Anda di halaman 1dari 15

SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS dan MICROPLATE READER

A. SPEKTROFOTOMETRI UV-VIS
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri
UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber
cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih
canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV
dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk
sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektrofotometer UVVis (Ultra Violet-Visible) adalah salah satu dari sekian banyak instrumen
yang biasa digunakan dalam menganalisa suatu senyawa kimia.
Spektrofotometer umum digunakan karena kemampuannya dalam
menganalisa begitu banyak senyawa kimia serta kepraktisannya dalam hal
preparasi sampel apabila dibandingkan dengan beberapa metode analisa.
Spektrofotometri UV/Vis melibatkan energi elektronik yang cukup besar
pada molekul yang dianalisis, sehingga spetrofotometer UV/Vis lebih
banyak dpakai ntuk analisis kuantitatif dibanding kualitatif.
Spektroskopi ultraviolet-visible atau spektrofotometri ultravioletvisible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari foton dalam
daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan
berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR))
kisaran. Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung
mempengaruhi warna bahan kimia yang terlibat. Spektrofotometri UV/VIS
merujuk pada spektrofotometri absorbsi UV/VIS yang mana termasuk
metode spektroskopi molekuler. Spektrofotometri UV/VIS bekerja pada
daerah

spektrum

Spektrofotometri

ultraviolet
UV

bekerja

(UV)
pada

dan

sinar

daerah

tampak

(VIS).

=10380 nm.

Spektrofotometri visibel bekerja pada daerah daerah

=400750 nm.

Warna sinar tampak berhubungan dengan panjang gelombangnya.


Hubungan antara warna dengan panjang gelombang sinar tampak
Panjang gelombang

Warna yang diserap

Warna komplementer

400-435
435-480
480-490
490-500
500-560
560-580
580-595
595-650
650-750

Ungu
Biru
Biru Kehijauan
Hijau Kebiruan
Hijau
Hijau Kekuningan
Kuning
Orange
Merah

Hijau Kekuningan
Kuning
Orange
Merah
Merah Anggur
Ungu
Biru
Biru Kehijauan
Hijau Kebiruan

1. Prinsip Kerja
Prinsip kerja spektrofotometri UV-Vis adalah interaksi yang terjadi
antara energy yang berupa sinar monokromatis dari sumber sinar dengan
materi yang berupa molekul. Besar energy yang diserap tertentu dan
menyebabkan electron tereksitasi dari ground state ke keadaan tereksitasi
yang memiliki energy lebih tinggi. Serapan tidak terjadi seketika pada
daerah ultraviolet-visible untuk semua struktur elektronik tetapi hanya
pada system-sistem terkonjugasi, struktur elektronik dengan adanya ikatan
p dan non bonding electron.
Prinsip kerja spektrofotometri berdasarkan hukum Lambert Beer,
bila cahaya monokromatik (Io) melalui suatu media (larutan), maka
sebagian cahaya tersebut diserap (Ia), sebagian dipantulkan (Ir), dan
sebagian lagi dipancarkan (It). Berdasarkan teori tersebut, pinsip kerja dari
alat ini adalah suatau cahaya monokromatik akan melalui suatu media
yang memiliki suatu konsentrasi tertentu, maka sakan membentuk
spectrum cahaya, namun ketika melewati monokromator, cahaya yang
keluar hanya akan terdapat satu cahaya yaitu yang sesuai dengan setting
awal, misalnya warna hijau. Setelah keluar dari monokromator, cahaya

akan menembus sampel atau larutan yang kemudian menuju detector


dimana cahaya yang di hasilkan dari sampel akan di ubah menjadi listrik
yang kemudian akan terbaca hasil pada read out (monitor).
Spectrum cahaya yang dapat terlihat oleh mata terentang antara
400 nm sampai 800 nm. Pada teknik spektrofotometri, cahaya dari sumber
cahaya diuraikan menggunakan prisma sehingga di peroleh cahaya
monokromatis yang diserap oleh zat yang akan diperiksa. Cahaya
monokromatis merupakan cahaya satu warna dengan satu panjang
gelombang, sehingga cahaya yang diserap oleh larutan berwarna dapat
diukur.
2. Instrumen
Sumber
Energi

3.

Monokro
mator

Kuvet

Detektor

Pengolah
Signal dan
Readout

Sumber energi yang umum yaitu lampu hidrogen dan lampu


deuterium yang memilki radiasi continum dengan panjang gelombang
160-380 nm. Lampu xenon juga dapat digunakan sebagai sumber energi
pada daerah UV, namun tidak sestabil lampu hidrogen. Kuvet yang
digunakan untuk daerah ultraviolet adalah berbahan kuarsa, sementara
untuk daerah visibel bisa menggunakan kuvet berbahan kuarsa, gelas, atau
plastik. Dua jenis detektor yang digunakan untuk spektrometer UV/VIS
adalah phototubes dan photomultiplier yang terdiri dari sebuah permukaan
photosensitif yang dapat menyerap radiasi UV/VIS dan menghasilkan arus
listrik yang sebanding dengan jumlah foton yang sampai pada detektor.

3. Bagian dan Fungsi dari UV-VIS


1) Sumber Cahaya
Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar
polikromatis dengan berbagai macam rentang panjang gelombang.
Untuk spektrofotometri :

a. UV menggunakan lampu deuterium atau disebut juga heavi


hydrogen (160-375 nm)
b. VIS menggunakan lampu tungsten yang sering disebut
lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spectrum
kontiniu 320-2500 nm
c. UV-VIS menggunan photodiode yang telah dilengkapi
monokromator
d. Infra merah, lampu pada panjang gelombang IR.
e. Lampu Tungsten (Wolfram) : Lampu ini digunakan untuk
mengukur sampel pada daerah tampak. Bentuk lampu ini
mirip dengna bola lampu pijar biasa. Memiliki panjang
gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya
berupa garis lengkung. Umumnya memiliki waktu 1000
jam pemakaian.
2) Monokromator
Terdiri atas :
a. Prisma, berfungsi mendispersikan radiasi elektromagnetik
sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari
radiasi polikromatis.
b. Kisi difraksi, berfungsi menghasilkan penyebaran dispersi
sinar secara merata, dengan pendispersi yang sama, hasil
dispersi akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat
digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum.
c. Celah optis, berfungsi untuk mengarahkan

sinar

monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi.


Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi
akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh
panjang gelombang yang diharapkan.
d. Filter, berfungsi untuk menyerap warna komplementer
sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya
berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang
dipilih.
Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang
gelombang yaitu mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar

polikromatis menjadi cahaya monaokromatis. Jenis monokromator


yang saat ini banyak digunakan adalan gratting atau lensa prisma
dan filter optik. Jika digunakan grating maka cahaya akan dirubah
menjadi spektrum cahaya. Sedangkan filter optik berupa lensa
berwarna sehingga cahaya yang diteruskan sesuai dengan warnya
lensa yang dikenai cahaya. Ada banyak lensa warna dalam satu alat
yang digunakan sesuai dengan jenis pemeriksaan.

3) Kompartemen sampel
Kompartemen ini digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet.
Kuvet merupakan wadah yang digunakan untuk menaruh sampel
yang akan dianalisis.
Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :
a. Permukaannya harus sejajar secara optis
b. Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat di
transmisikan
c. Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia
d. Tidak rapuh
e. Bentuknya sederhana

4) Detektor
Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel
dan mengubahnya menjadi arus listrik. Syarat-syarat sebuah
detektor :
a. Kepekaan yang tinggi
b. Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
c. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
d. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
e. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan
tenaga radiasi
5) Read out
Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya
isyarat listrik yang berasal dari detektor.
4. Prosedur Pemakaian Alat

a. Putar tombol on-off (disebelah kira) kekanan. Biarkan 15 menit


untuk memanaskan alat. Atur tombol sampai menunjuk angka nol
pada petunjuk %T.
b. Putar tombol pengatur panjang gelombang (yang ada di sebelah
atas alat) untuk memilah panjang gelombang sesuai panjang
gelombang yang diinginkan.
c. Masukkan kuvet yang berisi paling sedikit 3 ml aquadest kedalam
tempat sampel (sebelum memasukkan kuvet, pastikan kuvet dalam
keadaan kering dengan mengeringkannya dengan kertas tissue
(tutup penutup sampel.
d. Putar tombol pengatur cahaya (tombol yang terletak disebelah
kanan) sehingga %T menunjuk angka 100 atau A menunjuk angka
nol.
e. Angkat kuvet yang berisi aquadest dari tempat sampel dengan
tutup. Ganti isi kuvet dengan larutan lampu, baca serapannya.
f. Ganti larutan blanko dalam kuvet dengan larutan standar atau
larutan uji, baca serapannya.
5. Tipe Instrumentasi dari Spektrofotometri UV-VIS
a) Single Beam
Pada

spektrofotometri

UV-Vis

tipe

single

beam

absorbsi

berdasarkan pada sinar tunggal dimana sampel akan ditentukan


jumlahnya pada satu panjang gelombang atau fix wave lenght.
Hasil biasanya dibandingkan dengan blangko (biasanya pelarut).

Gambar 1 . Skema spektrofotometri tipe single beam

Keterangan gambar:
1) Dari celah mengeluarkan satu sinar monokromotis
2) Wadah atau kuvet yang dapat dilalui sinar hanya satu.
3) Setiap perubahan panjang gelombang, alat harus dinolkan
b) Double Beam
Pada spektrofotometri UV-Vis tipe double beam absorbsi biasanya
mempunyai variabel panjang gelombang atau multi wave length.
Hasilnya bisa langsung dibandingkan dengan blangko.

Gambar 2 . Skema spektrofotometri tipe double beam.


Keterangan gambar:
1) Dari celah mengeluarkan dua sinar monokromotis.
2) Sinar melaui 2 wadah atau kuvet yang sekaligus
3) Alat hanya di auto zero satu kali dengan cara mengisi kedua kuvet
dengan larutan blanko
Persyaratan suatu sampel dapat dianalisa menggunakan Spektrofotometri
UV Vis adalah :
1. Bahan mempunyai gugus kromofor
2. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor tapi berwarna
3. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dan tidak berwarna, maka
ditambahkan pereaksi warna (Vis)
4. Bahan tidak mempunyai gugus kromofor dibuat turunannya yang
mempunyai gugus kromofor (UV).

Dasar dari metoda ini karena adanya perubahan sifat fisikokimia dari
bahan yang diperiksa dengan jalan mengamati sifat serapannya terhadap
energi cahaya atau radiasi elektromagnetik. Spectrum UV-Vis merupakan
hasil interaksi antara radiasi elektromagnetik (REM) dengan molekul.
REM merupakan bentuk energi radiasi yang mempunyai sifat gelombang
dan partikel (foton). Karena bersifat sebagai gelombang maka beberapa
parameter perlu diketahui, misalnya panjang gelombang (), frekuensi (v),
bilangan gelombang (v), dan serapan (A). REM mempunyai vektor listrik
dan vektor magnet yang bergetar dalam bidang-bidang yang tegak lurus
satu sama lain dan masing-masing tegak lurus pada arah perambatan
radiasi. Bila suatu cahaya monokromatis atau bukan monokromatis jatuh
pada medium homogen, maka sebagian dari cahaya ini akan dipantulkan,
sebagian akan diabsorbsi dan sisanya akan diteruskan, sehingga dalam hal
ini dapat dinyatakan sebagai berikut:
Io = I r + I a + I t
Keterangan:
Io = Intensitas Cahaya yang Datang
Ir = Intensitas Cahaya yang Dipantulkan
Ia = Intensitas Cahaya yang Diserap
It = Intensitas Cahaya yang Diteruskan.
5. Spectrum UV-Vis
Data-data yang dikeluarkan oleh UV atau VIS dapat
berupa absorbansi atau transmitansi yang langsung
dibaca pada spektrofotometer. Namun untuk UV, VIS,
UV-VIS dan IR data yang dikeluarkan dapat berupa
spektrum jika telah dihubungkan dengan komputer.
Spektrum yang dikeluarkan oleh UV, VIS dan UV-VIS
berupa pita yang lebar sedangkan pada pita yang
dikeluarkan oleh IR berupa garis atau puncak tajam.

Pita melebar dari UV-VIS disebabkan karena energi yang dimiliki


selain menyebabkan transisi elektronik terjadi pula rotasi dan vibrasi
elektron dalam molekul. Sedangkan pada IR hanya terjadi vibrasi
elektron maka spektrum yang dihasilkan berupa garis atau puncak
tajam. Selain pada IR, spektrum berupa garis dapat terjadi pula pada
spektroskopi NMR karena hanya terjadi rotasi elektron.
Spektrum yang dihasilkan dari setiap spektroskopi berbeda
antara satu dengan yang lainnya. Para kimiawan spektrum UV, VIS
maupun IR dapat dibedakan dengan mudah. Spektrum yang dihasilkan
oleh UV, VIS dan UV-VIS tidak berbeda jauh namun sangat sangat
berbeda bila dibanding spektrum IR. Untuk membedakannya dapat
dilihat pada gambar:

Gambar spektrum UV. Namun spektrum dari spektrofotometer VIS


dan UV-VIS menyerupai spektrum UV

Ga
mbar spektrum IR. Pita tertinggi mengarah ke bawah sedangkan pada
UV pita yang paling tinggi mengarah ke atas hal ini disebabkan
spektrofotometer IR ditulis dalam bentung bilangan gelombang.

6. Hal-hal yang Harus Diperhatikan dalam Analisis Spektrofotometri


UV-VIS
a. Pada tiap pemeriksaan jangan lupa menutup tempat kuvet.
b. Tabung kuvet yang akan dibaca harus dalam keadaan bersih.
c. Bila pada dinding tabung kuvet terdapat udara, hilangkan
dengan menjentik-jentikkan tabung dengan jari.
d. Jangan sampai menumpahakan cairan yang diperiksa kedalam
lubang tempat kuvet atau pada alat.
e. Pastikan bahwa larutan yang akan diperiksa sudah tercampur
dengan baik sebelum dilakukan pengukuran.
f. Pengukuran selalu di kerjakan dalam duplo.
g. Penetapan pada panjang gelombang yang berbeda pada tiap
panjang gelombang alat harus di tera dengan aquadest (A)
harus menunjuk angka nol atau 100%T

Ada beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan


spektrofotometri Uv-Vis terutama untuk senyawa yang semula tidak
berwarna yang akan dianalisis dengan spektrofotometri visibel karena

senyawa tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi senyawa yang


berwarna. Berikut adalah tahapan-tahapan yang harus diperhatikan :
a. Pembentukan molekul yang dapat menyerap sinar UV-Vis hal ini
perlu dilakukan jika senyawa yang dianalisis tidak menyerap pada
daerah tersebut. Cara yang digunakan adalah dengan merubah
menjadi senyawa lain atau direaksikan dengan pereaksi tertentu.
Pereaksi yang digunakan harus memenuhi beberapa persyaratan
yaitu:
Reaksinya selektif dan sensitive
Reaksinya cepat, kuantitatif dan reprodusibel (ajeg)
Hasil reaksi stabil dalam jangka waktu yang lama
b. Waktu operasional (operating time)
Cara ini biasa digunakan untuk pengukuran hasil reaksi atau
pembentukan warna. Tujuannya adalah untuk mengetahui waktu
pengukuran yang stabil. Waktu operasional ditentukan dengan
mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi
larutan. Pada saat awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang
berwarna ini meningkat smpai waktu tertentu hingga diperoleh
absorbansi yang stabil. Semakin lama waktu pengukuran, maka ada
kemungkinan senyawa yang berwarna tersebut menjadi rusak atau
terurai sehingga intensitas warnanya turun akibatnya absorbansinya
juga turun. Karena alasan inilah, maka untunk pengukuran
senyawa berwarna (hasil suatu reaksi kimia) harus dilakukan pada
saat waktu operasional.

c. Pemilihan panjang gelombang


Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif
adalah panjang gelombang ynag mempunyai absorbansi maksimal.
Untuk memilih panjang gelombang maksimal, dilakukan dengan

membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang


gelombang dari suatu larutan baku pada konsenterasi tertentu.
Kadang-kadang dijumpai keadaan yang mana pemakaian panjang
gelombang maksimal kurang baik. Hal ini karena karena misalnya,
selain zat yang akan dianalisis, juga terdapat zat lain yang
mempunyai absorbansi pada panjang gelombang tersebut. Ada
beberapa variable yang dapat mempengaruhi absorbansi yaitu jenis
pelarut, pH larutan, suhu, konsentrasi dan zat-zat pengganggu.
d. Pembuatan kurva baku
Dibuat seri larutan baku dari zat yang akan dianilisis dengen
berbagai konsenterasi. Masing-masing absorbansi larutan dengan
berbagai konsentrasi kemudian dibuat kurva yang merupakan
hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi (X). bila
hokum Lamber-Beer terpenuhi, maka kurva baku berupa garis
lurus.
e. Pembacaan absorbansi sampel atau cuplikan
Absorban yang terbaca pada spektrofotometri hendaknya antara 0,2
sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitansi.
Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa kesalahan dalam
pembacaan T adalah 0,005 atau 0,5% (kesalahan fotometri).

Gambar Alat Spektrofotometer UV-Vis


B. MICROPLATE READER
Microplate Reader adalah suatu spektrofotometer khusus yang
disusun untuk membaca lempeng mikro (microplate). Microplate Reader
menggunakan prinsip spektofotometri yang sama seperti metode
konvensional, tetapi dapat menghasilkan peningkatan jumlah sampel yang
dapat dianalisis. Perbedaan dengan Spektrofotometer konvensional yang
memfasilitasi pembacaan pada berbagai panjang gelombang, microplate
reader memiliki filter atau kisi-kisi difraksi yang membatasi rentang
panjang gelombang yang digunakan ELISA, umumnya antara 400-750
nm. Beberapa microplate reader bekerja dalam rentang ultraviolet dan
melakukan analisis antara 340-700 nm. Sistem optik yang dimanfaatkan
oleh banyak produsen menggunakan serat optik untuk menyuplai cahaya
untuk sumur lempeng mikro yang berisi sampel. Berkas cahaya yang
melewati sampel memiliki diameter yang berkisar antara 1 sampai 3 mm.
Suatu sistem deteksi mendeteksi cahaya yang berasal dari sampel,
menguatkan sinyal dan menentukan absorbansi sampel. Selanjutnya, suatu
sistem pembacaan mengubahnya menjadi data yang memungkinkan
interpretasi hasil pengujian. Saat ini beberapa microplate reader
menggunakan sistem berkas cahaya ganda.

Keterangan:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Sumber Cahaya
Diafragma
Lensa Kondensor
Filter
Fiber Bundl
Lensa Fokus
Microplate
Detektor

1. Cara Kerja Alat


a. Hubungkan dengan arus listrik
b. Tekan tombol ON
c. Hubungkan dengan printer
d. Warm up selama 15 menit
e. Letakkan microplate yang berisi sampel pada tempat yang telah
ada
f. Pembacaan sampel pada microplate
g. Tunggu hasilnya secara langsung akan di print.

Gambar Alat Microplate Reader

DAFTAR PUSTAKA
Gandjar, Ibnu Gholib; Rohman, Abdul. 2007. Kimia Farmasi Analisis.
Yogyakarta: Pustaka Pelajar.
Rusli, Raisani. Penetapan Kadar Boraks Pada Mie Basah yang Beredar Di Pasar
Ciputat dengan Metode Spektrofotometri UV-VIS Menggunakan Pereaksi
Kurkumin. (Skripsi FMIPA Kedokteran Dan Ilmu Kesehatan, Jakarta, 2009).
Soewoto Hafiz, dkk. 2001. Biokimia Eksperimen Laboratorium Bagian Biokimia
FKUI. Jakarta : Widya Medika.
Utomo, Harry. Uji Aktivitas Senyawa 4-[(E)-2-(4-Okso-3-fenil-kuinazolin-2il)etenil]benzensulfonamida terhadap Siklooksigenase-2 (COX-2). (Skripsi
FMIPA UI, Depok, 2012).
Yusbarina. 2014. Analisis Instrumen Kimia (Metode Spektroskopi). Pekanbaru:
Kreasi Edukasi.