Ctedra: Ingeniera de las Reacciones Bioqumicas.

Facultad de Ingeniera. UNSJ

2016

Prctica de laboratorio N 1: Parmetros cinticos en cultivo sumergido.

Objetivo General.

Determinar los parmetros cinticos de una cepa de Aspergillus japonicus, creciendo en medio lquido.

Objetivos especficos

Determinar cintica de crecimiento del cultivo.

Establecer los perfiles de actividad amiloltica producida durante el cultivo.

Relacionar los perfiles de actividad enzimtica que produce la cepa con la curva de crecimiento.

Metodologa y condiciones de cultivo.

Se multiplicar Aspergillus japonicus en cultivo por lote, en frascos erlenmeyer con bafles de 125 ml, conteniendo 30
ml de medio de cultivo.

Medio de cultivo.
Para los cultivos sumergidos se utilizar un medio consistente en: 5 g/L de extracto de levadura y 5 g/L de almidn. El
medio se preparar en Buffer Sodio-Citrato 0,2 M a pH 5, con el fin de que los cambios en el pH del medio no afecten
la expresin de la enzima.

Preparacin del inculo y cultivo en medio lquido.

Estas etapas se realizarn dos das antes de la ejecucin de la prctica de laboratorio:

Para la obtencin del inculo se emplear un cultivo desarrollado previamente en medio slido.

Los esporos del microorganismo se suspendern en solucin agua-tween 0,05%, estril y se cuantificarn en
Cmara de Neubauer.

En base al recuento previo, se realizarn las diluciones apropiadas para inocular 15 frascos de cultivo con 1x106
esporos/ml.

La temperatura de cultivo se mantendr constante a 24-26C.

Se proveer agitacin a los frascos erlenmeyer en agitador orbital.

Obtencin de muestras.
Durante el transcurso del cultivo (cada 4 hs y por 2 das) se tomar un frasco inoculado y se determinar:
Biomasa:
El contenido de cada frasco se filtrar con filtro de vaco en un papel previamente tarado, para retener la masa fngica.
El lquido filtrado se retirar y se lavar el contenido del papel de filtro con agua destilada. Luego se colocar el papel

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con el hongo lavado en una balanza para peso seco Ohaus, con lmpara halgena, a 80C, para determinar el peso seco
de biomasa fngica.
Medio lquido:
El lquido obtenido de la filtracin, en la etapa anterior, se centrifugar a 5000 rpm durante 10 minutos y luego se
tomarn 3 muestras de sobrenadante para determinaciones analticas de azcares totales y reductores; pH y actividad
amiloltica.

Las determinaciones que se harn son:

Biomasa producida: como peso seco constante.

Azcares totales y reductores: mtodo con fenol sulfrico y DNS, respectivamente. Ver tcnica aparte.

pH: se tomar su valor en el filtrado, antes de centrifugar el lquido.

Actividad -amilasa: ver tcnica aparte.

Resultados.
1. Trazar los perfiles de crecimiento del hongo y de actividad amiloltica.
2. Establecer la relacin entre el crecimiento y la formacin del producto.
3. Determinar los rendimientos de biomasa y de actividad enzimtica en base al sustrato consumido.

Materiales a utilizar.

Vasos de precipitado

Tubos de ensayo

Erlenmeyers de 125 ml

Termmetros

Pipetas automticas

Ph-metro

Microscopio ptico

Cmara de Neubauer

Agitador orbital

Filtro de vaco

Centrfuga

Analizador de humedad

Bao de agua termostatizado para gradillas

Espectrofotmetro

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Tcnica para determinacin de azcares reductores.

1ml de muestra

1ml de DNS

Dejar 5 min a 100C

Enfriar y agregar 8ml de agua destilada

Leer en espectrofotmetro a 540 nm

Realizar una curva de calibracin con patrones de Glucosa de 0 a 1000 ppm (0, 200, 400, 600, 800 y 1000)
Es probable que sea necesario diluir las muestras antes de medir Absorbancia. Hacer diluciones 1/10 1/20

Tcnica para determinacin de azcares totales: Mtodo de Dubois (Fenol/Sulfrico).

En tubos bien limpios sumergidos en bao de agua-hielo agregar 0,5 ml de muestra, 0,5 ml de fenol 5% p/v y 2,5 ml de
H2SO4 concentrado. Agitar con vrtex con mucho cuidado cada tubo y llevar a bao Mara hirviendo durante 5
minutos. Enfriar rpidamente en agua-hielo. Leer en espectrofotmetro a 490 nm.
Realizar una curva de calibracin con patrones de Glucosa de 0 a 300 ppm (0, 50, 100, 150, 200, 250 y 300)
Es probable que sea necesario diluir las muestras antes de medir Absorbancia. Hacer diluciones 1/50 1/100

Tcnica para determinacin de actividad -amilasa.

800 l de solucin de almidn (1% p/v)

200 l de muestra
Dejar 20 min a 40C

1 ml de DNS

Dejar 5 min a 100C

Enfriar y agregar 8ml de agua destilada

Leer en espectrofotmetro a 540 nm

Realizar una curva de calibracin con patrones de Glucosa de 0 a 1000 ppm (0, 200, 400, 600, 800 y 1000)