Primer oligonukleotida reverse, 5 l
DNA
2. Dicentrifuge 8000 rpm selama 30 detik.
3. Dirunning dengan menggunakan alat PCR yang diatur diawal.
a. Denaturasi Awal, 5 menit dengan suhu 95C
b. Siklus 30x, 30 detik dengan suhu 95C (denaturasi), 30 detik dengan suhu
60C (anneling) dan 30 detik 72C (ekstensi)
c. Ekstensi Tambahan, 7,5 menit pada suhu 72C dan diakhiri dengan suhu
-4C.

95
5mn

95
30dtk
60
30dtk

Denatur
asi

Siklus
30x

72
72
30dtk 7,5

Ekestens
i

4C

Awal

d. Sambil menunggu tahap PCR seselai, persiapkan bahan dan alat untuk
elektroforesis.
-

Bahan (Elektroforesis)
Gel agarose 2 % (mengandung 1 l ethidium bromide 0,5 mg/ml dalam
larutan buffer TBE 1x)
Larutan buffer Tris Acete EDTA (TBE) 1x
Tracking dye [0,25% bromophenol blue (Bio-Red, 161-0404); 0,25% xylene
cyanol; dan 40% sukrosa w/v]
Produk hasil PCR dan marker DNA (DNA Molecular Weight Marker XIV
100-1500 bp)

Gambar : Buffer & Gel agarose

CARA KERJA (Elektroforesis)

1. Siapkan apparatus elektroporesis berisi 1x (Tris-Boric acid-ADTA, 10,8 d/L.
Tris pH 8 yang mengandung 5,5 g/l Boric Acid dan 0,5 M EDTA pH 8) dan
ditambahkan zat interkalator ethidium Bromide 0.1%.
2. Masukan DNA kedalam sumuran yang terdapat dalam gel. dipipet control
positif, control negative, dan sampel masing-masing 10L ke dalam well
agarose (konsentrasi 2%) yang telah direndam dalam alat elektroforesa.
3. Hubungkan elektroda dengan power supplay dan aliri listrik 110 volt selama
60 menit, kemudian direndam dalam ethidium bromide selama 15 menit.
4. Dibaca dengan alat translumineter (sinar UV, Gel Doc 1000) pada panjang
gelombang 300 nm dan direkam.

DISKUSI
PCR berfungsi untuk memecah serta memperpanjang rantai DNA yang ada pada sampel,
dan untuk membacanya memerlukan teknik elektroforesis yang telah dijelaskan didalam
prosedur. Ada beberapa faktor yang mempengaruhi proses migrasi DNA atau RNA,
faktor-faktor ini menentukan hasil pemisahan :
-

Konsentrasi agarosa. Molekul besar seperti genom untuk dielektroforesis

dengan agarosa berkonsentrasi 0,8%; sedangkan hasil amplifikasi DNA,
dielektroforesis dengan konsentrasi yang tinggi yaitu 1,5-2%.
Ukuran molekul DNA. Ukuran dan struktur molekul DNA mempengaruhi
mobilitas dan dielektroforesis. Secara berurutan mobilitas molekul berbeda dalam
hal kecepatan: Ssirkular > linier, fragmen DNA > genom utuh.
Voltase. DNA merupakan mlekul bermuatan negative. Voltase 100 V bias saja
digunakan untuk analisa rutin, sedangkan bila diperlukan pemisahan yang
sempurna maka digunakan voltase 50 V. Pada voltase 50 V ini, walaupun lebih
lambat tetapi hasil pemisahannya lebih maksimal.
Suhu. Moleku DNA akan cepat terurai pada suhu tinggi dan akan menyatu bila
suhu mendingin.