Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

I. Tujuan
Setelah melakukan praktikum ini mahasiswa diharapkan dapat :
Menjelaskan teori kromatografi cair kinerja tinggi;
Mengoperasikan alat kromatografi cair kinerja tinggi;
Menganalisis suatu senyawa kimia baik secara kualitatif maupun kuantitatif
dengan menggunakan alat kromatografi cair kinerja tinggi.
II. Alat dan Bahan yang digunakan
Alat yang digunakan
a) Alat KCKT/HPLC
b) Kolom Lichosphere C-18
c) Syringe
d) Penyaring milipore
e) Neraca Analitik
f)

Labu takar 100mL,

g) Corong gelas
Bahan yang digunakan
a)

Aquadest

b) Standar kaffein

III. Dasar Teori

Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) adalah metode pemisahan
komponen dalam larutan berdasarkan ukuran dan polaritas molekulnya. Bila
ditinjau dari sistem peralatannya maka KCKT termasuk kromatografi kolom

karena fase diam yang dipakai diisikan ke dalam kolom, sedangkan bila ditinjau
dari proses pemisahannya KCKT dapat digolongkan sebagai kromatografi
adsorpsi atau kromatografi partisi.
Proses pemisahannya berdasarkan afinitas, filtrasi gel dan ion yang
berpasangan, akan tetapi proses pemisahannya tetap dilaksanakan didalam kolom
disetai pemakaian pelarut pengembang dengan tekanan tinggi. Sistem KCKT
memiliki dua kegunaan yaitu pemisahan dan pendeteksian.
Keuntungan KCKT.
1.

Dapat dilakukan pada suhu kamar

2.

Detektor KCKT dapat divariasi

3.

Pelarut pengembang dapat dipakai berulangkali, demikian juga

dengan kolomnya

4.

Ketepatan dan ketelitian relatif tinggi di jajaran teknik analisis fisika

kimia.

Teknik Pemisahan pada KCKT

1.

Sistem isokratik

Teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak tidak berubah selama

analisis berlangsung. Hal ini berarti sistem fase gerak tetap selama pemisahan
berangsung sehingga pemisahan sample yang mengandung komponen-komponen
dengan polaritas bervariasi adalah memberikan hasil yang kurang memuaskan.
2.

Sistem Gradien

Teknik pemisahan dengan komposisi fase gerak berubah secara periodik

selama analisis berlangsung. Hal ini berarti selama analisis, polaritas fase gerak
bervariasi atau berubah-ubah. Sistem ini digunakan untuk pemisahan contoh

yang mengandung komponen-komponen dengan polaritas bervariasi sehingga

akan memberikan hasil pemisahan yang baik.
Keterangan gambar:
1) Reservoir fase gerak, adalah tempat penampungan fase gerak yang digunakan
selama sistem digunakan
2) Pompa, digunakan sebagai pendorong fase gerak melalui sistem HPLC
3) Filter, penyaring fase gerak yang digunakan sesuai dengan fase gerak yang
digunakan
4) Pulsa Damper, berfungsi untuk mengatur tekanan fase gerak yang digunakan
5) Ijektor, digunakan untuk memasukkan sampel
6) Kolom yang berisi fase diam
7) Detektor untuk mengetahui pemisahan apa yang telah terjadi dan berguna sebgai
alat untuk memberikan data dan mengevaluasi hasil pemisahan tersebut secara
kualitatif dan kuantitatif.
Berbagai jenis detektor yang telah dikembangkan untuk kromatografi cairan, yaitu:
- Detektor indeks rekraksi
- Detektor Uv-vis
- Detektor Fluoresence
- Detektor Hantaran
8) Pengolah data, ini berbentuk komputer yang berfungsi untuk engolah data yang
dihasilkan menjadi bentuk kromatogram

IV. Langkah Kerja

Terlampir
V. Data pengamatan.
Fase gerak

: metanol dan aquadest (cair)

Fase diam

: silika gel (padatan)

Kolom

: acclaimtm 210 C18

Panjang gelombang : 272nm

Kecepatan fase gerak : 1ml/mnt
Sampel

: standar kaffein 20 L

Konsentrasi sampel : 10 ppm

NO

1
2
3

Ret.time

Height

Area

Rel.area

Larutan

(min)

(mAU)

(mAU*min) (%)

(ppm)

Standard 1
Standard 2
Sampel

3,65
3,65
3,66

76,275
124,360
80,503

9,331
15,340
3,66

7,859
19,676
13,227

100,00
100,00
100,00

Amount

VI. PERHITUNGAN
NO
1
2

X
10
15

25

Y
9,331
15,34
24,67
1

6.1 Mencari Intecept (b)

b = n XY x.y
n X2 (X2)

XY
93,31
230,1
323,4
1

X2
100
225
325

VII. Analisa Data

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua
fase, pada HPLC kedua fase tersebut adalah silika gel (padatan) sebagai fase
diam dan metanol sebagai fase gerak yang berupa zat cair. HPLC berfungsi
sebagai sebuah alat untuk mendorong analit melalui sebuah kolom fase diam
dengan memompa cairan (fase gerak) pada tekanan tinggi melalui kolom yang
nantinya akan diteruskan ke rekorder lalu di buat ke dalam bentuk grafik.
Prinsip kerja HPLC adalah dengan bantuan pompa fase gerak cair yang dialirkan
melalui kolom menuju detektor. Kemudian cuplikan dialirkan kedalam aliran fase
gerak dengan cara penyuntikan.
Didalam

kolom akanterjadi

pemisahan

komponen-komponen

campuran.

Pemisahan tersebut bergantung atau didasarkan pada tingkat kepolaritasan dari setiap
komponen-komponen yang ada di dalam campuran tersebut. Apabila sifat kepolaran
salah satu komponen sama atau hampir sama dengan fase diam maka komponen
tersebut akan tertahan sejenak didalam kolom dan akan keluar sedikit lebih lama
dibandingkan dengan komponen lain yang sifat kepolarannya tidak sama atau
berbeda dengan fase diam.
Pada praktikum ini sampel yang digunakan adalah standar kafein yang memiliki
konsentrasi 50 ppm. Volume sampel yang diinjeksikan adalah 30 L tetapi volume
yang diatur melalui software chromeleon di komputer adalah 20 L, maka HPLC
dengan sendirinya akan mengatur volume yang terhisap atau dipakai sebesar 20 L
dan sisa volume 10 L akan otomatis mengalir melalui selang pembuangan. Pada
software chromeleon kita diminta untuk membuat beberapa file yaitu method file,
program, dan sequence. File-file tersebt berfungsi untuk membantu proses analisa dan
sebagai tempat data yang terukur disimpan.

VII. Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan didapatkan kesimpulan sebagai
berikut :
1.

Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran yang didasarkan atas

perbedaan distribusi dari komponen-komponen campuran tersebut diantara dua
fase.

2.

HPLC berfungsi sebagai sebuah alat untuk mendorong analit melalui sebuah
kolom fase diam dengan memompa cairan (fase gerak) pada tekanan tinggi
melalui kolom yang nantinya akan diteruskan ke rekorder lalu di buat ke dalam
bentuk grafik.

3.

Pada HPLC terdapat dua fasa yaitu :

a) Fase gerak : metanol dan aquadest ( zat cair )
b) Fase diam : silika gel ( zat padat )

4.

Data yang terukur berdasarkan sampel standar kafein adalah:

a) Retention Time : 4,63
b) Area : 54 . 715
c) Konsentrasi :50 ppm

VIII. Daftar Pustaka

1) Jobsheet Penuntun Pratikum Kimia Analitik Instrumen Tahun 2015. Politeknik
Negeri Sriwijaya Palembang
2) www.scribd.com/kromatografi-cair-kinerja-tinggi
3) www.academia.edu/high-performance-liquid-cromatograph

GAMBAR ALAT

SATU SET ALAT HPLC