TUGAS MATA KULIAH PILIHAN BIOANALISIS

LCMS/MS for the simultaneous determination of polar endogenous

ADMA and CML in plasma and urine from diabetics

Disusun oleh:

NAMA

: TIARA ISMIHAYATI K.

NIM

: 142210101099

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JEMBER
2016

LCMS/MS for the simultaneous determination of polar endogenous ADMA

and CML in plasma and urine from diabetics

Asymmetric dimetilarginin (ADMA) adalah molekul endogen yang menghalangi

generasi oksida nitrat dengan bertindak sebagai inhibitor kompetitif dari endothelial nitric
oxide synthase. ADMA berasal dari degradasi protein termetilasi dalam proses pergantian
protein fisiologis, dan dibersihkan secara metabolik oleh enzim spesifik dimetilarginin
dimethylaminohydrolase. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa ADMA terkait
ke penurunan jalur NO dan disfungsi endotel yang mengarah pada hipertensi, diabetes
mellitus dan stadium akhir gagal ginjal.
Produk akhir glikasi lanjutan atau Advanced glycation end-products (AGEs) adalah
kelompok heterogen senyawa endogen yang merusak integritas dan fungsi dinding pembuluh
darah. -N-karboksimetil-l-lisin (CML) adalah salah satu karakterisasi terbaik AGEs dan
dapat dibentuk oleh reaksi nonenzimatik dari mengurangi karbohidrat dengan gugus amino
dari protein atau makromolekul lainnya diikuti oleh pembelahan dan / atau penataan ulang
intramolekul. Berbagai penelitian telah melaporkan bahwa AGEs memiliki peran patogenik
penting dalam komplikasi mikrovaskuler diabetes dan aterosklerosis. Selain itu, AGEs
terbukti memiliki aktivitas menghambat dimethylaminohydrolase endotel, menyebabkan
akumulasi ADMA dan penghambatan nitrat oksida sintase.
ADMA dan CML adalah biomarker potensial yang berguna bagi proses patogenik yang
terkait dengan NO dan respon farmakologis untuk intervensi terapeutik. Saat ini, ada sejumlah
metode yang tersedia untuk menentukan ADMA di cairan biologis termasuk ELISA, HPLC
setelah derivatisasi fluoresensi, GC MS setelah derivatisasi, CE dan LC-MS / MS. Demikian
pula, CML bisa ditentukan dengan HPLC setelah derivatisasi fluoresensi, GC-MS dengan
derivatisasi, ELISA dan LC-MS / MS dengan kolom karbon berpori grafit atau dengan
pengenceran isotop stabil.
Namun, pada saat ini tidak ada metode untuk menentukan secara bersamaan baik
ADMA dan CML yang memberikan sensitivitas tinggi tanpa perlu untuk ekstraksi yang
membosankan dan langkah-langkah derivatisasi. Dalam penelitian ini digambarkan
perkembangan alat tes LC-MS / MS yang cepat dan sensitif untuk penentuan simultan ADMA
dan CML dan menyelidiki aplikasinya dalam diagnosis klinis diabetes mellitus tipe 2
(DMT2) dan nefropati diabetik (DN).
BAHAN DAN METODE

Senyawa Kimia dan Reagen

Senyawa kimia dan reagen yang digunakan antara lain HPLCgrade acetonitrile,
asam format, Ammonium format, air ultra murni yang disusun menggunakan UPH
Ultrapure Water System, NG, NG-Dimethylarginine (ADMA) hydrochloride (kemurnian >
99.0%), CML (kemurnian > 99.0%) dan -N-carboxy[2H2]methyl-L-lysine (kemurnian >
99.0%).

Instumentasi
Sistem HPLC terdiri dari degasser DGU-14A, CTO-10Avp kolom oven, CTC HTS
PAL autosampler, dua LC-10ADvp pompa dan SCL-10AUP kohesif kontroler.
Spektrometer massa terdiri AB SCIEX Model API 3000 instrumen quadrupole tiga
dilengkapi dengan sumber ESI beroperasi di mode ion positif.
Studi Klinis
Protokol klinis telah disetujui oleh komite etika lokal dan memenuhi Deklarasi
Helsinki. Penjelasan dan persetujuan telah diperoleh dari semua partisipan studi. Dalam
studi pertama, kelompok subyek sehat (n = 5) dan kelompok pasien dengan DMT2 (n =
10) direkrut dan, setelah puasa semalam, urin dikumpulkan dalam kantong plastik yang
berisi 40% formaldehid (1000: 5, v: v) sebagai bacteriostat. Dalam studi kedua, tiga
kelompok (n = 58 per kelompok) direkrut, satu kontrol sehat, satu pasien DMT2 dan satu
pasien dengan DN. Setelah puasa, seluruh darah semalam dikumpulkan ke dalam tabung
heparin, kemudian, plasma dipisahkan dengan sentrifugasi pada 2400 g selama 10 menit.
Blanko plasma dan urin segar manusia (dari lebih dari 6 pendonor yang berbeda) dibagi
menjadi aliquot kecil untuk digunakan dalam validasi uji. Semua sampel disimpan pada
-20 C.
Persiapan Sampel
Urine diencerkan 1:10 dengan air murni sebelum dianalisis. Larutan kerja IS (10 ml)
ditambahkan ke 100 ml plasma atau urin encer dan vortex selama 30 detik. Kemudian
asetonitril (200 ml) ditambahkan dan campuran vortex selama 0,5 menit dan disentrifugasi
pada 13.201 g selama 5 menit untuk menghilangkan endapan protein. Supernatan
dikumpulkan dan 5 ml disuntikkan ke dalam sistem LC-MS / MS.
Penyusunan Standar Kalibrasi dan Sampel QC
Larutan stok (1 mg / ml) dari ADMA dan CML disiapkan dalam air murni. Larutan standar
ADMA 200, 500, 1000, 2000, 5000, 10.000 dan 20.000 ng / ml dan CML pada 100, 200,
500, 1000, 2000 dan 5000 ng / ml disiapkan dengan pengenceran larutan stok dalam air.
Sebuah laritan kerja IS (1000 ng / ml) disiapkan dengan cara yang sama. Standar kalibrasi
dalam plasma (ADMA 20-1000 ng / ml; CML 10-500 ng / ml) dan
urine (ADMA 50-2000 ng / ml; CML 10-500 ng / ml) disiapkan dengan menambahkan 10
ml aliquot larutan standar untuk 90 ml aliquot dari plasma kosong atau urin encer (1:10
dengan air deionisasi). Sampel QC adalah standar dalam plasma atau urin, yang disiapkan
dengan cara yang sama. Konsentrasi sampel QC dalam plasma adalah 50, 190 dan 800 ng /
ml (ADMA) ; 20, 90 dan 400 ng / ml (CML) dan dalam urin 100, 400 dan 1600 ng / ml
(ADMA) ; 20, 90 dan 400 ng / ml (CML). Larutan stok dan IS dialikuot dan disimpan pada
suhu 4 C.
Kondisi Analisis LC-MS / MS
Kromatografi dilakukan pada kolom Welch Ultimate
XB- NH2 (150 2,1 mm, 5 mm) dipertahankan pada 38 C menggunakan elusi gradien
dengan asetonitril sebagai pelarut A dan 5 mM amonium format penyangga pH 4.0 sebagai
pelarut B. Laju aliran dari metode adalah 0,2 ml / menit.
Karena waktu retensi pengotor dalam plasma dan urine yang berbeda, sehingga dipilih
gradien yang berbeda. Program gradien adalah sebagai berikut: Plasma 0-0,5 menit 20% B;
0,5-1,50 menit 20-80% B; 1,50-4,0 menit 80% B; 4,50-6,0 menit 20% B selama eluen

diarahkan ke spektrometer massa 2,8-4,5 menit; Urine 0-0,5 menit 20% B; 0,5-4,0 menit
20-90% B; 4,01-7,0 menit 20% selama eluasi dimasukkan ke spektrometer massa 3,5-5,0
menit.
Uji Validasi
Selektivitas & carry-over
Selektivitas dinilai dengan menganalisis blanko plasma atau sampel urin encer dari
6 pendonor sehat yang berbeda; larutan standar campuran yang mengandung ADMA,
CML, IS; dan plasma atau sampel urin encer dari pasien diabetes pada awal seri
validasi. Luncuran diamati ketika larutan blanko yang mengandung IS dianalisis secara
langsung setelah injeksi standar tertinggi pada kurva kalibrasi.
Linearitas & LLOQ
Dalam membangun kurva kalibrasi, blanko plasma dan urin dikumpulkan dari
setidaknya 6 pendonor sehat yang berbeda. Karena rendahnya tingkat analit dalam
sampel blanko, latar belakang endogen tidak mengganggu deteksi LLOQ. Latar
belakang sinyal dari endogen ADMA dan CML diambil dengan Analis versi1.4.2.
Kurva kalibrasi disiapkan rangkap dalam tiga hari berturut-turut berdasarkan
perbandingan luas puncak analit untuk IS dengan Faktor bobot 1/x. r2 mewakili
koefisien korelasi kurva standar. Koefisien korelasi melebihi 0,99, menunjukkan
linearitas yang baik antara berbagai konsentrasi. LLOQ didefinisikan sebagai
konsentrasi terendah pada kalibrasi kurva di mana kedua akurasi dan presisi terevaluasi.
Akurasi & Presisi
Akurasi Intra dan interday (sebagai kesalahan relatif [RE]) dan presisi (seperti
RSD) dinilai dengan analisis dari lima ulangan sampel QC pada tiga hari yang berbeda.
Akurasi dan presisi tidak lebih dari 15% dianggap diterima.
Stabilitas
Stabilitas ADMA dan CML diselidiki menggunakan sampel QC (n = 3) disimpan di bawah
kondisi berikut: pada suhu kamar selama 24 jam; setelah tiga siklus freezethaw (mencair
pada 24C selama 2 jam dan pembekuan pada -20C selama setidaknya satu hari); dan
pada -20 C selama 60 hari. Stabilitas sampel yang diproses juga dinilai setelah
penyimpanan di autosampler pada 4 C untuk 24 jam. Stabilitas larutan stok yang
disimpan selama 15 hari pada 4 C dan selama 24 jam pada suhu kamar (24 C)
ditentukan setelah pengenceran yang tepat.
HASIL DAN PEMBAHASAN

Pengembangan Metode
Persiapan Sampel
Presipitasi protein sederhana dengan asetonitril ditemukan untuk memberikan
recovery tinggi dengan efek matriks rendah. Namun, dengan menggunakan asam
trikloroasetat, recovery CML dalam plasma lebih dari 90%, tetapi recovery ADMA
lebih rendah dari 50%. Untuk simultan ADMA dan CML, dipilih asetonitril sebagai
precipitator. Sampel QC harus mencerminkan sampel biologis nyata. Jadi, sampel QC
harus siap dalam setidaknya 95% dari matriks sama dengan eksperimen sampel untuk
metode divalidasi, yang dapat mencerminkan efek matriks dan recovery.

 Optimasi HPLC
ADMA dan CML adalah asam amino yang sangat polar dengan retensi rendah pada
fase terbalik HPLC. Selama percobaan awal, mereka juga memberi sinyal sangat lemah
yang mungkin disebabkan oleh penekanan ion dengan senyawa polar awal elusi.
Peneliti mencoba untuk menggunakan kolom HILIC, yang memiliki kemampuan baik
dalam pemisahan senyawa polar. Kolom yang dibentuk oleh NH2 memiliki karakteristik
di atas kolom HILIC. Tapi HILIC tidak bisa memisahkan pengotor endogen dari CML
dan ADMA. Selanjutnya, puncak simetris dengan pemisahan awal diperoleh dari Kolom
Welch Ultimate XB- NH2 (150 2,1 mm; 5 m) tanpa derivatisasi.
Dalam hal fase gerak, puncak ADMA sensitif terhadap perubahan pH fase gerak di
rentang 3-6 tetapi menurun pada pH yang lebih tinggi. Alhasil, elusi gradien dengan
asetonitril dan 5 mM ammonium format penyangga pH 4.0 memberikan bentuk puncak
yang baik dengan intensitas sinyal tinggi. Selain itu, total jangka waktu dari uji
termasuk pencucian dan re-equilibrium adalah 7,0 menit, yang lebih pendek daripada
10-30 menit yang ditemukan dalam laporan metode sebelumnya.
Optimasi MS / MS
Dalam kasus ADMA, produk ion pada m / z 46.0 yang terbentuk oleh hilangnya ion
Dimethylammonium ditemukan hanya di ADMA dan tidak dalam isomer terkait,
simetris dimetilarginin. CML dan CML-d2 memiliki produk ion serupa di m / z 130,0
dan 84,1. Untuk CML, ion produk di m / z 130,1 memberi puncak simetris bebas dari
gangguan senyawa endogen. CML-d2dipantau menggunakan m / z 84,1. Resolusi
spektrometer massa lebih tinggi, sehingga tidak ada gangguan untuk CML dan CML-d2.

Uji Validasi
Selektivitas & carry over
Pengujian pada plasma dan urin encer bebas dari gangguan pada waktu retensi
analit dan IS. Dengan mengubah aliran gradien dari LC dan kondisi massa, tidak ada
gangguan ditemukan pada retensi waktu analit. Karena CML dan ADMA adalah
senyawa endogen, mereka memiliki latar belakang, jadi kita perlu IS untuk mengukur
carry-over tersebut.
Linearitas & LLOQ
Penetapan kadar ADMA linear dalam plasma pada rentang konsentrasi 20-1000
ng/ml (r^2 = 0,9998) dan dalam urin pada rentang 50-2000 ng/ml (r^2 = 0,9999).
Pengujian CML juga linier dalam rentang 10-500 ng/ml pada plasma (r^2 = 0,9999) dan
urin (r^2 = 0,9995). Akurasi analit pada mereka LLOQ (n = 5) adalah: ADMA dalam
plasma 94-110%, RSD <7.59%; ADMA dalam urin 90-110%, RSD <6.54%; CML
dalam plasma
95-110%, RSD <4,74%; CML dalam urin 85-115%, RSD <9,41%. S/N dari ADMA dan
CML dalam plasma dan urine keduanya dihitung dengan Analis 1.4.2 dimana keduanya
lebih besar dari 5.
Akurasi & presisi
Untuk pengujian ADMA dan CML dalam sampel QC, akurasi memberikan nilai RE
dalam kisaran 6,09-1,85% dan presisi memberikan RSD <8,81%. Nilai-nilai tersebut
masuk dalam kriteria penerimaan (variasi 15%) dan menunjukkan bahwa pengujian
dapat diproduksi kembali dan dapat dipercaya.

 Recovery Ekstraksi & Efek Matriks

Recovery dari ADMA dan CML dalam plasma atau urine manusia, dengan
pengecualian CML dalam plasma, lebih besar dari 85% dan konsisten di tiga
konsentrasi. Recovery CML dalam plasma berkisar 66,18-70,23%. Selain itu, recovery
dari IS dalam plasma dan urin masing-masing adalah 88,30% dan 100,4%. Bioanalisis
senyawa endogen menjadi rumit ketika sampel matriks 'blanko' tidak tersedia. Recovery
lebih tinggi dari IS (d2-CML) dibandingkan CML dalam plasma mungkin karena deviasi
dari pengurangan latar belakang. Tidak ada efek matriks signifikan yang teramati,
dengan konsentrasi dalam rentang 85-115% dari nilai nominal untuk analit dan IS.
Uji Stabilitas
Data stabilitas menunjukkan bahwa analit stabil di bawah semua kondisi teruji
termasuk larutan stok pada suhu kamar (10 jam) dan 4 C (15 hari).
Studi Klinis
Dalam studi klinis pertama, metode analisis diterapkan untuk menentukan tingkat
ADMA dan CML dalam sampel urin dari individu yang sehat dan pasien dengan
DMT2. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok dalam konsentrasi
ADMA atau CML. Selain itu, urine klinis hasil konsentrasi urin klinis tidak
dinormalisasi untuk tingkatan kreatinin dalam studi tertentu, karena kadar kreatinin dari
sampel urin yang berasal dari subjek relawan tidak ditentukan.
Dalam studi klinis kedua, ADMA dan CML ditentukan dalam plasma dari tiga
kelompok (N = 58 per kelompok). Konsentrasi ADMA (mean SD) dalam penelitian
ini adalah 107,14 24,50 ng / ml pada subyek sehat, 128,01 34,32 ng / ml pada pasien
DMT2 dan 186,93 50,80 ng / ml pada pasien dengan DN. Dibandingkan dengan
kontrol yang sehat, tingkat ADMA secara signifikan lebih tinggi pada pasien T2DM (p
<0,05) dan di pasien dengan DN (p <0,001). Sedangkan, mean tingkat pada pasien DN
secara signifikan lebih tinggi daripada di pasien T2DM (p <0,001). Hasil ini sesuai
dengan nilai-nilai sebelumnya dan menunjukkan bahwa ADMA merupakan biomarker
potensial untuk DMT2 dan terutama untuk DN.
Dalam hal CML, tingkat plasma pada pasien DN (23.98 7.52 ng / ml) tidak secara
signifikan lebih tinggi dari di kontrol sehat (21,39 4,65 ng / ml) tetapi tingkat
pada pasien DMT2 adalah 32,33 14,72 ng / ml, dengan p <0,05. Karena banyak faktor
seperti usia dan aterosklerosis yang dapat menyebabkan peningkatan kadar CML,
penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengkonfirmasi status CML sebagai biomarker
dari DMT2 dan DN.
KESIMPULAN
Dalam penelitian ini dilaporkan pengembangan dan validasi metode bioanalitis untuk
kuantisasi simultan ADMA dan CML dalam plasma dan urin manusia berdasarkan LC-MS.
Optimasi kondisi HPLC dan MS memungkinkan pemisahan molekul kecil polar endogen
senyawa CML dan ADMA, dan mengesampingkan gangguan efek matriks endogen. Metode
ini memiliki reproduktifitas baik, spesifisitas dan telah berhasil diterapkan untuk menentukan
CML dan ADMA dalam plasma dan urin bagi individu yang sehat dan pasien dengan diabetes
nefropati. Di masa depan, kita perlu studi lebih lanjut apakah CML dan ADMA sebagai calon

pengganti endpoint untuk memprediksi perkembangan komplikasi mikrovaskuler diabetes,

dan bahkan sebagai target terapi yang potensial.