e

TIROSINASA I: Efecto del pH y la Temperatura sobre la Actividad Enzimtica.

La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin

catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando
la temperatura se eleva debido al incremento de la energa cintica de la
energa de las molculas reactantes. Sin embargo, al final, la energa cintica
de la enzima excede a la barrera energtica para romper los enlaces dbiles de
hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria.A esta
temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la
actividad cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima
de accin. Los limites de actividad para la mayor parte de las enzimas tiene
lugar entre los 10C y 50C; la temperatura ptima para las enzimas en el
cuerpo se hall alrededor de 37C.
Podemos decir que el aumento de la actividad enzimtica, observado a 50C o
por encima de esta temperatura, es de corta duracin, ya que la enzima a
temperaturas muy altas como esta, tiende a perder sus propiedades y
desnaturalizarse, posteriormente se coagula la parte de la protena enzimtica.
Todo esto hace que desaparezca la actividad enzimtica, Quiz a temperatura
de 4C no tiene actividad la enzima, ya que a esta temperatura la enzima se
inhibe, al igual que las proteasas, Quiz a temperatura de 4C no tiene
actividad la enzima, ya que a esta temperatura la enzima se inhibe, al igual
que las proteasas.

PH: La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo,

con rpida disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La
actividad ptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.El pH
ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la
superficie, o con condiciones ptimas para la fijacin de la enzima a su
sustrato. Cuando hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus
molculas y ante un dficit los ceden.Este cambio tiene una doble
consecuencia sobre la molcula. Como todas las protenas, las enzimas
desempean su funcin por los residuos de aminocidos; algunos confieren a
su superficie una distribucin de cargas elctricas.Cuando la concentracin de
iones hidrogeno es muy baja en comparacin con la concentracin optima, la
molcula los cede desapareciendo cargas positivas o apareciendo cargas
negativas en su superficie. Ante una concentracin elevada de iones
hidrogeno, algunos se fijan a la molcula desapareciendo cargas (-) o poniendo
cargas (+) que no existan.As mismo al cambiar las cargas elctricas en los
residuos de aminocidos se alteran los lazos de unin dentro de la molcula
variando su acomodo tridimensional con recuperacin de la actividad de la
enzima.

El pH es otro factor que influye en la manera de accionar de la enzima, pues,

como se menciona en la teora, cuando el pH es demasiado cido la enzima
trabajara menos, pero, a comparacin de un pH demasiado alcalino, la enzima
muestra actividad mayor que en la actividad mostrada a pH alcalino.

Los datos mostrados no dicen que de un pH 5 hacia abajo la enzima empieza a

perder actividad, y de pH 10 hacia arriba hace lo mismo, empieza a dejar de
trabajar. Esto nos lleva a pensar que al haber variaciones de aunque sean
dcimas, se puede afectar la manera de trabajar de la enzima. Por tanto, se
piensa que la practica estuvo bien realizada, al haber comprobado los objetivos
propuestos.

B. Medida de la actividad enzimtica

Tiempo
(min)/Tubo

0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

0,092
0,138
0,295
0,366
0,37
0,354
0,323
0,278
0,211
0,127

0,352
0,398
0,235
0,24
0,241
0,242
0,244
0,243
0,243
0,242

0,657
0,703
0,627
0,524
0,46
0,469
0,46
0,459
0,456
0,457

0,468
0,549
0,553
0,555
0,557
0,558
0,559
0,56
0,557
0,557

C. Medida de la actividad enzimtica con cambio de la temperatura

Tiempo (min)

Absorbancia 4 oC

Absorbancia 37 oC

Absorbancia 95 oC

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

0.017
0.070
0.105
0.112
0.115
0.115
0.114
0.113
0.113
0.112
0.110

0.568
0.581
0.586
0.595
0.599
0.607
0.614
0.617
0.620
0.622
0.626

0,171
0.246
0.244
0.244
0.245
0.245
0.246
0.246
0.246
0.245
0.245

En 37 se afecta la actividad enzimtica , en 95 C se afecta ms la actividad

enzimtica , en 4 C hay mucha actividad enzimtica no se altera la
estructura de la protena.
Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo,
al ser protenas, a partir de cierta temperatura, se empiezan a desnaturalizar
por el calor. La temperatura a la cual la actividad cataltica es mxima se llama
temperatura ptima (Figura de la derecha). Por encima de esta temperatura, el
aumento de velocidad de la reaccin debido a la temperatura es contrarrestado
por la prdida de actividad cataltica debida a la desnaturalizacin trmica, y la
actividad enzimtica decrece rpidamente hasta anularse. La teora nos indica
que a temperaturas bajas la enzima pudiera llegar a perder la actividad, esto
seria momentneamente; entonces a temperaturas altas, la enzima se
desnaturalizara, pero, a una temperatura media (entre unos 30C y 40C) la
enzima funciona casi perfecta.

1. Cuando se trabaja con manzana el extracto no es recomendable diluirlo Por

qu?.
Cuando se trabaja con manzana no es recomendable diluir el extracto, por qu se produce
pardeacin al ser expuesto al aire por el contacto con el oxgeno. El pardeamiento
enzimtico es el que ocurre por accin de enzimas, como por ejemplo la polifenoloxidasa que
acta sobre sustratos como los polifenoles produciendo las quinonas que se polimerizan para
dar finalmente el color marrn.
2. Cul es la funcin de la tirosinasa en los animales superiores?

La tirosina es un aminocido no esencial fundamental e importante para el

metabolismo y para nuestro estado de nimo, ya que es precursor de la
dopamina y la adrenalina, .Tambin con la norepinefrina y la epinefrina que
regulan el estado de nimo
Forma parte del funcionamiento correcto del sistema nervioso central.
Fundamental para el metabolismo.
Minimiza la absorcin y almacenamiento de determinadas grasas.
Efecto positivo en la mucosa de la piel y el pelo.
Estimula la mielina.
Influye en otras hormonas como la tiroides, siendo beneficiosa para personas
con trastornos de tiroides.
Tambin es beneficioso para los estrgenos, siendo interesante en caso de
menopausia.

3. De acuerdo con los resultados obtenidos en la prctica, Cul es la interpretacin y

explicacin que se le da a la fruta o frutas que tienen una mayor concentracin de
tirosinasa?

4. Qu se podr recomendar (y que no se podr recomendar), para evitar el

pardeamiento de las frutas y las papas cortadas?
Cuando cortamos algunas frutas y exponemos su carne a la accin del aire, vemos que en
unos instantes se oscurece. Esto ocurre con frutas como la manzana, la pera, el pltano y
con otros alimentos como las patatas o los championes. Este proceso se llama oxidacin o
pardea miento enzimtico, pues es el resultado de la accin del oxgeno contenido en el aire
en combinacin con los compuestos qumicos de la fruta, en concreto sobre los fenoles.
Cuando se rompe la compartimentalizacin por un dao mecnico, como el triturado, corte
o congelacin y descongelacin, la reaccin de pardeamiento se puede producir. Tambin
se produce la inhibicin del enzima por los productos de la reaccin. Adems de
manteniendo la compartimentalizacin, la reaccin de pardeamiento se puede frenar
actuando sobre diferentes factores: Evitando el contacto del oxgeno con la superficie de
corte, Bajando a la temperatura, Reduciendo el pH y Desnaturalizando el enzima, el cido
como el cido ctrico inhibe de inmediato la enzima y la oxidacin es tan lenta que parece
que no sucediera, Disminucin del Ph: a Ph bajos la actividad cataltica decrece y produce
una inactivacin de las enzimas.

TIROSINASA II: Determinacin de la constante Michaelis-Menten y la velocidad mxima

B. Medida de la actividad enzimtica

t(min)/
tubo

0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

0.019
0.037
0.099
0.153
0.204
0.250
0.292
0,326
0.352
0.370
0.376

0.078
0.081
0.126
0.197
0.259
0.315
0.362
0.403
0.429
0.447
0.453

0.035
0.088
0.157
0.215
0.257
0.278
0.283
0.283
0.283
0.284
0.286

0.69
0.075
0.077
0.126
0.174
0.200
0.206
0.206
0.204
0.204
0.202

0.014
0.017
0.017
0.017
0.018
0.020
0.023
0.027
0.031
0.032
0.032

0.099
0.098
0.096
0.098
0.101
0.099
0.100
0.101
0.101
0.102
0.102

La velocidad de una reaccin catalizada (V) nos indica la cantidad de sustrato

Consumido, o producto formado, por unidad de tiempo.
B)

GRAFICAS ABSORBANCIA VS TIEMPO

absorbancia vs tiempo tubo 1

0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
absorbancia 420 nm 0.06
0.04
0.02 f(x) = 0.01x - 0
0 R = 0.06
0
1
2
-0.02
-0.04

tiempo en minutos (m)

Grafica 2: absorbancia Vs tiempo del tubo 1 (1.0 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 2

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02

absorbancia 420 nm

0
-0.02

f(x) = 0.01x - 0.03

0 R = 0.09
1
2
3

-0.04
-0.06
-0.08
-0.1

tiempo en minutos (m)

Grafica 3: absorbancia Vs tiempo del tubo 2 (1.5 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 3

0.2
0.18
0.16
0.14
0.12

absorbancia 420 nm

0.1
0.08
0.06

f(x) = - 0.01x + 0.09

R = 0.15

0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

Grafica 4: absorbancia Vs tiempo del tubo 3 (2.0 ml de L-metildopa).

M=0,0007

absorbancia vs tiempo tubo 4

0.12
0.1
0.08

absorbancia 420 nm 0.06

Linear ()

f(x) = 0x + 0.05
R = 0

0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

Grafica 5: absorbancia Vs tiempo del tubo 4 (2.5 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 5

0.18
0.16
0.14
0.12

f(x) = - 0.02x + 0.13

R = 0.84

0.1

absorbancia 420 nm 0.08

0.06
0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

Grafica 6: absorbancia Vs tiempo del tubo 5 (3.0 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 6

0.14
0.12
0.1
0.08

absorbancia 420 nm

f(x) = - 0x + 0.08
R = 0.05

0.06
0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

c) [S] = Dopa 0.03 M inicial:

1: [S] = 0.03M*0.5ml/5ml totales = 0.03 M Para el tubo 1
2: [S] = 0.03M*1.0ml/5ml totales = 0.006 M Para el tubo 2
3: [S] = 0.03M*1.5ml/5.0 ml totales = 0.009 M Para el tubo 3
4: [S] = 0.03M*2.0ml/5ml totales = 0.012 M Para el tubo 4

5: [S] = 0.03M*2.5ml/5ml totales = 0.015 M Para el tubo 5

6: [S] = 0.03M*3.0ml/5ml totales = 0.018 M Para el tubo 6

D)
Tubo

[S]f

1
2
3
4
5
6

0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018

M
M
M
M
M
M

Vi

1/[S]

1/Vi

0,0065
0,0097
-0.0105
0,007
-0,0023
-0,0024

333.33
166.66
111.11
83.3
66.66
55.55

153.84
103.09
0.985
1428
0.977
0.9976

E)

v1 vs (s)
0.02
0.01
0.01

v1

0.01

0.01

0.01

0.01

-0.01
-0.01
-0.02

(s)concentracin

0.01

0.02

0.02

0.02

Lineweaver-Burke
1600
1400
1200
1000

1/v1

800
600
400
200
0

1/(s)concentracin

103,09153.84

M= 166.66333.33

= -50.75/166-67=0,304

333.33- ((0,304)x153.84)=1/vmax =
Vmax=1/286.63 vmax=0.0034
Km/vmax=m Km=vmax x m
KM=0.304X0,0034

km=0,001036 mM

TIROSINASA III: Efecto de un inhibidor sobre la constante Michaelis-Menten y la

velocidad mxima

Medida de la actividad enzimtica.

t(min)/
tubo

0.0
0.5
1.0

0.004
0.003
0.024

0.027
-0.088
0.016

0.085
0.058
0.054

0.100
0.038
0.040

0.160
0.094
0.107

0.057
0.063
0.069

1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0

0.000
0.017
-0.024
-0.001
-0.00
-0.001
0.135
-0.010

-0.088
0.007
-0.030
0.033
0.078
0.055
-0.045
0.004

0.190
0.067
0.037
0.047
0.028
0.029
0.060
0.052

0.025
0.047
0.045
0.028
0.048
0.083
0.056
0.062

0.078
0.085
0.080
0.079
0.073
0.038
0.020
0.019

0.116
0.091
0.068
0.062
0.060
0.061
0.056
0.069

MichaelisMenten

tubos

Vo (Ab/min)

[S]M

1
2
3
4
5
6

0.02
0.09
0.08
0.04
0.02
0.46 Abs/min

0.03 M
0.006 M
0.009M
0.012 M
0.015 M
0.018 M

b)Graficas vs absorbancia.

Grafica 1: absorbancia Vs tiempo del tubo 1 (0.5 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 1

0.16
0.14
0.12
0.1

absorbancia 420 nm

0.08
Linear ()

0.06
0.04
f(x) = 0.01x + 0
R = 0.07
0
0 1 2 3 4 5
-0.02
0.02

tiempo en minutos (m)

Grafica 2: absorbancia Vs tiempo del tubo 1 (1.0 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 2

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
f(x) = 0.01x - 0.03
absorbancia 420 nm
0
0 R1= 0.09
2 3 4 5 6
-0.02
-0.04
-0.06
-0.08
-0.1

Linear ()

tiempo en minutos (m)

Grafica 3: absorbancia Vs tiempo del tubo 2 (1.5 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 3

0.2
0.15

absorbancia 420 nm

0.1
f(x) = - 0.01x + 0.09
R = 0.15

0.05
0

tiempo en minutos (m)

Grafica 4: absorbancia Vs tiempo del tubo 3 (2.0 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 4

0.12
0.1
0.08

absorbancia 420 nm 0.06

f(x) = 0x + 0.05
R = 0

0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

Grafica 5: absorbancia Vs tiempo del tubo 4 (2.5 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 5

0.18
0.16
0.14
0.12

f(x) = - 0.02x + 0.13

R = 0.84

0.1

absorbancia 420 nm 0.08

0.06
0.04
0.02

tiempo en minutos (m)

Grafica 6: absorbancia Vs tiempo del tubo 5 (3.0 ml de L-metildopa).

absorbancia vs tiempo tubo 6

0.14
0.12
0.1
0.08

absorbancia 420 nm 0.06

f(x) = - 0x + 0.08
R = 0.05

0.04
0.02
0

tiempo en minutos (m)

c) [S] = Dopa 0.03 M inicial:

1: [S] = 0.03M*0.5ml/5ml totales = 0.03 M Para el tubo 1
2: [S] = 0.03M*1.0ml/5ml totales = 0.006 M Para el tubo 2
3: [S] = 0.03M*1.5ml/5.0 ml totales = 0.009 M Para el tubo 3
4: [S] = 0.03M*2.0ml/5ml totales = 0.012 M Para el tubo 4
5: [S] = 0.03M*2.5ml/5ml totales = 0.015 M Para el tubo 5

6: [S] = 0.03M*3.0ml/5ml totales = 0.018 M Para el tubo 6

D)
Tubo

[S]f

1
2
3
4
5
6

0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018

M
M
M
M
M
M

Vi

1/[S]

1/Vi

0,0066
0,0097
-0,0105
0,0007
-0,0223
-0,0024

333.33
166.66
111.11
83.3
66.66
55.55

151.15
103.09
0.989
1428
0,977
0.997

ANALISIS DE RESULTADOS
los resultados obtenidos no fueron los esperados, sin embargo algunas graficas
muestran una buena tendencia con respecto a la inhibicin como es el caso de
las graficas del tubo 1,2 y 4. En cuanto a las otras graficas no representan una
reaccin coherente a la inhibicin puesto que en ellas se nota como se daba la
reaccin enzimtica en momentos intermitentes y al mismo tiempo se observa
linealidad como si tambin estuviera actuando el inhibidor en fracciones de
tiempo pequeas.
Estos resultados tan diferentes pudieron ser ocasionados por mal manejo de
los materiales utilizados en el laboratorio a la hora de realizar el experimento
en especial a la hora de hacer las disoluciones de los reactivos y tambin
cuando se tomaron las respectivas lecturas de absorbancia en los equipos.

E) Grafica v1 vs sa

v1 vs (s)
0.02
0.01
0
0

v1

-0.01

-0.01
-0.02
-0.02
-0.03

(s)concentracin

Grafica 1/v1 vs 1/(s)

Lineweaver-Burke
1600
1400
1200
1000

1/v1

800
600
400
200
0

1/(s)concentracin

Al analizar la grfica obtenida despus de la linealizacin de la ecuacin de

Michaelis-Menten, (grafica de Lineweaver-Burke), no se evidencia lo
esperado, en principio queramos obtener una grfica que se aproximara a
un modelo de ecuacin de la lnea recta (para ello se linealiza) con el fin de
obtener la Vmax y la Km; en nuestro caso no obtuvimos dicho modelo; esto
podra deberse a errores sistemticos, donde se incluyen errores

experimentales, de procedimiento o calidad de reactivos los cuales seran

necesarios precisar.
Otro posible factor de error que ha nuestro criterio podra ser el ms
acertado radica que desde la realizacin de las curvas de progreso se
garantizaba la no linealidad; esto se puede evidenciar al observar las
grficas, la cual es discontinua en el tubo 3 y en otros casos como las del
tubo 5 y 6 donde tienen pendientes negativas. Apenas se inicia la reaccin;
puesto que los datos ni siquiera precisan un momento en el cual se alcanza
un estado de equilibrio donde se alcance la mxima concentracin de
producto; es decir un valor casi fijo de este. Para asegurar esta apreciacin
se debera iniciar el proceso y tomar lecturas hasta un tiempo superior a los
5 min hasta que los valores obtenidos ya no sufran cambios significativos
de tal forma que se pueda obtener una curva de progreso total y de esta
manera poder determinar con una tangente a ella los parmetros de V o
requeridos (como sugerencia a la prctica; aumentar el intervalo de
tiempo en las lecturas o revisar concentraciones de reactivos)
Clculos

103,09151.15

M= 166.66333.33

=0.288

333.33- (( 0.288)x151.15)=1/vmax =
Vmax=1/289.8 vmax=0,0034
Km/vmax=m Km=vmax x m km=0,00100
A altas concentraciones del sustrato, la velocidad de la reaccin era independiente de su
concentracin, siguiendo una cintica de orden 0: Vi = VM. Ello indica que en condiciones
de altas concentracin del sustrato, la enzima se halla saturada por ste, y la reaccin ya
ha llegado a su mxima velocidad (VM).
Al adicionar ms sustrato, la velocidad no aumenta porque no hay enzima disponible para
ello.

F) Se obtuvo con los resultado a simple vista , que el inhibidor era tipo
reversible , Al realizar los clculos del km y vmax se obtuvieron resultados
muy parecidos, vmax=0.0034 en ambos casos y en km m km=0,00100 y
0,001036 valores bastante cercanos , lo que indica que se utiliz un
Inhibidor reversible competitivo .Este tipo de inhibidores tienen la
caracterstica de ser qumicamente muy parecidos al sustrato, de tal
manera que pueden ocupar el sitio activo de la enzima, pero sta no los
transforma, mientras el inhibidor est dentro del sitio activo el verdadero
sustrato no puede entrar y por lo tanto no es posible que se forme ES y no

hay formacin de producto. Si usamos el ejemplo de la cerradura y la llave,

podemos pensar en una llave que entra en la chapa pero no puede abrirla
porque no es la correcta. Sin embargo, mientras la llave inadecuada est
dentro de la chapa, no es posible que entre la llave correcta.

G) KI

0,00100=0,001036 (1+0.2 ml/kI)

0,00100=0,001036 +0.00207
0.00036=0.00207/ki
Ki =0,173

CONCLUSIONES
El cianuro es un inhibidor enzimtico no especfico (tirosinasa, succinato deshidrogenasa,
superxido dismutasa, anhidrasa carbnica, citocromo oxidasa, etc.) inhibiendo su accin y de esta
manera bloqueando la produccin de ATP e induciendo hipoxia celular.
En el experimento realizado en el laboratorio se pudo notar como las cantidades de cianuro
interrumpan la reaccin en algunas de las lecturas de las absorbancias, aunque no fueron lecturas
precisas. Por ejemplo en la grafica 8 se nota como el NaCN bloqueo la reaccin enzima-sustrato
cuando se une aL sitio alostrico de la enzima, sin embargo a medida que se agrega ms sustrato,
este desplaza al inhibidor y la reaccin puede continuar.
se pudo notar que si hubo una diferencia con las lecturas de tirosinasa II hechas en el laboratorio
anterior por que la reaccin enzimtica ocurrio hasta que se saturo el sitio activo y las graficas
fueron coherentes; mientras que en tirosinasa III las graficas no muestran una buena informacin.