HPLC

Pendahuluan
HPLC ( High Performance Liquid Chromatography ) adalah suatu alat
kromatografi untuk zat cair dan disertai tekanan tinggi. Seperti teknik
kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. HPLC
merupakan bentuk dari kromatografi kolom yang memompa campuran sampel
atau analit dalam suatu fase gerak pada tekanan tinggi melalui fase diam.
Sampel dibawa oleh aliran gas dari Helium atau Nitrogen. HPLC dapat
memisahkan, dan mengindentifikasi senyawa yang terkandung didalam sampel
terlarut dengan konsentrasi sangat rendah seperti PPT( Part Per Trillion ). Karena
sifatnya yang fleksibel, HPLC digunakan di berbagai bidang seperti farmasi,
lingkungan, forensik dan kimia.
Dalam HPLC ini fasa gerak yang digunakan berupa cairan, sedangkan fasa
diamnya berupa padatan (silica gel) yang ditempatkan pada kolom tertutup
(melekat secara kimia dalam kolom tersebut), waktu retensi sampel akan
bervariasi tergantung pada interaksi antara fase diam, molekul yang dianalisis,
dan pelarut, atau pelarut yang digunakan. Sampel melewati kolom dan
berinteraksi antara dua fase pada tingkat yang berbeda, terutama karena
polaritas yang berbeda dalam analit. Analit yang memiliki interaksi paling sedikit
dengan fase diam atau interaksi paling banyak dengan fase gerak akan keluar
dari kolom lebih cepat.

Bagian Bagian
HPLC terbagi menjadi beberapa bagian , yaitu :
1. Tempat Sampel
Tempat sampel pada HPLC berfungsi untuk menampung sampel
yang akan dipisahkan menggunakan HPLC, sampel yang digunakan
disimpan dalam botol yang kemudian akan dimasukan kedalam tempat
sampel tersebut. Tempat sampel ini dapat menyimpan banyak botol
sampel, oleh karena itu HPLC dapat memisahkan sampel dengan jumlah
yang banyak.
2. Injektor
Injector pada HPLC adalah alat yang digunakan untuk menginjeksi
sampel yang akan dipisahkan. Sampel yang dimasukkan ke dalam HPLC
hanya beberapa puluh mikroliter. adakalanya injektor merupakan suatu
sistem autosampler. Terdapat beberapa jenis Injektor, antara lain :
a. Stop-flow
Pada Injektor Stop-flow ini terjadi suatu mekanisme, pada saat
Aliran dalam HPLC dihentikan dilakukan Injeksi pada kinerja
atmosfir, dan pada saat sistem tertutup , aliran dilanjutkan lagi.
Teknik ini dapat digunakan karena difusi di dalam cairan kecil dan
resolusi tidak dipengaruhi.
b. Syringe

Injektor Syringe adalah Alat yang paling dulu dan paling mudah
untuk memasukkan cuplikan adalah syringe. Syringe disuntikkan
melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang
tahan tekanan sampai 1500 psi. akan tetapi akibat injeksi syringe
ini kurang baik karena partikel kecil dari septum yang terkoyak
(akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.
c. Loop Valve
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume
lebih besar dari 10 L dan dilakukan dengan cara otomatis (dengan
menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat
diinjeksifan secara manual).
3. Detektor
Detektor pada HPLC berfungsi untuk mendeteksi adanya komponen
sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadarnya
(analisis kuantitatif). Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi,
gangguan (noise) yang rendah, kisaran respons linier yang luas, dan
memberi respons untuk semua tipe senyawa. Detektor pada HPLC
dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:
a) Detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum,
tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor
indeks bias dan detektor spektrometri massa
b) Detektor spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik
dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
4. Pompa
Pompa pada HPLC berfungsi untuk mengalirkan fase gerak cair
melalui kolom, pompa yang digunakan dalam HPLC harus memenuhi
persyaratan :
1. Menghasilkan tekanan sampai 600 psi
2. Kecepatan alir berkisar antara 0,1-10 mL/menit
3. Bahan tahan korosi
4. Pompa harus Inert terhadap fasa gerak
Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan
karat, Teflon, dan batu nilam. Agar tahan lama pompa harus dirawat
dengan perlakuan yang benar,antara lain:
a. Menggunakan solvent yang tidak mengandung partikulat
b. Pompa tidak boleh dibiarkan kering, sehingga tidak terjadi geseran
yang mengakibatkan pompa mengalami kebocoran
c. Bila solvent mengandung garam, maka setelah digunakan pompa
harus dialiri dengan aquadest hingga bersih kemudian dibilas
dengan methanol agar tidak terjadi pengendapan dalam pompa dan
menimbulkan kerak.
d. Jangan menggunakan pompa dalam keadaan kering.
5. Kolom
Kolom pada HPLC berfungsi untuk tempat berlangsungnya proses
pemisahan analit. Kolom terbuat dari stainless steel atau dari bahan gelas.
Untuk kolom yang terbuat dari gelas memiliki kekurangan terhadap
tekanan tinggi, kolom ini hanya bisa dipakai dibawah tekanan sekitar 600

psi. Kolom berbentuk tabung lurus dengan diameter dalam 4-10 mm dan
ukuran partikel dalam kolom 5-10 m, kolom biasanya memiliki ukuran
antara 10-30 cm. Semakin panjang kolom yang digunakan semakin baik
resolusinya tetapi membutuhkan waktu yang lebih lama.
6. Fasa gerak ( eluen )
Fasa gerak pada HPLC berfungsi untuk membawa komponenkomponen campuran melalui kolom menuju detector, selain itu fasa gerak
dapat berinteraksi dengan solute-solute. Oleh karena itu, fasa gerak dalam
HPLC merupakan salah satu faktor penentu -keberhasilan proses
pemisahan. Fasa gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut.
7. Recorder
Recorder pada HPLC berfungsi untuk mengolah hasil pembacaan
detector dan menampilkannya dalam bentuk chromatogram. Pada HPLC
recorder ini dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas
chromathogram dan bahkan dapat menghitung kadarnya.

Prinsip
Dengan bantuan pompa, fasa gerak dialirkan melalui kolom ke detektor.
sampel dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan ( injeksi
). Didalam kolom, solut atau zat terlarut terpisah karena adanya perbedaan
kecepatan elusi, dikarenakan solut-solut ini melewati suatu kolom kromatografi.
Hasil pemisahan kemudian ditampilkan dalam bentuk kromatogram.

Jenis sample
Sample yang dapat dipisahkan dengan HPLC adalah sampel berupa zat
cair baik dalam bentuk senyawa ataupun molekulnya. Jika sample yang
digunakan mengandung banyak komponen, maka hasil kromatogram akan
memiliki banyak peak (puncak). Bahkan tak jarang antar peak dapat saling
bertumpuk (overlap). Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan
perhitungan konsentrasi. Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini
dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sampel yang siap
diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.

Metode Preparasi Sampel

Untuk sampel padatan, digerus hingga halus lalu ditimbang terlebih
dahulu dan diekstrak dengan reagen tertentu kemudian disaring dengan
ultrafiltrasi, filtrat hasil penyaringan di injeksi kan ke HPLC . Jika sampel yang
digunakan mengandung banyak komponen, maka dapat dilakukan preparasi
tertentu dengan reagen yang tepat.

Metode analisis
Metode analisis yang digunakan pada alat HPLC adalah metode
Kromatografi kolom yang mengandalkan gravitasi bumi dan pemisahan dengan
fasa gerak dan fasa diam. Untuk metode berdasarkan jenis sampel dapat dilihat
di tabel berikut:

Analit yang larut dalam pelarut organik

Kepolaran

Polar

Nonpolar

Contoh Analit

Alkaloid, Gula,
Senyawa Nitro

Steroid, Hidrokarbon

Mode

Normal Phase (NP)

Fasa gerak

heksan, khloroform

Reverse Phase ( RP )

acetonitril/air,
methanol/air,
THF/air

Analit yang larut dalam air

Senyawa

Ion

Asam lemah dan Basa

Mode

Ion Exchange (IE)

Reverse Phase ( RP )

Fasa gerak

Buffer

Buffer, Asam, Basa

Metode pengolahan data hasil analisis

Untuk pengolahan data hasil analisis pada Instrumen HPLC adalah sebagai
berikut :
Perhitungan kuantitatif

RD ( Respon Detektor ) Senyawa=

RD ( Respon Detektor ) Standar=

F( Faktor Koreksi)=

Luas puncak standar

Berat standar

RD Senyawa
RD Standar

Kadar komponen ( %Berat )=

Komposisi( )=

Luas puncak sampel

Berat sampel

Luas puncak komponen x Berat STD

x 100
F x Luas Puncak STD x Berat sampel

Luas puncak senyawa

x 100
Luas puncak total

Daftar Pustaka

TEORI-QUANTIFASI-HPLC.pdf
HPLC.pdf
farmasi-effendy2.pdf
07-A Practical Handbook of Preparative HPLC-Donald A Wellings1856174662-Elsevier Science-2006-17.pdf
http://lansida.blogspot.co.id/2010/07/hplc-kromatografi-cair-kinerjatinggi.html
http://indonesiakimia.blogspot.co.id/2011/05/high-performanceliquid-chromatography.html
http://materi-kimia-lengkap.blogspot.com/2014/07/kromatograficair-kinerja-tinggi-kckt.html
elisa.ugm.ac.id/user/archive/download/prinsip dasar hplc.pdf