Laboratory Exercise

A Laboratory Exercise For Visible Gel

Filtration Chromatography Using
Fluorescent Proteins

Wenqiang Zhang
Yibin Cao
Lishan Xu
Jufang Gong
Meihao Sun*

From the Department of Biology, College of Chemistry and Life

Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua, China, 321004

Abstract
Cromatografa de filtracin en gel (GFC) separa las molculas segn su tamao y es uno de los mtodos ms utilizados para la
purificacin de protenas. Aqu, protena fluorescente roja (RFP), protena verde fluorescente (GFP), protena amarilla
fluorescente (YFP), protena fluorescente cian (CFP), y / o sus protenas de fusin se prokaryotically expresso, purificada, y se
utilizan en un ejercicio de laboratorio para intuitivamente Manda GFC. Las diferentes bandas, correspondiente a solicitud de
propuesta, RFP, CFP (RC),
YFP-RFP-YFP (yry), y piruvato quinasa II-GFP (PKG) Se bien separados en una columna Superdex 200 de una muestra de
0,5 ml. El aumento del volumen de la muestra y el cambio de la resina cromatogrfica Sephadex G-100 result en un menor
separacin resolucin. Los estudiantes disfrutaron de Identificacin de combinaciones de protenas de colores y encontraron
este ejercicio til para entender los factores Que afecta la resolucin de GFC. VC 2014 por la Unin Internacional de
Bioqumica y Biologa Molecular, 43 (1): 33-38, 2015.

Keywords: gel filtration chromatography;

laboratory exercise

fluorescent protein;

Introduction
Como una de las macromolculas biolgicas ms
abundantes, las protenas se producen en todos los
organismos de una gran diversidad de tamaos y
funciones. Las protenas pueden ser separadas en base
a su tamao relativo, la carga y / o afinidad con
resinas usadas en cromatografa de columna.
cromatografa de filtracin en gel (GFC), tambin
conocida como cromatografa de exclusin por tamao,
separa las protenas en su estado nativo de acuerdo a
su tamao relativo. medio de filtracin en gel constan
de cuentas en forma precisa con cavidades de un tamao
determinado. La probabilidad de una protena
difundirse en Estas cavidades aumenta con la
disminucin del tamao de la protena, tales Que
protenas ms pequeas son retenidas ms largo [1].
Por lo tanto, la mezcla de protenas se eluyen de la
columna en orden decreciente de tamao. La resolucin
de GFC depende de muchos factores, incluyendo la
naturaleza del medio de separacin (tamao de
partcula, la uniformidad, partido de tamao entre las
cavidades, y el analito), factores de columna (altura
del lecho
,

*Address for correspondence to: The Department of Biology, College

of Chemistry and Life Sciences, Zhejiang Normal University, Jinhua,
China 321004. E-mail: mhsun@zjnu.cn
Received 30 April 2014; Revised 11 September 2014; Accepted 21
October 2014
DOI 10.1002/bmb.20833
Published online 17 November 2014 in Wiley Online Library
(wileyonlinelibrary.com)

Biochemistry and Molecular Biology Education

calidad relleno de la columna) y factores

experimentales varios, tales como velocidad de flujo,
volumen de la muestra, y la viscosidad eluyente.
Muchas protenas fluorescentes, como el verde (GFP),
amarilla (YFP), cian (CFP), y las protenas
fluorescentes rojas (RFP), son visibles a simple vista
y son de colores brillantes en solucin [2-6]. Varias
de estas protenas se han utilizado en las clases de
enseanza en la expresin y purificacin de protenas
[7-9] y las relaciones estructura-funcin [10, 11]. Se
han utilizado tambin para demostrar diferentes de
purificacin de protenas tcnicas [7, 9], incluyendo
GFC con RFP marcada con polihistidina y etiquetada con
MBP EGFP [9]. A fin de facilitar el uso de protenas
fluorescentes de colores y visiblemente en la
educacin, BioTM
Rad (http://www.bio-rad.com) suministra la bacteriana
PGLO
kit de transformacin (166-0003EDU) para expresar GFP
en E. coli y el kit de cromatografa de GFP (1660005EDU) para purificar GFP en columnas de
cromatografa hidrfobos. En el ejercicio actual,
varias protenas fluorescentes se fusionaron para
producir protenas de colores Que se utilizaron para
evaluar los efectos del volumen de la muestra y el
dimetro de la cavidad de resina sobre la resolucin
de GFC. las protenas de fusin marcada con
polihistidina de RFP (26,9 kD), RFP, CFP (RC, 54,9
kD), YFP-RFP-YFP (yry, 84,3 kD) y piruvato quinasa IIGFP (PKG, 84 kDa monmero, dmero
168,0 kD) Se expresso, purificado, y se separ con
xito en una columna Superdex 200 (globular intervalo
de fraccionamiento de protenas de 10 a 600 kD). Los
estudiantes encontraron resolucin GFC Que se podra
reducir drsticamente la muestra El aumento de volumen
o de conmutacin de la resina de cromatografa de
Sephadex G-100.

33

Biochemistry and
Molecular Biology Education

TABLE 1

Primers used for DNA fragment amplification

Primer
name

(5-3) Nucleotide sequence

RFPf

GGATCCATGGACAACACCGAGGACGTCATCAAGGAG (BamH I)

RFPr

GGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT (EcoR I)

YFPf

GGGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG (Nde I)

YFPrBamHI

CGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCAT (BamH I)

YFPrEcoRI

GAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGATCCC (EcoR I)

GFP-F

CGGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG (BamH I)

GFP-R

GGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCATG (EcoR I)

PKf

GGGAATTCCATATGATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAAC (Nde I)

PKr

CGCGGATCCCTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAG (BamH I)

RYir

CGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATCTGGGAGCCGGAGTGGCGGG

RYif

CCCGCCACTCCGGCTCCCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG

Sequence
RFP

YFP

GFP

PK

YRY

Restriction sites are underlined.

Materials and Methods

Materials and Reagents
Prime Star polimerasa, endonucleasas de
restriccin, mezcla de dNTP, marcadores de ADN,
y ADN ligasa de T4 se adquirieron de Takara
(Japn). Lisozima, TDT, IPTG, PMSF y pepstatina
A fueron adquiridos de AMRESCO (EE.UU.). Ni-NTA
Su Enlazar Superflow Resin era de Novagen
(Alemania). Superdex 200 y Sephadex G-100 se
obtuvieron resinas de GE Healthcare (EE.UU.).
La ampicilina se adquiri de Oxford LTD
(Hampshire, Inglaterra). Todos los dems
productos qumicos de grado analtico y se
fueron obtenidos de las empresas nacionales.
pDsRed-N1, pEGFP-Cl, pEYFP-N1, y pETCFP-Cl se
adquirieron de RYgene (www.yrbio.com, Changsha,
China). simple vector pMD18-T se adquiri de
Takara (Shiga, Japn). vectores de expresin
procaritica res pHIS9 (un derivado del vector
pGEX-6P-1, en el que la proteasa GST y
PreScission regiones codificantes fueron
sustituidos por la secuencia codificante de
nueve residuos de histidina), pGEX-PK (vector de
expresin pGEX-6P-1 portadoras piruvato quinasa
II de Escherichia coli) de E. coli DH5a, y BL21
(DE3) se obtuvieron de la coleccin de
laboratorio.
Construccin de pRFP para la expresin de RFP
Se utiliz PCR para amplificar secuencias de
nucletidos. La mezcla tpica de PCR consisti
en 2 tampn lL PCR, dNTP solucin la IL 2 (2,5
mM), 1 lL de solucin que contiene el cebadores
directo e inverso (100 ng / lL) 1 IL solucin de
ADN plantilla (100 ng / lL) y 0,2 lL ADN
polimerasa (1,0 unidades). la

Las condiciones de PCR Compuesta de arranque en

caliente de 5 min a 95 C, seguido por 30 ciclos de
desnaturalizacin (30 sa 95 C), recocido ing (30 s a
58 C), y ampliacin (60 s a 72C). RFP se amplific
utilizando cebadores RFPf y RFPr con pDsRed-N1 a la
plantilla. Despus de la digestin posterior con las
enzimas de restriccin co- rrespondientes (BamH I y
EcoR I), el fragmento de RFP se purific por
cromatografa en gel y se insert en el vector de
expresin para producir pHIS9 pRFP. secuencias
clonadas fueron validados mediante la secuenciacin
(Sangon Biotech, Shanghai, China). Los cebadores y los
genes amplificados se enumeran en la Tabla 1.
Construccin de pRC para la expresin de Fusin
protena RC
La unin de PP y PPC se realiz mediante PCR de
solapamiento. Las secuencias complementarias a PP y
PPC estn situados en los extremos de los cebadores y
RYir RYif, respectivamente. Dos fragmentos de ADN RFPI
(derivan usando cebadores RFPf y RYir) y CFPI (derivan
usando cebadores RYif y YFPrEcoRI) se amplificaron a
partir de plantillas pETCFP-Cl-N1 y pDsRed,
respectivamente. RC se amplific adicionalmente
utilizando los cebadores RFPf y YFPrEcoRI con
plantillas mixtos de RFPI (50 ng) y CFPI (50 ng), y el
producto se inserta en pHIS9 Luego, para producir el
vector de expresin pRC despus de la digestin con
BamH I y EcoR I.
Construccin de Pyry para la expresin de Fusin
yry de protenas
YFP se amplific utilizando cebadores YFPf y YFPrBamHI
junto con pEYFP-N1 a la plantilla. siguiente

TABLE 2

Timetable for a practical course on GFC

Days
1

Methods
Introduction
Construction of plasmids
Competent cell transformation (E.coli DH5a)

Individual colony selection and growth in liquid media

Purification of plasmid DNA
Competent cell transformation (E.coli BL21)

Individual colony selection and growth in liquid media

IPTG induction

Protein purification by Ni resin

SDS-PAGE
Concentration measurement of the proteins

Gel filtration chromatography

la digestin con Nde I y BamH I, YFP se lig en pHIS9

para producir pYFP vector. Despus de la amplificacin
por PCR solapadas como se describe anteriormente, RY
(RFP-YFP) se digiri con BamH I y EcoR I y se lig en
pYFP para crear el vector de expresin Pyry.
Construccin de pPKG para la expresin de Fusin
La protena PKG
Piruvato quinasa II (PK) se amplific usando cebadores
PKF y PKR y la plantilla pGEX-PK. Despus de la doble
digestin con Nde I y BamH I, PK se insert en pHIS9
para producir pPK. GFP se amplific usando los
cebadores GFPf y GFPr y la plantilla de pEGFP-Cl.
Despus de la digestin con BamH I y EcoR I, GFP se
insert en pPK para producir pPKG.

carg en la columna de afinidad Ni-NTA (10 30 3 mm)

pre equilibrada con tampn A (50 mM KPO 4, 0,4 M KCl
pH
8.0). La columna se lava despus con cama de cinco
veces en volumen
ume de tampn B (50 mM KPO 4, 0,4 M KCl, 75 mM imidaz
ole, pH 7.3) y se eluy con tampn C (50 mM KPO 4, 0,4 M
KCl, 5 mM b-ME y 250 mM imidazol, pH 7,3). Despus de
la dilisis utilizando tampn D (KCl 50 mM, DTT 1,5
mM, 5% de glicerol y Hepes 50 mM, pH 8,0), las
protenas finales se analizaron por SDS-PAGE y se
almacenan a 280 C. concentraciones de protena se
determin a travs de el mtodo de Bradford [13] con
albmina de suero bovino (BSA) al estndar.
Filtracin en gel La cromatografa
Cualquiera de 500 ml o 2 ml de la mezcla de protenas
que contiene RFP, RC, YRF, y PKG (0,3-0,5 mg cada una)
se cargaron en pre-equilibrada (KCl 50 mM, Hepes 50
mM, pH 8,0) Superdex
200 (S200) o Sephadex G-100 (PP100) columnas (1 3
30 cm) con el primer AKTA (GE Ciencias de la Salud).
GFC separacin racin se realiz a una velocidad de

flujo de 0,4 mL / min.

Results and Discussion

Laboratorio de Diseo Ejercicio

Este ejercicio de laboratorio fue diseado para un
curso de Bioqumica Avanzada Consta de los estudiantes
que han completado Las extremidades anteriores ormente
Bioqumica, Biologa Molecular y cursos de ingeniera
gentica. Despus de una charla inicial outlin- cin
de los objetivos de este ejercicio, el horario (Tabla
2) fue distribuy a los estudiantes. Los estudiantes
trabajaron en grupos de dos para recoger un gen para
clonar, expresar la protena correspondiente, y puesta
en marcha un experimento GFC mediante el intercambio
de las protenas que se purifica.

Expresin y Purificacin de Protenas

Altamente protenas fluorescentes estables fueron
seleccionados para este ejercicio de laboratorio.
protenas y combinaciones de los mismos fluorescentes
se usaron para obtener diferentes colores protenas
informales. genes de protenas fluorescentes se
clonaron y se unen en vectores de expresin de los
estudiantes (Fig. 1). Teniendo en cuenta los
requisitos previos de Biologa Molecular y Gentica
Expresin y Purificacin de Protenas
Engineer- ING, y, en particular, los cursos de
expresin y purificacin de protenas se realizaron
como se describe anteriormente [12]. En pocas palabras, laboratorio correspondientes
los vectores de expresin se transformaron en E. coli
BL21 (DE3). La cepa transformada se cultiv en medio LB
suplementado con
0,1 mg / ml de ampicilina durante la noche a 37 C. Una
vez que la OD600 Alcanzado 0,6-0,8, los cultivos se
enfriaron a 16 C y se aadi isopropil-bD-1thiogalactopy-ranoside (IPTG) a una concentracin final
de 0,5 mM para inducir sin de protenas expresin
durante 16 h. Las clulas se recogieron por
centrifugacin (5000
3 g) a 4 C durante 10 min. Las clulas se
resuspendieron en tampn de lisis (50 mM KPO 4, 0,4 M
KCl, 290 lM PMSF, 1,5 lM estatina PEP-A, 0,1 mg / ml de
lisozima, pH 8,0) y se incubaron a 4 C durante 1 h. Las
clulas se rompieron an ms mediante ultrasonidos (450
W,
Illustration of the gene structures for RFP, RC,

10 min a 0 C) y se removieron los residuos

por centrifugacin
cin (18.000 g) a 4 C durante 40 minutos.
El sobrenadante se

Zhang et al.

FIG 1

YRY, and PKG and their corresponding molecular

weights. H represents the polyhistidines.

35

Biochemistry and
Molecular Biology Education

FIG 3

FIG 2

la purificacin de protenas tpicas y las

protenas fluorescentes purificados. (A)
Expresin y purificacin de RFP; Carril M:
marcador de protena molecular (kD), Lane 1:
antes de la induccin IPTG, carril 2:
despus de la induccin IPTG, Lane 3: el
sobrenadante de lisado celular, carril 4: el
flujo a travs cargado a la Ni21 co- lumna,
Lane 5: lavar la muestra de la columna de
Ni21, carril 6: la protena diana final RFP.
(B) las protenas fluorescentes purificadas.
De izquierda a derecha, las protenas son
RFP, RC, yry, y PKG.

Fueron los estudiantes que ya estn bien

versados y experimentados en
clonacin de genes y la construccin del vector.
protenas fluorescentes marcada con
polihistidina sobreexpresa prokaryotically
fueron entonces y se purifica usando una columna
de afinidad Ni-NTA. Los resultados tpicos se
muestran en la Fig. 2a. RFP, RC, yry, PKG y los
distintos colores de la pantalla (Fig. 2b). La
mayora de los estudiantes se sorprendieron por
las nuevas protenas de colores Que el resultado
de las diversas combinaciones. PKII se encontr
a existir como un dmero basado en filtracin en
gel (H. Li y M. Sun, datos no publicados). Por
lo tanto, la PKG (monmero de 84 kDa) sera la
protena 168- kD en su estado nativo.

0.4 mL/min. A typical GFC column loaded with the S200a resin is shown in Fig. 3a.
The four proteins were well sepa- rated on the column with RFP at the top, followed by
RC, YRY, and PKG. The UV280 chromatogram in Fig. 3b is con- sistent with the visibly
colored bands on the column. One minor peak corresponding to
22 mL was most
likely due to protein contaminants. PKG was the first to elute, sug- gesting the
oligomerization of PKII. The GFC column con- taining the S200b resin is shown in
Fig. 4. The four pro- teins were not separated as well, and the chromatographic
peaks overlapped significantly, demonstrating that increas-

tipo de resina y el volumen de muestra en la

resolucin de separacin ing the sample volume from 0.5 to 2
mL decreased the

Filtracin en gel La cromatografa

Despus de la purificacin, cada grupo determin la
concentracin de su solucin de protenas y comparti estas
fechas, con los otros grupos para producir un conjunto de
muestras de cuatro protenas fluorescentes. Tres juegos
fueron designados para evaluar los efectos de

de GFC. Uno septiembre se utiliz con una columna

Superdex 200 con un volumen de muestra de 0,5 ml
(S200a), el segundo septiembre se utiliz con una
columna Superdex 200 con un volumen de muestra 2 ml
(S200B), y el tercero de septiembre fue usado con un
Sephadex G-100 con un volumen de muestra de 0,5 ml
(SG100). Los caudales se

(a) An image of a typical Superdex 200 column

during protein separation using a sample volume
of 0.5 mL. From top to bottom, the four fluorescent bands are RFP, RC, YRY, and PKG. (b) The
corresponding OD280 chromatogram contained
four major peaks representing PKG, YRY, RC,
and RFP (from left to right).

(a) An image of a typical Superdex 200 column

FIG 4

Durante la separacin de protenas

utilizando un volumen de muestra de 2
ml. De arriba a abajo, las cuatro bandas
fluorescentes son RFP, RC, yry, y PKG.
(B) La correccin pondiente DO280
cromatograma contena cuatro picos
principales que representan PKG, yry,
RC, y RFP (de izquierda a derecha).

FIG 5

(A) Una imagen de una columna tpica

Sephadex G-100 Durante la separacin de
protenas utilizando un volumen de
muestra de 0,5 mL. (B) El
correspondiente DO280 chromat- OGRAMA
contiene slo un nico pico
.

resolucin. Realizacin de la separacin usando

una columna de Sephadex G100 columna dio lugar a una resolucin an ms
pobres (Fig. 5). Las cuatro protenas no estaban
separados de forma visible (Fig. 5a), y slo un
pico principal se observ en el cromatograma
(Fig.
5b). Esto mostr Que sea la resina no era
adecuado para estas protenas particulares o Que
la columna estaba lleno mal.

DISCUSIN
Este ejercicio de laboratorio se llev a
cabo en el Colegio de Qumica y Ciencias de
la Vida, Universidad Normal de Zhejiang.
Los estudiantes realiz la clonacin de
genes, expresin de la protena, y la
separacin de GFC. Despus del ejercicio,
facilitan a los estudiantes con preguntas
para llevar a casa para reforzar los
conceptos fundamentales y ampliar sus
conocimientos sobre las protenas en
general:
1. Las cuatro protenas fluorescentes en tndem
fusionadas tenan pesos moleculares nativos
alquiler de rato de 26,9, 54,9, 84,3 y
168 kD. Cul fue el orden de las protenas que
eluyen de la columna de filtracin en gel? Por
qu?
2. Las protenas de fluorescencia ms visible
exhibicin? Explicar por qu las protenas
elegidas son fluorescentes.
3. Si PKII Estaban monmero en su estado nativo,
cmo se vera afectado el orden de elucin?
Por qu?
4. Puede cualquier tipo de resina de
cromatografa de filtracin en gel pueden
utilizar en este ejercicio de laboratorio? Por
qu?

Despus de clase evaluacin consisti en

preguntas como: "Qu piensa usted acerca de
este ejercicio?"; "Qu tan til fue que en la
consecucin de los objetivos del curso?"; "Hay
algunas mejoras que podran introducirse en el
experimento?" Ms del 80% de los estudiantes ha
dejado su opinin positiva en este ejercicio.
Algunos de sus comentarios se enumeran a
continuacin:
"Las protenas fluorescentes de colores son
preciosos. Ellos son realmente impresionantes.
Nunca olvidar este experimento ".
"Esta demostracin definitivamente me ayud a
recordar Que Cuando se utiliza la cromatografa
de filtracin en gel, los grandes salen primero,
no como en el tamiz, donde se conservan los
grandes."
Un estudiante tambin dej un mensaje relativo a
la limitacin en el experimento: "Cuando se
utiliza la cromatografa de filtracin en gel,
las molculas se separan en funcin del peso
molecular AMBOS (tamao) y su forma
tridimensional. Aqu, hemos visto los resultados
cin de separacin basada en el tamao, pero no
a dar forma. Hay alguna manera de mostrar los
efectos del tamao y forma de un ejercicio? "
Esta es una mejora que podemos hacer en el
futuro. Tambin podemos llevar a cabo
experimentos adicionales para hacer frente a
algunos de la cola otras variables afectan
resolucin GFC y proporcionar opciones
adicionales para los estudiantes en la
construccin de genes de fusin. Todas las
construcciones realizadas en este ejercicio de
laboratorio estn disponibles bajo peticin.
Errores comunes y cuestiones de seguridad
Varios errores comunes y problemas de seguridad
se enumeran a continuacin:

1. El bromuro de etidio, un potente

mutgeno, es un componente del gel de

agarosa utilizado en la electroforesis
Durante plasma construccin mediados. Que
no deberia ser usado en un rea designada.
Los guantes no debera ser usados para
evitar el contacto directo con la piel. Los
materiales de desecho no debera ser
desechados como residuos especiales a
travs del Programa de Residuos Peligrosos.
2. La azida sdica se utiliza a veces para
evitar el crecimiento bacteriano en
columnas de filtracin en gel. Los guantes
no debera ser usado mientras se trabaja
azida de sodio. shouldnt relacionadas con
la basura se inactiv con cido nitroso
antes de su eliminacin.
3. La impureza de las protenas marcada con
polihistidina puede com- plicadas
resultados. La elucin usando un gradiente
lineal de 10
imidazol 250 mM resolvera este problema.
4. La calidad de relleno de la columna es
esencial para la separacin de protenas
efi- ciente. Resinas no debera ser
desgasificados antes de su envasado. Si la
columna se seca necesita ser embalados de
nuevo segn las instrucciones del
fabricante.

Acknowledgements
This work was supported by the High Education and
Teaching Reformation Project from the Bureau of Education of Zhejiang Province (kg2013080).

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Visible Gel Filtration Chromatography Using Fluorescent Proteins