Anda di halaman 1dari 3

Uji ACE inhibitor

Uji ACE inhibitor didasarkan pada metode Arihara


et al. (2001). Sebanyak 50 l sampel (15 mg/ml)
ditambah 125 l buffer substrat (7,6 mM HHL dan 608
mM NaCl dalam 10 ml buffer borat pH 8,3). Campuran
diinkubasi pada suhu 37oC selama 15 menit.
Selanjutnya, 50 l enzim ACE 50 mU/ml ditambahkan
pada campuran kemudian diinkubasi selama 30 menit.
Reaksi dihentikan dengan penambahan 200 l HCl 1
N. Campuran divortex, ditambah dengan 1140 l etil
asetat kemudian disentrifuse 10.000 g selama 10
menit. Supernatan sebanyak 1000 l diambil dan
dikeringkan pada suhu 95 oC selama 90 menit. Asam
hipurat yang terbentuk dilarutkan ke dalam 1000 l
aquabides. Absorbansi diukur pada panjang
gelombang 228 nm menggunakan spektro UV-vis dan
sebagai kontrol positif digunakan captopril. Persen
penghambatan ACE ditentukan dengan rumus :
(%) penghambatan =
Keterangan : A (Absorbansi kontrol)
B (Absorbansi blanko kontrol)
C (Absorbansi sampel)
D (Absorbansi blanko sampel)

Bahan utama yang digunakan pada penelitian adalah organ dalam bandeng fase
post rigor yaitu pilorik kaeka, hepatopankreas dan usus. Kolagen untuk substrat
enzim, dibuat
dari kulit ikan bandeng dengan metode Lestari (2005). Bahan-bahan kimia yang
digunakan
adalah Triton-X 100, CaCl2, asam trikloro asetat, L-leusin, 1-propanol, dan
pereaksi
Bradford. Logam-logam yang digunakan untuk karakterisasi yaitu NaCl, CaCl2,
MnCl2 dan
CoCl2, inhibitor yang digunakan adalah EDTA, PMSF dan pepstatin. Peralatan
yang
digunakan antara lain spektrofotometer sinar tampak, sentrifus dingin, shaker
inkubator, oven,
mikropipet, homogenizer.
Metode Penelitian
Ektraksi enzim kolagenase diperoleh dari organ dalam bandeng, mengacu pada
metode Kim et al. (2002) yang dimodifikasi. Substrat kolagen terbuat dari kulit
bandeng.

Pada penelitian ini akan dilakukan modifikasi konsentrasi ninhidrin, konsentrasi


TCA dan
jumlah enzim kolagenase yang ditambahkan secara bertahap.
Optimalisasi metode uji aktivitas kolagenase mengacu pada metoda
spektrofotometri
(Moore dan Stein 1954, diacu dalam Kim et al. 2002) yaitu sebanyak (0,2; 5; 10)
ml larutan
kolagenase ditambah dengan 5 mlml kolagen dan 1 ml 0,05 mM tris-HCl pada pH
7,5 yang
mengandung 5 mM CaCl2. Reaksi ini dilakukan pada suhu 37 C selama 1 jam.
Reaksi
dihentikan dengan penambahan 0,2 ml; (0,2; 0,5; 1; 2; 5; 10; 50)% TCA. Setelah
10 menit
pada suhu ruang, larutan disentrifus pada 1.800 rpm selama 20 menit. Supernatan,
sebanyak
0,2 ml dicampur dengan 1,0 ml larutan ninhidrin (0,2; 0,5; 1; 1,5; 2%), diinkubasi
pada suhu
100 C selama 20 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Campuran
kemudian
ditambah dengan 5 ml 50% 1-propanol dan diukur serapannya menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 570 nm. Larutan buffer Tris-HCl
digunakan
sebagai blanko, dan L-leusin digunakan sebagai standar (asam amino hasil
hidrolisis
kolagenase). Satu unit aktivitas kolagenase didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang
menyebabkan perubahan 1 mol substrat per menit.

Aktivator Enzim
Suatu senyawa, unsur atau ion, kadang-kadang dapat meningkatkan aktivitas kerja
suatu enzim. Zat-zat yang mempunyai peranan demikian disebut aktivator enzim.
Beberapa enzim yang dihasilkan dalam bentuk tidak aktif (inaktif) disebut
proenzim atau zimogen. Apabila zimogen pada kondisi tertentu berhubungan
dengan aktivatornya, enzim ini akan berubah menjadi enzim yang aktif.
Pepsinogen, tripsinogen, kimotripsinogen dan prokarboksipeptidase adalah
contoh-contoh zimogen yang terdapat di saluran cerna.
Kebanyakan aktivator adalah ion-ion anorganik, terutama ion logam atau kation.
Aktivator yang baik untuk enzim deoksiribonuklease adalah ion-ion Mg, Mn+2,
Co+2 dan Fe+2, sedangkan aktivator yang lemah untuk enzim ini adalah ion-ion
Ca+2, Ba+2, Sr+2 dan Cd+2. Aktivator untuk enzim trombiokinase dan enzim
plasma fosfa lase adalah ion Mg+2, sedangkan aktivator untuk enzim
trombiokinaase adalah ion Ca+2. Selain aktivator kation, ada juga aktivator anion,
misalnya aktivator ion Cl-. untuk amilase ludah atau ptialin.
Ada beberapa enzim yang dapat berfungsi sebagai aktivator zimogen, antara lain
(a) pepsin dapat mengubah pepsinogen menjadi pepsin;
(b) enterokinase dan tripsin dapat mengubah tripsinogen menjadi tripsin;
(c) tripsin dan kimotripsin dapat mengubah kimotripsinogen menjadi kimotripsin
dan
(d) tripsin dapat mengubah prokarboksipeptidase menjadi karboksipeptidase.