Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

CHAPITRE IV METHODES DETUDE DE LA CELLULE

I : HISTOIRE SUR LINVENTION DU MICROSCOPE
Il est difficile de dire qui a invent le microscope compos. On dit souvent que l'opticien
hollandais Hans Janssen et son fils Zacharias Janssen fabriqurent le premier microscope en
1590, mais ceci provient d'une dclaration de Zacharias Janssen lui-mme au milieu du
XVIIe sicle. La date annonce est assez improbable tant donn qu'il a t montr que
Zacharias Janssen est n vers 1590.
Un autre favori au titre d'inventeur du microscope est Galile. Il a dvelopp un microscope
compos d'une lentille convexe et d'une autre concave en 1609.
Christiaan Huygens, un autre Hollandais, a dvelopp la fin du XVIIe sicle un oculaire
simple deux lentilles corrig des aberrations chromatiques, ce qui fut un grand pas en avant
dans le dveloppement du microscope. L'oculaire de Huygens est toujours fabriqu
aujourd'hui, mais souffre d'un champ assez rduit et d'autres problmes mineurs.
On attribue en gnral Antoni van Leeuwenhoek (1632-1723) le fait d'avoir attir l'attention
des biologistes sur les utilisations du microscope, mme si des loupes ordinaires taient dj
fabriques et utilises au XVIe sicle. Les microscopes artisanaux de Van Leeuwenhoek
taient des instruments simples et de taille rduite comprenant une lentille unique mais forte.
En comparaison, les systmes plusieurs lentilles restaient difficiles mettre au point et il
fallut pas moins de 150 ans de dveloppement des optiques avant que le microscope compos
puisse livrer une qualit d'image quivalente celle des microscopes simples de Van
Leeuwenhoek. Nanmoins, et malgr de nombreuses revendications, on ne peut pas
considrer Van Leeunwenhoek comme l'inventeur du microscope compos.
II : INTRODUCTION
Les cellules sont de trs petite taille et dorganisation trs complexe. Ltude de leur structure,
de leur composition chimique et de leur fonctionnement (physiologie) a ncessit la mise au
point doutils et de techniques appropris qui ont t perfectionns au fur et mesure des
progrs scientifiques et technologiques raliss dans divers domaines. Les progrs de la
microscopie ont repouss la frontire entre le visible et l'invisible. Au microscope
lectronique, on parvient mme obtenir l'image d'atomes d'or cristallin.
Aujourd'hui, la mdecine, la biologie ne peuvent plus se passer du microscope.
Pour comprendre la biologie cellulaire contemporaine, il est indispensable de se familiariser
avec les mthodes et les appareillages utiliss pour son tude.

Trois approches sont dveloppes pour tudier les divers aspects de la cellule :
*- les techniques morphologiques.
*- les techniques chimiques et biochimiques.
*- les techniques physiologiques.
Ces techniques sont toutes bases sur lemploi de microscopes optiques et lectroniques ;
les manipulations sont justifies par les deux exigences de lexamen au microscope :
Les objets examiner doivent tre minces
Leurs diffrents lments doivent prsenter un certain contraste.
1

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

En cytologie de nombreux procds prparatoires des cellules sont utiliss pour une analyse
morpho fonctionnelle. Nous traiterons dans ce chapitre que les principales techniques
histologiques et cytologiques.
III : LA MICROSCOPIE
La microscopie est un ensemble de techniques permettant d'obtenir une image des structures
biologiques. Le principe est dans tous les cas le mme : une onde est envoye sur la
prparation ou mise par la prparation. Cette onde est capte par un objectif qui la concentre
et passe par un oculaire qui cre une image observable. Cette image est soit observe l'il
nu, soit photographie, soit enregistre par camra CCD et stock sur ordinateur pour
retraitement.
Aujourd'hui la microscopie est divise en deux grands groupes, diffrents par la nature de la
particule lmentaire implique : le microscope optique, aussi appel photonique, parce qu'il
utilise des photons et le microscope lectronique qui utilise des lectrons pour tudier l'objet.
Afin dtudier des structures on utilise un certain nombre de techniques : prparation des
coupes fines, coloration ngative, ombrage mtallique, cryodcapage etc.
A : LA MICROSCOPIE OPTIQUE OU PHOTONIQUE

Cette technique est la plus ancienne utilise. Elle est galement celle dont il existe le plus de
variantes. Le principe est le suivant, la prparation est claire par une lampe. Les molcules
observer vont interagir avec la lumire de plusieurs faons :
- soit en absorbant certaines longueurs d'onde de la lumire. C'est la microscopie en lumire
directe.
- soit en provoquant un dphasage des diffrents rayons lumineux. C'est la microscopie en
contraste de phase.
- soit en mettant de la lumire une autre longueur d'onde que celle d'origine. C'est la
microscopie fluorescence.
Le microscope optique est un instrument d'optique muni d'un objectif et d'un oculaire qui
permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions (ce qui caractrise son
grossissement) et de sparer les dtails de cette image (et son pouvoir de rsolution) afin qu'il
soit observable par l'il humain. Il est utilis en biologie, pour observer les cellules, les tissus,
en ptrographie pour reconnatre les roches, en mtallurgie et en mtallographie pour
examiner la structure d'un mtal ou d'un alliage.
Il ne faut pas le confondre avec la loupe binoculaire qui n'exige pas des chantillons plats de
faible paisseur
Ce microscope il a lavantage de donner une vue gnrale des cellules ou des tissus et aussi d
e permettre lexamen de cellules vivantes ; mais le pouvoir sparateur du microscope optique
ne peut dpasser 0,2 m, le grandissement tant au maximum de 1000.

1 : Prsentation du microscope optique :

Un microscope optique en gnral est compos dun statif (pied) qui assure la stabilit de
lappareil, dun tube optique le long duquel existe un systme de lentilles en verre et
comportant ses extrmits un oculaire permettant de recueillir limage et des objectif servant
agrandir un certain nombre de fois limage de la prparation, dune platine (porte objet)

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

perce dun trou et munie de pinces pour immobiliser la lame et dune source lumineuse
clairant la prparation. (Voir TP sur la microscopie).

Le microscope est caractris par :

- son grossissement ou puissance : Egal au produit du grossissement ( ou puissance) de
lobjectif et de loculaire Plus le grossissement de lobjectif est important, plus lobjectif doit
tre proche de lobjet observer.
- son pouvoir de rsolution : La rsolution d'un microscope dsigne sa capacit sparer des
dtails trs voisins. Indpendamment du capteur utilis et des aberrations ou imperfections des
lentilles, la rsolution du microscope optique est fondamentalement limite par la diffraction
de la lumire.
La rsolution ou le pouvoir sparateur (PS) est dfinie comme tant la distance minimale sparant deux
points individualisables. Chez lhomme le PS est de 0,1 mm une distance de 25 cm. Lil humain ne peut
distinguer 25cm que deux objets distants lun de lautre que de 0,1 mm. Au-del limage des 02 objets
sera unique ou nulle.
Le PS du microscope optique est de 0,2 m alors que celui du microscope lectronique est de lordre de A

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

2 : Principe du fonctionnement du microscope :

Deux types dobservations sont ralisables en microscopie : lobservation par transmission
pour le microscope optique et pour le microscope lectronique transmission et lobservation
par rflexion pour le microscope lectronique balayage.
Donc le microscope travaille en :
Transmission : lchantillon est travers par des photons et lectrons ; les lentilles de verre
(MO) ou les champs lectromagntiques (MET) permettent lobtention dune image qui est
reprise par loculaire (MO) ou cran fluorescent (MET).
Rflexion : le microscope ne capte que les rayons rflchis par les parois de la prparation. Ce
type de microscopie donne une image de la surface des objets et non de leur structure interne.
Lintensit tant fonction de lorientation des parois par rapport au systme optique, cela
donne une image en relief de lobjet. Elles ne sont donc pas applicables des objets sans
relief comme les coupes de tissus ! Elles ncessitent un clairage latral de lobjet. Ce
mode de microscopie est peu utilis, il correspond aux loupes binoculaires ou
stromicroscopes, au microscope fond noir en microscopie optique et au microscope
lectronique balayage (MEB) en microscopie lectronique.
3 : Conditions dobservation en microscopie :
Pour effectuer une observation en microscopie deux exigences simposent : lpaisseur de
lchantillon et le contraste.
Lpaisseur de lchantillon : pour une observation par transmission lchantillon doit
prsenter une faible paisseur afin de permettre le passage du faisceau incident des photons ou
dlectrons do la ncessit de faire des coupes trs trs fines. Les coupes exiges en (MO)
varient entre 2 m 10 m et de 0,03m 0,05m
Le contraste : Lobservation par transmission nest possible que si certaines rgions de la
coupe absorbent les photons ou les lectrons plus que dautres (effet contraste). En rgle
gnrale, les constituants cellulaires prsentent des contrastes naturels faibles do
lutilisation de certains artifices tels que les montages optiques qui amplifient les contrastes
naturels comme le microscope contraste de phase ou des colorants vitaux slectifs (MO) ou
encore des sels de mtaux lourds comme les sels de plomb (ME).
4 : Types de microscopes optiques :
Un certain nombre de microscopes ayant chacun des montages optiques spciaux ont t mis
au point pour permettre lobservation des cellules dans certaines conditions et amliorer la
qualit de celle ci. Le dveloppement de ces microscopes rpond principalement 2 objectifs
- augmenter les contrastes pour mieux visualiser les structures subcellulaires
- amliorer le pouvoir de rsolution (voir des dtails de plus en plus petits !)
Parmi ces microscopes, nous avons :
a) Microscope fond noir :

Il permet de rvler certains dtails lors de lobservation des cellules vivantes, en augmentant
les contrastes naturels. Dans ce type de microscope, la source de lumire est oblique par
rapport la prparation cellulaire.
4

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

Un condenseur spcial illumine la prparation sous une incidence rasante, seul les rayons
rflchis sont capts par lobjectif : le fond du champ d'observation est noir, et le moindre
objet apparat brillamment clair. Cela permet d'observer des objets dont la dimension est
la limite extrme du pouvoir sparateur, et qui passeraient inaperus avec les techniques
ordinaires. Mais ces objets devenant des sources lumineuses, leur forme et leur dimension ne
peuvent pas tre correctement apprcis.
b) Microscope contraste de phase :

Ce type de microscope est largement utilis pour lobservation de cellules vivantes. Son
principe repose sur lamplification des contrastes naturels en mettant profit les diffrences
dindices de rfraction entre les organites ; diffrences quil transforme en diffrences
dintensits de lumires qui sont alors visibles lil. La base de cette transformation repose
sur les interactions entre les ondes lumineuses : on parle dinterfrences. Ce microscope est un
bon outil pour lobservation des mouvements des cellules et de leurs organites tels que les
mitochondrie, les chromosomes, et de suivre les tapes de processus comme la mitose par
exemple. Les images de lobservation peuvent tre enregistres par camra vido, les films
sont ensuite projets sur un cran de tlvision.
c) Microscope fluorescence :
Dune manire gnrale, les molcules fluorescentes absorbent des radiations une longueur
donde donne et mettent des radiations de longueur donde plus leve. Cest le cas des
substances appeles Fluorescine qui fluoresce en vert et la Rhodamine en rouge sont des
exemples de ce type de substances largement utilises dans la biologie cellulaire. Ce
microscope est semblable au microscope photonique ordinaire, sauf quil est muni dune
source de rayon UV (lampe UV) et dun systme de filtre qui permet de choisir la longueur
donde des UV appropris pour chaque substance. Il est le plus souvent utilis pour dtecter
les protines spcifiques ou dautres molcules rendues fluorescentes par couplage un
fluochrome ; titre dexemple, on peut aussi dtecter la prsence dinsuline dans une cellule
avec anticorps Anti-insuline marqu par fluorescine.
d) Microscope lumire polarise :

Il permet de dtecter des structures birfringentes qui ont une organisation molculaire
particulire, telles que les microtubules et les chloroplastes et parois des cellules vgtales.
Les photons lumineux passant travers certains matriaux tels que les filtres Polarod ou
certains cristaux (Nicol) en ressortent "polariss" : ils ne vibrent plus que dans un seul plan. Si
un second filtre Polarod ou un second Nicol est dispos sur leur trajet on peut par rotation de
ce second filtre les arrter compltement et obtenir l'extinction totale du faisceau. (Nicol
"croiss") Si on place entre les deux filtres croiss un objet actif sur la lumire polarise, tel
qu'une substance organique possdant un carbone asymtrique ou un arrangement molculaire
ordonn, le plan de polarisation est dvi et l'extinction est leve, la lumire issue de l'objet
traverse le second filtre. Il faudra oprer une rotation du second filtre pour obtenir nouveau
l'extinction. Un microscope lumire polarise est quip d'un premier filtre au niveau du
condenseur et un second filtre en position croise dans le tube optique
e) Microscope balayage confocal :

Dans ce type de microscope, lobjet est clair par un faisceau laser finement focalis qui
balai rapidement un seul niveau nclairant quun plan mince de lobjet, on parle de coupes
optiques. Les prparations sont souvent traites par des colorants fluorescents et la lumire
mise par la coupe optique claire donne une image sur un cran vido. Les coupes
photographiques dun cerveau humain prises par un scanner sont un exemple de ce type.
5

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

B : LA MICROSCOPIE ELECTRONIQUE
Le microscope lectronique est beaucoup plus rcent : le premier a t construit en 1931, par
Max Knoll et Ernst Ruska, ce dernier a d'ailleurs reu le prix Nobel de physique en 1986 pour
cette invention. Puis il s'est rpandu partir des annes 60. La rsolution d'un microscope
lectronique peut atteindre 2 angstrms, mais gnralement les meilleurs microscopes
atteignent 20 angstrms seulement.
Le principe de fonctionnement d'un microscope lectronique ressemble un peu celui d'un
microscope optique sauf que au lieu des photons ce microscope fonction avec des lectrons le
faisceau est produit et acclr par un canon lectrons (cathode et anode perce).
Lensemble du dispositif est plac sous vide. Les lentilles de verre sont remplaces par des
bobines lectromagntiques ("lentilles" lectromagntiques) seules capables de focaliser les
lectrons, et de crer des images.
Avec ces microscopes on ne peut examiner que des cellules tues, mais le pouvoir sparateur
est de lordre de quelques A. On aura donc accs lultra structure des organites.
1 : Types de microscopes lectroniques
Il existe deux variantes de la microscopie lectronique :
- la microscopie transmission
- la microscopie balayage
a) Microscope lectronique transmission :
C'est la technique la plus performante. Dans son principe, elle ressemble la microscopie
optique en lumire directe. Le faisceau d'lectron est mis par un canon lectron, focalis
sur la prparation l'aide de lentilles lectromagntiques et la traverse, ils sont plus ou moins
absorbe (la prparation est dite plus ou moins dense aux lectrons), l'image se forme derrire
la prparation sur un cran fluorescent similaire ceux qui quipent les tlviseurs noirs et
blanc. Hormis le fait que les absorbeurs d'lectrons sont des mtaux lourds les mmes
techniques de rvlation que pour la microscopie en lumire directe peuvent tre utilises.
b) Microscope lectronique balayage (scaning) :
Bien que de rsolution plus faible que la prcdente, cette technique donne des images
absolument spectaculaires, en pseudo 3D.
Le flux dlectrons balaye la surface de lobjet au pralable recouvert dune couche
mtallique. Ce sont les lectrons secondaires, renvoys par la surface mtallique, qui sont
utiliss pour fournir une image. Cet appareil permet de gagner en profondeur de champ, mais
son pouvoir sparateur est plus faible que celui du microscope transmission. Il fournit des
renseignements sur laspect tridimensionnel des surfaces cellulaires, par exemple.

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

Comparaison entre le microscope optique et lectronique

M. OPTIQUE
*grossissement : de 25 1500 fois
*pouvoir sparateur : environ 0.2m
* prparation est traverse par des photons
*longueur donde : 0,4 0,8 m
*lentilles sont en verre
*image : est reue directement
*les coupes au microtome : 2 10 m

Caractristiques

M. ELECTRONIQUE

* grossissement : 1500 200000 fois

* pouvoir sparateur : 10A
* Prparation traverse par les lectrons
* longueur donde : variable de lordre de 0,05 A
* les lentilles sont des champs magntiques
* image : est reue sur cran fluorescent
* les coupes lultramicrotome : 0,05m

Avantages
* on peut voir la structure fine de la cellule
* on atteint trs souvent le niveau molculaire
*a permis de rsoudre de vieux litiges
(ex : synapse Golgi des vgtaux)
Inconvnients
* on ne peut pas pousser lanalyse
* la cellule est morte
assez loin
* on a pas une vue densemble
des structures artificielles (artefacts) apparaissent
Units
*lunit est le micromtre ou micron (m)
* lunit est le nanomtre (nm)
1m = 10-3 mm
1nm = 1 millimicron = 10-6 mm ou 10-9 m
* on peut voir la cellule en entier
* on peut observer une cellule vivante
* on peut utiliser des colorants et voire
des couleurs relles

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

IV : TECHNIQUES DE COUPES ET DE REPLIQUES

Le microscope permet d'observer les cellules d'un tissu, mais dans des conditions trs strictes :
il faut que l'objet examiner soit transparent la lumire. Les objets biologiques ne le sont
que rarement, lexception des objets naturellement trs minces : suspensions (sang, ..) ou
cultures cellulaires. Il faut donc les dcouper en tranches trs minces (coupes) de l'ordre de 5
10 microns. Pour cela, il faut durcir lobjet par diffrentes techniques physiques ou
chimiques. Mais la coupe causerait des dommages irrparables aux tissus et aux cellules et
l'observation ne correspondrait pas la ralit des cellules vivantes : sparation physique de
structures proches plus ou moins entranes par loutil de coupe, libration denzymes lytiques
(protases essentiellement) contenues dans des compartiments spcifiques (lysosomes,
peroxysomes, ) il faut donc au pralable "immobiliser" les structures dans un tat aussi
proche que possible de l'tat vivant et inactiver ces enzymes : c'est le but de toute une srie de
manipulations qui amneront les objets biologiques l'examen convenable au microscope.
A : TECHNIQUES DE COUPE
Pour un examen morphologique des cellules ou des chantillons biologiques en microscopie,
des procds prparatoires de lchantillon sont ncessaires.
Examen des chantillons en microscopie optique
Examen de cellules vivantes :
Elles peuvent tre examines sans prparation, mais dans un nombre trs limit de cas. Il ne
peut sagir que des cellules isoles, naturellement ou en culture.
Une cellule animale dpourvue dexosquelette se dshydrate trs rapidement dans lair. Son
observation ne peut seffectuer quen milieu liquide. Lobservation en milieu de culture
permet de maintenir la physiologie cellulaire. Mais les botes de culture interdisent des
objectifs de grossissement utile (maximum X5). Lastuce consiste inverser le montage du
systme optique : on illumine la bote par le haut (les condenseurs actuels permettent de
focaliser la lumire sur le fond de la bote de culture) et lon observe travers le fond :
microscope invers.
Comment observer correctement les cellules vivantes ?
Il faut utiliser des techniques qui augmentent les contrastes sans toxicit pour la cellule.
a) les mthodes chimiques, les colorants vitaux :
La quasi totalit des colorants sont trs
toxiques pour les cellules, quelques rares colorants n'ont pas cet inconvnient. Ils augmentent
le contraste dabsorption de certaines longueurs donde, confrant une couleur aux structures
qui les retiennent. On peut citer :
Le Vert Janus B spcifique des mitochondries
Le bleu de Trypan, qui ne peut pntrer dans des cellules vivantes, mais qui colore les
cellules mortes (test d'exclusion du bleu trypan) : il est trs utilis pour valuer la vitalit des
cellules.
Les colorants dexclusion drivent dune technique utilise par les microbiologistes qui
visualisaient des levures par contraste en les dispersant dans lencre de Chine.

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

b) les mthodes physiques, le microscope contraste de phase :

ce microscope augment le contraste des objets. Cest le seul moyen dobserver les
mouvements cellulaires et de les filmer.
Examen des cellules mortes:
Il est ncessaire la mise en uvre de manipulations indispensables lobtention dobjets
minces et contrasts. On ne peut en effet, examiner que des celles colores ; il est aussi
ncessaire dobtenir des coupes minces de ces cellules et donc de les inclure au pralable dans
des substances relativement dure, il faut auparavant les fixer, pour viter toute altration
susceptible de se produire au cours des manipulations. La squence de ces manipulations est
donc la suivante : Prlvement, fixation, inclusion, coupe et coloration.
a) Prlvement :
Dans le milieu mdical, les prlvements sont effectus en clinique, l'hpital ou dans des
cabinets privs ou mdecin spcialiste. Ils sont raliss par des chirurgiens.

On distingue quatre catgories majeures de prlvement :

o Les frottis : grattage (du col de l'utrus...),
o Les biopsies : fragments de tissu ou dorgane,
o Les organes en intgralit,
o Les liquides d'panchement divers (pleural, ascitique, pricardique, etc.).

Il existe galement des techniques de prlvement plus sophistiques : par excision, ponction
ou microdissection.
b) Fixation :
Cest laction de tuer les cellules, en vitant tout phnomne agonique, de manire
conserver les structures dans un tat morphologique aussi proche que possible de ltat vivant.
Une bonne fixation doit viter tout artefact : apparition dune structure nouvelle (par
coagulation), disparition dune structure normalement prsente (par solubilisation),
dformation ou dplacement des constituants cellulaires (par cristallisation) on peut fixer
laide de procds chimiques : Alcool, formol, acide actique, etc.ou bien par des procds
physiques, comme la conglation brusque (meilleur fixateur).
c) Dshydratation :
Pour dshydrater les tissus, on les plonge dans des alcools de degrs croissants, 70, 80,
90, 100, pendant le temps ncessaire l'quilibre des concentrations.
La paraffine n'est pas miscible l'eau, la pice anatomique doit tre entirement dshydrate
avant l'inclusion dans la paraffine. La paraffine n'est pas non plus soluble dans l'alcool utilis
pour la dshydratation. On procde donc une double substitution.

On remplace l'eau par de l'alcool (Dshydratation)

On remplace l'alcool par le tolune (Substitution)

d) Inclusion :
La coupe ne peut tre pratique que dans une substance assez dure ; cest pourquoi on
imprgne les tissus dune substance denrobage, en gnral la paraffine ; lalcool ntant pas
parfaitement miscible avec la paraffine, on plonge le tissu dshydrat dans un solvant
organique intermdiaire miscible lalcool et la paraffine, le xylne, puis dans la paraffine
9

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

maintenue liquide l'tuve entre 50 et 60C. On refroidit alors et on obtient un bloc de

paraffine durcie contenant le tissu examiner.
Cette imprgnation suppose une dshydratation et une substitution de leau par lalcool,
solvant de la paraffine. En effet l'inclusion ne se fera de faon satisfaisante que si la pice
couper ne contient ni eau ni solvant intermdiaire (alcool).
e) Coupe (microtomisation) :
Le bloc de paraffine est dcoup en tranches minces laide des microtomes qui sont des
appareils permettant de dbiter les blocs de paraffine en coupes de quelques microns
quelques dizaines de microns. Les forces de frictions entre couteau et bloc chauffent la
paraffine et la mettent en surfusion, ce qui permet de coller les coupes les unes la suite de
l'autre : ruban de coupes sries. On les recueille sur des lames de verre (porte objets)
autrefois enduites d'une solution d'ovalbumine qui les colle sur la lame en schant.
Actuellement on utilise des verres traits chimiquement.

f) R hydratation :
Les coupes colles sur lame de verre sont dparaffines l'aide d'un solvant organique et
ramenes l'eau par des bains d'alcools de concentrations dcroissantes. Cela permet de les
colorer, car la majorit des colorants sont solubles dans l'eau ou dans l'alcool.
g) Coloration :

Les objets biologiques coups et examins par transparence ne sont pas ou peu colors: ils
offrent trs peu de contraste, donc de visibilit, et aucun dtail ne peut tre peru. Il faut
renforcer le contraste de couleur des diffrents organites ou mieux les colorer. Cette lame de
verre est alors plonge dans un colorant. On dispose nombreux colorants naturels, qui se
fixent sur telle ou telle structure de la cellule, par exemple, le vert de mthyle colore en vert la
chromatine
On utilise deux catgories de colorants : Les plus courants sont :
l'hmatoxyline, qui colore les noyaux cellulaires en bleu violac
Losine, qui colore les cytoplasmes en rose
Les bleus (Bleu de mthylne, de toluidine) sont galement employs en routine.

10

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

Techniques de prparation de coupes pour le microscope photonique

Examen des chantillons en microscopie lectronique
La squence de manipulation est analogue celle qui a t expose pour la microscopie
optique.
a) Fixation : encore plus exigeante (les artefacts sont plus visibles), elle est ralise avec des
fixateurs spciaux, comme : le ttraoxyde dosmium OsO4 et le glutaraldehyde C5H8O2. Ce
sont les deux principaux fixateurs chimiques utiliss en microscopie lectronique.
b) Dshydratation : elle suit le mme principe qu'en microscopie optique; mais elle est
dlicate car les tissus doivent tre conservs jusqu'au niveau molculaire.
c) Inclusion : elle se fait dans un milieu trs dur, dans des matires plastiques telle que la
rsine. Une fois refroidi, durci par polymrisation, on obtient un chantillon solide.
d) Coupe : effectue sur un ultramicrotome, elle fournit des tranches encore plus minces,
de 50 nm.
11

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

e) Coloration : cest plutt une imprgnation (il ny a que le noir et le blanc en microscopie
lectronique) par des sels de mtaux lourds, comme les sels de plomb ou duranyle, qui
augmente le contraste des structures cellulaires.
B : TECHNIQUE DE REPLIQUES
Elle est gnralement applicable au MEB et seffectue en 03 tapes : la conglation de
lchantillon, la cryofracture et lobtention des rplique.
Examen de rpliques aprs cryofracture et cryodcapage :
Cette technique permet de raliser une empreinte topographique (rplique) aprs fracture dun
chantillon congel. Elle permet lobtention dune simple ou dune double rplique (moulage
des deux faces de la fracture).
Le tissu est fractur aprs fixation basses tempratures, le trait de fracture prsente des
reliefs dus lhtrognit des constituants cellulaires. Ceux ci sont accentus par la
projection selon une incidence rasante (ombrage) dune fine couche mtallique. Celle ci est
ensuite dtache et constitue une rplique qui peut tre examine au microscope. On a alors
une ide des reliefs de la surface dun organite ou mme dune membrane si la fracture la
dlamine (coupe tangentielle).
Elle est gnralement applicable au MEB et seffectue comme suit :
La conglation de lchantillon, la cryofracture, le dcapage, ombrage et obtention de la
rplique.
Les tissus prlevs sont congels rapidement sans fixation ou aprs fixation. A fin dviter les
dgts provoqus par la formation de cristaux de glaces, les tissus sont imprgns de
substances telles que le glycrol, puis congels rapidement dans des liquides temprature
trs basses comme le fron liquide, dont le point de fusion se situe 150C ou en plaant
lchantillon au contact dun bloc de mtal refroidi dans lhlium liquide. Quand le tissu est
congel, on lobserve souvent par la technique de la rplique de cryofracture, illustre dans
la figure ci-dessous. De petits fragments de tissus sont mis sur un petit disque mtallique et
congel rapidement, le disque est ensuite plac dans un support spcial et le bloc de tissu
congel est frapp par une lame, provoquant partir du point de contact une fente qui clive le
tissu en deux parties.
Quand le plan de fracture traverse une cellule compose dorganites trs divers, de
composition diffrente. Ces structures ont tendance dvier le plan de fracture, vers le haut
ou vers le bas, provoquant dans les surfaces des protubrances, des dpressions et des crtes
qui refltent les contours du protoplasme travers. En dautres termes, les surfaces exposes
par la fracture donnent des informations sur le contenu de la cellule. Le but est de rendre
visibles ces informations. Pour ce faire, la technique de la rplique utilise la surface de
fracture comme un moule sur lequel on dpose une couche de mtal lourd. Le mtal est
dpos la surface du tissu congel qui vient dtre expose dans lenceinte mme qui a servi
produire la fracture. Le mtal est dpos sous un angle qui accentue la topographie locale
par ombrage. On dpose ensuite une couche de carbone au dessus de la couche mtallique
directement partir du haut, plutt que latralement, de manire obtenir une couche
uniforme de carbone qui cimente les plages mtalliques dans un film continu. Quand on a
ainsi obtenu un moulage de la surface, on peut faire fondre le tissu qui a servi de modle,
lenlev et lliminer ; cest la rplique de mtal et de carbone qui est plac sur la grille et
observe dans le faisceau dlectrons.

12

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

Par consquent, cette technique convient particulirement pour tudier lintrieur des
membranes.
La rplique de cryofracture est, par elle-mme, une technique extrmement utile, mais elle
peut encore servir pour donner plus dinformations quand on y ajoute une tape de
cryodcapage. Au cours de cette tape, lobjet congel et fractur, toujours dans la chambre
froide, est plac sous vide une temprature leve pendant une ou quelques minutes : une
couche de glace superficielle svapore (sublimation). Aprs llimination de leau, la surface
de la structure peut tre recouverte par un mtal lourd.

Prparation de rpliques de cryofracture pour lobservation au microscope lectronique

VI : TECHNIQUES DE COLORATION
Le microscope lectronique convient tout autant pour ltude de trs petites particules, comme
les virus, les ribosomes, lments de cytosquelette et complexes protiques. On peut
galement mettre en vidence la forme des protines et acides nucliques individuels au
microscope pour autant quont leur donne un contraste suffisant. Un des meilleurs moyens de
rendre ces substances visibles est lutilisation de techniques de coloration ngative. Il y a

13

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

galement une autre technique largement utilise pour rendre visible de trs petites particules
isoles est leur ombrage.
A : LA COLORATION NEGATIVE
Les chantillons minces (de quelques nanomtres quelques dizaines de nanomtres
d'paisseur) sont adsorbs sur une grille mtallique recouverte d'un film de carbone fin
(quelques nanomtres). Ce sont typiquement des complexes protiques ou des virus.
On forme un dpt de mtal lourd sur toute la surface de la grille sauf aux endroits o se
trouvent les particules. Par consquent, la structure de lobjet se distingue par sa clart relative
sur lcran fluorescent .Dans cette technique, on place une goutte de colorant (actate
duranyle ou phosphotungstate de potassium) sur une grille qui porte les particules tudier et
on laisse svaporer la plus grande partie de la goutte. A cause de la tension superficielle, le
colorant a tendance envelopper la particule sur le filme qui le supporte et pntre dans toutes
les irrgularits qui souvrent la surface de la particule. Le reste de la particule recueille peu
de colorant .De par sa forte masse atomique, le contrastant dvie les lectrons dans le
diaphragme objectif. Ainsi l'chantillon biologique apparat plus clair que ce qui l'entoure,
d'o le nom de coloration ngative. L'chantillon apparat blanc sur un fond sombre sur les
photographies.

B : LOMBRAGE
Une autre technique largement utilise pour rendre visible de trs petites particules isoles est
leur ombrage. Les grilles sont places dans un espace ferm, o lon fait le vide. Dans la
chambre se trouve un filament compos dun mtal lourd (gnralement le platine) avec du
carbone. Le filament est port haute temprature, ce qui provoque son vaporation et le
dpt dun revtement mtallique sur toutes les surfaces accessibles dans la chambre.
Le mtal se dpose donc sur les surfaces qui font face au filament, tan disque les surfaces
opposes de lobjet et les parties du support qui sont dans lombre restent non revtues et
incapable de diffracter les lectrons. Par consquent, les zones qui sont dans lombre sont
claires sur lcran, alors que les rgions couvertes de mtal sont fonces. Cette relation est
inverse sur la plaque photographique, qui est le ngatif de limage. Par consquent, on
reprsente les prparations ombres en imprimant une image ngative dans laquelle la
particule parait claire par une vive lumire blanche (correspondant la surface revtue),
avec une ombre fonce produite par la particule. Cette technique donne un trs bon contraste
pour un matriel isol et produit une impression dimage en trois dimensions (3D).
14

Cours de Biologie Cellulaire

Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

V : TECHNIQUES DISOLEMNT DES ORGANITES

Fractionnement cellulaire
Afin d'analyser leur structure ou leur composition, il peut tre intressant de sparer les
diffrentes structures prsentes dans la cellule.
Pour ce faire, on broie une culture de cellules. La sparation des constituants peut alors se
faire par centrifugation. Soumis l'effet centrifuge, les structures les plus massives se
rassemblent dans le fond du tube en rotation.
L'acclration centrifuge est exprime en multiples de l'acclration de pesanteur terrestre
note g. L'acclration laquelle on soumet les chantillons atteint des valeurs de 100 000
200 000 g.

15

 Prsents par Mr CHELLI A.

1re Anne LMD

FSNV 2012/2013

Les diffrentes fractions issues de la centrifugation peuvent ensuite tre identifies et analyss
chimiquement.
N B : Les techniques histologiques, cytologiques, coloration ngative et ombrage, renseignent

sur la morphologie des cellules et de leurs organites, alors que

les techniques
dAutoradiographie et de fluorescence renseignent sur la physiologie de la cellule.

16