LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

I. JUDUL PERCOBAAN : Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
II.HARI, TANGGAL PERCOBAAN :
Mulai
: Senin, 17 Oktober 2016, pukul 13.00 WIB
Selesai
III.
IV.

: Senin, 17 Oktober 2016, pukul 15.40 WIB

TUJUAN PERCOBAAN :
Menentukan kadar protein yang ada pada sampel dengan menggunakan cara Biuret.
DASAR TEORI
Protein berasal dari kata protos atau proteos yang berarti pertama atau utama.Protein
merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karea
itu, sel merupakan pembentuk tubuh, maka protein yan terdapat dalam makanan
berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh (Poedjiadi dan
Supriyanti, 2006).
Protein merupakan molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000
sampai jutaan. Dengan cara hidrolisis oleh asam atau oleh enzim, protein akan
menghasilkan asam-asam amino. Ada 20 jenias asam amino yang terdapat dalam
molekul protein. Asam-asam amino ini terikat satu sama lain dengan ikatan peptida.
Komposisi rata-rata unsur kimia yang terdapat dalam molekul protein ialah sebagai
berikut : karbon 50%, hidrogen 7%, oksigen 23%, nitrogen 16%, belerang 0-3%, dan
fosfor 0-3%. Dengan berpedoman pada kadar nitrogen sebesar 16%, dapat dilakukan
penentuan kandungan protein dalam suatu bahan makanan. Unsur nitrogen ditentukan
secara kuatitatif, misalnya dengan cara Kjedahl, yaitu dengan cara destruksi dengan asam
pekat.berat protein yang ditetukan adalah 6,25 kali berat unsur nitrogen (Poedjiadi dan
Supriyanti, 2006).
Ikatan yang terjadi antara dua dua asam amino tersebu dinamakan ikata peptida.
Jadi, pada satu molekul dipeptida terdapat satu ikatan peptida. Suatu senyawa yang
terdiri atas tiga buah asam amino yang berikatan disebut tripeptida. Pada satu molekul
tripeptida ini terdapat dua buah ikatan peptida. Ikatan peptida yaitu :

Melalui suatu proses tertetu, sejumlah besar molekul asam amino dapat membentuk
suatu senyawa yang memiliki banyak ikatan peptida. Molekul senyawa ini merupakan
suatu molekul besar atau makromolekul yang terdiri atas banyak molekul asam amino

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
dan karenanya disebut polipeptida. Protein adalah salah satu makromolekul yang terdiri
atas sejumlah besar asam amin (Poedjiadi dan Supriyanti, 2006).
Suatu peptida yang mempunyai dua ikatan peptida ata lebih dapat bereaksi dengan
ion Cu++ dalam suasana basa dan membentuk suatu senyawa kompleks yang berwarna
biru ungu. Reaksi ini dikenal dengan nama reaksi biuret (Poedjiadi dan Supriyanti,
2006).
Protein banyak terkandung di dalam makanan yang sering dikonsumsi oleh
manusia. Seperti pada tempe, tahu, ikan dan lain sebagainya. Secara umum, sumber dari
protein adalah dari sumber nabati dan hewani. Protein sangat penting bagi kehidupan
organisme pada umumnya, karena ia berfungsi untuk memperbaiki sel-sel tubuh yang
rusak dan suplai nutrisi yang dibutuhkan tubuh. Maka, penting bagi kita untuk
mengetahui tentang protein dan hal-hal yang berkaitan dengannya.
Struktur protein tidak stabil karena mudah mengalami denaturasi yaitu keadaan
dimana protein terurai menjadi struktur primernya, baik reversibel maupun ireversibel.
Faktor-faktor yang menyebabkan denaturasi adalah pH, panas, pelarut, kekuatan ion,
terlarut, dan radiasi. Protein ada yang reaktif karena asam amino penyusunnya
mengandung gugus fungsi yang reaktif, seperti SH, -OH, NH2, dan COOH. Kelarutan
protein di dalam suatu cairan, sesungguhnya sangat dipengaruhi oleh beberapa faktor
antara lain, pH, suhu, kekuatan ionik dan konstanta dielektrik pelarutnya. Protein seperti
asam amino bebas memiliki titik isoelektrik yang berbeda-beda. Titik Isoelektrik (TI)
adalah daerah pH tertentu dimana protein tidak mempunyai selisih muatan atau jumlah
muatan positif dan negatifnya sama, sehingga tidak bergerak ketika diletakkan dalam
medan listrik. Pada pH isoelektrik (pI), suatu protein sangat mudah diendapkan karena
pada saat itu muatan listriknya nol.
Protein dapat juga dibagi menjadi dua golongan utama berdasarkan bentuk dan
sifat-sifat fisik tertentu yaitu protein globular dan protein serabut. Protein serabut
bersifat tidal larut didalam air, merupakan molekul serabut panjang, dengan rantai
polipeptida yang menunjang pada satu sumbu dan tidak berlipat. Sedangkan protein yang
lain adalah Protein Globular, mempunyai rantai-rantai popipeptida berlipat rapat-rapat
menjadi bentuk globular atau bulat padat. Protein ini biasanya larut dalam airyang segera
berdifusi, hampir semua mempunyai fungsi gerak dan dinamik. Hampir semua enzim
merupakan protein globular.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Kebanyakan protein mengabsorbsi sinar ultraviolet maksimumpada 280 nm.
Penentuan protein berdasarkan absorbansi sinar UV adalah cepat, mudah, dan tidak
merusak bahan. Untuk keperluan perhitungan juga diperlukan kurva standar yang
melukiskan hubungan antara konsentrasi protein dengan optical density. Keuntungan
dari spekrofotometer UV-tampak ini adalah dilengkapi dengan alat perekam yang
menyediakan plot absorban vs panjang gelombang. Agar plot ini akurat, penempatan
radiasi suatu sampel, harus sedekat mungkin dengan monokromatik. Selain itu,
spektrofotometer menggunakan prisma yang memiliki pita absorbansi efektif dari satu
nanometer atau kurang (Dangeubun dan Putnarubun, 2009).
Dalam percobaan ini kita menguji protein secara biuret yaitu yang berdasarkan
serapan cahaya oleh senyawa kompleks yang berwarna ungu. Di mana kompleks ini
terbentuk dari Cu2+ dan gugus CO dan NH pada protein. Untuk penentuan kadar
protein dengan uji biuret ini, digunakan spektrofotometer UV. Adapun penggunaannya
yaitu dengan mengukur absorban senyawa pada panjang gelombang yang rangenya sama
dengan panjang gelombang UV, sedangkan range yang digunakan pada percobaan ini
adalah 540 nm.
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus
kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis
elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-kromofor organik
seperto karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan
sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut
yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas
nseperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan
pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang yang lebih besar dan disertai
dengan peningkatan intensitas
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan.
Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya
discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar
dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran
absorbansi dalam spektrofotometer.

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik
dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel).
Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh
detektor yang kemudian menyampaikan ke layar pembaca. Larutan yang akan diamati
melalui spektrofotometer harus memiliki warna tertentu. Hal ini dilakukan supaya zat di
dalam larutan lebih mudah menyerap energi cahaya yang diberikan. Secara kuantitatif,
besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik dengan jumlah zat di dalam larutan
tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi dapat diserap akan
menunjukkan jenis zatnya (Cahyanto 2008).
Pada percobaan ini digunakan kacang tunggak sebagai sampel untuk dihitung kadar
protein yang ada didalamnya. Kacang tunggak (Vigna unguiculata) merupakan tanaman
yang banyak dibudidayakan oleh masyarakat. Tanaman kacang tunggak biasanya tumbuh
di dataran rendah. Tanaman ini tahan terhadap kekeringan, sehingga cocok
dikembangkan pada lahan kering dibandingkan dengan jenis kacang-kacangan lainnya
(Rukmana dan Oesman, 2000). Di Indonesia produksi kacang tunggak cukup tinggi yaitu
mencapai 1,5-2 ton/ha tergantung varietas, lokasi, musim tanam dan budidaya yang
diterapkan (Sayekti et al., 2012). Kacang tunggak mengandung protein 22,9%,
karbohidrat 61,6%, namun kandungan lemaknya rendah 1,4%, dengan kadar air 11%.
(Anonim, 2012a).
Analisis protein umumnya bertujuan untuk mengukur kadar protein dalam
bahan makanan. Analisis protein dapat dilakukan antara lain dengan metode Kjeldahl,
Lowry, Biuret, Bradford, turbidimetri dan titrasi formol (Sudarmadji dkk, 2007).
Metode Kjeldahl
Metode Kjeldahl dilakukan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam
bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah
kadar nitrogennya (Winarno, 1986). Prinsip analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut:
bahan organik di didihkan dengan asam sulfat pekat sehingga unsur-unsur dapat
terurai. Atom karbon menjadi CO2 dan nitrogen menjadi amonium sulfat. Larutan
tersebut kemudian dibuat alkalis dengan menambahkan NaOH berle bihan sehingga
ion amonium bebas menjadi amonia bebas. Amonia yang dipisahkan dengan cara

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
distilasi

kemudian

dijerat

dengan

larutan

asam

borat.

Garam

borat

yang

terbentukdititrasi dengan HCl (Sudarmadji, 1996).

Dari hasil titrasi dapat dihitung % N. Hasil % N tersebut dapat digunakan
untuk memperkirakan kadar protein kasarnya. Umumnya campuran protein murni
terdiri dari 16% nitrogen. Apabila jumlah N dalam bahan telah diketahui, maka
jumlah protein dihitung dengan mengalikan jumlah N dengan faktor konversi 6,25
(100/16). Besarnya faktor konversi (tabel 2.3) tergantung pada persentase nitrogen
yang menyusun protein dalam bahan pangan. Pada protein tertentu yang telah
diketahui komposisinya dengan tepat, maka faktor konversi yang lebih tepat lah yang
dipakai.

Kekurangan metode Kjeldahl ialah bahwa purin, purimidin, vitamin-vitamin,asam

amino besar, kreatin, dan kreatinin ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein
(Winarno, 1986).
Metode Bradford
Metode Bradford digunakan untuk menentukan konsentrasi protein dalam
larutan. Prinsip metode ini berdasarkan pembentukan komplek antara Coomassie
Brillant Blue (CBB) dengan larutan protein yang diukur pada pa njang gelombang 595
nm (gambar 2.4). Pembentukan komplek disebabkan adanya ikatan antara pewarna
CBB dengan protein melalui interaksi ionik antara gugus asam sulfonat dengan
muatan positif protein yaitu pada gugus amina.
Asam amino bebas, peptida dan protein dengan berat molekul kecil tidak
menghasilkan warna biru dengan reagen ini. Umumnya berat molekul peptida atau
protein harus lebih besar dari 3000 Da untuk menghasilkan warna biru dengan reagen
ini. Banyaknya ligan yang berikatan dengan molekul protein sebanding dengan
muatan positif protein, sehingga jumlah absorbansi sebanding dengan kadar protein
dalam larutan (Pierce, 2005).

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Metode Dumas Termodifikasi

Akhir-akhir ini, teknik instrumen otomastis telah berkembang dengan kemampuan
penentuan kadar protein dalam sampel dengan cepat. Teknik ini berdasarkan metode
yang dikembangkan oleh Dumas lebih dari 1,5 abad yang lalu, dan mulai berkompetisi
dengan metode Kjeldahl sebagai metode standart penentuan kadar protein karena lebih
cepat.
Prinsip Umun
Sampel dengan massa tertentu dipanaskan dalam tangas pada suhu tinggi (sekitar
900oC) dengan adanya oksigen. Cara ini akan melepaskan CO2, H2O dan N2. Gas CO2
dan H2O dipisahkan dengan melewatkan gas pada kolom khusus untuk menyerapnya.
Kandungan nitrogen kemudian dihitung dengan melewatkan sisa gas melalui kolom
dengan detektor konduktivitas termal pada ujungnya. Kolom ini akan membantu
memisahkan nitrogen dari sisa CO2 dan H2O. Alat dikalibrasi dengan senyawa analis
yang murni dan telah diketahui jumlah nitrogennya, seperti EDTA (= 9,59 %N). Dengan
demikian sinyal dari detektor dapat dikonversi menjadi kadar nitrogen. Dengan metode
Kjeldahl diperlukan konversi nitrogen dalam sampel menjadi kadar protein, tergantung
susunan asam amino protein.
Keuntungan dan Kerugian
a. Keuntungan :
Jauh lebih cepat dari pada metode Kjeldahl (di bawah 4 menit per pengukuran,

b.

dibandingkan dengan 1-2 jam pada Kjeldahl).

Metode ini tidak menggunakan senyawa kimia atau katalis toksik.
Banyak sampel dapat diukur secara otomatis.
Mudah digunakan.
Kerugian :
Mahal.
Tidak memberikan ukuran protein sesungguhnya, karena tidak semua nitrogen dalam
makanan berasal dari protein.
6

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Protein yang berbeda membutuhkan faktor koreksi yang berbeda karena susunan

asam amino yang berbeda.

Ukuran sampel yang kecil menyulitkan mendapatkan sampel yang representatif.

Metode Lowry
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini
terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode
biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion
Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdatphosphotungstat, menghasilkan heteropoly-molybdenum blue akibat reaksi oksidasi
gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru
intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama
bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode
Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan
sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01
mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya
(Lowry, dkk, 1951).
Beberapa zat yang bisa mengganggu penetapan kadar protein dengan metode
Lowry ini, diantaranya buffer, asam nuklet, gula atau karbohidrat, deterjen, gliserol,
Tricine, EDTA, Tris, senyawa-senyawa kalium, sulfhidril, disulfida, fenolat, asam urat,
guanin, xanthine,

magnesium,

dan

kalsium.

Interferensi

agen-agen

ini

dapat

diminimalkan dengan menghilangkan interferensi tersebut. Oleh karena itu dianjurkan

untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi yang disebabkan
oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan SDS atau
melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein (Lowry dkk 1951).
Metode Lowry-Folin hanya dapat mengukur molekul peptida pendek dan tidak
dapat mengukur molekul peptida panjang. Prinsip kerja metode Lowry adalah reduksi
Cu2+ (reagen Lowry B) menjadi Cu+ oleh tirosin, triptofan, dan sistein yang terdapat
dalam protein. Ion Cu+ bersama dengan fosfotungstat dan fosfomolibdat (reagen Lowry
E) membentuk warna biru, sehingga dapat menyerap cahaya (Lowry dkk 1951).
Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Reaksi yang terlibat
adalah kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam
7

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi
reagen

Folin-Ciocalteu,

kompleks

phosphomolibdat

phosphotungstat

(phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi

oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan
warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru
terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Namun
metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.
Metode Biuret
Untuk menentukan adanya protein atau ikatan peptida termasuk hasil hidrolisis
protein seperti metaprotein, proteosa, polipeptida kecuali asam amino dilakukan uji
biuret. Biuret adalah senyawa dengan dua ikatan peptida yang terbentuk pada pemanasan
dua mulekul urea. Dalam suasana basa, CuSO4 bereaksi dengan senyawa yang
mengandung dua atau lebih ikatan peptida membentuk kompleks berwarna ungu. Reaksi
positif tersebut terjadi dengan adanya perubahan warna menjadi ungu atau merah muda
akibat terjadinya persenyawaan antara cadangan N dari peptida dan O dari air. Warna
yang terjadi dari panjangnya ikatan peptida panjang berwarna ungu, sebaliknya jika
pendek warnanya merah muda. Berikut ini adalah komplek yang akan terbentuk dari
reaksi tersebut.

Metode Turbidimetri
Kekeruhan akan terbentuk dalam larutan yang mengandung protein apabila
ditambahkan bahan pengendap protein misalnya Tri Chloro Acetic (TCA), Kalium Ferri
Cianida [K4Fe(CN)6] atau asam sulfosalisilat. Tingkat kekeruhan diukur dengan alat
Turbudimeter. Cara ini hanya dipakai untuk bahan protein yang berupa larutan atau
hasilnya, tetapi biasanya hasilnya kurang tepat (Sudarmadji, 1989).

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Molekul protein yang umumnya laruta dapat dibuat mengendap dengan
penambahan senyawa kimia tertentu, seperti asam trikloroasetat. Pengendapan protein
menyebabkan larutan menjadi keruh, sehingga konsentrasi protein dapat ditentukan
dengan mengukur derajat kekeruhan (turbiditas).

Keuntungan :
Teknik UV-visible merupakan teknik yang cepat dan sederhana, serta sensitif terhap
protein dengan konsentrasi rendah.
Kerugian :
Sebagian besar teknik UV-visible memerlukan larutan yang encer dan jernih, serta
tidak mengandung senyawa kontaminan yang dapat mengabsorpsi atau memantulkan
cahaya pada panjang gelombang di mana protein akan dianalisis. Karena diperlukan
larutan jernih, maka makanan harus mengalami sejumlah tahap preparasi sampel
sebelum dianalisis, seperti homogenisasi, ekstraksi pelarut, sentrifugasi, filtrasi, dsb.
yang dapat menyita waktu dan tenaga. Selain itu, kadang-kadang sulit untuk secara
kuantitatif mengekstraksi protein dari jenis makanan tertentu, terutama bila makanan
tersebut telah mengalami proses dimana protein menjadi agregat atau terikat secara
kovalen dengan senyawa lain. Kelemahan lain adalah, serapan tergantung pada jenis
protein (karena protein yang berbeda mempunyai sekuens/urutan asam amino yang
berbeda pula).
V. Alat dan Bahan
Alat :

Tabung reaksi

10 buah

Spektronik 20

1 buah

Gelas kimia

2 buah

Gelas ukur
Labu ukur 10 mL
Pipet tetes
Sentrifuge

1 buah
1 buah
5 buah
2 buah

Bahan :

Kacang kedelai
9

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

VI.

Larutan standar protein

Reagen biuret

Aquades

Alur Kerja
1. Persiapan Sampel

1 g sampel
Dihancurkan dengan mortar
Ditambah air
Dimasukkan labu ukur
Ditambah air sampai tanda batas
Disaring

Residu

Filtrat
Dilakukan pengenceran
Sampel
Disentrifuge selama 10 menit 3500 rpm
Sampel filtrat

10

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Sampel filtrat
Dibagi dalam tiga tabung masing-masing sebanyak 1 ml
Ditambah 5 ml reagen Biuret ke dalam 3 tabung
Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit
Diukur absorbansi pada 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-Vis

Absorbansi

2. Penetapan Absorbansi Larutan Blanko

1mL sampel
11

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Dimasukkan tabung reaksi
Ditambah 5 mL reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37oC, 10 menit
Diukur absorbansi pada 540nm dengan

alat spektronik 20

absorbansi

3. Penetapan Absorbansi Larutan Standar

Tb. reaksi 1:
1mL larutan
1mg/mL

Tb. reaksi 2:
1mL larutan
2mg/mL

Tb. reaksi 3:
1mL larutan
3mg/mL

Tb. reaksi 4:
1mL larutan
4mg/mL

Tb. reaksi 5:
1mL larutan
5mg/mL

Ditambah 5mL reagen biuret

Diinkubasi (tabung) pada suhu 37oC,
selama 10 menit/ suhu kamar selama
30 menit

Hasil pengamatan
1 ml aquades
Diukur absorbansinya pada
Ditambah 5 ml reagen Biuret
panjang gelombang 540nm
Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama
10 alat
menit
dengan
spektronik 20
Diukur absorbansi pada 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-Vis
12

Absorbasi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

absorbansi

13

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
VII.

Hasil Pengamatan

No.

Prosedur Percobaan

Perc
1.

Hasil Pengamatan
Sebelum
Sampel: kacang

Persiapan Sampel
1 g sampel

ose
Aquades: larutan

Dihancurkan dengan mortar

tidak berwarna
Ditambah air
Sampel
Dimasukkan labu ukur
dihancurkan:
Ditambah air sampai tanda batas
serbuk putih
Disaring

Residu

Dugaan / Reaksi

Kesimpulan

Sesudah
Sampel

Sampel kacang ose

disentrifuge:

yang dihasilkan

dihasilkan

larutan berwarna

larutan keruh

putih keruh

dan terdapat
endapan putih

Filtrat
Dilakukan pengenceran
Sampel
Disentrifuge selama 10 menit 3500 rpm
Sampel filtrat

14

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Sampel filtrat

Sampel filtrat:

Tabung I +

putih keruh
reagen Biuret:
Reagen Biuret:
Dibagi dalam tiga tabung masing-masing sebanyak 1 ml
larutan
Ditambah 5 ml reagen Biuret ke dalam 3 tabung
warna biru
berwarna biru
Dikocok
muda
muda
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit
Tabung II +
Diukur absorbansi pada 520 nm dengan alat spektrofotometri UV-Vis
reagen Biuret:

Kandungan protein kacang

Protein (kacang ose)

ose / kacang tunggak

positif terhadap uji

dalam per 100 g adalah

biuret dengan

22,9 gram

membentuk senyawa

(Sumber: Departemen

kompleks berwarna

Kesehatan RI, 1979)

biru-ungu.
Rata-rata kadar

larutan

protein adalah

berwarna biru

0,02126%

muda
Tabung III +
reagen Biuret:

Absorbasi

larutan
berwarna biru
muda
Hasil absorbansi
Sampel 1 : 0,143
Sampel 2 : 0,140
Sampel 3 : 0,138

2.

Penetapan absorbansi larutan blanko

Aquades: cairan

Aquades +

Larutan basa Cu2+ akan

Nilai absorbansi

1 ml aquades
15

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Ditambah 5 ml reagen Biuret

Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama

10 menit
Diukur absorbansi pada 520 nm

tidak berwarna
Reagen Biuret:

reagen Biuret:

menghasilkan kompleks

larutan

ikatan peptida sehingga

larutan

berwarna biru

menghasilkan warna ungu.

berwarna biru

muda

Hasil absorbansi larutan

muda

blanko adalah nol

blanko :

dengan alat spektrofotometri UV-Vis

Absorbasi

1 ml larutan standar dengan kadar 1, 2, 3, 4, 5 mg/ml

Dimasukkan dalam 5 tabung reaksi

Ditambah 5 ml reagen Biuret pada masing-masing tabung
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit sampai terbentuk warna yang stabil
Diukur absorbansinya pada 520 nm dengan spektrofotometri UV-Vis

Larutan standar

3.

Kadar 1 mg/ml +

Absorbansi berbanding lurus Absorbansi

16

Absorbansi

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
protein dengan

reagen Biuret:

kadar 1, 2, 3, 4,

larutan

5 mg/ml: larutan

berwarna biru

dengan konsentrasi

dengan konsentrasi
CuSO4.5H2O + 2NaOH

Cu(OH)2 + Na2SO4 +
tidak berwarna
muda
Reagen Biuret:
Kadar 2 mg/ml + 5H2O

larutan

reagen Biuret:

berwarna biru

larutan

muda

berwarna biru
muda
Kadar 3 mg/ml +
reagen Biuret:

berbanding lurus

Cu(OH)2
2OH-

Cu2+ +

sehingga semakin
tinggi konsnetrasi
maka semakin pekat
warnanya
Regresi linier larutan
standar
y= 4,15 x + 0,052
R2 = 0,975

larutan
berwarna ungu
(-)
Kadar 4 mg/ml +
reagen Biuret:
larutan
berwarna ungu
(+)
Kadar 5 mg/ml +
reagen Biuret:
larutan
17

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
berwarna ungu
(+)
Hasil
absorbansi :
Std 1 : 0,104
Std 2 : 0,130
Std 3 : 0,162
Std 4 : 0,227
Std 5 : 0,263

18

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
VIII.

Analisis Pembahasan
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan kadar protein pada suatu sampel.
Disini sampel yang digunakan adalah kacang ose atau kacang tungga. Penentuan
kadar dari protein dilakukan dengan analisis kualitatif menggunakan metode
spektrofotometer UV-VIS single beam dengan menggunakan larutan biuret.
Penyerapan sinar UV-VIS dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus
kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi yang rendah.
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, dapat terjadi dua kemungkinan.
Kemungkinan pertama yaitu cahaya ditangkap, serta kemungkinan yang kedua adalah
cahaya discattering. Apabila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan
energi dasar dan energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang akan
menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam spektrofotometer. Spektrofotometer
sendiri merupakan suatu teknik analisis yang bertujuan untuk mengetahui jumah
(konsentrasi) zat dalam suatu bahan berdasarkan spektroskopi khusus untuk panjang
gelombang UV-Visible. Pengertian spektroskopi sendiri adaah istiah atau nama yang
digunakan untuk ilmu yang mempelajari tentang hubungan antara radiasi (sinar) dan
energi ( yang memiliki fungsi panajang gelombang yang biasa disebut adalah dengan
frekuensi) dengan benda.
Prinsip dari spektrofotometri adalah suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu larutan berwarna pada panjang
gelombang spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi
dengan detektor fototube. Metode ini dapat digunakan untuk sampel yang berupa
larutan berwarna atau tidak berwarna, karena pada umumnya suatu alat
spektrofotometri yang dilengkapi sumber cahaya untuk mengukur spektrum dan
panjang gelombang pada larutan tertentu. Jumah sinar yang diserap atau diteruskan
oleh suatu larutan merupakan suatu fungsi eksponensial dari konsentrasi larutan dan
pada panjang larutan yang dilalui sinar.
Prinsip dari metode biuret adalah untuk mengetahui adanya ikatan peptida pada
sampel. Ikatan peptida dapat membentuk senyawa kompleks berwarna ungu dengan
penambahan garam kupri dalam suasana basa. Reaksi biuret merupakan reaksi warna
yang umum untuk gugus peptida (-CO-NH-N) dan protein. Senyawa dengan dipeptida
19

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
memberikan warna ungu, biru dan merah. Warna biru-ungu yang dihasilkan
bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Sehingga fungsi dari
warna biru-ungu yaitu untuk mengetahui pada panjang gelombang berapa sampel
dapat dihitung absorbansinya. Dari warna biru-ungu tersebut diketahui panjang
gelombang yang akan digunakan untuk menghitung absorbansi yaitu 540 nm.
Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret yaitu menganalisa
adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret ke dalam sampel yang
kemudian diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer,
Hal yang pertama dilakukan yaitu mempersiapkan sampel yang digunakan pada
percobaan ini. Sampel yang digunakan adalah kacang ose atau kacang tunggak.
Kacang ose ditimbang sebanyak 1 gram kemudian ditumbuk sampai halus,. Setelah
itu, sampel yang sudah halus dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL dan ditambah
aquades sampai tanda batas. Sampel dilarutkan dalam aquades berfungsi untuk
melarutkan kandungan protein yang terdapat dalam sampel, serta pada metode ini
yang digunakan untuk mengukur absorbansi yaitu larutan sehingga perlu untuk
dilarutkan. Selanjutnya, campuran dipindahkan ke tabung sentrifuge. Setelah
campuran terpisah, diambil filtratnya yang berwarna keruh. Pengambilan filtrat
dikarenakan pada filtrat merupakan larutan yang mengandung protein. Filtrat dibagi
dalam 3 tabung reaksi yang akan digunakan sebagai sampel 1, sampel 2, dan sampel
3. Masing-masing tabung reaksi berisi 1 mL filtrate. Ketiga sampel ini yang akan
digunakan dalam pengukuran absorbansi.
Pada percobaan ini digunakan larutan protein standart. Pertama yang perlu
dilakukan yaitu mempersiapkan larutan standart sebagai pembanding kadar protein
pada sampel. Disiapkan larutan standart dengan kadar protein 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3
mg/mL, 4 mg/mL, dan 5 mg/mL. Kemudian ditambahkan dengan reagen biuret
sehingga ikatan peptida pada protein membentuk senyawa kompleks dengan Cu 2+

reaksinya:

20

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Hasil warna yang pada larutan sampel dengan berbagai kadar + reagen biuret.
Kadar 1mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna biru muda
Kadar 2mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna biru muda
Kadar 3mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (-)
Kadar 4mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (+)
Kadar 5mg/mL + reagen biuret : larutan berwarna ungu (+)
Kemudian dilakukan uji spektrofotometer UV-vis pada larutan srandart, sehingga
didapat nilai absorbansi:
Larutan Standart
1 mg/mL
2 mg/mL
3 mg/mL
4 mg/mL
5 mg/mL

Absorbansi
0,104
0,130
0,162
0,227
0,263

Dari nilai absorbansi yang didapat dapat dibuat grafik antar konsentrasi vs absorbansi:

21

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Grafik Larutan Standart

0.3
0.25
0.2
Absorbansi

f(x) = 4.15x + 0.05

R = 0.98

0.15
0.1
0.05
0
0.01

0.01

0.02

0.02

0.03

0.03

0.04

0.04

0.05

0.05

0.06

Konsentrasi

Berdasarkan grafik tersebut didapat sebuah persamaan garis lurus:

y = 4.15x + 0.0527
Dengan nilai regresi sebesar 0,9753. Dari persamaan tersebut nantinya dapat digunakan
untuk menghitung kadar protein dari sampel kacang ose atau kacang tunggak.
Larutan blanko digunakan sebagai pembanding dengan larutan satandart dan larutan
sampel pada proses pengukuran absorbansi yang menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS.
Larutan blanko dibuat dengan, 1 ml aquades dimasukkan dalam tabung reaksi kemudian
ditambah 5 ml reagen biuret. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 oC selama 10 menit dan
didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit, lalu diukur absorbansinya . Ketika aquades
ditambahkan dengan reagen biuret larutan berwarna biru muda. Kemudian diinkubasi larutan
tetap biru muda.Nilai absorbansi larutan blanko adalah 0,000.
Langkah awal dalam penentuan absorbansi sampel yaitu dengan menambahkan 1 mL
sampel yang terdapat dalam 3 tabung reaksi dengan 5 ml reagen biuret. Pada saat penambahan
reagen biuret terjadi perubahan dari larutan tidak berwarna sedikit keruh menjadi biru muda
(sampel 1), biru muda (sampel 2), biru muda dan (sampel 3). Larutan dikocok, lalu diinkubasi
pada suhu 37oC selama 10 menit dan didiamkan pada suhu ruang selama 10 menit. Diukur
absorbansi sampel, diperoleh nilai absorbansinya :

Sampel 1 : 0.143
Sampel 2 : 0.140
Sampel 3 : 0.138
Nilai absorbansi tersebut dimasukkan pada persamaan y = 4,15x + 0,0527 sebagai
nilai y. Sehingga didapat nilai x atau konsentrasi protein sebesar: x1= 0,0219 ; x2=
22

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
0,0212 ; x3= 0,0207 ; dengan x rata-rata = 0,02126. Kemudian berdasarkan
perhitungan, diperoleh kadar protein sebesar 0,02126%. Kadar protein secara teori
pada sampel berupa kacang ose atau kacang tunggak sebesar 22,9 g/100 g. Kadar
protein yang diperoleh telah mendekati dengan kadar protein pada teori. Kadar yang
tidak tepat dengan teori ini dapat disebabkan oleh kurang halusnya sampel sehingga
kadar protein tidak sepenuhnya larut dalam filtrat.
IX.

Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, tentang penentuan kadar protein
dengan metode biuret diperoleh nilai absorbansi larutan standar dengan berbagai
konsentrasi sehingga didapat persamaan kurva y = 4.15x 0.0527, dengan nilai regresi
linear 0,9753. Pada sampel diperoleh nilai absorbansi rata-rata sebesar 0,02126 mg/mL.
Kadar protein pada kacang ose atau kacang tunggak dalam 1 g/mL sebesar 0,02126%.

X. Daftar Pustaka
Anonim. 2012a. Daftar Komposisi Bahan Makanan. Depkes RI. Jakarta: Bhratara Karya
Aksara.
Dangeubun, J.L., dan Putnarubun. C, 2009. Isolasi dan Penentuan Aktivitas Enzim
Proteolitik Dari Pancreas Ikan Lele. Percikan, Vol. 104, Edisi September 2009,
Hal. 111.
Fessenden, JR & Fessenden, JS. 1986. Kimia Organik Jilid 2 Edisi Ketiga. Jakarta:
Erlangga.
Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Lowry , Rosenbrough , Farr, Randall. 1951. Protein Measurement with the Folin Phenol
Reagent. New York: Kluwer Academic Publishers
23

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Poedjiadi, Anna dan F.M. Titin Supriyanti. 2006. Dasar-Dasar Biokimia, Edisi Kedua.
Jakarta : UI Press, Hal. 81-82, 91-92.
Rukmana, R dan Oesman, Y. 2000. Kacang Tunggak, Budidaya dan Prospek Usaha
Tani. Yogyakarta: Kanisius
Sudarmadji, Slamet . 1996. Teknik Analisa Biokimiawi. Yogyakarta: Liberty
Yogyakarta.
Tim Dosen.2016. Penuntun Praktikum Biokimia. Surabaya: UNESA Press.
Underwood /R.A. Day, Jr. 1980. Analisa Kimia Kuantitatif Edisi Keempat. Jakarta;
Erlangga.

LAMPIRAN
A. Tugas
1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva standart
tersebut tentukan kadar protein sampel!
Jawab :

24

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Larutan
Standar 1
Standar 2
Standar 3
Standar 4
Standar 5

Konsentrasi
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050

Absorbansi
0,104
0,130
0,162
0,227
0,263

Grafik Larutan Standart

0.3
f(x) = 4.15x + 0.05
R = 0.98

0.2
Absorbansi 0.1
0
0

0.02

0.04

0.06

Konsentrasi

Kadar protein dalam sampel kacang tunggak (x)

1. Sampel 1
y=4,15 x +0,052

0,143=4,15 x+ 0,052
x 1=

0,1430,052
4,15

x 1=0,0219 mg/m L
2. Sampel 2
y=4,15 x +0,052

0,140=4,15 x+ 0,052
x 1=

0,1400,052
4,15

25

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
x 1=0,0212 mg/mL

3. Sampel 3
y=4,15 x +0,052

0,138=4,15 x+ 0,052
x 1=

0,1380,052
4,15

x 1=0,0207 mg/m L
Rata-rata kadar protein kacang tunggak
x 1 + x 2+ x 3 0,0219+0,0212+0,0207
=
=0,02126 mg/mL
3
3
Kadar protein (mg / 100 gram)
0,02126
x 100 =0,02126
1000
10
2. Apakah peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret? Jika benar
demikian, bagaimana menemukan kadar protein yang tercampur dengan peptida ?
Jawab :
Ya, peptida akan memberikan reaksi positif terhadap pereaksi biuret karena dengan
metode Biuret merupakan salah satu cara yang baik untuk menentukan kadar protein
suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu2+ akan membentuk kompleks dengan ikatan
peptida suatu protein, sehingga menghasilkan warna ungu yang dapat diidentifikasi
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Absorbansi ini berbanding
langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis protein karena seluruh
protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama persatuan berat.

26

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

B. Dokumentasi
No.
1.

Dokumentasi

Keterangan
1 gram sampel padatan yaitu
kacang ose atau kacang lento
dihancurkan dengan mortar.

2.

Diencerkan

dengan

aquades

menggunakan labu ukur 10 mL.

3.

Sampel yang telah diencerkan

dimasukkan

dalam

tabung

sentrifuge.
27

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

4.

Tabung

yang

berisi

larutan

sampel dimasukkan dalam alat

sentrifuge

dengan

kecepatan

3700 rpm selama 10 menit.

5.

Sampel
digunakan

protein

yang

sebagai

akan
larutan

standar.

6.

Setelah diambil 5 mL sampel

protein

diencerkan

secara

berurutan (5, 4, 3, 2, 1 mg/mL).

28

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
7.

Hasil

pengenceran

sampel

protein (5, 4, 3, 2, 1) mg/mL

larutan tidak berwarna.

8.

Larutan

pengenceran

standar

protein ditambah dengan 5 mL

reagen biuret. Terjadi perubahan
warna, pengenceran :
5 mg/mL :
4 mg/mL :
3 mg/ mL :
2 mg/ mL :
1 mg/mL :

9.

Hasil sentrifuge, larutan keruh

diambil dan dimasukkan dalam 3
tabung reaksi masing-masing 1
mL sebagai larutan sampel 1, 2,
dan 3. 1 tabung reaksi sebagai
blanko berisi 1 mL aquades.

29

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
10.

Larutan sampel 1, 2, dan 3 serta

blanko ditambah dengan 5 mL
reagen biuret. Terjadi perubahan
warna menjadi biru muda pada
larutan

blanko

dan

larutan

sampel 1, 2, 3.

11.

Tabung

reaksi

pengenceran,

blanko, dan sampel diinkubasi

dalam waterbath pada suhu 37oC
selama 10 menit.

12.

Pada tabung pengenceran sampel

protein terjadi perubahan warna
pada tabung 3, 4, dan 5 :
Tabung 3 : ungu
Tabung 4 : ungu (+)
Tabung 5 : ungu (+)

30

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
13.

Setelah diinkubasi pada larutan

blanko dan sampel tidak terjadi
perubahan warna.

14.

Semua

larutan

pada

tabung

reaksi di ukur absorbansinya

dengan

UV-VIS.

Data

yang

diperoleh :
- Blanko : 0.000
- Sampel 1 : 0.143
- Sampel 2 : 0.140
- Sampel 3 : 0.138
Larutan standar :
- Tabung 1 : 0.104
- Tabung 2 : 0.130
- Tabung 3 : 0.162
- Tabung 4 : 0.227
- Tabung 5 : 0.263

C. Lampiran Perhitungan

Pengenceran Larutan Standar

Diketahui: Konsentrasi protein 10 mg/mL

31

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
Ditanya: penambahan volume?
Penyelesaian:
1. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 10 = 10 . 5
V1 = 5 ml
2. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 5 = 10 . 4
V1 = 8 ml
3. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 4 = 10 . 3
V1 = 7,5 ml
4. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 3 = 10 . 2
V1 = 6,7 ml
5. V1 . M1 = V2 . M2
V1 . 2 = 10 . 1
V1 = 5 ml

Kadar protein dalam sampel kacang (x)

y =
4,15 x +0,052
Diketahui :
y1

0,143
32

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret

Ditanya
Jawab
Sampel 1

y2

0,140

y3

0,138

:
:

1g

= 1000 mg
10 mL

Kadar protein pada kacang kedelai mentah?

y=4,15 x +0,052

0,143=4,15 x+ 0,052
x 1=

0,1430,052
4,15

x 1=0,0219 mg/mL
Sampel 2
y=4,15 x +0,052
0,140=4,15 x+ 0,052

x 1=

0,1400,052
4,15

x 1=0,0212 mg/m L
Sampel 3
y=4,15 x +0,052
0,138=4,15 x+ 0,052

x 1=

0,1380,052
4,15

x 1=0,0207 mg/m L
Rata-rata kadar protein kacang tunggak
x 1 + x 2+ x 3 0,0219+0,0212+0,0207
=
=0,02126 mg/mL
3
3
Kadar protein (mg / 100 gram)
33

LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA I

Penentuan Kadar Protein Dengan Metode Biuret
0,02126
x 100 =0,02126
1000
10

34