DNA RECOMBINANTE

Generalidades del DNA recombinante.

El trmino DNA recombinante hace referencia a la creacin de nuevas combinaciones de segmentos o de
molculas de DNA que no se encuentran juntas de manera natural. Aunque el proceso gentico de la
recombinacin produce DNA recombinante, este trmino se reserva a las molculas de DNA producidas por la
unin de segmentos que provienen de diferentes fuentes biolgicas.
La tecnologa del DNA recombinante utiliza tcnicas que provienen de la bioqumica de los cidos nucleicos unidas
a metodologas genricas desarrolladas originalmente para la investigacin de bacterias y de virus. La utilizacin
del DNA recombinante es una herramienta poderosa para el aislamiento de poblaciones puras de secuencias
especficas de DNA a partir de una poblacin de secuencias mezcladas. Los procedimientos bsicos incluyen una
serie de pasos:
1. Los fragmentos de DNA se generan utilizando unas enzimas denominadas endonucleasas de restriccin,
que reconocen y cortan las molculas de DNA por secuencias nucleotdicas especficas.
2. Los fragmentos producidos mediante la digestin con enzimas de restriccin se unen a otras molculas de
DNA que sirven de vectores. Los vectores pueden replicarse autnomamente en una clula husped y facilitan
la manipulacin de la molcula de DNA recombinante recin creada.
3. La molcula de DNA recombinante, formada por un vector que lleva un segmento de DNA insertado, se
transfiere a una clula husped. Dentro de esta clula, la molcula de DNA recombinante se replica,
produciendo docenas de copias idnticas conocidas como clones.
4. Al replicarse las clulas husped, las clulas descendientes heredan el DNA recombinante, crendose una
poblacin de clulas idnticas, que llevan todas la secuencia clonada.
5. Los segmentos de DNA clonados pueden recuperarse de las clulas husped, purificarse y analizarse.
6. Potencialmente, el DNA clonado puede transcribirse, su mRNA puede traducirse, y el producto gnico puede
aislarse y examinarse.

Fabricacin del DNA recombinante.

El desarrollo de las tcnicas de DNA recombinante ofrece nuevas oportunidades para la investigacin, ya que
simplifica la obtencin de grandes cantidades de DNA que codifican genes especficos, y facilita las
investigaciones de la organizacin, estructura y expresin gnicas.
Esta metodologa tambin ha dado un impulso al desarrollo de la naciente industria biotecnolgica, que est
suministrando un nmero creciente de productos al mercado. El DNA recombinante produce grandes cantidades
de copias de segmentos de DNA especficos, incluyendo genes.

Enzimas de restriccin.
La piedra angular de la tecnologa del DNA recombinante es un tipo de enzimas denominadas endonucleasas de
restriccin. Estas enzimas, aisladas en bacterias, reciben este nombre debido a que limitan o previenen las
infecciones vricas degradando el cido nucleico invasor. Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia
especfica de nucletidos (denominada sitio de restriccin) de una molcula de DNA de doble cadena, y cortan el
DNA por esa secuencia. El premio Nobel de 1978 se otorg a Werner Arber, Hamilton Smith y Daniel Nathans por
su investigacin sobre las enzimas de restriccin. Hasta la fecha, se han aislado y caracterizado casi 200 tipos de
enzimas de restriccin diferentes.

La enzima de restriccin EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindrmica

GAATTC. El corte del DNA en este sitio produce colas de cadena sencilla
complementarias. La colas de cadena sencilla resultantes pueden unirse con colas
complementarias de otros fragmentos de DNA para formar molculas de DNA
recombinante.

Las enzimas de restriccin se denominan segn el organismo en el que se descubrieron, utilizando un sistema
alfanumrico. La enzima EcoRI proviene de Escherichia coli; HindIII se descubri en Hemophilus influenzae. Hay
dos tipos de enzimas de restriccin:
Las enzimas de Tipo I cortan las dos cadenas del DNA en una posicin aleatoria a cierta distancia del sitio de
restriccin. No se utilizan normalmente en la investigacin de DNA recombinante ya que el sitio de corte no es
preciso.
Las enzimas de Tipo II reconocen una secuencia especfica y cortan las dos cadenas de la molcula de DNA con
absoluta precisin dentro de la secuencia reconocida. Se usan ampliamente en investigacin de DNA
recombinante puesto que cortan en sitios especficos. Las secuencias reconocidas por las enzimas de Tipo II
son simtricas (palindrmicas), es decir, la secuencia de una de las cadenas leda en direccin 5' 3' es la
misma que la secuencia de la cadena complementaria leda tambin en direccin 5' 3'.
La enzima EcoRI corta las cadenas de manera escalonada dentro del sitio de reconocimiento, dejando extremos
de cadena sencilla. Estas colas, que tienen secuencias nucleotdicas idnticas, son pegajosas (cohesivas), ya
que pueden unirse a colas complementarias de otros fragmentos de DNA mediante puentes de hidrgeno. Si
molculas de DNA de diferente origen comparten los mismos sitios de reconocimiento palindrmicos, ambas
tendrn colas complementarias de cadena sencilla cuando se traten con una endonucleasa de restriccin. Si estos
fragmentos se ponen juntos bajo determinadas condiciones, los fragmentos de DNA de distinto origen pueden
formar molculas recombinantes estableciendo puentes de hidrgeno entre los extremos cohesivos. Luego se
utiliza la enzima DNA ligasa para unir covalentemente los esqueletos azcar-fosfato de los dos fragmentos,
producindose as una molcula de DNA recombinante.

Para formar molculas de DNA recombinante, se corta DNA de

distintas fuentes con EcoRI y se mezcla para que se unan
formando molculas recombinantes. Despus se utiliza la enzima
DNA ligasa para unirlos covalentemente en molculas de DNA
recombinante.

Algunas enzimas de restriccin comunes, con sus sitios de reconocimiento y de corte, el patrn de corte y la fuente de origen.

Otras enzimas de restriccin de Tipo II, como SmaI, cortan el DNA formando fragmentos romos. Los fragmentos
de DNA con extremos romos tambin pueden unirse y formar molculas recombinantes, pero primero deben
modificarse. La enzima desoxinucleotidil transferasa terminal se utiliza para crear extremos de cadena sencilla
mediante la adicin de colas de nucletidos. Si a uno de los DNA se le aade una cola de poli-dA, y al otro DNA
se le aade una cola de poli-dT, se forman colas complementarias, y los fragmentos pueden unirse mediante
puentes de hidrgeno. Entonces, por ligacin, pueden formarse molculas recombinantes.

Las molculas de DNA recombinante pueden

formarse a partir DNA cortado con enzimas que
dejan extremos romos. En este mtodo se
utiliza la enzima desoxinucleotidil transferasa
terminal para crear colas complementarias
mediante la adicin de fragmentos de poli-dA y
de poli-dT. Estas colas sirven para unir el DNA
de diferentes fuentes y para crear molculas de
DNA
recombinante,
que
son
unidas
covalentemente por tratamiento con la DNA
ligasa.

Vectores
Despus de unirse a un vector o vehculo de clonacin, un segmento de DNA puede llegar a entrar en una clula
husped y replicarse o clonarse. Los vectores son, esencialmente, molculas de DNA transportadoras. Para servir
de vector, una molcula de DNA debe tener unas determinadas caractersticas:
1. Debe poder replicarse independientemente junto con el segmento de DNA que transporta.
2. Debe contener algunos sitios de corte para enzimas de restriccin, presentes slo una vez en el vector. Estos
sitios de restriccin se cortan con una enzima de restriccin y se utilizan para insertar segmentos de DNA
cortados con la misma enzima.

3. Debe tener algn marcador de seleccin (normalmente genes de resistencia a antibiticos o genes de enzimas
que la clula husped no tiene) para poder distinguir las clulas husped que transportan el vector de las que
no lo contienen.
4. El vector de la clula husped debe ser fcil de recuperar.
Actualmente se utilizan tres tipos principales de vectores: los plsmidos, los bacterifagos y los csmidos.

Plsmidos.
Los plsmidos son molculas de DNA de doble cadena extracromosmicas de origen natural que tienen un
origen de replicacin (ori+) y que se replican autnomamente en las clulas bacterianas. Para poder utilizarlos
en ingeniera gentica, se han modificado o diseado muchos plsmidos de manera que contengan un nmero
limitado de sitios de restriccin y genes de resistencia a antibitico s especficos.
El vector pBR322 fue uno de los primeros plsmidos diseados que se utiliz en DNA recombinante. Este
plsmido tiene un origen de replicacin (ori+), dos genes de seleccin (resistencia a los antibiticos ampicilina y
tetraciclina), y algunos sitios de restriccin nicos.

Mapa de restriccin del plsmido pBR322, que muestra las

localizaciones de los sitios de las enzimas de restriccin que
cortan el plsmido por un solo sitio. Estos sitios pueden utilizarse
para insertar los fragmentos de DNA a clonar. Tambin se
muestran las localizaciones de los genes de resistencia a
antibiticos.

Dentro del gen de resistencia a tetraciclina hay sitios de restriccin nicos para las enzimas BamHI, SphI, SalI,
XmaIII y NruI, y dentro del gen de resistencia a ampicilina hay sitios de restriccin nicos para las enzimas
RruI, PvuI y PstI. Si se introduce pBR322 en una clula bacteriana sin plsmidos y sensible a antibiticos, la
clula se convertir en resistente a la tetraciclina y a la ampicilina. Si se inserta un fragmento de DNA en los
sitios de restriccin RruI, PvuI, o PstI, se inactivar el gen de resistencia a ampicilina, pero el gen de resistencia
a tetraciclina seguir activo. Si este plsmido recombinante se transfiere a una clula bacteriana que no
contenga plsmidos, las clulas que contengan el plsmido recombinante podrn identificarse, ya que sern
resistentes a tetraciclina y sensibles a ampicilina.
Con el paso del tiempo se han desarrollado vectores plasmdicos ms sofisticados, que ofrecen diversas
caractersticas tiles. Uno de estos plsmidos, que deriva de pBR322, es el pUC18, que tiene las siguientes
caractersticas:
1. El plsmido tiene la mitad de tamao que pBR322, lo que permite insertar fragmentos de DNA ms largos.
2. pUC18 se replica produciendo unas 500 copias por clula, lo que significa unas 5 10 veces ms que las
que produce pBR322.
3. Tiene un gran nmero de sitios de restriccin nicos, agrupados en una regin denominada sitio de
clonacin mltiple (poliylinker).
4. El plsmido contiene un fragmento de un gen bacteriano denominado lacZ, y el sitio de clonacin mltiple
est insertado dentro de ste fragmento del gen. El gen lacZ normal codifica la -galactosidasa, enzima que
corta molculas de azcar. Cuando pUC18 se introduce en una clula husped bacteriana que tiene el gen
lacZ mutante, se produce -galactosidasa funcional. La presencia de -galactosidasa funcional en una
colonia bacteriana puede detectarse mediante un ensayo colorimtrico. Las clulas bacterianas que
contienen pUC18 forman colonias de color azul cuando crecen en un medio que contiene una sustancia
denominada X-gal. Si hay DNA insertado en el sitio de clonacin mltiple, se interrumpe el gen lacZ y se
forman colonias blancas. Las colonias blancas, resistentes a ampicilina, contienen plsmidos con DNA
insertado.

El plsmido pUC18 ofrece varias ventajas

como vector de clonacin. Debido a su
pequeo
tamao,
puede
aceptar
fragmentos de DNA relativamente grandes;
se replica hasta un alto nmero de copias,
y tiene un gran nmero de sitios de
restriccin en el sitio de clonacin mltiple,
localizado dentro del gen lacZ. Las
bacterias que contienen pUC18 producen
colonias de color azul si crecen en un
medio que contenga X-gal. El DNA
insertado en el sitio de clonacin mltiple
interrumpe el gen lacZ, resultando en
colonias blancas, lo que permite la
identificacin directa de las colonias que
tienen insertos de DNA clonados.

Bacterifagos lambda (fago ) y M13.

Lambda es un bacterifago muy utilizado en experimentos de DNA recombinante. Se han identificado y
cartografiado todos los genes de lambda, y se conoce toda la secuencia nucleotdica de su genoma. El tercio
central de su cromosoma es prescindible, y puede reemplazarse por DNA exgeno sin afectar la capacidad del
fago para infectar clulas y formar calvas. Se han desarrollado ms de 100 vectores basados en el fago
lambda, eliminando diversas porciones del grupo gnico central.
Para clonar utilizando el fago lambda, se corta el DNA del fago con una enzima de restriccin (por ejemplo,
EcoRI), lo que produce un brazo izquierdo, un brazo derecho y una regin central. Se aslan los brazos y se
ligan (utilizando la DNA ligasa) a un segmento de DNA obtenido tras cortar DNA genmico con la misma
enzima de restriccin (en este ejemplo, con EcoRI).
Las molculas recombinantes resultantes pueden introducirse en clulas husped bacterianas por transfeccin.
Primero, se permeabilizan las clulas husped mediante un tratamiento qumico, y se mezclan con las
molculas ligadas. Los vectores que contienen el inserto entran en las clulas husped, donde dirigen la
sntesis de fagos infectivos, llevando cada uno de ellos el inserto de DNA. Como alternativa, se mezcla el DNA
de lambda que contiene el inserto con los componentes proteicos del fago; de esta mezcla se forman partculas
fgicas infectivas. Los fagos pueden amplificarse hacindolos crecer en placas sembradas con bacterias,
donde se formarn calvas, o bien infectando clulas en un medio lquido y recogiendo las clulas lisadas.

Pasos en
la
clonacin
utilizando el fago lambda como vector. Se extrae el DNA de una preparacin de fago lambda y se elimina el grupo central de
genes por tratamiento con una enzima de restriccin. El DNA a clonar se corta con la misma enzima y se liga entre los brazos
del cromosoma de lambda. Luego se empaqueta el cromosoma recombinante dentro de las protenas del fago para formar un
virus recombinante. Este virus puede infectar clulas bacterianas y replicar su cromosoma, incluido el inserto de DNA.

Tambin se utilizan otros bacterifagos como vectores, entre los que destaca el fago de cadena sencilla M13.
Cuando M13 infecta a una clula bacteriana, la cadena sencilla (cadena +) se replica y produce una molcula de
doble cadena denominada forma replicativa (RF). Las molculas RF pueden considerarse similares a los
plsmidos, pudindose insertar DNA exgeno en sitios de restriccin nicos presentes en el DNA del fago. Cuando
se reinsertan en clulas bacterianas, las molculas RF se replican y producen cadenas sencillas (+), en las que
hay una cadena del DNA insertado. La clula hace salir los clones de DNA de cadena sencilla que produce M13,
que pueden recuperarse y utilizarse directamente para su secuenciacin, o como molde para alteraciones
mutacionales de la secuencia clonada.

Los csmidos y los vectores transbordadores

Los csmidos son vectores hbridos construidos utilizando partes del cromosoma del fago lambda y de DNA
plasmdico. Los csmidos contienen la secuencia cos del fago lambda, necesaria para el empaquetamiento
del DNA del fago dentro de su cubierta proteica, y secuencias plasmdicas de replicacin y de genes de
resistencia a antibiticos, que permiten identificar las clulas husped que los contienen. El DNA de los
csmidos que contiene insertos de DNA se empaqueta en la cpside proteica de lambda para formar partculas
fgicas infectivas. Una vez el csmido entra en la clula husped, se replica como un plsmido. Puesto que la
mayora del genoma de lambda se ha delecionado, los csmidos pueden transportar insertos de DNA mucho
ms grandes que los que lambda puede llevar. Los csmidos pueden transportar casi 50kb de DNA insertado,
mientras que los vectores fgicos pueden acomodar insertos de DNA de unas 15kb y los plsmidos
generalmente estn limitados a insertos de 5-10kb.
El csmido pJBS contiene un origen de
replicacin bacteriano (ori), un solo sitio cos, un
gen de resistencia a ampicilina (ampR , para
seleccionar las colonias que han incorporado el
csmido), y una regin que contiene cuatro
sitios de restriccin para la clonacin (BamHI,
EcoRI, ClaI y Hindlll). Puesto que el vector es
pequeo (5,4kb de longitud), puede aceptar
segmentos de DNA exgeno de 33 a 46kb de
longitud. El sitio cos permite que el csmido
que contenga un inserto grande se empaquete
con protenas de cubierta vrica de lambda
como si fuesen cromosomas vricos. Las
cubiertas vricas que contienen un csmido
pueden utilizarse para infectar clulas husped
adecuadas, y el vector, que transporta el
inserto de DNA, se transferir a la clula
husped. Una vez dentro, la secuencia ori
permite que el csmido se replique como un
plsmido bacteriano.

Existen otros vectores hbridos, construidos con orgenes de replicacin provenientes de distintas fuentes (por
ejemplo, plsmidos y virus animales como SV40), que pueden replicarse en ms de un tipo de clula husped.
Generalmente, estos vectores transbordadores contienen marcadores genticos que permiten su seleccin en los
dos sistemas husped, y pueden utilizarse para transportar insertos de DNA entre E.coli y otras clulas husped,
como levadura, y viceversa. A menudo, estos vectores se emplean para investigar la expresin gnica.

Pasos en la clonacin utilizando csmidos como vectores.

Cromosomas artificiales bacterianos.

Para cartografiar y analizar genomas eucariticos complejos, se ha desarrollado un vector multiuso
denominado cromosoma artificial bacteriano (BAC) basado en el factor F de bacterias. El factor F es un
plsmido que se replica independientemente y que est implicado en la transferencia de informacin gentica
durante la conjugacin bacteriana. Puesto que los factores F pueden transportar fragmentos del cromosoma
bacteriano de hasta 1Mb, han sido diseados para que funcionen como vectores de DNA eucaritico. Los
vectores BAC tienen los genes de replicacin y de nmero de copias del factor F, e incorporan un marcador de
resistencia a un antibitico y sitios de restriccin para insertar el DNA exgeno que se desee donar. Adems, el
sitio de donacin est flanqueado por regiones promotoras que pueden utilizarse para generar molculas de
RNA y expresar as el gen donado, o para utilizadas como sonda para paseo cromosmico, y para secuenciar
el DNA del inserto clonado.

Cromosoma artificial bacteriano (BAC). El sitio de

clonacin mltiple tiene diversos sitios de
restriccin nicos para la insercin de DNA
exgeno. Las flechas marcadas como T7 y Sp6
son regiones promotoras que permiten la
expresin de los genes clonados entre estas
regiones.

Transformacin del DNA.

Uno de los mecanismos por el cual el DNA puede movilizarse entre las bacterias es la transformacin, descubierta
por Fred Griffith en 1928. La transformacin consiste en la captacin por parte de una clula receptora de una
molcula o fragmento de DNA desnudo y la incorporacin de esta molcula al cromosoma del receptor en una
forma heredable. En la transformacin natural, el DNA procede de una bacteria donadora. Es un proceso aleatorio,
y puede transferirse cualquier porcin del genoma entre bacterias.
Cuando las bacterias se lisan, liberan unas cantidades considerables de DNA al medio que las rodea. Estos
fragmentos liberados pueden ser relativamente grandes y contener diversos genes. Si un fragmento establece

contacto con una clula competente, es decir, una clula capaz de captar DNA y ser transformada, dicho
fragmento puede unirse a la clula y ser transportado a su interior. La frecuencia de transformacin de las clulas
muy competentes cuando se utiliza un exceso de DNA es de alrededor de 10 -3 para la mayora de los gneros. Es
decir, aproximadamente una clula de cada mil toma e integra el gen. La competencia es un fenmeno muy
complejo y depende de diversas condiciones. Es preciso que las bacterias se encuentren en una determinada fase
de crecimiento, por ejemplo, S.pneumoniae se vuelve competente durante la fase exponencial, cuando la
poblacin alcanza las 107 108 clulas/mL. Cuando una poblacin se vuelve competente, las bacterias del tipo de
los neumococos segregan una pequea protena denominada factor de competencia que estimula la produccin
de 8 a 9 nuevas protenas necesarias para el proceso de transformacin. La transformacin natural slo se ha
descubierto hasta la fecha en ciertos gneros de bacterias grampositivas y gramnegativas:
Streptococcus, Bacillus, Thermoactinomyces, Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Azotobacter y Pseudomonas,
aunque otros gneros tambin puede que sean capaces de experimentar transformacin. La transferencia de
genes mediante este proceso ocurre en medios terrestres y marinos, y puede constituir una importante ruta de
intercambio gentico en la naturaleza.

Transformacin natural con fragmentos de DNA.

La transformacin en Haemophilus influenzae, una bacteria gramnegativa, difiere de la de S.pneumoniae en

diversos aspectos. Haemophilus no produce un factor de competencia para estimular el desarrollo de
competencia, y slo capta el DNA procedente de especies estrechamente relacionadas. El DNA bicatenario forma
complejos con protenas y es captado por vesculas de membrana. La especificidad de la transformacin de
Haemophilus se debe a una secuencia especial de pares de bases (5'-AAGTGCGGTCA-3') que se repite unas
1.400 veces en el DNA de H.influenzae. El DNA debe contener esta secuencia para que una clula competente se
una a l.
La transformacin artificial se lleva a cabo en el laboratorio mediante diversas tcnicas, entre ellas el tratamiento
de las clulas con cloruro clcico, que aumenta la permeabilidad de sus membranas al DNA. Este enfoque tiene
xito incluso con especies que no son competentes de forma natural, como E.coli. Para aumentar la frecuencia de
transformacin se utilizan concentraciones relativamente ms altas de DNA, superiores a las que estn presentes
en condiciones normales en la naturaleza. Cuando se utilizan para la transformacin fragmentos lineales de DNA,
suele hacerse que E.coli pierda la actividad de una o ms exonucleasas con el fin de proteger los fragmentos
transformantes. Resulta ms sencillo transformar bacterias con DNA de plsmido, ya que los plsmidos no se
degradan con tanta facilidad como los fragmentos lineales y son capaces de replicarse dentro del husped. ste
es un mtodo habitual para introducir DNA recombinante en las clulas bacterianas. Puede introducirse DNA de
cualquier fuente en las bacterias insertndolo en un plsmido antes de la transformacin.

Transformacin artificial con plsmidos.

Transduccin.
Los virus bacterianos o bacterifagos participan en otra modalidad de transferencia gnica bacteriana. Estos virus
tienen estructuras relativamente sencillas en las que el material gentico del virus est incluido dentro de una
cubierta externa, compuesta principalmente o exclusivamente de protenas. La cubierta protege el genoma y lo
transmite entre clulas husped.
Despus de infectar la clula husped, un bacterifago a menudo toma el control y obliga al husped a fabricar
numerosas copias del virus. Finalmente la bacteria husped estalla o se lisa y libera los nuevos fagos. Este ciclo
reproductor se denomina ciclo ltico porque concluye con la lisis del husped. Consta de cuatro fases:
En la primera, la partcula viral se fija a un sitio receptor especfico de la superficie bacteriana.
En la segunda, el material gentico del virus que con frecuencia es DNA bicatenario, penetra entonces en la clula.
Tras la adsorcin y la penetracin, el cromosoma viral obliga a la bacteria a fabricar cidos nucleicos y
protenas del virus.
La tercera fase comienza tras la sntesis de los componentes virales. Se ensamblan fagos a partir de estos
componentes. El proceso de ensamblaje puede ser complejo, pero en todos los casos el cido nucleico se
introduce (se empaqueta) en la cpside proteica viral.
Finalmente, los virus maduros son liberados al medio mediante la lisis de la clula husped.
Los virus bacterianos que se reproducen mediante un ciclo ltico a menudo se denominan bacterifagos virulentos
porque destruyen la clula husped. Muchos fagos DNA, como el fago lambda, tambin son capaces de
establecer una relacin diferente con su husped. Tras la adsorcin y la penetracin, el genoma viral no toma el
control de su husped ni lo destruye, al tiempo que produce nuevos fagos. En cambio, el genoma permanece en el
interior de la clula husped y se reproduce junto con el cromosoma bacteriano. Se origina un clon de clulas
infectadas que puede crecer durante un largo perodo con apariencia totalmente normal. Cada una de estas
clulas infectadas es capaz de producir fagos y lisarse bajo las condiciones ambientales apropiadas. Esta relacin
entre el fago y el husped se denomina lisogenia. La forma latente del genoma viral que permanece en el interior
de la clula husped sin destruirla se denomina profago y suele estar integrado en el genoma bacteriano. En
ocasiones, la produccin de fagos se activa en un cultivo de bacterias lisgenas mediante la exposicin a
radiacin UV u otros factores. Las clulas lisgenas son destruidas y se liberan nuevos fagos. Este fenmeno se
denomina induccin.
Por lo tanto, la transduccin natural es la transferencia de genes bacterianos por medio de virus. Se produce la
incorporacin de genes bacterianos al interior de la cpside de un fago a consecuencia de errores cometidos
durante el ciclo vital del virus. El virus que contiene estos genes los inyecta a continuacin en otra bacteria,
completando de esta forma la transferencia. La transduccin es el mecanismo ms frecuente de intercambio y
recombinacin gnica en las bacterias.

Se distinguen dos tipos muy diferentes de transduccin:

Generalizada. Ocurre durante el ciclo ltico de fagos virulentos y atemperados, y es capaz de transferir
cualquier parte del genoma bacteriano. Durante la fase de ensamblaje, cuando los cromosomas virales son
empaquetados en el interior de cpsides proteicas pueden quedar encapsidados fragmentos del cromosoma
bacteriano parcialmente degradado. Puesto que la cpside slo puede contener una cantidad limitada de DNA,
el DNA del virus no se incorpora a la cpside, y slo queda incluido en ella el DNA bacteriano. La cantidad de
DNA bacteriano transportada depende principalmente del tamao de la cpside.

Especializada. En ella la partcula transductora transporta slo porciones especficas del genoma bacteriano.
La transduccin especializada es posible a consecuencia de un error durante el ciclo vital lisognico. Cuando
se induce a un fago a abandonar el cromosoma de la clula husped, en ocasiones la escisin se realiza de
forma incorrecta. El genoma del fago resultante contiene porciones del cromosoma bacteriano
(aproximadamente, entre el 5 y el 10 % del DNA bacteriano) adyacentes al sitio de integracin. El genoma del
fago originado en la transduccin suele ser defectuoso y carece de alguna parte de su sitio de fijacin. La
partcula transductora inyecta los genes virales a otra bacteria, aunque el fago defectuoso no es capaz de
reproducirse sin ayuda. Los genes bacterianos pueden quedar incorporados de forma estable en las
condiciones adecuadas. El ejemplo mejor estudiado de transduccin especializada es el fago lambda.

Construccin de bibliotecas de DNA

Puesto que cada segmento de DNA clonado es relativamente pequeo, deben construirse muchos clones
diferentes para incluir todas las pequeas porciones del genoma de un organismo. El conjunto clonado de todas
las secuencias genmicas de un slo individuo se denomina biblioteca. Las bibliotecas clonadas pueden provenir
del genoma completo de un individuo, del DNA de un solo cromosoma, o del conjunto de genes
transcripcionalmente activos en un nico tipo celular.

Bibliotecas genmicas.
Las bibliotecas genmicas (o genotecas) suelen construirse utilizando vectores fgicos, que pueden contener
grandes fragmentos cromosmicos. Para preparar una biblioteca en el fago lambda, se corta el DNA de lambda
con una enzima de restriccin para eliminar el grupo gnico central, tal y como se ha comentado anteriormente. El
DNA genmico que se desea clonar se corta con la misma enzima, y se purifican los fragmentos cortados de
tamao ptimo para el empaquetamiento (de 15 a 17kb) mediante una electroforesis en gel o por centrifugacin.
Estos fragmentos de DNA se ligan con los brazos del cromosoma de lambda para formar la biblioteca.
En una biblioteca genmica estn representados todos los genes de un organismo. La biblioteca es un medio para
recuperar cualquier gen del genoma del organismo, pudindose estudiar con detalle junto con sus secuencias
reguladoras adyacentes. Tericamente, una biblioteca genmica contiene al menos una copia de todas las
secuencias representadas en el genoma. Sin embargo, cada molcula de vector puede contener slo unas
relativamente pocas kilobases de DNA insertado, por lo que una de las primeras tareas al preparar una biblioteca
genmica es seleccionar el vector ms adecuado para contener el genoma completo en el menor nmero posible
de clones. El nmero de clones necesarios para contener todas las secuencias de un genoma depende del
tamao medio de los insertos clonados y del tamao del genoma a clonar. Este nmero puede calcularse con la
siguiente frmula:

N=

ln ( 1 p)
ln ( 1f )

donde N es el nmero de clones necesarios, P es la probabilidad de recuperar una secuencia determinada, y f

representa la fraccin del genoma presente en cada clon.
Supongamos que deseamos preparar una biblioteca del genoma humano utilizando como vector al fago lambda.
El genoma humano tiene 3,0 106 kb; si el tamao medio de los insertos clonados en el vector es de 17 kb, y
queremos tener una probabilidad del 99% (P = 0,99) de que cualquier gen humano est representado al menos en
una copia, precisaremos una biblioteca de:

N=

ln ( 10,99)

ln 1

17 x 10
3,0 x 109

=8,1 x 105 clones

y si hubisemos seleccionado a pBR322 como vector, con un tamao medio de insertos de 5 kb, la biblioteca
necesitara contener:

N=

ln ( 10,99)

ln 1

5 x 10
3,0 x 109

=2,8 x 106 clones

Mutagnesis dirigida.
Los avances en las tcnicas de sntesis de DNA han acelerado los progresos experimentados en el estudio de
las funciones de las protenas y de la expresin gnica. Una de las formas ms efectiva de estudiar la relacin
entre la estructura y la funcin proteicas consiste en alterar una porcin determinada de la protena y observar
los cambios funcionales que se producen. Hasta hace unos aos, esto se realizaba mediante la modificacin
qumica de aminocidos individuales o mediante induccin de mutaciones en el gen que codifica la protena
objeto de estudio. Sin embargo, la modificacin qumica de una protena no siempre es especfica, ya que
pueden verse alterados varios aminocidos y no slo el que se desea alterar; por otro lado, hasta hace unos
aos no siempre era posible producir la mutacin adecuada en la localizacin del gen que se deseaba.
Estas dificultades han sido superadas en los ltimos aos gracias a la tcnica de la mutagnesis dirigida; en
ella se sintetiza un oligonucletido de unas 20 bases que contiene el cambio de secuencia deseado.
Posteriormente se permite que dicho oligonucletido alterado con la mutacin objeto de estudio hibride con una
copia monocatenaria del gen salvaje original completo; posteriormente se amplifica el complejo mediante PCR,
con lo que la polimerasa extiende el olignucletido y copia el resto del gen diana para producir una nueva copia
del gen con la mutacin deseada. Si unimos el gen a un fago de DNA monocatenario como es el caso del fago
M13, puede introducirse el gen mutado en una bacteria husped y clonarse, con lo que obtendremos grandes
cantidades de una protena mutante para el estudio de su funcin.

Bibliotecas cromosmicas.
Una biblioteca construida a partir de una fraccin genmica,
como un cromosoma, puede ser muy valiosa para seleccionar
genes especficos y para examinar la organizacin del
cromosoma. Por ejemplo, se aisl por microdiseccin por lser
un pequeo segmento del cromosoma X de Drosophila
correspondiente a una regin de unas 50 bandas politnicas.
Se extrajo el DNA de este fragmento cromosmico, se cort
con una endonucleasa de restriccin, y se clon en un vector
lambda. Esta regin del cromosoma contiene los genes white,
zeste y Notch, as como el sitio original de un elemento
transponible que puede transponer un segmento cromosmico
a ms de un centenar de otros loci. Aunque puede ser
tcnicamente difcil, este procedimiento produce una biblioteca
que contiene slo los genes que nos interesan y sus
secuencias adyacentes.
Las bibliotecas provenientes de cromosomas individuales
humanos se han preparado utilizando la citometra de flujo.
Los cromosomas de clulas mitticas se tien con dos
colorantes fluorescentes, uno que se une a los pares A T, y
otro a los pares G C. Los cromosomas teidos pasan por un
rayo lser que estimula la fluorescencia, y un fotmetro clasifica y fracciona los cromosomas segn las diferencias
de unin de los colorantes y de dispersin de la luz. Utilizando esta tcnica, diferentes laboratorios han preparado
bibliotecas de cada uno de los cromosomas humanos. Esto ha facilitado enormemente el cartografiado y el anlisis
de cromosomas individuales como parte del Proyecto Genoma Humano.
Una modificacin de la electroforesis conocida como electroforesis de campo pulstil se ha utilizado para aislar
cromosomas de levadura con el fin de construir bibliotecas cromosmicas de este organismo. El aislamiento y la
construccin de bibliotecas del cromosoma III de levadura (315 kb) fue el punto de partida para la formacin de un
consorcio de 35 laboratorios para determinar la secuencia nucleotdica de este cromosoma. Uno de los resultados
inesperados de este proyecto fue el descubrimiento de que aproximadamente la mitad de las secuencias
codificantes de protenas de este cromosoma eran desconocidas. Para muchos genticos, fue difcil aceptar que los
mtodos convencionales de mutagnesis sistemtica y de cartografiado de genes no fuesen tan eficientes como
pensaban. Sin embargo, este descubrimiento se confirm y se ampli en 1994 con la publicacin de la secuencia
del cromosoma XI (664 kb), y en 1996 con la secuenciacin del resto del genoma de levadura. Estos resultados
indican que las bibliotecas cromosmicas pueden utilizarse para acceder a los loci gnicos a los que los mtodos
convencionales como la mutagnesis y el anlisis gentico no han podido acceder, o de los que no se dispone o no
se conocen otras sondas como el mRNA o los productos gnicos. Adems, las bibliotecas cromosmicas
proporcionan un medio para investigar la organizacin molecular y la secuencia nucleotdica en una regin definida
del genoma.

Bibliotecas de cDNA.
Se puede construir una biblioteca que represente los genes que se estn transcribiendo en una clula eucaritica en
un momento dado, utilizando el mRNA aislado de esa clula. Casi todas las molculas de mRNA eucaritico tienen
una cola de poli-A en su extremo 3'. Primero, se hibrida la poblacin de molculas de mRNA que tienen colas de
poli-A 3' con oligo-dT (DNA corto de cadena sencilla formado slo por desoxitimidina).
La secuencia de oligo-dT hibrida con la cola de poli-A, y sirve de cebador para la sntesis de una cadena
complementaria de DNA utilizando la enzima retrotranscriptasa. Esta enzima es una DNA polimerasa dependiente
de RNA que copia un molde de RNA de cadena sencilla en un DNA de cadena sencilla. El resultado es un dplex
RNA DNA de doble cadena. La cadena de RNA se elimina tratndola con la enzima ribonucleasa H. Entonces, la
cadena sencilla de DNA se utiliza como molde para sintetizar la cadena complementaria de DNA, utilizando la DNA
polimerasa I. El extremo 3' de la cadena sencilla de DNA se dobla sobre s mismo formando una horquilla (un lazo),
por lo que puede servir de cebador para sintetizar la segunda cadena. El resultado es un DNA dplex con las
cadenas unidas por un extremo. La horquilla puede abrirse utilizando la enzima nucleasa S 1 obtenindose una
molcula de DNA de doble cadena (denominada DNA complementario o cDNA), cuya secuencia nudeotdica deriva
de una molcula de RNA.

Si se aade un trozo corto de DNA con sitios de restriccin en cada uno de sus extremos, el cDNA puede clonarse.
Este sitio de clonacin puede cortarse con la enzima de restriccin adecuada, produciendo extremos cohesivos, lo
que permite que el cDNA se inserte en el sitio de restriccin de un vector plasmdico o fgico.
Una biblioteca de cDNA es diferente a una biblioteca genmica ya que representa slo un subconjunto de todos los
genes del genoma, no contienen las secuencias promotoras adyacentes al gen y tampoco contienen los intrones, ya
que stos han sido eliminados del pre-mRNA durante la maduracin del mismo. Las bibliotecas de cDNA utilizan
mRNA como punto de partida, de manera que slo representan a las secuencias que se estn expresando en un
tipo celular, en un tejido, o en un estadio concreto del desarrollo embrionario. La decisin de construir una biblioteca
genmica o de cDNA depende del problema planteado. Si se est interesado en un gen particular, podra ser ms
fcil preparar una biblioteca de cDNA del tejido en el que se expresa dicho gen. Por ejemplo, los glbulos rojos
producen grandes cantidades de hemoglobina, y la mayora del mRNA de estas clulas es mRNA de la -globina.
Una biblioteca de cDNA preparada utilizando mRNA aislado de glbulos rojos permite aislar con facilidad un gen de
la globina. Si nos interesasen las secuencias reguladoras adyacentes al gen de la globina, necesitaramos construir
una biblioteca genmica, ya que estas secuencias reguladoras no se encuentran en el mRNA de la globina, y por lo
tanto no estaran representadas en la biblioteca de cDNA.

Produccin de cDNA a partir de

mRNA. Puesto que muchos mRNA
eucariticos tienen una cola poliadenilada de longitud variable, en su
extremo 3', un oligonucletido poli-dT
corto puede hibridarse a ella. El poli-dT
acta de cebador de la enzima
retrotranscriptasa, que utiliza al mRNA
como molde para sintetizar una
cadena de DNA complementaria. Se
forma una horquilla caracterstica al
terminarse la sntesis de la cadena de
DNA. Se elimina el mRNA por
tratamiento alcalino del complejo, y se
utiliza la DNA polimerasa para
sintetizar la segunda cadena de DNA.
La nucleasa S1 se utiliza para abrir la
horquilla; el resultado es una molcula
de cDNA de doble cadena que puede
clonarse en un vector adecuado, o
utilizarse como sonda para rastrear
una biblioteca.