Centro de Bachillerato Tecnologico

Industrial y de servicion N134

PROCESAR CULTIVOS BACTERIOLOGICOS

Manual de Tcnicas de Identificacin de

Enterobacterias.

OBJETIVO
GENERAL:
Conocer las diferentes pruebas que son realizadas para el
diagnostico de enterobacterias que afectan al ser humano.

OBJETIVOS PARTICULARES:

Conocer las formas de identificar a las entero bacterias

de inters medico.

Realizar e interpretar mtodos de identificacin de

bacterias gramnegativas.

Conocer los medios de cultivo mas empleados en la

identificacin de enterobacterias patgenas del ser
humano.

ndice
1. introduccin..1
2

2. Medios de cultivo ...3

Agar Mc Conkey3
Agar Eosina azul de metileno.7
Agar salmonella-Shigella.9
Agar Hektoen Enterico11
Agar xiosa lisina desoxicolato..13
Agar Sangre...15
Agar chocolate18
Agar Cassman.....20
Agar Thayer Martn..22
Agar Biggy..24
Agar Mueller-Hinton..26
Agar Soya tripticasa....27
Agar Verde Brillante.29
Agar Lowenstein-Jensen (medio base).31
3. Pruebas
Bioqumicas..32
Medio MIO.32
Agar Kligler Hierro.35
Agar Simmons Citrato38
Caldo rojo de fenol y sacarosa..41
Agar lisina-Hierro.....42
Medio SIM.........................45
Urea..48
Agar TSI49
3

4. Pruebas automatizadas.
..51
API20E..51
5. Tinciones....5
6
Tincin de Gram.
...........................56
Tincin de Ziehl-Neelsen.58
6. Pruebas
serolgicas...59
Inmunofluorescencia directa...59
Prueba PCR61
Inmunofluorescencia indirecta........................63
Prueba ELISA..64
Pruebas serolgicas segn cada bacteria67
7. Pruebas de
aglutinacin..77
8. Electroforesis.
79
Tcnica de electroforesis en gel de Agarosa.79
electroforesis capilar...81

9. Conclusin...........8
3
10.
Bibliografa...84

Introduccin:
Enterobacteriaceae es una familia de bacterias Gram
negativas que contiene ms de 30 gneros y ms de 100
especies que pueden tener morfologa de bacilos o cocos.
Los miembros de esta familia forman parte de la microbiota
del intestino (llamados coliformes) y de otros rganos del
ser humano y de otras especies animales. Algunas especies
pueden vivir en tierra, en plantas o en animales acuticos.
Sucumben con relativa facilidad a desinfectantes comunes,
incluido el cloro. Con frecuencia se encuentran especies de
Enterobacteriaceae en la bio-industria: para la fermentacin
de quesos y productos lcteos, alcoholes, tratamientos
mdicos, produccin de toxinas en el uso de cosmticos,
fabricacin de agentes antivirales de la industria
farmacutica, etc.
Toma de muestra y aislamiento en cultivo en medios
selectivos como el McConkey o en medio de Levine
(desarrollo selectivo de enterobacterias frente a GRAM +),
permiten determinar la fermentacin de la lactosa e inhiben
la motilidad del Proteus. Hoy en da se dispone de una
amplia variedad de tinciones microbiolgicas que
constituyen herramientas muy importantes para la
deteccin, identificacin y control de los microorganismo
que van desde tcnicas sencillas y rutinarias, hasta
tinciones altamente sofisticadas para el diagnostico y la
investigacin.
Las pruebas bioqumicas son un conjunto de reacciones
basadas en el metabolismo de los microorganismos que
generalmente se realizan en sistemas miniaturizados y
automticos. Entre otros aspectos, se analiza la accin de la
bacteria sobre los hidratos de carbono, la liberacin de
enzimas y metabolitos al medio de cultivo etc. A partir del
conocimiento del metabolismo, las pruebas bioqumicas nos
permiten determinar el gnero y la especie de la bacteria
en estudio.
Hay que tener en cuenta, adems, que las caractersticas
metablicas de los microorganismos pueden variar en
5

funcin de distintos factores de manera que para realizar

una caracterizacin fiable es necesario realizar las pruebas
en condiciones estandarizadas.
El manual de tcnicas para la identificacin de las
enterobacterias es una recopilacin de conocimientos que
pueden ser utilizadas con un fin futuro en donde est
registrado tcnicas como son tinciones, cultivos, pruebas
bioqumica, serolgicas, de inmunodifusin, entre otros.

MEDIOS DE CULTIVO
Agar Mc Conkey
Formula
Peptona. 17g
Polipeptona..3g
Lactosa..10g
Sales Biliares..1.5g
Cloruro de sodio.5g
Agar.13.5g
Rojo neutro..0.03g
Cristal violeta..0.001 g
Agua destiladac.s.p 1 L
pH7.1
Fundamento:
El Agar MC es un medio de plaqueo diferencial para la
seleccin
y
recuperacin
de
bacterias
de
Enterobacteriaceae y bacilos gramnegativos entricos
relacionados. Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el
crecimiento de bacterias gran positivas y de algunas
gramnegativas. La sacarosa es el nico hidrato de carbono.
Las bacterias fermentadoras de lactosa producen bacterias
que producen distintos tonos de rojos, debido a la
conversin del colorante indicador neutro (rojo con pH de
6.8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias de
bacterias no fermentadoras de la lactosa aparecen sin color
y transparentes.
Interpretacin:
Los fermentadores fuertes de lactosa tpicos como especies
de escherichia, klebsiella y enterobacter producen colonias
rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada.

Los fermentadores lentos o dbiles de lactosa, como

sitrobacter, providencia, serratia y hafnia pueden aparecer
sin color despus de 24 horas o rosa plido de 24 a 48
horas. Las especies de Proteus, salmonella y shigella, con
raras excepciones producen colonias con poco color o
transparentes.

ESPECIAL PARA:
Klebsiella
Enterobacter
Citrobacter,
Providencia
Serratia
Hafnia
Proteus
Edwadsiella
Salmonella
Shigella
E. coli

Escherichia
Shigella

Salmonella
Klebsiella

Proteus

10

Agar Eosina Azul De Metileno (EMB)

Formula:
Peptona 10g
Lactosa5g
Sacarosa .5g
Dipotasico,PO4 2g
Agar 13.5g
Eosina.
g

0.5

Azul de metileno.. 0.065 g

Agua destilada C.S.P 1 L
pH final 7.2
Fundamento
El Agar EMB es un medio de plaqueo diferencial que puede
ser usado en lugar del Agar MC en el aislamiento de
Enterobacteriaceae o de bacilos coliformes de muestras
con bacterias mixtas. Los colorantes analticos (eosina y
azul de metileno) inhiben a las bacterias grampositivas. Se
combinan para formar un precipitado a un pH acido y, de
ese modo, sirven tambin como indicadores de la
produccin de acido. EMB levine, con solo lactosa, da
reacciones ms paralelo con las del Agar MC; la formula
modificada tambin detecta fermentadores de la lactosa.
Interpretacin:
Las colonias de los fermentadores fuertes tpicos
notablemente E. coli, son negro verdoso o con brillo
metlico. Los fermentadores dbiles incluidos klebsiella,
enterobacter, serratia y hafnia, producen colonias purpuras
en 24-48 horas.

11

Los no fermentadores de lactosa, que incluyen proteus,

salmonella y shigella, producen colonias transparentes.
Yersinia enterocolitica, un fermentador de sacarosa no
fermentador de lactosa, producen colonias transparentes en
EMB levine en colonias purpura a negro en la formula
modificada.
ESPECIAL PARA:
Klebsiella
E. coli
Proteus
Salmonella
shigella
Yersenia
Enterobacter
serratia
Hafnia

Agar Salmonella Shigella

12

Formula
Extracto de carne 5g
Peptona.5 g
Lactosa..10 g
Sales biliares 8.5 g
Citrato de sodio...8.5g
Tiosulfato de sodio...8.5g
Citrato frrico.. 1 g
Agar..12.5 g
Rojo neutro,...0.025g
Verde brillante.0.033 g
Agua destilada C.S.P .1 L
pH .7.4

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y
diferencial La selectividad, esta dada
por la sales biliares y el verde brillante,
que inhiben el desarrollo de bacterias
Grampositivas, de la mayora de los
coliformes y el desarrollo invasor del
Proteus spp. Es diferencial debido a la
fermentacin de la lactosa, y a la
formacin de cido Sulfhdrico a partir
del tiosulfato de sodio.
Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa
capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al
rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o
rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros
microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien
en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes.
La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como
13

colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro

de hierro.
Interpretacin
Cualquier colonia fermentadora que aparezca se coloreara
de rojo por rojo neutro. Ciertas cepas poco frecuentes de
salmonella arizonae son fermentadores de lactosa pueden
parecerse a Escherichia coli. El crecimiento de especies de
salmonella no es inhibido, y las colonias aparecen sin color
con centro negro, debido a la produccin de sulfuro de
hidrogeno. Las especies de shigella muestran inhibicin
variada y colonias sin color y sin ennegrecimiento. Las cepas
mviles de Proteus que aparecen en el agra SS no se
dispersan.

ESPECIAL PARA:
Salmonella
Shigella

Shigella

14

Agar Hektoen Entrico (HE)

Formula:
Peptona.. 12 g
Extracto de levadura. 3 g
Sales biliares. 9 g
Lactosa...12g
Sacarosa.12g
Salicina..2 g
Cloruro de sodio 5g
Tiosulfato de sodio.. 5 g
Citrato frrico de amonio.1.5 g
Fucsina acida ..0.1 g
Azul de timn....0.04 g
Agar....14 g
Agua destilada C.S.P..1 L
PH

..7.6

FUNDAMENTO:
El agar HE es una formulacin
reciente diseada como un medio
de
plaqueo
indirecto
para
muestras
fecales
para
incrementar el rendimiento de
especies de salmonella y shigella
a
partir
de
flora
normal
numerosa. La alta concentracin
de sales biliares inhibe el
crecimiento
de
todas
las
bacterias grampositivas y retarda
el de muchas cepas coliformes.

15

Pueden producirse cidos a travs de hidratos de carbono,

y la fucsina acida, al reaccionar con el azul de timol,
produce un color amarillo cuando baja el pH. El tiosulfato de
sodio es una fuente de sulfuro, y el gas sulfuro de hidrogeno
se detecta mediante el citrato frrico de amonio
(relativamente sensible).
Interpretacin
Los fermentadores rpidos de lactosa (E. coli) son inhibidos
moderadamente y producen colonias naranja brillante a
roja salmn. Las colonias de salmonella son azul verdosas
tpicamente con centros negros de gas de sulfuro de
hidrogeno. Shigella aparece ms verde que salmonella, y
las colonias palidecen hacia la periferia. Las cepas de
proteus son inhibidas en cierta forma las colonias que
desarrollan son pquelas y trasparentes, y de aspectos ms
brillantes o acuosos . Agar entrico Hektoen (HE) con un
desarrollo de 24 horas es E.coli. el color amarillo del medio
indica produccin de acido por fermentacin de lactosa o
sacarosa.

16

Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD)

Formula
Xilosa.3.5 g
Lisina...5 g
Lactosa...7.5 g
Sacarosa....7.5 g
Cloruro de sodio...5 g
Extracto de levadura..5 g
Rojo fenol.0.008 g
Agar...13.5
g
Deoxicolato de sodio.2.5 g
Tiosulfato de sodio.6.8g
Citrato frrico de amonio..0.8
Agua destilada C.S.P. 1 L
pH.7.4

Fundamento

El Agar XLD es menos inhibidor

del
crecimiento
de
bacilos
coliformes que el Agar HE y fue
diseado para detectar shigellae
en
heces
despus
de
enriquecimiento en caldo para
gramnegativos. Tres hidratos de
carbono estn disponibles para la
produccin de acido, y el rojo
fenol es un indicador de pH. Los microorganismos lisina
positivos, como especies de shigella, producen colonias
inicialmente amarillas debido a la utilizacin de xilosa y
17

colonias rojas retardadas por la descarboxilacion de la

lisina. El sistema de deteccin de sulfuro de hidrogeno es
similar al del Agar HE.

Interpretacin
Los microorganismos como E. coli y especies de Klebsiella,
Enterobacter pueden usar ms de un hidrato de carbono y
producir colonias amarillo brillante. Las colonias en muchas
especies de Proteus son tambin amarillas. La mayora de
las especies de salmonella producen colonias rojas, con
centros negros de gas sulfuro de hidrogeno. Shigella,
Providencia y muchas especies de Proteus no usan ninguno
de los hidratos de carbono y producen colonias
transparentes. Colonias de Citrobacter son amarillas con
centros negros; muchas especies de Proteus son amarillas o
transparentes con centros negros; las de salmonella son
rojas con centro negro.
ESPECIAL PARA:
Shigella
Salmonella
Klebsiella
Proteus

18

Agar Sangre
FUNDAMENTO:
La Base de Agar Sangre es un medio utilizado para el
aislamiento y cultivo de una amplia variedad de
microorganismos, adicionado de sangre es til para el
cultivo de microorganismos fastidiosos. La Base de Agar
Sangre generalmente es suplementada con sangre de
carnero, conejo o caballo al 5-10% para aislar cultivar y
estudiar reacciones hemolticas de una amplia variedad de
microorganismos fastidiosos patgenos. La infusin de
msculo de corazn y la peptona de casena proporcionan
la fuente de nitrgeno, carbono, Aminocidos y protenas. El
extracto de levadura provee vitaminas y aminocidos
esenciales. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico y el agar es usado como agente solidificante. Este
medio est relativamente libre de azcares reductores los
cuales interfieren en las reacciones hemolticas de
Estreptococos. El patrn de las reacciones hemolticas
puede variar dependiendo del tipo de sangre utilizada.

Formula aproximada para 1000ml de agua

Extract de levadura .5.0g
Infusin de msculo cardiaco ..2.0g
Peptona de casena .13.0g
Cloruro de sodio..5.0g
Agar ..5.0g
pH Final..7.3 0.2
interpretacin:

19

Los
estreptococos
hemolticos
presentan
colonias
translcidas u opacas, grises, pequeas y mucoides con
una zona de hemlisis. Otros organismos que pueden
producir
hemlisis
incluyen
a
Listeria,
varias
conirebacterias, estafilococcos hemolticos, E. coli y
Pseudomonas. Las colonias de neumococcos aparecen
planas, lisas, translcidas, grisceas y algunas veces
mucoides rodeadas por una pequea zona verdosa de alfa
hemlisis, Las colonias de estafilococcos tienen una
apariencia opaca, de color blanco a amarillo y rodeadas de
una zona clara por la beta hemlisis.

ESPECIAL PARA:
Escherichia
Brucella
Neumococos
Estafilococos
Listeria

Escherichia hermannii
Escherichia vulneris

20

Klebsiella
abortus

Brucella

21

Agar Chocolate
FUNDAMENTO:
La Base de Agar Chocolate es un medio utilizado con varios
suplementos para el aislamiento y cultivo de Neisseria
gonorrhoeae y otros microorganismos fastidiosos. La Base
de Agar GC es utilizada para preparar Agar Gelosa
Chocolate cuando es suplementada con hemoglobina al 2%
que provee la hemina (Factor X) requerida para el
crecimiento de Haemophilus y mejorar el desarrollo de
Neisseria,
as
como
suplementos
(disponibles
comercialmente)
que
Proveen glutamina, cocarboxilasa, levadura, glutamina,
coenzimas, hemina, vitaminas, aminocidos, dextrosa y
otros factores de crecimiento, todos ellos necesarios para el
mejor desarrollo de Haemophylus y Neisseria.
COMPOSICION DEL MEDIO:
Peptona de casena7.5g
Peptona de carne7.5g
Almidn de Maz .1.0g
Fosfato Dipotsico.. 4.5g
Fosfato Monopotsico.1.0g
Cloruro de Sodio..5.0g
Agar ..10.0g
pH final.. 7.2 + 0.2
Interpretacin:
Haemophylus influenzae presenta Colonias pequeas,
hmedas, perladas con caracterstico olor hmedo.
Neisseria gonorrhoeae presenta Colonias pequeas
grisceas incoloras, mucoides.
Neisseria meningitidis presenta Colonias medianas a
grandes, de color azul grisceo, mucoides.
Streptococcus pneumoniae presenta Colonias pequeas,

22

planas, pueden aparecer verdes por la decoloracin del

medio

ESPECIAL PARA:
Haemophylus influenzae
Neisseria gonorrhoeae
Neisseria meningitidis
Streptococcus pneumoniae

Haemophylus

23

Agar Cassman
FUNDAMENTO:
Agar CASMAN es utilizado para el aislamiento de
microorganismos exigentes. La proteasa peptona n 3,
triptona y extracto de carne proporcionan nitrgeno,
vitaminas y aminocidos. La nicotinamida favorece el
crecimiento de Neisseria gonorrhoeae y Haemophilus
influenzae impidiendo la Liberacin de la coenzima (factor
V) por medio de nucleotidasas procendentes del
enriquecimiento con sangre. La dextrosa se aade para
favorecer el crecimiento de cocos patgenos. El Cloruro
sdico mantiene el balance osmtico en el medio. El
almidn tiene como funcin asegurar que cualquier
metabolito txico producido sea absorbido, neutralizar la
inhibicin de beta-hemlisis por la glucosa y favorecer el
crecimientode Neisseria. El agar bacteriolgico es el agente
gelificante.

Formula aproximada a 1000 ml

Proteosa Peptona n 3 10.0
Triptona.10.
0
Cloruro Sdico5.0
Extracto de carne..3.0
Almidn..1.0
Dextrosa.0.
5
Nicotinamida..0.0
5
cido p-

24

Aminobenzoico..0.05
Agar Bacteriolgico..14.0
pH 7.3 0.2
ESPECIAL PARA:
Neisseria Gonorrhoeae Crecimiento satisfactorio.
Haemophilus influenzae Crecimiento satisfactorio.

Agar Thayer Martin

25

FUNDAMENTO:
El medio de Thayer Martin es utilizado principalmente para
el aislamiento y desarrollo de especies de Neisseria. El
Medio de Thayer Martin es preparado a partir de la Base de
Agar GC adicionada de Hemoglobina, de la Mezcla de
antibiticos VCNT (Vancomicina, Colistina, Nistatina,
Trimetoprim) y de Enriquecimiento GC.

Formula
aproximada a 1000 ml
Pluripeptona..15.0
Almidn
soluble..1.0
Fosfato
dipotsico.4.0
Fosfato
monopotsico.1.0
Cloruro de
sodio.5.0
Agar.15.0
pH final.7.2
0.2
Interpretacin:
Las colonias de gonococos y meningococos obtenidas en
este medio selectivo son usualmente opacas, grisceas,
convexas, de 1-4 mm de dimetro. Luego de 48 h de
incubacin pueden transformarse en colonias mucoides.
Coloracin de Gram: diplococos Gram negativos. Se sugiere
proseguir
con
este
esquema
de
identificacin.
Microorganismos T.M. T.M. A.N C22C OXI GLU MAL
N. gonorrhoeae + + - - + + -N. meningitidis + + - - + + +
Acinetobacter spp. - + + + - -* - Neisseria spp. - + + + + V
V
Moraxella spp - + V V + - - Moraxella (Branhamella)
catarrhalis - + + + + - - T.M. medio Thayer Martin (CO2); A.
Cho: Agar chocolate (CO2); A.N.: agar o caldo nutritivo;
C22C: desarrollo a 22C; OXI: oxidasa; GLU: fermentacin
26

de glucosa; MAL: fermentacin de maltosa; + = reaccin

positiva; - = reaccin negativa; V = reaccin variable. * La
mayora de las especies de Acinetobacter pueden usar
glucosa por la va oxidativa.

ESPECIAL PARA:
N. gonorrhoeae
N. meningitidis
Acinetobacter spp.
Neisseria spp.
Moraxella spp Moraxella (Branhamella) catarrhalis

neisseria

AGAR BIGGY
El Agar Biggy (por sus siglas en ingls Bismuth-GlucoseGlycine-Yeast) es utilizado para el aislamiento y
27

diferenciacin de especies de Candida. Tambin es conocido

como Agar de Nickerson.
FORMULA
Citrato de Amonio y Bismuto5.0 g
Glicina10.g
Sulfito de Sodio 3.0 Extracto de Levadura 1.0
Dextrosa 10.0 Agar Bacteriolgico 16.0
pH 6.8 0.2

FUNDAMENTO
El Agar Biggy es una modificacin de la frmula
desarrollada por Nickerson quin realiz estudios sobre la
reduccin de sulfito por especies de Candida. La
diferenciacin est basada en la morfologa colonial y la
pigmentacin tpica que se presenta en este medio. La
reduccin del sulfito de bismuto se manifiesta en una
pigmentacin de la colonia que en ocasiones difunde en el
medio. En este medio el extracto de levadura proporciona
vitaminas y aminocidos. La glicina es utilizada para
estimular el crecimiento. La dextrosa es la fuente de
carbono. El indicador sulfito de bismuto acta tambin
como un inhibidor del desarrollo bacteriano. El agar es
adicionado como agente solidificante.

Interpretacin:
La morfologa colonial tpica se describe: C. albicans
Colonias de color caf oscuro o negro sin difusin en el
medio, con ligera presencia de micelio y tamao mediano.
C. krusei Colonias grandes, planas, rugosas de color negro
con brillo metlico, borde caf y halo amarillo.
C. tropicallis Colonias ligeramente oscuras con centro negro
y brillante, de tamao mediano. Despus de 72 hrs. El
pigmento difunde en el medio.
28

C. parakruzei Colonias de tamao mediano, planas rugosas,

caf-rojizas, con crecimiento micelial amarillo.
C. pseudotropicalis Colonias grandes de color rojo oscuro,
planas con ligero crecimiento micelial.
C. stellatoidea Colonias de tamao mediano, planas, de
color caf oscuro, con muy pequea presencia de micelio.

ESPECIAL PARA:
C. albicans
C. krusei
C. tropicallis
C. parakruzei

Candida

Agar Muller Hinton

Fundamento:

29

El Agar Mueller Hinton es un medio utilizado para realizar

las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana en
microorganismos aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby.
Con este medio se han llevado a cabo una gran cantidad de
estudios sobre susceptibilidad antimicrobiana. En este
medio la infusin de carne y la peptona de casena proveen
la fuente de nitrgeno, vitaminas, carbn y aminocidos. El
almidn es agregado para absorber cualquier metabolito
txico y el agar es adicionado como agente solidificante.

Formula por litro de agua destilada

Agar ..17.0 g
Almidn1.5 g
Infusin de carne de res.3.0 g
Peptona de casena acida17.5 g
pH.7.3 + 0.1

Interpretacin:
es un medio utilizado para realizar las pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana en microorganismos
aerbicos por el mtodo de Bauer-Kirby

ESPECIAL PARA:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Enterococcus faecalis
Bacillus subtilis
Neisseria
Agar Soya Tripticasa

30

El Agar Soya Tripticasa es un medio utilizado para promover

el crecimiento de microorganismos fastidiosos y adicionado
de sangre para observa reacciones hemolticas.
Fundamento
El Agar de Soya Tripticasena provee un excelente soporte
de crecimiento para organismo aerobio y anaerobios, segn
lo demostr Leavit en 1955. Este medio es recomendado en
los procedimientos microbiolgicos de control de aguas,
cosmticos y en la industria farmacutica. De acuerdo con
la Farmacopea. Clnicamente se utiliza para diferenciar
especies de Haemophylus debido a que no contiene los
factores X y V requeridos para su crecimiento. As mismo
este medio puede ser utilizado como base para preparar
medios suplementados como el Agar Sangre y Agar Glosa
Chocolate. En este medio las peptonas proveen la fuente de
nitrgeno y minerales. El azcar de la Peptona de Soya
provee la fuente de carbohidratos. El Cloruro de Sodio tiene
su funcin en el balance osmtico y el Agar es incorporado
como agente solidificante.
Formula
Peptona de Casena.15.0g
Peptona de Soya..5.0g
Cloruro de Sodio .5.0g
Agar Bacteriolgico.15.0g
pH 7.3 0.2

ESPECIAL PARA:
Especies de Haemophylus

31

Agar Verde Brillante

Caractersticas del medio
Medio preparado: verde.
FUNDAMENTO: Es un medio altamente selectivo
empleado para aislar la Salmonella (excepto styphi y
shigellas) de haces, orina, leche, producto lcteos y otros
alimentos de importancia sanitaria. En el medio de cultivo,
la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la
fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la
sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo
fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay
produccin de cido a partir de la fermentacin de
azcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico,
y el verde brillante acta como agente selectivo.
Formula aproximada a 1000 ml:
Peptona de carne5.0g
Extracto de levadura.3.0g
Peptona de casena.5.0g
Cloruro de sodio..5.0g
Lactosa10.0g
Sacarosa.10.0g
Rojo fenol.0.08g
Verde brillante..0.0125g
Agar..20.0g
pH final6.9
0.2
Interpretacin:
Las colonias de Escherichia coli presentan un color
Amarillo-verdosas sobre fondo amarillento en Salmonella
enteritidis las colonias son Rosas, blancas o transparentes
sobre
fondo
rojo.
Salmonella typhi con crecimiento inhibido mientras que las
colonias de Salmonella typhimurium son Rosas, blancas o
transparentes sobre fondo rojo.
32

ESPECIAL PARA:
Escherichia coli
Salmonella (excepto styphi y
shigellas)

Agar Lowenstein-Jensen Medio Base

33

Formula:
Fosfato monopotasico..2.5
Sulfato de magnesio.0.24
Citrato de magnesio.0.6
Asparragina...3.6
Harina de papa.....30.0
Verde de malaquita..0.4
pH final4.8 0.1

Fundamento:
Los nutrientes de este medio basal, ms los aportados por
el agregado de la mezcla de huevos, constituyen un rico
soporte para el crecimiento de una gran variedad de
micobacterias. El verde de malaquita inhibe a gran parte de
la flora acompaante. Con el agregado de glicerina se
estimula el crecimiento de Mycobacterium tuberculosis,
aunque gran parte de M. bovis es inhibido. Agregando un
5% de NaCl, se pueden seleccionar micobacterias
tolerantes a la sal, como es el caso de M. smegmatis.
Interpretacin:
Observar las caractersticas morfolgicas y la presencia o
ausencia de pigmento en las colonias.
MICROORGANISM
OS
Mycobacterium
tuberculosis

CRECIMIEN
TO
Excelente

Mycobacterium
avium
Mycobacterium
gordonae

Excelente

CARACTERSTICAS
DE LAS COLONIAS
Grandes, secas,
amarillentas,
granulares
Lisas, sin pigmentos

Excelente

Lisas

34

PRUEBAS BIOQUIMICAS
MEDIO MIO
Formula (Gramos Por Litro):

Dextrosa..1.0
Extracto de levadura..3.0
Peptona..10.0
Triptena.10.0
Clorhidrato de L-ornitina.5.0
Agar..2.0
Prpura de bromocresol..0.02
pH final..6.5 0.2

Caractersticas Del Medio

Medio preparado: prpura transparente a ligeramente
opalescente.

Fundamento:
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a
la presencia de extracto de levadura, peptona y Triptena.
Adems, la Triptena aporta grandes cantidades de
triptfano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la
35

realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato

de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la
deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura
de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino
es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su
composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo
tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.
La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del
medio o por crecimiento que difunde ms all de la lnea de
inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por
un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la
glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y
originando que el indicador de pH prpura de bromocresol
vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones
ptimas para la actividad de la enzima ornitina
decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por
decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente
viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es
producido a partir del triptfano por los microorganismos
que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un
color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovac
s o de Erlich, indica un resultado positivo.

INTERPRETACIN:
Movilidad:
Resultado
positivo:
presencia
de
turbidez
o
crecimiento mas all de la lnea de siembra.
Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea
de siembra.
Ornitina decarboxilasa:
Resultado positivo: color prpura.
Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede
desarrollar un color violceo en la superficie del medio.
Prueba del indol:
La prueba de indol se realiza una vez que se ha
determinado la movilidad y la prueba de ornitina.
36

 Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo

revelador.

Microorganis
mo

Crecimien
to

Movilid
ad

Indo
l

K.
pneumoniae
ATCC 700603
P. mirabilis
ATCC 43071

Bueno

Ornitina
decarboxila
sa
-

Bueno

Resultado negativo: el color del reactivo revelador

permanece incoloro-amarillento.

37

AGAR KLIGLER HIERRO

Formula (Gramos Por Litro):
Peptona de carne...13.0
Cloruro de sodio 5.0
Lactosa..10.0
Triptena10.0
Glucosa.1.0
Citrato de hierro y amonio..0.5
Tiosulfato de sodio.0.3
Rojo de fenol..0.025
Agar.15.0
pH final: 7.3 0.2

Caractersticas Del Medio

Medio preparado: rojo / naranja
Fundamento:
Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de
alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en
base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la
produccin de cido sulfhdrico. En el medio de cultivo, la
peptona de carne y la Triptena, aportan los nutrientes
adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la
glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El
Tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la
produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y
amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan
con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de
38

color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el

cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El Agar es el
agente solidificante.
Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se
detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira
al color amarillo en medio cido. El Tiosulfato de sodio se
reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con
una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro
de color negro.
INTERPRETACIN:
Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el
microorganismo solamente fermenta la glucosa.
Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo):
el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa.
Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el
microorganismo es no fermentador de azcares.
La presencia de burbujas, o ruptura del medio de
cultivo, indica que el microorganismo produce gas.
El ennegrecimiento del medio indica que

el

microorganismo produce cido sulfhdrico.

39

Microorganism
o

Pico/Fondo

Produccin
de gas

E. coli ATCC
25922
K. pneumoniae
ATCC700603
P. mirabilis
ATCC 43071
S.
typhimurium
ATCC 14028
S. enteritidis
ATCC 13076
S. flexneri
ATCC 12022
P. aeruginosa
ATCC 27853

A/A

Produccin
de
cido
sulfhdrico
-

A/A

K/A

K/A

K/A

K/A

K/K

A: cido
K: alcalino

40

AGAR SIMMONS CITRATO

FORMULA (Gramos Por Litro):
Citrato de sodio.2.0
Cloruro de sodio5.0
Fosfato dipotsico.1.0
Fosfato monoamnico1.0
Sulfato de magnesio.0.2
Azul de bromotimol.0.08
Agar
15.0
pH final: .6.9
0.2

Caractersticas Del Medio

Medio preparado: verde.

FUNDAMENTO:
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica
fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente
de carbono. Ambos componentes son necesarios para el
desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un
sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El
cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de
bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en
medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a
que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica
fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de
alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias
poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido
41

tricarboxlico.
El
desdoblamiento
del
citrato
da
progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en
presencia de un medio alcalino, da origen a cidos
orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono,
producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio
entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin
de citrato permeasa.

INTERPRETACIN:
Positivo: crecimiento y color
azul en el pico, alcalinidad.
Negativo:
el
medio
permanece

de

color

verde

debido a que no hay desarrollo

bacteriano y no hay cambio de
color.
Si se usa un inoculo denso para sembrar el medio de
cultivo, puede variar el color del pico del verde al
amarillo-amarronado.
Esto no afecta el color verde del resto del medio de
cultivo, pero puede afectar la visualizacin azul de un
resultado
positivo.
Inculos muy densos, pueden originar resultados
falsos
positivos.

Microorganismo

Citrato
permeasa

Color del
medio

Klebsiella pneumoniae
ATCC 700603

Positivo

Azul

42

S. typhimurium ATCC 14028

Positivo

Azul

E. coli ATCC 25922

Negativo

Verde

S. flexneri ATCC 12022

Negativo

Verde

43

CALDO ROJO DE FENOL Y SACAROSA

Formula (Gramos Por Litro):
Peptona de
Casena10.0
Cloruro de
Sodio.5.0

Sacarosa5.0
Rojo de Fenol.0.018
pH final..7.4 0.2

Fundamento:
El Caldo Rojo de Fenol y Sacarosa es utilizado para la
diferenciacin de cultivos puros, en base a su capacidad
para fermentar la sacarosa.
La capacidad de las bacterias de fermentar carbohidratos
es utilizada como un criterio para su identificacin. El medio
provee los requerimientos nutricionales para el crecimiento
de los microorganismos y contiene Rojo de Fenol como
indicador de pH. Este indicador fue utilizado por Vera
obtenindose resultados altamente confiables.
La peptona provee la fuente de nitrgeno para el buen
desarrollo de los microorganismos, el
Cloruro de Sodio mantiene el balance osmtico del medio y
el Rojo de Fenol acta como indicador, virando de color
rojo-naranja a amarillo en presencia del cido producido por
la fermentacin del azcar.

44

AGAR LISINA HIERRO

Formula gramos por litro):
Peptona de gelatina..5.0
Extracto de levadura

..3.0

Glucosa.1.0
Lisina
10.0
Citrato de hierro y amonio.0.5
Tiosulfato de
sodio..0.04
Prpura de
bromocresol..0.02
Agar15.0
pH final..6.7
0.2

Caractersticas Del Medio

Medio preparado: color violeta.

Fundamento:
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura
aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La
glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es
el sustrato utilizado para detectar la presencia de las
enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y
amonio, y el Tiosulfato de sodio, son los indicadores de la
produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol,
es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual
o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.
45

Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina

cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje
del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina,
tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la
glucosa sea previamente fermentada.
Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa,
pero que son fermentadores de la glucosa, producen un
viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a
las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta
debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo.
La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el
ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro
de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas
cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un
cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo
la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la
superficie del medio.

INTERPRETACIN:
Decarboxilacin De La Lisina:
Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.
Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
Desaminacin De La Lisina:
Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del
gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de
Morganella spp.
Produccin De cido Sulfhdrico:
Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio
(especialmente en el lmite del pico y fondo)

46

Microorganismos

Color en el
pico de flauta

Color en
la base
del tubo

Ennegrecimient
o del medio

Proteus mirabilis
ATCC 43071

Rojo

Amarillo

Negativo

Salmonella
typhimurium ATCC
14028

Prpura

Prpura

Positivo

Salmonella
enteritidis ATCC
13076

Prpura

Prpura

Positivo

Providencia spp.

Rojo

Amarillo

Negativo

Citrobacter freundii

Prpura

Amarillo

Positivo

Morganella spp.*

Rojo

Amarillo

Negativo

Edwarsiella spp.

Prpura

Prpura

Positivo

Klebsiella
pneumoniae ATCC
700603

Prpura

Prpura

Negativo

Escherichia coli ATCC

Prpura
Prpura
Negativo
25922
Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos,
especialmente Salmonella spp., basado en la
decarboxilacin / desaminacin de la
lisina y en la produccin de cido
sulfhdri

47

SIM Medio
Formula (gramos por litro):
Triptena..20.0
Peptona..6.1
Sulfato de hierro y amonio..0.2
Tiosulfato de sodio.0.2
Agar3.5
pH final.7.3 0.2

Caractersticas Del Medio

Medio preparado: mbar.
Fundamento:
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas
peptonas, y particularmente de la Triptena, que puede ser
oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el
proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas
triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo
del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un
compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden
apreciarse en este medio, por la turbidez que producen
alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas
cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la
formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a
partir del Tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un
pH mayor a 7.2.
INTERPRETACIN:
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se
extiende mas all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente
en la lnea de siembra.
48

 Cepas

SH2

positivas:

ennegrecimiento a lo largo
de la lnea de siembra o en
todo el medio.
Cepas SH2 negativas: el
medio permanece sin cambio de color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de
agregar el reactivo de Kovacs o de Erlich.
Cepas indol negativas: sin cambio de color.
Limitaciones
En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en
superficie, la movilidad puede ser difcil de observar.
Algunas bacterias productoras de melanina como M.
morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe
confundirse con el color negro debido a la produccin de
cido sulfhdrico.

Microorganis
mo

Movilidad

Indol

Produccin
de cido
sulfhdrico

E. coli ATCC
25922

49

K.
pneumoniae
ATCC 700603

P. mirabilis
ATCC 43071

S.
typhimurium
ATCC 14028

S. enteritidis
ATCC 13076

S. flexneri
ATCC 12022

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad,

produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo
tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

50

UREA
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos,
en base a la actividad uresica. Es particularmente til para
diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
Frmula (en gramos por litro)
Urea20.0
Fosfato
monopotsico..9.1
Fosfato disdico.9.5
Extracto de levadura
0.1
Rojo fenol0.01
pH final: ..6.8
0.
Fundamento:
Medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta
bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer.
El extracto de levadura es la nica fuente de carbono,
nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes
esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de
fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el
indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.
Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden
utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan,
liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos
metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador
rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para
diferenciar Proteus spp. de otros gneros

51

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de
enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa,
lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Frmula (en gramos por litro):
Extracto de
carne...................................3.0
Pluripeptona...................................2
Cloruro de
sodio...............................5.0
Lactosa........................................1

0.

0.

Sacarosa.........................................10.0
Glucosa..........................................1.0
Sulfato de hierro y amonio..............0.2
Tiosulfato de sodio............................0.2
Rojo de fenol...............................0.025
Agar...............................................13.0
pH final: ......................................7.3 0.2
Positivo

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la
pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el
desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los
hidratos de carbono Fermentables. El tiosulfato de sodio es
el sustrato necesario para la produccin de cido
sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de
iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico
y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio
mantiene
el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se
producen cidos, que se detectan por medio del indicador
rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El
52

tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que

reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el
tpico sulfuro de hierro de color negro.

PRUEBAS AUTOMATIZADAS
API20E
La batera de pruebas API20E es un sistema de
identificacin rpida para bacterias de la familia
Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram-. Bsicamente
consta de 21 tests bioqumicos estandarizados y
miniaturizados, y una base de datos. Este sistema presenta
las ventajas de ser rpido, eficaz y de permitir realizar
numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene
20 microtubos o pocillos con distintos sustratos
deshidratados. Cada tubo es una prueba bioqumica
distinta. La prueba nmero 21, la oxidasa, se hace de forma
independiente a la tira.
Las pruebas de que consta la galeria son las siguientes:
Prueb
a
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA

Reaccin / Enzimas
Beta-galactosidasa
Arginina deshidrolasa
Lisina descarboxilasa
Ornitina descarboxilasa
Utilizacin del citrato
Produccin de H 2 S
Ureasa
Triptfano desaminasa
Produccin de indol
Produccin de acetona (VogesProskauer)
Gelatinasa
Fermentacin/oxidacin de glucosa
Fermentacin/oxidacin de manitol
Fermentacin/oxidacin de inositol
Fermentacin/oxidacin de sorbitol
Fermentacin/oxidacin de
53

SAC
MEL
AMY
ARA
OX

ramnosa
Fermentacin/oxidacin
sacarosa
Fermentacin/oxidacin
melobiosa
Fermentacin/oxidacin
amigdalina
Fermentacin/oxidacin
arabinosa
Citocromo oxidasa

de
de
de
de

A patir de una colonia bien aislada del

microorganismo,
hacer
una
suspensin en 5 mL de solucin
salina (1% de NaCl) o 5 mL de agua
estril.

Llenar con la suspensin de bacterias

los tubos, no la cpula (cada pocillo
tiene un tubo y una cpula, parte
aerobia), de todos los pocillos.

Llenar la cpula de los pocillos CIT ,

VP, GEL con la suspensin de
bacterias.

Cubrir con parafina las cpulas de

los pocillos ADH, LDC, ODC, URE,
H2S para obtener anaerobiosis.

54

Poner la tira en su propia cmara

hmeda
de
incubacin.
Previamente poner agua en los
alvolos de la cmara para
proporcionar
una
atmsfera
hmeda durante la incubacin.
Incubar a 37 C durante 18-24 h.

Tras la incubacin se anotan los resultados inmediatos, es

decir, los que no requieren ser revelados. Determinadas
pruebas requieren ser reveladas, para el revelado se tienen
que tener en cuenta dos criterios:

Si la glucosa da negativo y los tests positivos son dos o

menos de dos, no hay que aadir reactivos. Cuando
sto ocurre se hacen otros tipos de API como el API
20NE, API OF, el API M o el API 10S para ver
determinados metabolismos especiales.

Si la glucosa es positiva y/o tres o ms tests son

positivos se revelan los test que requieren reactivos:

TDA
Aadir una gota de FeCl3 10 %.
VP
Aadir una gota del reactivo 1 (KOH al 40%) y una gota del
reactivo 2 (C2 H5 OH).
IND
55

Aadir una gota de reactivo de Kovacs o de Dimetilaminocinamaldehido.

Oxidasa
Aadir una gota del reactivo (tetrafenilendiamina) recin
preparado.
INTERPRETACIN:
La lectura de los resultados se lleva a cabo por
comparacin de los colores de cada pocillo con los de las
tablas de lectura, y anotando el resultado como positivo o
negativo (ms adelante se explicar con detalle).
Prueb
a
ONPG
ADH

Reaccin / Enzimas

Negativo

Positivo

Beta-galactosidasa
Arginina deshidrolasa

sin color
amarillo

LDC

Lisina descarboxilasa

amarillo

ODC

Ornitina descarboxilasa

amarillo

CIT

Utilizacin del citrato

verde

H2S

Produccin de H 2 S

URE

Ureasa

sin
precipitado
negro
amarillo

amarillo
rojo o
naranja
rojo o
naranja
rojo o
naranja
azul oscuro
o turquesa
precipitado
negro

TDA
IND

Triptfano desaminasa
Produccin de indol

amarillo
amarillo

VP

Produccin de acetona
(Voges-Proskauer)
Gelatinasa

sin color
sin difusin

Fermentacin/oxidacin
de glucosa
Fermentacin/oxidacin
de manitol

azul o
verde
azul o
verde

GEL
GLU
MAN

rojo o
naranja
marrn-rojo
color rosa o
anillo rosarojo
rosa-rojo
difusin de
pigmento
amarillo
amarillo

56

INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY
ARA
OX

Fermentacin/oxidacin
de inositol
Fermentacin/oxidacin
de sorbitol
Fermentacin/oxidacin
de ramnosa
Fermentacin/oxidacin
de sacarosa
Fermentacin/oxidacin
de melobiosa
Fermentacin/oxidacin
de amigdalina
Fermentacin/oxidacin
de arabinosa
Citocromo oxidasa

azul o
verde
azul o
verde
azul o
verde
azul o
verde
azul o
verde
azul o
verde
azul o
verde

amarillo
amarillo
amarillo
amarillo
amarillo
amarillo
amarillo

Del conjunto de reacciones y resultados se obtiene un perfil

numrico de 7 cifras. Los pocillos estn separados en
grupos de tres: en total tenemos 7 grupos de tres tubos o
tripletes (el test nmero 21 corresponde al test de la
oxidasa). Para obtener el perfil nmerico de 7 cifras, a cada
pocillo se le dar el valor 0, 1, 2 4, de acuerdo a los
siguientes criterios:

Si la reaccin es negativa se pone 0.

Si la reaccin es positiva se pone: 1 si es el primer

pocillo de un triplete, 2 si es el segundo, 4 si es el
tercero.

57

Se suman los valores de cada triplete, con las sumas

de los siete tripletes se obtiene un cdigo de 7 cifras.

Con este cdigo se busca en la tabla de identificacin la

especie de que se trata, para realizar esta operacin hay
programas informticos.

58

TINCIONES
Tincin GRAM
Tinte Primario: Cristal violeta, tie la bacteria de color
violeta
Agente Mordiente: Lugol, forma un complejo insoluble con
cristal violeta. Ayuda a adherir el tiente a la clula. Ayuda a
resistir la decoloracin.
Agente Decolorizante: Alcohol acetona o alcohol, el cual
sirve como solvente de lpidos y agente deshidratante de
protenas.
Contra tint: Safranina que tie de rojo a la bacteria.
Fundamento:
Es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa
para la visualizacin de bacterias, sobre todo en muestras
clnicas. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa
celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin
a
la
diferenciacin
bacteriana,
considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que
se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las
que se visualizan de color rosa.
La tcnica incluye tincin primaria, decoloracin y tincin
de contraste.
Las especies de enterobacterias que pueden ser
identificadas son:
E. coli
Salmonella,
Neisseria,
Haemophylus,
Vibrio.
ETC.

59

Mtodo de realizacin:
1) Colocar la muestra en un portaobjetos y este en un
puente de tincin.
2) Cubrir la muestra con cristal violeta y dejar actuar 1 min,
ya pasado el minuto se lava con agua corriente.
3) Cubrir con lugol y dejar actuar durante 1 min. y
posteriormente se vuelve a lavar.
4) Decolorar con alcohol acetona gota a gota dejndose
actuar 30 seg. Se lava una ves transcurrido el tiempo.
5) Cubrir con safranina al 95% por 1 min.
6) Eliminar exceso y lavar con agua para eliminar restos de
decolorantes
7) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la
muestra para posteriormente ser observada en el
microscopio.
8) Identificar las bacterias Gram positivas y negativas
identificndolas con e color caracterstico.

INTERPRETACION:

Bacterias
Gram positivas

Bacterias
Gram
negativas

60

Tincin de Ziehl-Neelsen
Fundamento:
Esta tincin sirve para teir bacterias del gnero
Mycobacterium, el resto de las bacterias se tien de azul
por el colorante de contraste. M. tuberculosis, causante de
la tuberculosis y M. leprae, causante de la lepra o
enfermedad de Hansen, se identifican mediante esta
tincin. Las micobacterias son cido-alcohol resistentes
porque poseen en sus cubiertas lpidos de cidos grasos
complejos que forman en su pared celular un material de
tipo creo resistente a la decoloracin. Una tincin cidoalcohol resistente se realiza segn los siguientes pasos:
Tincin primaria con fucsina bsica, que tie todas las
clulas de rojo.
Calentamiento suave de la preparacin para facilitar la
penetracin del colorante en el interior de la clula.
Decoloracin con una solucin de cido clorhdrico en
etanol. Este decolorante elimina la fucsina de todas las
clulas excepto de las micobacterias, que la retienen
debido a su superficie crea.
Coloracin de contraste con azul de metileno. Se tien de
azul todas las clulas previamente decoloradas, lo que
facilita la diferenciacin entre las clulas de Mycobacterum,
an teidas de rojo, y las clulas restantes del espcimen.
Las micobacterias permanecen teidas de rojo, mientras
que el resto de las bacterias toman el color azul del
colorante de contraste
Preparacin de la tincin cido -resistente
1. Preparar un frotis.Carbol fucsina (3 minutos). Utilizar
unpapel toalla bien impregnado delreactivo.
2. Lavar con agua.
3. Decolorizar con alcohol etlico.
4. Lavar con agua.
5. Azul de metileno por 2 minutos y lavar con agua.
61

Pruebas serolgicas
Inmunofluorescencia Directa:
Fundamento:
Sobre un portaobjetos depositamos una muestra en la que
buscamos la presencia de un determinado antgeno.
Aadimos un suero especfico del antgeno problema
marcado con isotiocinato de fluorescena (conjugado). Si el
antgeno problema se encuentra presente en la muestra,
se une el conjugado. En caso contrario el conjugado se
elimina con un lavado del portaobjetos.
Las enterobacterias que se pueden observar con esta
prueba son: Salmonella,
Helicobacter,
E. coli,
Clamydia trachomatis. .

Mtodo de realizacin:
1) Cubrimos dos de las extensiones con 10ml de
tampn BABS (testigo conjugado), otros dos con
10ml de sorbente (testigo sorbente). Cubrimos las
otras extensiones con 10ml de cada dilucin de los
sueros problemas y los sueros testigos.

2) Incubamos 30 minutos a 37 C en una cmara

hmeda. Lavamos en PBS-Tween 2 veces durante 5
minutos. Enjuagamos rpidamente en un bao de
agua destilada. Escurrimos y dejamos secar.

62

3) Cubrimos cada extensin de 10ml de globulina antihumana diluida en tampn BABS.

4) Incubamos 30 minutos a 37 C en una cmara
hmeda. Lavamos los portas en PBS-Tween 2 veces
durante 5 minutos. Pasamos rpidamente por un
bao de agua destilada. Dejamos secar.

5) Observacin de los resultados en microscopio de

campo oscuro.

INTERPRETACION:

Los anticuerpos de la bacteria a estudiar se unirn contra

los que son especficos, y al aadir el complejo
antiinmunoglobulina G marcado, se unir a los anticuerpos.
Al mirar en el microscopio de campo oscuro. Se observar
fluorescencia.

63

Prueba PCR
Fundamento:
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las
ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual
emplea ciclos de alta y bajas temperaturas alternadas para
separar las hebras de ADN recin formadas entre si tras
cada fase de replicacin y , dejar que vuelvan a unirse a
polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.
Todo el
proceso de PCR esta automatizado mediante un aparato
llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los
tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria
para cada etapa de la reaccin. Los tubos usados para PCR
tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena
conductividad trmica, permitiendo que se alcance
rpidamente el equilibrio trmico. Una de las bacterias
que puede ser identificada con esta prueba es
Chlamydia tranchomatis

Procedimiento
Paso de inicializacin
Este paso consiste en calentar la reaccin a una
temperatura de 94 a 96C, que se mantiene durante 1-9
min.
Paso de desnaturalizacin
Este paso es el de regular el evento de ciclismo primero y
consiste en calentar la reaccin a 94-98C durante 20 a 30
segundos.
Paso de recocido
La temperatura de reaccin se reduce a 50 65 C durante
20-40 segundos, dejando de recocido de los iniciadores de
ADN de cadena nica.

64

Extensin / alargamiento
La temperatura en este paso depende de la polimerasa de
ADN utilizados; Taq polimerasa tiene su optima actividad de
temperatura a 75- 80 C.
Alargamiento final
Este paso solo se puede realizar ocasionalmente a una
temperatura de 70 74C durante 5 15 min.

INTERPRETACION:

65

Inmunofluorescencia indirecta:
Fundamento:
Sobre un portaobjetos
que lleva pegado un antgeno
conocido, aadimos el suero problema. Si ste contiene
anticuerpos especficos, se unen al antgeno. Los
anticuerpos del suero no especficos del antgeno del
portaobjetos
se
eliminan
mediante
un
lavado.
Posteriormente se aade un suero anti-inmunoglobulina
humana marcada con isotiocianato de fluorescena
(conjugado). El conjugado se une a los anticuerpos
especficos o se elimina mediante lavado haba anticuerpos
especficos en el suero.
Las enterobacterias que se logran observar en esta prueba
son: Treponema pallidum, Bordetella, Mycobacterium
leprae, Neisseria gonorrhoeae.

Mtodo de realizacin:
1) La muestra problema es colocada sobre un
portaobjetos donde se deja secar y fijar.
2) Luego se agregan anticuerpos especficos marcados
con isotiocianato de fluorescena que difunden a
travs de la membrana celular y se combinan con los
antgenos vricos en el interior de las clulas.
3) La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el
microscopio de fluorescencia, por la aparicin de
fluorescencia de color verde manzana.

Interpretacin:

Prueba de ELISA
66

Fundamento:
Existen dos importantes variaciones en relacin con ELISA.
En primer lugar, que los anticuerpos o antgenos soluble se
pueden hacer insolubles por adsorcin a una fase slida,
como pueden ser las placas de microtitulacin o los tubos
de poliestireno. La adsorcin depende tambin dl tiempo,
temperatura y pH. Algunos mtodos precisan que las placas
se mantengan durante toda la noche a 4 C, en un tampn
de pH elevado. En segundo lugar, los antgenos o
anticuerpos se pueden conjugar al enzima sin prdida de
actividad. Se han utilizado toda una variedad de enzimas,
entre los que citaremos la fosfatasa alcalina, la peroxidasa
dl rbano picante y la glucosa-oxidasa. El 4-nitrofenil fosfato
o sustrato usado para la fosfatasa alcalina no es peligroso,
a diferencia del cido 5-aminosaliclico o sustrato de la
peroxidasa del rbano, que se considera carcinogntico. La
hidrlisis de estos sustratos da, respectivamente, un color
amarillo. ELISA tiene la ventaja sobre las tcnicas de
inmunofluorescencia de su mayor sensibilidad ya que, el
enzima acta catalticamente y de forma objetivable, por lo
que es posible medir la densidad ptica de la coloracin
final. La preparacin de conjugados se consigue, en el caso
de la fosfatasa alcalina, mediante la unin covalente con
glutaraldehido. La fraccin inmunogloblinica de la
globulina antiespecie se asla por precipitacin salina. sta
se combina con el enzima en la proporcin 3:1. La mezcla
se incuba con glutaraldehdo al 0.2% durante 2-4 horas a
temperatura ambiente. El glutaraldehdo libre se elimina
por dilisis. Se debe aadir un estabilizante enzimtico
antes de proceder a su conservacin a 4C, que puede
prolongarse hasta 12 meses.
ELISA directo

DESARROLLO:
Consta de las siguientes etapas:

67

1) Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos

especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados
deficientemente o no fijados.
2) Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con
una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los
antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado
para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan
reaccionado.
3) Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de
actuar la enzima marcadora. Se puede parar la
reaccin si se desea.
4) Lectura visual o colorimtrica del producto final
coloreado.
INTERPRETACION:

ELISA indirecta:
DESARROLLO:

68

1) Aadir sobre cada excavacin de la placa de

microtitulacin
200ml
de
antgeno
a
la
concentracin ptima. Incubar toda la noche a 4C
con tampn para bao.
2) Aclarar dos veces en tampn para lavado,
manteniendo la duracin del enjuagado entre 5 y 10
minutos.
3) Adicionar 200ml de suero diluido e incubar a
temperatura ambiente, durante 2 horas. Repetimos
el punto 2.
4) Aadir 200 ml de antiglobulina fosfatasa alcalina a
la concentracin ptima. Incubar durante 2 horas a
temperatura ambiente. Repetir el punto 2.
5) Adicionar 200ml de sustrato con fosfato en tampn
dietanolamina, bien permitiendo que la reaccin
tenga lugar hasta que presente el color adecuado, al
compararlo
con
un
control
positivo,
bien
mantenindola a lo largo de 30 minutos.
6) Para la reaccin aadir 50ml de NaOH 3 M.
7) El nivel de hidrlisis o de cambio de color es
proporcional a la cantidad de anticuerpo de la
muestra problema. Este cambio de color se puede
comparar con los controles y efectuar la lectura
directamente o se lee en un espectrofotmetro a
405nm.
INTERPRETACION:

69

PRUEBAS SEROLOGICAS SEGN CADA

BACTERIA
Shigella

Reaccion en cadena de la polimerasa (RCP)

Inmunoanalisis enzimtico comercial para detectar toxinas

de la familia shiga
70

Salmonella

Prueba de Widal clsica para las aglutininas febriles

71

Reaccion en cadena de la polimera (RCP)

Proteus

Reaccion de weil-felix

Helicobacter

72

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP: cuenta con la

ventaja de poderla utilizar tambin con muestras de jugo
gstrico, saliva, placa dentaria y heces, convirtindola en
una prueba no invasiva

Prueba ELISA que detecta niveles de IgG,

73

Brucella

La prueba de coombs

Anlisis de inmunoabsorcion ligado a enzimas

74

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP

Haemophilus

La prueba de Inmunoelectroforesis es eficaz para detectar

PRP

75

La Prueba de aglutinacin de ltex y la Prueba de

inmunoabsorcion ligada a enzimas son eficaces para
detectar PRP
Bordetella

Reaccion en cadena de la polimerasa RCP

76

Inmunoensayo enzimtico que detecta anticuerpos igA e

igG contra la toxina de la tos ferina

Vibrio

77

Reaccion en cadena de la polimerasa sobre sondas de ADN

para V. cholerae O1 y O139
Mycobacterium tuberculosis
Las pruebas serolgicas para la mayora de los antgenos
micobacterianos tienen poco valor predictivo cuando se
aplican a una poblacin que se supone tiene pocas
probabilidades de padecer la enfermedad
Mycobacterium leprae
En un 95% de los pacientes con lepra lepromatosa se
encuentran anticuerpos igM contra el PGL-1
En los pacientes con lepra tuberculoide solo un 60% tiene
un titulo significativo de de anticuerpos anti PGL-1
Por eso la serologa tiene poco valor en la lepra
Treponema pallidum
Hay dos clases de pruebas para investigar la sfilis:
No treponemicas:

Prueba rpida de reaginas en plasma (RPR) y la prueba

sobre portaobjetos (VDRL)

Treponemicas:
78

La prueba fluorescente de absorcin de anticuerpos

antitreponemicos(FTA-ABS) y la prueba seriodia TP-AP

Chlamydia trachomatis

Las tcnicas de enzimoinmunoanalisis(ELISA) y la prueba de

la fijacin del complemento(FC) con antgeno termoestable
especifico de chlamydia.
Neisseria gonorrhoeae

79

Puede que las tcnicas de amplificacin del ADN como la PCR terminen por
resultar equivalentes o superiores a las tcnicas de cultivo.

Pruebas De Aglutinacin
Fundamento:
Esta prueba determina la presencia o ausencia de un
determinado anticuerpo o antgeno en una muestra
problema. Si se produce la aglutinacin, la mezcla de la
muestra con el reactivo dar lugar ala formacin de
cogulos, siendo la prueba positiva. La prueba es negativa
si no se produce aglutinacin. En la prueba de aglutinacin
el antgeno o el anticuerpo se fija a una partcula de gran
tamao, como una clula o una bolita de ltex. Por lo tanto
en la prueba de aglutinacin se forma un coagulo visible
que esta constituido por el antgeno, el anticuerpo y las
partculas a las que se fijan. Se utilizan con antgenos
particulados tales
como una suspensin bacteriana.
Detectan preferentemente IgM. Este tipo de pruebas suele
ser extremadamente sensibles pro al mismo tiempo suele
padecer de falta de especificidad por el hecho de ser
mayoritariamente IgM lo que se detecta.
Las enterobacterias que pueden ser identificadas es
80

mycobacterium tuberculosis,
vibrio,
haemophilus,
mycobacterium leprae,
treponema pallidum.
DESARROLLO

1.- lleve todos los reactivos a temperatura ambiente y

mezcle suavemente antes de usar.
2.- coloque en las divisiones separadas (celdas) de la
misma lamina: una gota de suero, control positivo una gota,
control negativo una gota.
3.- adicione una gota de reactivo latex a cada celula.
4. Mezcle con el extremo plano de la pipeta / mezcle y
esparza el fluido regularmente sobre cada celda.
5. Incline la lamina de atrs hacia adelante suavemente por
3 minutos mientras observa la aglutinacin

INTERPRETACION:

81

ELECTROFORESIS
Tcnica De Electroforesis En Gel De Agarosa

Fundamento:
Para realizar la electroforesis se utiliza un medio de
migracin adecuado, de modo que la separacin sea
eficiente, ya que se necesita que exista una suficiente
fuerza de rozamiento para que las molculas de distinto
tamao se separen. Para ello se utiliza un gel que consiste
en una red compuesta por un polmero orgnico y que
aumenta considerablemente la friccin, impidiendo a la vez
la difusin de las molculas a travs del medio acuoso en
todas las direcciones.
Las enterobacterias que se pueden observar son:
Mycobacter,
E. coli,
Pseudomonas.

Mtodo de realizacin:
1) El DNA plasmdico es extrado con una micropipeta
automtica agregando a un tubo eppendorf con 2 ml de
Loading Buffer.
2) Mezclarlos cargando y descargando con la micropipeta.
3) Luego se carg la pipeta con toda la muestra del tubo.
4) Se la apoya en uno de los bordes del pocillo del gel de
agarosa.
5) Descargar su contenido en el pocillo.

82

6) Se conecta la cuba que contena al gel a un electrodo,

con el polo positivo en el lado opuesto al sitio de
siembra.
7) El buffer en que est inmerso el gel posibilita que circule
corriente elctrica, ya que presenta iones (el agua
destilada no conduce electricidad, por eso no se puede
utilizar como medio de corrida). Se corre a voltaje
constante (3-5 V/cm) hasta que el azul de bromofenol
haya migrado aproximadamente 10 cm.
8) Se apaga la fuente y se expulsa el gel a radiacin
ultavioleta (colocado en un transiluminador ultravioleta).

INTERPRETACION:

83

Electroforesis Capilar
Fundamento:
Es una tcnica de separacin utilizada en distintas reas
para separar las diferentes molculas presentes en una
disolucin de acuerdo a la relacin masa/carga de las
mismas. La separacin se lleva a cabo en un tubo hueco de
dimetro muy pequeo, de ah que reciba el nombre de
capilar. Dentro de este capilar se encuentran la disolucin
que contiene los analitos o las molculas a separar y el
tampn o medio electroltico que es el encargado de
conducir la corriente. La separacin se lleva a cabo segn la
relacin masa/carga de las distintas molculas. Para que
esto sea posible es necesario aplicar una diferencia de
potencial entre los dos extremos del capilar que har que
las molculas se muevan hacia un extremo u otro del
capilar (movilidad electrofortica) (las molculas catinicas
hacia el polo negativo y las aninicas hacia el polo positivo)
y que se vayan separando entre s. Adems existe dentro
del capilar otro fenmeno denominado flujo electroosmtico
que se da debido a que la superficie interna del capilar est
cargada. El flujo electroosmtico es el mismo dentro de
todo el capilar y afecta de igual forma a todas las molculas
arrastrndolas hacia uno de los extremos. As, la separacin
se vera afectada por el flujo electroosmtico y por la
movilidad electrofortica de cada una de las molculas.
La eficacia y la velocidad de la separacin se pueden
mejorar mediante la optimizacin de diferentes factores
como son la temperatura, el voltaje aplicado, el medio de
separacin, el disolvente en el que se encuentra disuelta la
muestra, etc. Generalmente se obtienen tiempos de anlisis
bastante bajos si se compara con otras tcnicas separativas
como la cromatografa de gases o la de lquidos.
Algunas de la enterobacterias que se puede diagnosticar
con esta prueba son: Pseudomonas aeruginosa, Candidas.

84

Mtodo de realizacin:
1) Se introduce la muestra dentro del capilar se cambia el
va de entrada por la va con muestra y se aplica la
inyeccin durante 10-30 seg. Introducindose en el
capilar un volumen de muestra del orden de nanolitros.
2) El tampn de separacin rellena una columna capilar.
3) El uso de capilares evita los problemas asociados al
calentamiento o degradacin de los electrolitos

compuestos. La muestra migra hacia el otro extremo.

4) Los resultados son en aspecto similares a

la

cromatografa

aportando

informacin

cualitativa

cuantitativa.
INTERPRETACION:

85

CONCLUSION
La creacin de este manual de tcnicas de identificacin
concluimos que ser de gran utilidad para todo aquel que
lo lea ya que contiene los conocimientos bsicos para
realizar
prcticas
de
laboratorio
as
como
los
procedimientos
adecuados
y
tcnicas
bsicas
bacteriolgicas.
Abarca desde una tincin bacteriolgica comn y hasta
pruebas no comunes como las sistematizadas o las de
ELISA. Al seguir los procedimientos correctamente tambin
se identificaran las bacterias que afectan al hombre;
ayudara al mdico a proporcionar el tratamiento correcto
del paciente. Los conocimientos contenidos en este manual
de identificacin son de vital importancia ya que la persona
que efecte las prcticas debe hacerlo con total
responsabilidad y exactitud ya que en sus manos est la
vida del paciente (por ejemplo si hablamos de una mala
identificacin de una bacteria seria fatal para una persona
si se le proporciona un medicamento incorrecto.
Gracias a la manera de explicar y los conocimientos bien
fundamentados que nos proporciono el catedrtico, en la
materia de bacteriologa, este manual nos ayudo mucho en
nuestra formacin no solo como tcnicos laboratorista
clnico sino tambin todas sus enseanzas nos servirn
posteriormente cuando iniciemos una carrera profesional
en el rea clnica.

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BIBLIOGRAFA:
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