UNIVERSIDAD EL BOSQUE

Programa de Biologa
Microbiologa Aplicada
Estudiante: Shirley Andrea Gil Gutierrez
Profesor: Juan Pablo Hernndez

Inmovilizacin de bacterias azospirillum brasilense en esferas de Alginato

Introduccin
La inmovilizacin celular se define como el confinamiento fsico o localizacin de las clulas
intactas en una determinada regin del espacio con la preservacin de su actividad
metablica (Kourkoutas et al., 2004). Dentro de los distintos tipos de inmovilizacin, el
atrapamiento dentro de una matriz porosa representa la solucin ms sencilla y efectiva
para inmovilizar microorganismos que no tienen una tendencia natural a unirse. Diversos
materiales han sido probados como soportes de inmovilizacin de clulas ; el material ms
ampliamente empleado para la inmovilizacin de clulas es el alginato de calcio, por su
biocompatibilidad y flexibilidad (Kurayama et al., 2010). El alginato es un componente de la
pared celular de las algas pardas, est formado por dos tipos de unidades monomericas: el
acido (1-4) D-manuronico y el acido (1,4)-L-guluronico. Cuando el alginato es expuesto a
la presencia de iones calcio se forma una red de entrecruzamiento con los polmeros del
cido gulurnico, que permite la inmovilizacin de clulas.
La inmovilizacin de microorganismos en alginato de calcio es el mtodo ms usado porque
debido a que en su preparacin no se requieren condiciones de reaccin extremas, es de
bajo costo y de baja toxicidad (Sanjay y col., 2008; de-Bashan y Bashan, 2010). Ha sido
considerado como un mtodo promisorio para incrementar la degradacin de compuestos
txicos debido a que las clulas atrapadas en el interior de la matriz estn protegidas contra
ambientes adversos, lo cual no sucede cuando las clulas son retenidas en la superficie de
un soporte. Adicionalmente, las clulas inmovilizadas son fcilmente liberadas al medio por
la disolucin del gel en presencia de agentes quelantes del calcio, tales como citrato de
sodio y fosfato de potasio (Mohammad y Bustard, 2008), lo cual permite cuantificar la
biomasa formada. En la prctica el alginato de calcio ha sido ampliablemente utilizado para
el atrapamiento de enzimas y clulas usadas para la remocin de iones metlicos por
absorcin en la biomasa de algas u hongos ; remocin de colorantes y compuestos
fenolicos (Dursun y Tepea, 2005), entre otros compuestos.

Los microorganismos interactan con los vegetales a nivel de races (rizsfera), hojas
(filsfera), granos (espermatsfera) y restos sobre el suelo (efecto mantillo),y los vegetales
actan sobre los microorganismos en forma: directa, por aporte de sustancias energticas,
estimulantes o inhibidoras, en forma de exudados radicales o restos vegetales; e
indirectamente por modificacin del medio fsico (temperatura y humedad) o qumico
(absorcin de nutrientes). La microflora acta sobre las plantas directamente por los
diferentes compuestos que liberan (nitratos, sulfatos, fitohormonas y fosfatos); e
indirectamente por modificacin del medio fsico (estructura) o qumico (inmovilizacin), con
carcter simbitico (FBN, micorrizas), sin carcter simbitico (asociaciones rizosfricas,
filosfricas y efecto mantillo) Las rizobacterias benficas que promueven el desarrollo

vegetal se designaron como promotoras del crecimiento vegetal (PGPR; Plant Growing
Promoting Rhizobacteria) y son extensamente estudiadas por sus efectos benficos en
rendimientos de importantes cultivos; VandeBroek et al. 1993). Azospirillum brasilense es
una de las bacterias ms estudiadas como promotoras del crecimiento vegetal. Se
considera una bacteria presente en el suelo con caractersticas como bacterias de vida libre,
la cual tiene la capacidad de afectar el crecimiento de numerosos cultivos agrcolas en todo
el mundo a travs de la excrecin de varias hormonas y la capacidad de fijacin de
nitrgeno de la bacteria. (EA, 1996)
Objetivo General
Comprender la tcnica de inmovilizacin de bacterias (Azospirillum brasilense) por
medio del mtodo de esferas de alginato.
Objetivos Especficos
1. Preparar medios de cultivos y soluciones necesarios para llevar a cabo el proceso
de inmovilizacin de bacterias de Azospirillum brasilense.
2. Aplicar el mtodo de esterificacin con alginato para la inmovilizacin de bacterias .
MATERIALES Y METODOS
Materiales:

Matraces Erlenmeyer de 500, 250 y 125 mL

Micro pipetas de 10-100 y de 100-1000 L y puntas para micro pipetas
Celdas de 1mL para espectrofotmetro
Tubos Eppendorf
Tubos de Ensaye vasos de precipitado
Pipetas
Agitador orbital
Placas de Petri
Esptula
Jeringa con aguja

Caldo nutritivo: 1,6g del

medio de cultivo en 200mL
de agua destilada.
GIL, 2016

GIL, 2016

Azospirillum brasilense

Agar Nutritivo: 4g del

medio de cultivo en 500mL
de agua destilada + 8.5g
de Agar-Agar con agua
destilada

900 L de solucin salina 0.85% + 4.25g

GIL, 2016

 5ml de solucin de bicarbonato de Sodio al 4%

Cloruro de Calcio al 2% en 500mL de agua destilada
Bicarbonato de Sodio 4% + 4g de Na2HCO3 en 100 mL de agua destilada

Resultados
Observacin Macroscpica:
Se identific una colonia de Azospirillum sp., empleando Tincin Gram. Las principales
caractersticas de la colonia tomadas en cuenta fueron: color fucsia, presencia de borde
regular y colonia con elevacin.

GIL, 2016

Figura 1. Tincin Gram Azospirillum: Gram negativa

.
Para la realizacin del cultivo, se utiliz la tcnica de repique por duplicado y se incubo
durante 24 horas; observando el crecimiento y las caractersticas de las colonias. A partir de
una muestra aislada y pura del cultivo.
Posteriormente, se realiz la preparacin del medio de cultivo y de las soluciones
empleadas en la inmovilizacin, que consisti en: Solucin salina 0,85% (isotnico), 12 g de

Alginato de Sodio (1,2%) en 100ml de agua destilada, Cloruro de Calcio 4%, Glicerina 20%
(Criopreservacin: Disminucin del metabolismo de los organismos).
Para llevar a cabo la inmovilizacin bacteriana, se sirvieron 2 tubos estriles de 50 mL con
cultivo de Azospirillum sp., se tap con papel aluminio, y se centrifugaron las muestras a
4000 rpm durante 10 minutos. Despus, el sobrenadante se sirvi en un vaso de
precipitado, y el paquete celular restante en los tubos se resuspendi con 50 mL de solucin
salina al 0.85%, se diluy en esta solucin, y nuevamente se centrifugaron a 4000 rpm
durante 10 minutos. Se repiti este proceso y lavado tres veces, hasta obtener un paquete
celular puro. A continuacin, en un vaso de precipitado con 100 mL de Cloruro de Calcio al
2% se adicion gota a gota una mezcla del paquete celular final con alginato con una
jeringa estril de 10 ml , generando inmediatamente las macro esferas de Azospirillum sp.
Finalmente, se sirvi el sobrenadante en las muestras que se encontraban en los tubos
eppendorf y se dejaron en refrigeracin para obtener la inmovilizacin de la bacteria
presente.
Conclusiones
El uso de microorganismos inmovilizados ha sido ampliamente explorado, tanto a nivel
industrial como de investigacin , el uso de matrices de inmovilizacin se ha convertido en
una solucin para proteger a los microorganismos por medio de geles (Kourkoutas et al.,
2004), lo que ha mejorado la tasa el incrementando el metabolismo de las clulas
inmovilizadas; ha disminuido la prdida de biomasa al permitir la adhesin o atrapamiento
no reversible de sta: son estas razones principalmente las que han permitido que cada da
se incremente el uso de estas tcnicas .

Bibliografa
EA, R. (1996). Influencia de la inoculacion de Azospirillum brasilience en trigo
cultivado en suelos de la Provincia de PAMPA,Argentina. Instituto de Microbiologia y
Zoologia Agricola, CICA INTA, Universidad Nacional de Lujn. Pcia de Bs, Argentina.
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Kourkoutas, Y., Bekatorou, A., Banat, I.M., Marchant, R. & Koutinas, A.A. (2004).
Immobilization technologies and support materials suitable in alcohol beverages
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Kurayama, F., Suzuki, S., Oyamada, T., Furusawa, T., Sato, M. & Suzuki, N. (2010).
Facile method for preparing organic/inorganic hybrid capsules using amino functional
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Sanjay, K., Asish, M., Pradeep, K., Saptadip, S., Bikash, R. Keshab, C. (2008).
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Mohammad, B.T. y Bustard, M.T. (2008). Fed batch bioconversion of 2-propanol by a
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Dursun, A.Y. y Tepea, O. (2005). Internal mass transfer effect on biodegradation of
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