Facult de Mdecine Dpartement de Mdecine - Cours de Cytologie - Premire anne de mdecine.

Anne Universitaire 2015/2016- Responsable du module: Pr W. AYAD

Les mthodes d'tude de la cellule

I- Les microscopes
A / Microscope optique ou photonique en lumire transmise
Le microscope optique en lumire transmise permet dtudier les cellules fixes (tues sans
modifications essentielles de leur structure). La microscopie optique est fonde sur lutilisation de la lumire
et de lentilles optiques pour permettre lobservation dlments non visibles lil nu. Dans la microscopie
optique conventionnelle, une source lumineuse est concentre par une lentille spciale appele condenseur.
La lumire traverse le spcimen biologique par en dessous (celui-ci se trouve sur une lame de verre qui est
elle-mme dispose sur la platine du microscope) puis une autre lentille appele objectif. Ensuite, elle est
mise au point sur le plan focal et limage est visualise travers une lentille oculaire. Les deux proprits
importantes dun microscope optique sont le grossissement et la rsolution. Le grossissement dpend des
caractristiques physiques de la lentille objectif et de la lentille oculaire et peut atteindre jusqu un facteur
1000. La rsolution est la capacit de distinguer deux objets contigus.
B/ Microscope fluorescence
Cette mthode microscopique permet de visualiser des substances spontanment fluorescentes ou
colores par des molcules fluorescentes. Les molcules fluorescentes sont capables dabsorber une lumire
de longueur donde spcifique et mettent une lumire de longueur donde diffrente qui fait partie de
spectre visible. Un microscope optique fluorescence va donc tout dabord consister en une source de
lumire de diffrentes longueurs dondes. Cette lumire traverse ensuite un filtre excitateur qui ne va laisser
passer quune seule longueur donde. Celle-ci va tre rflchie par un filtre dichromatique vers le spcimen
biologique. Les molcules fluorescentes dans la cellule sont alors excites et elles mettent une lumire
visible qui va tre concentre par une lentille objectif. Un filtre supplmentaire arrte toute lumire
rsiduelle qui possde la frquence de londe lumineuse excitatrice. La seule lumire visible qui passe
travers la lentille oculaire est celle mise par le compos fluorescent. Les composs fluorescents exognes
les plus utiliss sont la rhodamine (qui produit une lumire rouge) et la fluorescine (qui produit une lumire
verte). Limage la plus commune de lauto fluorescence est la fluorescence faible et bleute du cytoplasme
et la fluorescence jaune des granules cytoplasmiques.
C/ Microscope confocal balayage
La microscopie confocale balayage permet de visualiser des molcules fluorescentes selon le mme
principe que la microscopie en fluorescence mais elle sen distingue par le fait que la source lumineuse
excitatrice est produite par un laser qui balaye rapidement le spcimen biologique dans toute son paisseur et
sa largeur. Les images produites par la fluorescence de ces diffrents points sont enregistres par un
ordinateur qui forme alors une image composite de lensemble de la cellule. La microscopie confocale
permet donc une visualisation de laspect tridimensionnel de la cellule.
D/ Microscope contraste de phase
Ce type de microscopie est surtout utilis pour observer les cellules vivantes en culture car il permet
de voir nettement les mitochondries, le noyau et diverses autres structures cellulaires. Les structures
biologiques sont capables dinduire des changements de phase de la lumire qui les traverse. La microscopie
contraste de phase met profit cette proprit pour permettre lobservation de cellules vivantes non fixes
et non colores. Les petites diffrences dans lindice de rfraction des diffrentes parties de la cellule
ralentissent plus ou moins la lumire. Les rgions de la cellule ayant un indice de rfraction lev
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ralentissent davantage la lumire laquelle sera dphase par rapport la lumire traversant une rgion de la
cellule dont lindice de rfraction est peu lev. Le degr de dphasage entre les diffrentes ondes
lumineuses recombines va rsulter en une lumire plus ou moins intense.
E/ Microscope lectronique transmission
Le principe de la microscopie lectronique est de concentrer un faisceau dlectrons sur le spcimen
biologique. Les lectrons qui frappent le spcimen biologique sont plus ou moins diffracts par les diverses
structures cellulaires selon leur densit. Les lectrons qui ne sont pas diffracts sont dirigs sur un cran qui
produit alors une image alors que les lectrons diffracts natteignent pas lcran ce qui va rsulter en une
zone sombre sur lcran. Une lentille lectromagntique condenseur concentre le faisceau dlectron sur le
spcimen biologique. Des lentilles objectifs et une lentille projecteur concentrent les lectrons sur un cran.
F/ Microscope lectronique balayage
Le microscope lectronique balayage donne des images de la surface des objets. Le spcimen
biologique est pralablement vaporis avec un mtal lourd tel que le platine avant dtre dispos dans le
microscope lectronique puis balay par un faisceau dlectrons. Les molcules de mtal recouvrant le
spcimen sont alors excites et mettent des lectrons secondaires qui sont concentrs sur un dtecteur
scintillation. Le signal rsultant est envoy vers un tube cathodique et observ sur un cran. On peut obtenir
une vue tridimensionnelle du spcimen biologique.
II- Les techniques de prparation des tissus pour la microscopie
Microscopie optique
Techniques de fixation-inclusion-coupe-coloration
La fixation conserve la structure des cellules. Les fixateurs (thanol; formol...) crent des liaisons
chimiques trs stables entre les molcules de la cellule et en empchent la dgradation. Les tissus ou organes
fixer sont plongs dans le fixateur. Les tissus fixs, aprs lavage puis dshydratation par lalcool sont
inclus dans la paraffine. Linclusion permet la ralisation de coupes fines qui se font grce un microtome.
Les coupes sont tales et colles leau glatine sur une lame de verre, puis sches ltuve pour tre
ensuite colores.
Microscopie lectronique
La fixation des prlvements se fait dans des fixateurs (paraformaldhyde, glutaraldhyde). Elle
est suivie dune post fixation dans du ttroxyde dosmium pour stabiliser les lipides. Les objets sont ensuite
rincs puis dshydrats et inclus dans des rsines. Le bloc de rsine contenant lobjet est taill, plac dans un
porte-bloc de lultramicrotome. Les coupes ultrafines (90nm dpaisseur) sont traites par des sels de
mtaux lourds (actate duranyle, citrate de plomb) qui se fixent prfrentiellement sur certaines structures.
Les sels fixs absorbent plus ou moins les lectrons et renforcent le contraste de limage obtenue sur lcran
fluorescent.
III- Lhistochimie
Lhistochimie est ltude de la composition chimique des cellules, des divers tissus vivants et des
ractions chimiques cellulaires et tissulaires au cours des processus mtaboliques.
Les techniques histochimiques permettent de colorer des groupes chimiques, de localiser des
enzymes, dtudier les fonctions cellulaires, de connaitre la rpartition des acides nucliques, des protines,
des lipides, des glucides dans la cellule,.

a-Dtection des groupes chimiques spcifiques

Lutilisation de colorants liposolubles permet de localiser les lipides dans les cellules.
b-Localisation des enzymes actives
Ltude de la distribution dune enzyme (phosphatases acides..) se fait sur des coupes de tissus frais
prpares au microtome conglation. Ces coupes sont places dans un milieu contenant le substrat de
lenzyme. Lenzyme ragit avec le substrat et il se forme un produit de raction primaire insoluble qui peut
tre mis en vidence par coloration.
c- Marquage des molcules
Le marquage des molcules est la fixation sur une molcule, dun signe de reconnaissance facilement
identifiable qui autorise le suivi dun compos dans un organisme, un organe, un tissu ou dans une cellule.
Le marquage utilise soit les isotopes radioactifs (autohistoradiographie), soit des substances fluorescentes.
IV- Les cultures cellulaires
Les cultures cellulaires offrent la possibilit de comprendre le fonctionnement cellulaire et de
poursuivre des exprimentations sur du matriel en dehors de lorganisme dont elles sont issues. Ces
techniques permettent dtudier les cellules vivantes soumises des conditions varies et de suivre le
droulement de la mitose, dans des conditions normales ou aprs application de substances antimitotiques.
Elles permettent galement dobserver les cellules cancreuses et leur comportement et de maintenir des
virus et de fabriquer des vaccins..
V-Les techniques dultracentrifugation
Les techniques de centrifugation zonale et isopycnique permettent disoler des culots purs
dorganites en fonction de la vitesse de centrifugation. Elles offrent la possibilit de dterminer avec
prcision la composition biochimique des constituants cellulaires.
-Centrifugation zonale
Les divers organites cellulaires diffrent les uns des autres par leur taille, leur forme et leur densit.
Les lments les plus gros et les plus denses sdimentent plus rapidement que les autres structures. Un tissu
est broy mcaniquement dans une solution de saccharose et lhomognat obtenu subit plusieurs
centrifugations pour isoler les diffrents composants.
-Centrifugation isopycnique
Les fractions obtenues par la centrifugation zonale qui ne sont pas parfaitement pures sont soumises
ce type de centrifugation: cest une centrifugation lquilibre en gradient de densit. Une solution de
saccharose est prpare de telle sorte que la concentration la plus leve se situe au fond et la moins leve
en haut du tube centrifuger. La fraction tudier est place dans ce tube qui est soumis une
centrifugation trs leve (40000 tours/min) pendant plusieurs heures. Chaque lment contenu dans le tube
finit par flotter sa position dquilibre. Cette position dquilibre correspond une zone du tube ou la
densit du liquide est gale celle de llment concern.
VI- Les techniques de diffraction des rayons X
Cette mthode permet de dterminer la structure tridimensionnelle dune molcule. Le principe de la
mthode repose sur la proprit des rayons X dtre diffracts lorsquils rencontrent des obstacles de faibles
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dimensions. Ainsi, selon lespacement et la disposition des atomes dans une molcule, les rayons X seront
dvis de manire diffrente. Cette mthode de diffraction aux rayons X a notamment permis de dterminer
la structure en double hlice de la molcule dADN.