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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA M É T O D

INSTITUTO

POLITÉCNICO

NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA M É T O D

M É T O D O S

D E

A N Á L I S I S

Práctica

“SEPARACIÓN DE UNA MEZCLA DE AZUL DE METILENO Y FLOURESCEÍNA USANDO CROMATOGRAFÍA POR ADSORCION”

Sección 2

5QM2

Díaz López Mónica/ Trejo Solórzano Alejandra.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

INTRODUCCION

Existen ciertas sustancias sólidas, químicamente inertes, que tienen la propiedad de adsorber o fijar débilmente en su superficie a una gran cantidad de compuestos. La fortaleza con la que se adsorben las sustancias sobre un adsorbente dado varía de un compuesto a otro. Entre los adsorbentes más usuales: sílica Gel (óxido de silicio), alúmina (óxido de aluminio), celulosa, fluorosil (silicato de magnesio) y sulfato de calcio. La separación se realiza por la diferente tendencia de adsorción de los compuestos orgánicos por la fase estacionaria. La fase móvil desplaza y disuelve a los componentes de la mezcla según sea su afinidad por la fase estacionaria es decir, los componentes más polares estarán adsorbidos con más fuerza y serán más difíciles de separar de la fase estacionaria que los componentes poco polares. Los menos polares no presentan una interacción importante con la fase estacionaria (gel de sílice) y no serán retenidos. En un proceso de adsorción los componentes de la mezcla son adsorbidos por la fase estacionaria con diferente intensidad de tal forma que el proceso adsorción – desorción hace que unos componentes avancen más rápidamente que otros. La adsorción es un proceso de superficie mientras que la absorción es la penetración de una sustancia en el seno de otra (al escribir el papel adsorbe tinta mientras que la esponja absorbe agua). En cualquier fenómeno de adsorción influyen tres variables independientes: el adsorbente, el disolvente y las sustancias a separar. Por tanto, sí una molécula tiene una gran afinidad pasará muy lentamente mientras que otro componente con menos afinidad lo hará más rápidamente.

OBJETIVOS

Conocer el manejo de algunas técnicas para la separación de dos componentes

de una mezcla. Analizar los factores que influyen en el proceso de cromatografía por adsorción,

Comprobar la separación con base al perfil de elución.

RESULTADOS

  • A. CONSTRUCCION DEL PERFIL DE ELUCION.

Tabla No. 1 Valores de Absorbancia obtenidos para la separación de azul de metileno y fluoresceína.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

Volumen de elución (ml)

A 493

A 668

  • 3 -0.020

-0.049

  • 6 0.047

0.905

  • 9 0.082

1.156

  • 12 -0.011

0.134

  • 15 -0.020

0.000

  • 18 -0.083

0.022

  • 21 -0.014

-0.002

  • 24 -0.010

-0.008

  • 27 -0.009

0.000

  • 30 -0.017

-0.006

  • 33 -0.017

-0.010

  • 36 -0.019

-0.011

  • 39 -0.021

-0.010

  • 42 1.424

-0.010

  • 45 0.938

-0.008

  • 48 0.210

-0.008

  • 51 0.030

-0.012

  • 54 0.006

-0.011

  • 57 0.002

-0.011

1.6 1.4 1.42 1.4 1.16 1.2 1.2 1 1 0.8 0.8 Absorbancia 0.6 0.6 0.4 0.4
1.6
1.4
1.42
1.4
1.16
1.2
1.2
1
1
0.8
0.8
Absorbancia
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
-0.2
-0.2
Volumen de Elucion (mL)
Azul de Metileno
Flouresceína

Figura No. 1. En esta grafica se muestra los valores de absorbancia obtenidos a partir de los diferentes volúmenes de elución en la separación por cromatografía de absorción del azul de metileno y la flouresceína.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

Preguntas Extras

  • 1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatógrafico para esta separación.

Eluyente Elución Eluato
Eluyente
Elución
Eluato

Figura No. 2. Componentes de un sistema cromatógrafo y eluato/elución

Eluato: Líquido que es colectado por elución en la cromatografía en columna. Elución: Es la migración de los solutos a lo largo de la columna desde el punto de aplicación. Eluyente: Es la Fase Móvil que ocasiona la elución.

  • 2. Defina el Termino adsorción y empleando formulas, esquematice que fuerzas intermoleculares participan en el proceso de separación de los solutos.

Adsorción: Fenómeno de superficie en la cual las moléculas en solución tienden a agruparse sobre la superficie de un sólido poroso o una interfase en forma reversible.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Preguntas Extras 1. Especifique y defina los elementos del sistema cromatógrafico para esta

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

Para invertir el orden de elución de los colorantes podemos cambiar

la fase

estacionaria que tenga menos afinidad por la Fluoresceína que por el Azul de Metileno. En este caso consideramos el pH; si a un pH acido la alúmina está cargada positivamente y por atracción retiene a la Fluoresceína, podemos llevar a un pH ácido y así esta estará cargada negativamente y retendrá con mayor afinidad al azul de metileno.

Otro punto a considerar es elegir la polaridad del disolvente análoga a la de la muestra a emplear en este caso podremos seguir utilizando el regulador de fosfatos.

Las fuerzas intermoleculares que actúan son de atracción en el caso de la alúmina y el Azul de Metileno y de repulsión o menor atracción con la Fluoresceína por lo que esta eluirá primero.

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Cambio de Fase Móvil

Cambio de Fase Móvil

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Cambio de Fase Móvil
CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Cambio de Fase Móvil

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

Figura No. 3. Mecanismo de Separación de la mezcla de dos colorantes (Azul de Metileno y Fluoresceína) por cromatografía de adsorción.

ESTRUCTURAS DE LOS COLORANTES

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Figura No. 3. Mecanismo de Separación de la mezcla de dos colorantes (Azul

AZUL DE METILENO

Fig. 4 Estructura química del azul de metileno

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION Figura No. 3. Mecanismo de Separación de la mezcla de dos colorantes (Azul

FLOURESCEÍNA

Fig. 5 Estructura química de la fluoresceína

DISCUSIÓN

Durante el procedimiento de separación de nuestra mezcla por cromatografía de adsorción en columna, se debieron tomar en cuenta distintos cuidados:

-Mantener constante la hidratación de la alúmina (fase estacionaria) razón por la cual el volumen de la fase móvil se mantuvo 4 cm por arriba de la fase estacionaria -Correcta colocación del disco de lana -La no formación de burbujas de aire al momento de empaquetar. -Elución lenta y constante para evitar una estratificación, es por eso que la velocidad de goteo fue regulada a 10 gotas por 15 segundos.

La cromatografía por adsorción considera la separación de dos sustancias A y B en base a la diferencia de afinidad de adsorción sobre la superficie de un sólido, implica el transporte de una especie a través de una columna por adición sucesiva de fase móvil (eluyente); haciendo descender a las moléculas del analito a través de una fase estacionaria.

La Alúmina tiene propiedades anfóteras en un amplio rango de pH. La capacidad de una sustancia química para actuar ya sea como un ácido o una base se llama anfoterismo. Por lo cual mediante esta ventaja podemos separar la mezcla como se explica a continuación:

Si Observamos la Fig. No.3 se utiliza en un principio una alúmina con un pH de 12 por lo

tanto nuestra fase estacionaria está cargada

positivamente, la

fuerza

con

que

es

CROMATOGRAFIA POR ADSORCION

absorbido cada componente de la mezcla dependen de la polaridad de estos; lo cual se puede deducir de acuerdo a su estructura química (Fig. No.4 y Fig. No. 5 ) El azul de Metileno tiene una carga positiva y La Fluoresceína una carga Negativa en consecuencia al utilizar como primer fase móvil el agua destilada el primer componente en separarse será el azul de metileno ya que por repulsión con la alúmina será desplazado fácilmente y retenido con mayor afinidad la fluoresceína.

Como ya antes se mencionó la alúmina es de carácter anfótero, aprovechando esta característica la fluoresceína será separada de la alúmina al cambiar la fase móvil, es por esto que al terminar la completa recolección de los eluatos que puedan contener azul de metileno se hace un cambio de fase móvil por regulador de fosfatos, que cambiara la carga de la alúmina y esta pasara de estar cargada positivamente a estar cargada negativamente, propiciando el desplazamiento de la fluoresceína a lo largo de la columna.

Una vez obtenido nuestros componentes separados se procedió a leer nuestros eluatos a dos longitudes de onda 493 y 668 para la construcción del perfil de elución y para su mayor representación la gráfica de absorbancia contra volumen de elución.

Si analizamos la Fig. No 1 es comportamiento es el esperado en un volumen de elución de 3 mL obtenemos un pico de absorción a 668 nm correspondiente a el azul de metileno, el siguiente pico máximo corresponde a la fluoresceína con un volumen de elución de 42 mL a 493 nm en esta misma longitud de onda también podemos observar una pequeña cresta que se puede explicar, como correspondiente al azul de metileno que también es capaz de absorber a esta longitud de onda pero en menor proporción.

CONCLUSIONES

El azul de Metileno tiene un absorbancia máxima en una longitud de onda de 493 nm

La fluoresceína tiene una absorbancia máxima a una longitud de onda de

668 nm Se obtuvo una buena separación de colorantes utilizando la técnica de separación por cromatografía por adsorción.

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA.